Виробництво генетично модифікованого інтерферону

Порядок приготування розчину С: беруть наважку персульфату аммонію та розчиняють її в 100 мл води.

Розчини А та В можуть зберігатися в темних посудинах в холодильнику на протязі декількох тижнів. Розчин С готують безпосередньо перед аналізом.

Електродний буфер готують з:

тріс-(гідроксиметил)-амінометан 1,2 г;

гліцин 5,76 г;

вода 2 л.

Електрофорез в поліакріламідному гелі найпростіше провести за такою методикою.

В спеціальній формі зі скла або пластика формують пластинку з гелю. В верхній частині пластинки вирізають прямокутні ячейки, в які поміщають проби речовини. Поверх проб насалюють буферний розчин та опускають катод. Форма з пластинкою гелю ставиться вертикально або під нахилом в резервуар з буферним розчином, в який опускається анод. Електроди підключають до джерела струму та проводять електрофорез. Схема установки для електрофорезу в поліакриламідному гелі представлена на малюнку 5.1.

Малюнок 5.1 - Схема установки для електрофорезу в поліакріламідному гелі

Умовні позначення:

1 - електроди; 2 - буферний розчин; 3 - ячейки з пробоми; 4 - пластинка гелю; 5 - резервуар з буферним розчином.

В лабораторних умовах був проведений дослід щодо можливості використання електрофорезу в поліакріламідному гелі, як методу очистки та концентрування рекомбінантного інтерферону.

Концентрування препарату відбувалося в присутності додецилсульфату натрію (ДСН) та 2-меркаптоетанола, використовувався 12% акриламід.

Після проведення електрофорезу гель пофарбували розчином Кумасі голубим. Виявилися полоси, які відповідають білкам з молекулярною масою 68, 25, 23 і 12,5 кДа.

Сканування пофарбованого гелю за допомогою денситометра при ??= 575 мкм дозволило визначити площу піків, це дало можливість виявити %-вий склад кожного білку в препараті, 45% від загальної кількості білку становив низькомолекулярний білок з молекулярною масою 12,5 кДа, 30% - білок з молекулярною масою 23 кДа, 9% - білок з молекулярною масою 25кДа та 13% білок з молекулярною масою 68 кДа. (див. малюнок 5.2)

Малюнок 5.2 - Електрофореграмма білків препарату очищеного інтерферону

Умовні позначення:

1 - поглинання при l?= 575мкм (права ордината); 2 - титр інтерферону в МО/мл (ліва ордината); по осі абсцис - номер фракції.

Представлені результати титрування елюатів зі зрізів гелю. Після електрофорезу в поліакриламіді пластинку гелю розрізали на полоси шириною 0,5 см починая з нижнього краю гелю. Інтерферон екстрагували фосфатним буфером з рН = 7,2 в присутності 0,1% ДСН. Антивірусна активність виявилася у білків з молекулярною масою 15 та 23 кДа, що свідчить про належність цих білків до інтерферонів.

Після такої очистки вміст антигена клітин-продуцентів зменшилася в 32 рази. В препараті не знайдено антигенів вірусу-індуктора.

З метою оцінки ефективності використаного даного методу для очистки інтерферонів від можливих вірусів-контамінантів був проведений дослід з штучною контамінацією препарату. В нативний інтерферон вносили різні віруси, які відносяться до різних таксономічних груп. Це віруси енцефаломіокардиту, хвороби Ньюкасла та осповакцини. Кількість вірусу осповакцини визначали по кількості оспін на хоріон-алантоісної аболонці курячих ембріонів , кількість вірусу хвороби Ньюкасла по інфекційності для курячих ембріонів, а кількість вірусу енцефаломіокардиту по цитопатичній дії на культуру клітин.

Препарат, заражений вірусами, очищували та концентрували по такій же методиці. В очищеному концентрованому препараті інтерферону внесені віруси виявлені не були. [12]

На основі отриманих даних можна зробити висновок, що метод електрофорезу в поліакріламідному гелі можна використовувати для очистки та концентрування рекомбінантного інтерферону. Цей метод є перспективним завдяки своїй універсальності, зручності та швидкості виконання, а також із-за простоти обладнання та його обслуговування.

ВИСНОВКИ

1. В дипломній роботі бакалавра досліджено технологію виробництва та контролю рекомбінантного інтерферону з мутантного штаму E. coli.

2. Теоретично обґрунтовано можливість застосування електрофорезу в поліакриламідному гелі, як методу очистки та концентрування препарату.

3. Запропонована схема електрофоретичної установки.

4. Вибрана методика приготування поліакриламідного гелю.

5. За допомогою техніко-економічних розрахунків було доведено, що виробництво рекомбінантного інтерферону економічно вигідніше ніж лейкоцитарного.

6. Доведено економічну ефективність, прибутковість та рентабельність виробництва генетично модифікованого інтерферону.

ПЕРЕЛІК ДЖЕРЕЛ ІНФОРМАЦІЇ

1 Герасименко В. Г. Біотехнологія, - Київ: 1989 р. - стор. 202 - 216.

2 Петровский Б.В. Большая медицинскаят энциклопедия. - 3 - е издание - М.: Советская энциклопедия, 1978г.

3 ВиестурУ.Э., Шмитте И.А., Жилевич А.В. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. - Киев: 1989г.

4 Лечение интерфероном. Доклад научной группы ВОЗ; Всемирная организация здравоохранения, Женева: 1984г.

5 Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Интерферон и его индукторы, - М.: 1980г.

6 Золотарёва Г.Н., Ломнова Н.С., Радченко Л.У. Международный симпозиум Ассоциации исследователей интерферона: Тезисы, - Л.: 1990г. - стр. 3 - 5.

7 Машковский М.Д., Лекарственные препараты, - 13 - е изд. - Харьков: Торсинг, 1997г.

8 Державна фармакопея України, - 1 - е вид. - Харків: 2001р.

9 Государственная фармакопея, XI - изд. - М.: Медицина, 1987г.

10 Коммедбиопром, Харьковское ЗАО “Биолек”. Промышленный регламент на производство лаферона, 2000г.

11 Коммедбиопром, Харьковское ЗАО “Биолек”. Промышленный регламент на производство интерферона человеческого лейкоцитарного. 1996г.

12 Получение очищеного и концентрированого человеческого интерферона из клеток линии намальва / Н.Л. Мельникова, Н.Р. Шухмина, Э.Р. Пилле и др., - Вопросы вирусологии, Т - 34, № 6, 1980г. - стр. 711 - 714.

13 Реоферон (Генно - инженерный человеческий альфа 2 интерферон): сб. научных тр. / ВНИИ гриппа; [Редкол: О.И. Киселёв (отв. ед.)] - Л:1988г.

14 Маниатис Т., Фричи Э.; Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. - М.: 1984г.

15 Шухмина Н.Р., Мельникова Н.Л. Молекулярная генетика; № 6, 1984г.

16 Дикий И.Л. Иммунобиотехнология. Учебное пособие для внеаудиторной работы студентов, - Укр. ФА. Кафедра микробиологии, - 1999г.

17 ВФС 42У - 83 - 111 - 95 - Интерферон человеческий рекомбинантный альфа - 2б

18 Сборник инструкций по контролю МИБП (Приказ минздрава СССР 13.01.83.№ 31)

19 Научные исследования ЗАО “Биолек” / И.И. Гольбец, Г.А. Сенников, Г.Л.Орлова и др., - Харьков: Фармаком, 1998г. - № 5.

20 Ю.Г. Фролов. Курс коллоидной химии, - М.: Химия, 1982г.

21 Боев А.А. Генетическая инженерия - основние понятия. Биотехнология, - М; 1984г.

22 Толстощев П.А., Ленюк Ж.П. Генная инженерия ибиотехнология. Генетика и наследственность. - М, 1987г.

23 ДСТУ 3008 - 95. Документація. Звіти у сфері науки і техніки. Структура і правила оформлення. Держстандарт Укр., Київ, 1995р.

24 Закон України “Про охорону праці”. Виданий в жовтні 1992р.

25 ГОСТ 12.0003 - 74 ССБТ.Опасные и вредные производственные факторы. Классификация - Введ. 01.01.76г.

26 Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности - М.: Химия, 1976г.

27 ГОСТ 12.1.005 - 88 ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно - гигиенические требования. - Введ. 01.01.89г.

28 Макаров Г.В. и др. Охрана труда в химической промышлености - М.: Химия, 1980г.

29 СНиП 2.04.05.86. Нормы проэктирования. Отопление, вентиляция и кондиционирование воздуха - М.: Стройиздат, 1985г.

30 СниП 2 - 4 - 79. Естественное и искуственное освещение. Нормы проэктирования - М.: Стройиздат, 1980г.

31 ГОСТ 12.1003 - 83 ССБТ Шум. Общие требования безопасности. - Введ 01.01.84г.

32 ГОСТ 12.1012 - 78 ССБТ Вибрация. Общие требования безопасности. - Введ 01.01.80г.

33 Правила устройства электроустановок. Минэнерго СССР - М.: Энергоатомиздат, 1987г.

34 ГОСТ 12.1004 - 76 ССБТ Пожарная безопасность. Общие требования. Введ. 01.07.77г.

35 Е.А. Дмитриенко. Методические указания к выполнению экономической части курсового проэктирования. ХПИ. Харьков, 1993г.

Размещено на Allbest.ru