Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Кафедра Биотехнологии и бионанотехнологии

Учебное пособие

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

А.Б. Пшеничникова

Москва 2010

УДК 574.6 (075.8)

ББК 30.16

Пшеничникова А.Б.

Основы биотехнологии

Учебное пособие

М., МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 2010 - 92 c.: ил.

Утверждено Библиотечно-издательской комиссией МИТХТ им М.В. Ломоносова в качестве учебного пособия.

Поз.253/2010.

Данное учебное пособие представляет собой избранные главы курса лекций «Основы биотехнологии» для подготовки бакалавров по направлению 240100.62 «Химические технологии и биотехнология». В данном издании изложены основные понятия биотехнологического процесса, особенности объектов биотехнологии, их культивировании и использовании, рассматриваются вопросы генетической инженерии.

Рецензент: Д.б.н., г.н.с., проф. Складнев Д.А. (ФГУП ГосНИИГенетика, лаборатория генетики метилотрофных бактерий)

МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 2010 г.

Содержание

• Введение 4
• 1. Предмет и содержание курса 5
• 2. Биологические объекты 8
• 2.1 Классификация живых организмов 8
• 2.2 Вирусы 11
• 2.3 Бактерии 14
• 2.3.1 Таксономия бактерий 14
• 2.3.2 Генетическая изменчивость бактерий 19
• 2.3.3 Рост бактерий 23
• 2.3.4 Бактерии как продуценты в биотехнологии 27
• 2.4 Эукариоты 31
• 2.4.1 Грибы 33
• 2.4.1.1 Строение и классификация грибов 34
• 2.4.1.2 Дрожжи 35
• 2.4.1.3 Мицелиальные грибы 38
• 2.4.2 Простейшие 38
• 2.4.3 Растения 39
• 2.4.4 Животные 41
• 3. Получение продуцентов для биотехнологических процессов 44
• 3.1 Получение продуцентов методами селекции 45
• 3.2 Получение продуцентов методами генетической инженерии 48
• 3.2.1 Теоретические предпосылки генетической инженерии 49
• 3.2.1.1 Термины и определения 49
• 3.2.1.2 Важнейшие достижения молекулярной биологии 50
• 3.2.2 Технология рекомбинантных ДНК (рДНК) 61
• 3.2.2.1 Получение генов, кодирующих целевые белки 61
• 3.2.2.2 Встраивание полученного гена в вектор 64
• 3.2.2.3 Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент 65
• 3.2.2.4 Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген 67
• 3.2.3 Получение рекомбинантного инсулина 68
• 4. Основные этапы биотехнологического процесса 73
• 5. Вопросы для подготовки к зачету 81
• Рекомендуемая литература 84

Введение

Дисциплина «Основы биотехнологии» является первым шагом на пути познания новой области науки - Биотехнологии. Эта новая современная междисциплинарная область связывает биологию и химическую технологию, биохимию и инженерные науки. Синтез биологических и химических наук расширяет возможности промышленной технологии для получения жизненно важных продуктов - препаратов для медицины, пищевых продуктов, биотоплива, экологических технологий. Знания биотехнологии необходимы также специалистам, работающим в области химии полимеров, основного органического и нефтехимического синтеза и других областях химической технологии, поскольку возможности живых систем могут усилить достижения отдельных химических технологий. Создавая новую технологию, современный специалист химик-технолог обязан учитывать возможности живых систем, заложенные природой, для усовершенствования технологий получения самых разных продуктов.

Базовыми знаниями, без которых невозможно освоение курса «Основы биотехнологии» являются знания органической химии, химии биологически активных веществ, биохимии, общей химической технологии, процессов и аппаратов химической технологии.

Настоящее учебное пособие «Основы биотехнологии» базируется на материале предшествующей дисциплины «Основы биохимии», восполняет отсутствующие у студентов 4 курса знания по микробиологии и дает всю необходимую терминологическую базу для освоения ключевого раздела биотехнологии - генетической инженерии.

1. Предмет и содержание курса

Биотехнология (от греческих слов bios - жизнь, teken - искусство, logos - слово, учение, наука) - область науки и практики, основанная на направленном использовании биологических объектов для получения полезных продуктов. Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, простейшие организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека и их метаболиты, в частности биополимеры - ферменты, нуклеиновые кислоты и др.

Термин «биотехнология» был введен в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология - это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». Только в 1961 г. к термину «биотехнология» вновь вернулись после того как шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала «Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology» (Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на «Biotechnology and Bioengineering» (Биотехнология и биоинженерия). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов».

Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической технологии позволяет получать необходимые продукты с использованием свойств микроорганизмов и клеточных культур. Она создает возможность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов важных для жизни и благосостояния людей продуктов. В качестве источников сырья для биотехнологии все большее значение будут приобретать воспроизводимые ресурсы не пищевых растительных материалов, отходов сельского хозяйства, которые служат дополнительным источником как кормовых веществ, так и вторичного топлива (биогаза), органических удобрений.

Биотехнология базируется на интегральном использовании биохимии, микробиологии и инженерных наук в целях промышленной реализации способности микроорганизмов, культур клеток и тканей и их частей. Междисциплинарный характер биотехнологии отражается в сочетанном использовании достижений биологических, химических и технических наук - общей биологии, микробиологии, ботаники, зоологии, анатомии и физиологии, генетики, биологической, органической, физической и коллоидной химии, иммунологии, биоинженерии, электроники, химической технологии и др. Можно выделить следующие основные направления биотехнологии: медицинская биотехнология, биотехнология пищевых продуктов, сельскохозяйственная биотехнология, инженерная энзимология, клеточная и генетическая инженерия, технологическая биоэнергетика, геобиотехнология, экологическая биотехнология (Рис.1).

Дисциплина «Основы биотехнологии» содержит сведения о биологических объектах - биотехнологических продуцентах, способах получения продуцентов с нужными свойствами, в том числе методами генетической инженерии, основных стадиях биотехнологического производства, отдельных технологиях получения важнейших продуктов.



Рис.1. Основные продукты биотехнологической промышленности.

2. Биологические объекты

2.1 Классификация живых организмов

Классификация живых организмов (распределение единиц по группам более высокого порядка) осуществляется по иерархической схеме. Организмы объединяют в группы разного ранга - таксоны - группы организмов, обладающих заданной степенью однородности. Низшей единицей является вид, виды объединяются в роды, далее - семейства, отряды, классы, типы, царства, надцарства (таксоны наивысшего ранга). Разделение живых организмов по царствам и надцарствам основано на наличии у них ядра и клеточного строения (Рис.2). Выделено три надцарства: акариоты (безъядерные, клеточное строение отсутствует), прокариоты (доядерные, присутствует предшественник ядра - нуклеоид, клеточное строение) и эукариоты (ядерные, клеточное строение).

Рис.2. Классификация живых организмов по царствам и надцарствам.

В систематике (систематика - наука о многообразии и взаимосвязях между организмами) используют биномиальную номенклатуру К. Линнея: биологическому виду присваивают название на латинском языке, состоящее из двух слов: первое определяет принадлежность организма к определенному роду, второе -- виду. Пример - кишечная палочка Escherichia coli (обитает в кишечнике человека и животных), родовое название можно сократить до первой буквы - E. coli. В микробиологии используют термин «штамм», объединяющие культуры вирусов, бактерий и других микроорганизмов и линий клеток растений и животных одного вида, выделенные из разных источников (мест обитания). Различия между штаммами не выходят за пределы вида. В мире не существует общепризнанной номенклатуры названия штаммов, и используемые названия достаточно произвольны. Как правило, они состоят из отдельных букв и цифр, которые записываются после видового названия. Например, один из самых известных штаммов кишечной палочки - E. coli K-12.

Представители всех царств используются в биотехнологии, являются биологическими объектами. Традиционная биотехнология базировалась на использовании микроорганизмов. Микроорганизмы - это биологические объекты микроскопического размера, невидимые невооруженным глазом. Термин «микроорганизмы» не имеет таксономического значения, представители микромира есть во всех царствах. Вирусы, бактерии и грибы - все являются микроорганизмами, в царстве растений микроорганизмами являются водоросли, а в царстве животных - простейшие. Основным преимуществом микроорганизмов является их быстрый рост, связанный с высоким отношением поверхности клетки к объему, т.е. с высокой скоростью взаимодействия с внешней средой.

Отличительной особенностью микроорганизмов является способность к быстрому размножению. Например, время удвоения клеток кишечной палочки Escherichia coli составляет 20 мин. Подсчитано, что потомство одной клетки в случае неограниченного роста уже через 48 ч превысило бы массу Земли в 150 раз.

Современная биотехнология все чаще рассматривает в качестве биологических объектов не только микроорганизмы, но и клетки (ткани) растений, животных и человека и их метаболиты, в частности биополимеры.

Биологические объекты продуцируют (производят) важные целевые продукты (все их разнообразие представлено на Рис.1), поэтому их называют продуцентами, наиболее важными из которых в настоящее время являются бактерии и грибы.

Известно множество способов классификации живых организмов по различным признакам. Для промышленной биотехнологии наиболее важной является классификация по способам питания (по трофике) (Табл.1), поскольку вклад исходных продуктов (субстратов) в цену производимых продуктов в биотехнологии является определяющим.

С позиций сегодняшней экономики наиболее рентабельны продуценты, использующие в качестве источников энергии, углерода и доноров электронов соответственно свет и неорганические вещества, т.е. - фотолитоавтотрофы. К этой подгруппе относятся растения и бактерии, например цианобактерии - значительная группа крупных грамотрицательных бактерий, способных к фотосинтезу, сопровождающемуся выделением кислорода, и азотфиксации. Рассматривается возможное применение цианобактерий, в частности спирулины, в создании замкнутых циклов жизнеобеспечения, а также как массовой кормовой или пищевой добавки. К фотоорганогетеротрофам относятся зеленые бактерии (хлоробактерии) - фотосинтетические анаэробные организмы, способны жить в отсутствии атмосферного кислорода. К хемолитоавтотрофам относятся аэробные тиобациллы рода Thiobacillus, они окисляют сульфиды, серу и некоторые из них железо(II), используя углекислый газ в качестве источника углерода. Эти бактерии осуществляют бактериальное выщелачивание металлов из сульфидных руд. Фотолитоавтотрофы и хемолитоавтотрофы растут на доступных питательных неорганических средах, однако применение их ограничено, они не способны продуцировать полезные продукты, кроме биомассы и ограниченного ряда веществ. Большинство продуцентов важнейших биотехнологических продуктов являются хемоорганогетеротрофами, т.е. способны расти на сложных органических питательных средах. Многие из них используют в качестве источника углерода и энергии сахара, органические кислоты, спирты и др. Такие питательные среды дороги, поэтому в биотехнологии часто используются отходы пищевой, целлюлозо-бумажной и других отраслей промышленности, а также сельского хозяйства.

2.2 Вирусы

Вирусы - образующиеся биологическим путем надмолекулярные комплексы, способные к самовоспроизведению в клетках-хозяевах. Вирусы - облигатные паразиты. Их воспроизведение возможно только в клетках-хозяевах. Вне клеток вирусы (вирионы) являются неживыми, имеют правильную форму (Рис.), состоят из молекулы нуклеиновой кислоты (или ДНК, или РНК) и окружающей ее белковой оболочки - капсида. Вирусы специфичны в отношении хозяев. По природе клетки-хозяина вирусы делят на вирусы бактерий - бактериофаги (ДНК, РНК); вирусы растений (РНК); вирусы животных и человека (ДНК, РНК) (Рис.3,4). Внутри клетки вирусная частица становится внутриклеточным паразитом

Рис.3. Форма и величина вирионов некоторых вирусов.

По характеру взаимодействия бактериофага с клеткой все бактериофаги делятся: на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки и умеренные (лизогенные), вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой (Рис.5). Умеренные фаги, в отличие от вирулентных, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ними переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом. Профаг - геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений.

Рис.4. Модель бактериофага Т2. А. Фаг с вытянутым чехлом до адсорбции. Б. Фаг с сократившимся чехлом после адсорбции и инъекции.

Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения бактериальная клетка лизирует и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление - изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага -- называется фаговой, или лизогенной, конверсией (проявление вирус-индуцироанной трансформации).

Исключение фаговой ДНК из бактериальной хромосомы под действием, например мутагенов, приводит к переходу в литический цикл и репродукции фаговых частиц.

Рис.5. Жизненные циклы умеренного фага (на примере фага E.coli): включение ДНК фага в ДНК хозяина и исключение, приводящее к лизису клетки.

Умеренные фаги, неспособные ни при каких условиях переходить из профага в вегетативный фаг (образовывать зрелые фаговые частицы), называются дефектными, чаще это происходит в результате нарушения стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий - трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Наиболее широко вирусы применяют в вакцинном производстве и в генетической инженерии, где они используются в качестве векторов для внесения чужеродной ДНК, несущей нужный ген, в клетку-хозяина.

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования больных людей. Однако чаще всего их используют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Отличительной чертой бактериофагов как терапевтических средств является почти полное отсутствие у них побочного действия. В настоящее время используются бактериофаги: сальмонеллезный, брюшнотифозный, дизентерийный, протейный, синегнойный, холерный, стафилококковый, стрептококковый, коли-фаг (кишечной палочки) и др.

2.3 Бактерии

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. Рассмотрение их будет более подробным. Все бактерии делятся на две группы - эубактерии (собственно бактерии) и архебактерии, имеющие по некоторым данным более раннее происхождение, чем эубактерии. Для большинства архебактерий характерна способность расти в экстремальных условиях - при высоких температурах, низких значениях рН, концентрированных растворах соли. Ряд биохимических свойств сближает архебактерии с эукариотами, есть у них и уникальные свойства, поэтому архебактерии выделены в отдельную группу.

2.3.1 Таксономия бактерий

Бактерии имеют клеточное строение (Рис.6), размер клеток в среднем 1Ч5 мкм. В цитоплазме (клеточное пространство, заполненное водным раствором - цитозолем) находится зона нуклеоида, состоящая на 80% из ДНК, 20% приходится на белки и РНК. Наследственная информация в бактериальной клетке содержится в кольцевой молекуле ДНК - единственной хромосоме, которая не окружена мембраной, т.е. ядро отсутствует. В клетках присутствуют небольшие кольцевые молекулы нехромосомной ДНК - плазмиды, несущие необязательную для выживания клетки информацию. Чаще это гены устойчивости к антибиотикам или способности использовать определенные субстраты. Плазмиды реплицируются автономно от хромосомы.

Рис.6. Схема строения бактериальной клетки.

Цитоплазма окружена важнейшей клеточной структурой - цитоплазматической мембраной, представляющей собой двойной слой липидов, в который погружены интегральные белки (в область одного липидного слоя), периферические белки примыкают к поверхности мембраны, трансмембранные белки пронизывают бислой (Рис.7). Функции цитоплазматической мембраны - транспорт питательных веществ внутрь клетки и продуктов метаболизма наружу, а также получение энергии в виде АТФ. Цитоплазматическая мембрана вместе с цитоплазмой называется протопластом.

В цитоплазме находятся рибосомы - комплексы рибосомальной РНК и белка - на рибосомах происходит биосинтез белка на матрице матричной РНК. В клетках бактерии могут присутствовать включения запасных веществ, выросты цитоплазматической мембраны.



Рис.7. Жидко-мозаичная модель строения плазматической мембраны.

Структуры, расположенные снаружи цитоплазматической мембраны, называются поверхностными структурами. К поверхностным структурам относятся клеточная стенка, капсула, чехол, жгутики, ворсинки (Рис.6). Важнейшим компонентом клетки является клеточная стенка, выполняющая функции пограничного механичного барьера. Все многообразие бактерий по строению клеточной стенки делится на две большие группы, отнесение к которым определяется окрашиванием по Граму. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием животных тканей. Позднее он был использован для бактерий).

Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных) (Рис.8). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Муреин - пептидогликан бактериальных клеточных стенок построен из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, к последнему присоединена тетрапептидная боковая цепь из L-аланина, D-глутаминовой кислоты, L-лизина или мезо-(или LL-)диаминопимелиновая кислоты и D-аланина. Диаминокислоты играют важную роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп. Тетрапептидные боковые связи всех дисахаридных единиц связаны с соседними цепями при помощи поперечных пентапептидных мостиков из глицина. Таким образом, образуется гигантская мешкообразная молекула - муреиновый мешок.

Рис.8. Строение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных бактерий (Б). 1 - цитоплазматическая мембрана, 2 - пептидогликан, 3 - периплазматическое пространство, 4 - наружная мембрана, 5 - цитоплазма (в центре ДНК).

Для быстрой идентификации бактерий используют Определитель бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D.H. Bergey, 1860-1937), девятое издание в 4 томах вышло в 1984-1989 гг. Признаки, по которым осуществляется разделение на группы, следующие:

- морфологические (форма клетки (Рис.9), наличие или отсутствие жгутиков, капсулы, способность к спорообразованию, особенности внутриклеточного строения, окрашивание по Граму);

- культуральные (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры бактерии);

- физиолого-биохимические (способы получения энергии, потребности в питательных веществах, отношение к факторам внешней среды, нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, наличие и характер минорных оснований в ДНК, нуклеотидный состав рибосомальной РНК, последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).

-

Рис.9. Формы бактерий.

А - микрококки, б - стрептококки, в - сарцины, г - диплококки и тетракокки, д - стафилококки, е - палочки, ж - спороносные палочки.

В девятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные к царству бактерий, разделены на 35 групп, относящихся к 4 секциям - 1) Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку (Gracilicutes); 2) Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку (Firmicutes); 3) Эубактерии, не имеющие клеточной стенки (Tenericutes); 4) Архебактерии (Mendosicutes).

Представленная в Определителе бактерий Берги система классификации является строго идентификационной и не решает задачи выявления эволюционных связей между прокариотами. Для установления степени родства между прокариотными организмами разработаны методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Общепринятой мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК. Наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов соответственно. Как показал анализ нуклеотидного состава 16S рРНК, эволюция живых организмов протекала от прокариот к эукариотам, причем эубактерии и архебактерии - отдельные ветви эволюции (Рис.10).

2.3.2 Генетическая изменчивость бактерий

Бактерии размножаются бинарным делением, которому предшествует репликация (удвоение) бактериальной хромосомы. В результате образуются две одинаковые дочерние клетки. При этом дочерние клетки являются полными копиями родительской клетки. Как же осуществляется процесс эволюции у бактерий, ведь меняющиеся условия среды диктуют необходимость изменений и адаптации для сохранения жизнеспособности. Такие изменения могут быть результатом мутаций (мутация - стойкое (то есть такое, которое может быть унаследовано потомками данной клетки или организма) изменение генотипа, происходящие под влиянием внешней или внутренней среды.



Рис.10. Классификация организмов по нуклеотидному составу 16S рРНК.

Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза). Передача генетического материала между бактериями может происходить в результате конъюгации, трансформации и трансдукции (Рис.11).

Конъюгация - направленный перенос генетического материала путем прямого контакта между клетками. ДНК переносится из клетки донора в клетку реципиента через ворсинки F-пили. Биологическая значимость этого процесса стала проясняться после внедрения в медицинскую практику антибиотиков. Устойчивость к антибиотикам можно получить в результате мутации, что происходит один раз на каждые 10⁶ клеточных делений. Однако, однажды изменившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий благодаря конъюгации, поскольку каждая третья из близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса. Для реализации процесса необходим F-фактор - плазмида, кодирующая информацию, необходимую для конъюгации.



Рис.11. Механизмы переноса бактериальной ДНК. Конъюгация (А), трансформация с использованием отдельной молекулы ДНК (Б), трансдукция с помощью фагов (В).

Конъюгация требует наличия двух типов клеток: доноров (F⁺), обладающих F-фактором, и реципиентов (F^-), не обладающих им. При скрещивании клеток F^- и F⁺ фактор фертильности передаётся с частотой, близкой к 100%.

Фактор переноса содержит гены специальных и необходимых при конъюгации структур -- F-пилей и ряд других генов, вовлечённых в процесс взаимодействия с F-клетками.

Первый этап конъюгации -- прикрепление клетки-донора к реципиенту с помощью F-пилей. Затем между клетками формируется конъюгационный мостик, через который передаётся F-фактор, а также и другие плазмиды, автономно пребывающие в цитоплазме донора. При попадании F-фактора в реципиентную клетку она становится F⁺ и приобретает способность передавать фактор фертильности другим F-клеткам. Подобный механизм обеспечивает приобретение популяционной устойчивости к антибактериальным агентам.

Трансформация - передача генов при помощи свободной растворимой ДНК, выделенной из клеток-доноров. Клетки поглощают любую ДНК, но включаться в геном может только ДНК, содержащая последовательности, гомологичные последователям ДНК реципиента. Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Как правило, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами, но при некоторых условиях такая ДНК может быть включена в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, «трансформирующие» реципиента. Подобным путём в популяции могут быть распространены гены, кодирующие факторы вирулентности. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Стадии трансформации бактерии.

Трансформация протекает в три стадии:

1) адсорбция двуцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток;

2) ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов 4-5*10⁶ D;

3) проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5*10⁶ D, сопровождающееся разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.

Трансдукция - передача участков бактериальной ДНК от клетки-донора клетке реципиенту при участии бактериофагов. В клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК могут проникнуть фрагменты бактериальной ДНК или плазмиды. Вирусы ограничены в объёме генетического материала в соответствии с объёмом головки. Если ДНК бактериальной клетки расщепляется фагом в нетипичном месте, то чтобы освободить пространство для фрагмента хромосомной ДНК, некоторые участки вирусных ДНК «приносятся в жертву», что приводит к утере определённых их функций. При этом фаговая частица может стать дефектной. Количество аномальных фагов может достигать 0,3% всей дочерней популяции. Образовавшийся фаг и есть частица, вызывающая неспецифическую (общую) трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены.

2.3.3 Рост бактерий

Для интенсивного роста бактериям необходимы определенные условия: необходимые питательные вещества в соответствии с типом питания в водном растворе, температура, рН среды, кислород воздуха (для аэробных бактерий). Если внести бактерии в питательную среду и создать необходимые условия, они будут расти до тех пор, пока не исчерпаются питательные вещества или образуются ингибирующие рост продукты. Рост клеток без добавок свежей питательной среды и удаления продуктов (кроме воздуха) называют периодической культурой. Зависимость логарифма количества живых клеток от времени называется кривой роста, которая имеет S-образную форму (Рис.12). На кривой роста выделяют несколько фаз., сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания. В лаг-фазе клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, Escherichia coli при 37°С - примерно каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у Nitrosomonas и Nitrobacter - даже 5-10 ч. Концентрация клеток Х экспоненциально зависит от времени (уравнение 1).

(1)

где Х_О - начальная концентрация бактерий (клеток/мл или г биомассы/мл); - удельная скорость роста, ч^-1; t - время культивирования.

Рис.12. Фазы роста бактерий в периодической культуре I- лаг-фаза, II - логарифмическая фаза, III- фаза замедленного роста, IV - стационарая фаза, V - фаза отмирания. Х - концентрация клеток, 10⁶кл/мл.

Удельная скорость роста - параметр, рассчитываемый как отношение скорости прироста биомассы (клеток бактерий) к концентрации биомассы (уравнение 2) и может быть рассчитана как тангенс угла наклона линеаризованной (экспоненциальной) части кривой роста (в полулогарифмических координатах, Рис.11).

(2)

Время генерации t_d (время между делениями клеток) связано с удельной скоростью роста уравнением (3).

(3)

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата - при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за недостатка 0₂ или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. В стационарной фазе достигается динамическое равновесие между гибнущими и лизирующими клетками и бактериями, сохраняющими жизнеспособность за счет продуктов обмена, выделяющихся в результате лизиса.

Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.

Фаза отмирания характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.

Наибольшую концентрацию биомассы, достигаемую в стационарной фазе роста, называют выходом или урожаем (). Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования. Для биотехнолога важно определить время окончания культивирования. Оно зависит от природы и механизма образования целевого продукта. Если целевыми продуктами являются собственно биомасса продуцента, внутриклеточные продукты или внеклеточные продукты, образующиеся параллельно (_актериям) с ростом клеток, наивыгоднейшим (без учета технико-экономических показателей) временем окончания является время, соответствующее максимуму средней продуктивности по биомассе (), приходящееся на время окончания экспоненциальной фазы и резкого замедления роста. Средняя продуктивность биотехнологического процесса - количество целевого продукта, полученного с единицы объема культуральной жидкости в единицу времени (формула 4).

(4)

В некоторых случаях при получении вторичных метаболитов, например антибиотиков, образование целевого продукта начинается по окончании роста клеток и достижения стационарной фазы. В этом случае оптимальное время окончания процесса увеличивается и определяется динамикой продуктивности по конкретному продукту, не связанной с продуктивностью по биомассе. Причем выход целевого продукта пропорционален накоплению биомассы.

В задачи биотехнологии во всех вариантах входит решение следующих основных проблем - сокращения непродуктивной лаг-фазы и продления экспоненциальной фазы. Сокращению лаг-фазы способствует идентичность состава питательной среды инокулята и промышленного процесса, а главное - объем инокулята должен составлять 10-15% объема промышленного культивирования.

Проблема продления экспоненциальной, самой продуктивной, фазы роста является и самой трудной. Здесь важно не допустить исчерпания питательных веществ и своевременно удалять ингибирующие рост продукты метаболизма.

2.3.4 Бактерии как продуценты в биотехнологии

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. С помощью бактерий получают вино, молочные продукты, закваски и другие пищевые продукты, ацетон и бутанол, этанол, уксусную и лимонную кислоты, витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Бактерии участвуют в трансформации стероидных гормонов. Их используют для получения белка и ряда аминокислот. Применение бактерий для переработки отходов в биогаз или этанол даёт возможность создания принципиально новых возобновляемых энергетических ресурсов. Бактерии используют для извлечения металлов (в т.ч. золота), увеличения нефтеотдачи пластов. Благодаря бактериям и плазмидам стало возможным развитие генетической инженерии. Изучение бактерий сыграло огромную роль в становлении многих направлений биологии, в медицине, агрономии и др. Велико их значение в развитии генетики, т.к. они стали классическом объектом для изучения природы генов и механизмов их действия. С бактериями связано установление путей метаболизма различных соединений и др.

Потенциал бактерий в практическом отношении неисчерпаем. Углубление знаний об их жизнедеятельности открывает новые направления эффективного использования бактерий в биотехнологии и других отраслях промышленности.

Производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость - устойчивость к заражению бактериофагами. Примеры использования бактерий в биотехнологии приведены в Табл.2.

Таблица 2. Бактерии - продуценты важнейших биотехнологических продуктов

Бактерии	Субстрат, источник углерода	Продукты
Аэробные бактерии
Acetobacter aceti	Этанол, уксусная кислота	Уксусная кислота
Gluconobacter oxydans	1. Глицерин 2. D-сорбит	1. Диоксиацетон 2. L-сорбоза
Corynebacterium glutamicum	Сахароза (меласса)	L-глутаминовая кислота L-лизин
Streptomyces griseus	Глюкоза, соевая мука	Стрептомицин
Streptomyces erythreus	Глюкоза	Эритромицин
Streptomyces aureofciencs	Сахароза	Тетрациклин
Streptomyces venezuelae	Глицерин	Левомицетин (хлоамфеникол)
Amycolatopsis rifamycinica	Соевая мука	Рифампицин, противотуберкулезный антибиотик
Streptomyces noursei	Глюкоза, соевая мука	Нистатин, противогрибной антибиотик
Bacillus subtilis	Крахмал или кукурузная мука	Амилолитические ферменты
Xanthomonas campestris	Меласса, гидролизаты крахмала	Экзополисахарид ксантан
Micobacterium globiform	Глюкоза	Биотрансформа-ция гидрокорти-зона в преднизо-лон
Alcaligenes eutrophus	Диоксид углерода	Поли-3-гидрок-сибутират, биоразлагаемый полимер
Azotobacter vinelandii	Меласса, гидролизаты крахмала	Альгинат, полисахарид с гелеобразующими свойствами
Zoogloea rumigera, нитчатые бактерии, тионовые бактерии, псевдомонады	Органические вещества в составе сточных вод	Биологическая очистка сточных вод
Факультативные анаэробные бактерии
Lactobacillus bulgaricus	Сахароза (меласса), гидролизаты крахмала	L-молочная кислота
Leuconostos mesenteroides	Сахароза	Декстраны
Генномодифицированные штаммы Escherichia coli	Глюкоза	Инсулин Соматотропин
Propionbacterium freudenreichii Propionbacterium shermanii	Гидролизаты казеина, пептоны	Витамин В12
Анаэробные бактерии
Clostridium acetobuthylicum	Меласса, гидролизаты крахмала, мука	Ацетон, бутанол
Methanococcus, Methanosarcina, Methanobacterium	Низшие жирные кислоты	Биогаз (метан+диоксид углерода)

2.4 Эукариоты

Эукариоты, или Ямдерные (лат. Eucaryota от греч. еэ- - хорошо и кЬсхпн - ядро) - надцарство живых организмов, клетки которых содержат ядра (см. Рис.2). Все организмы, кроме вирусов и бактерий, являются ядерными. В ядре содержится генетическая информация (ДНК) и осуществляются процессы репликации (удвоение молекул ДНК), транскрипции (синтез молекул РНК на матрице ДНК) и процессинг РНК с образованием мРНК (см. раздел 4.2.1). В специальном образовании внутри ядра - ядрышке - происходит синтез рибосомальной РНК (рРНК).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты (простейшие) - все являются эукариотическими организмами. Они аэробны, могут быть одноклеточными и многоклеточными, но все имеют общее строение клеток. В отличие от клеток бактерий у эукариотов в клетках присутствуют органеллы, отделенные от цитоплазмы одной или двумя мембранами. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. Одна мембрана ограничивает эндоплазматический ретикулум (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы. Такое выраженное подразделение цитоплазмы на множество обособленных пространств называется компартментализацией. Ряд клеточных органелл (рибосомы, центриоли) не окружены мембранами.

Митохондрии - важнейшие органеллы, в которых осуществляется окисление органических веществ до диоксида углерода и воды и аккумулирование выделяющейся энергии в виде АТФ. У растений также присутствуют пластиды, например хлоропласты - пластиды зелёного цвета, содержащие хлорофилл. В хлоропластах происходит фотосинтез.

Эндоплазматический ретикулум образует в цитоплазме каналы, по которым осуществляется транспорт веществ. ЭР, примыкающий к ядру, покрыт рибосомами, белковонуклеиновыми комплексами, в которых осуществляется синтез мембранных белков, и называется шероховатым. ЭР без рибосом называют гладким.

Лизосомы - контейнеры с гидролитическими ферментами, пероксисомы - контейнеры с ферментом каталазой, разрушающей пероксид водорода.

Рис.13. Строение типичной клетки животного. Отмеченные органеллы: 1. Ядрышко 2. Ядро 3. Рибосома 4. Везикула 5. Шероховатый эндоплазматический ретикулум 6. Аппарат Гольджи 7. Клеточная стенка 8. Гладкий эндоплазматический ретикулум 9. Митохондрия 10. Вакуоль 11. Гиалоплазма 12. Лизосома 13. Центросома (Центриоль)

Аппарат Гольджи - органеллы в виде стопки сплющенных цистерн, от которых отделяются пузырьки и перемещаются к внешней мембране и сливаются с ней (экзоцитоз). Аппарат Гольджи (комплекс Гольджи) -- мембранная структура эукариотической клетки, органелла, в основном предназначенная для выведения веществ, синтезированных в эндоплазматическом ретикулуме. Аппарат Гольджи был назван так в честь итальянского учёного Камилло Гольджи, впервые обнаружившего его в 1898 году.

В цитоплазме эукариот содержится цитоскелет - система длинных полых структур, придающий клеткам форму, служит местом прикрепления органелл.

Сравнение про- и эукариотов представлено в Табл.3.

Таблица 3. Сравнение прокариотов и эукариотов

2.4.1 Грибы

Грибым (лат. Fungi или Mycota) -- особая форма жизни, царство живой природы, объединяющее эукариотические организмы, сочетающие в себе некоторые признаки как растений, так и животных. Они играют важную роль в биосфере, разлагая всевозможные органические материалы. Грибы - важнейшие продуценты в биотехнологии.

Изучение грибов - это предмет науки микологии. Грибы относятся к эукариотам, они растут в аэробных условиях и получают энергию путем окисления органических веществ, как и животные. Также они имеют клеточную оболочку, состоящую из хитина. С растениями их сближает ряд общих признаков: наличие клеточной стенки и вакуолей, заполненных клеточным соком, апикальный рост, хорошо видимое под микроскопом движение протоплазмы, неспособность к активному перемещению. В отличие от растений грибы не способны к фотосинтезу и слабо дифференцированы морфологически, у них почти нет разделения функций между разными частями организма.

2.4.1.1 Строение и классификация грибов

К грибам относятся истинные слизевики (миксомицеты), низшие грибы (фикомицеты) и высшие грибы (собственно грибы или эумицеты) (Табл.3).Тело гриба состоит из тонких (диаметром около 5 мкм) нитей, называемых гифами, которые, переплетаясь, образуют мицелий. В зависимости от строения гифов грибы подразделяют на низшие и высшие (Рис.14).

Рис.14. Вегетативные гифы грибов: А -у фикомицетов гифы несептированные(не имеют поперечных перегородок); Б - септированные гифы эумицетов; В - у оомицетов гифы разделены неполными перетяжками.

Гифы грибов растут путем удлинения кончиков (апикальный рост). Различают два способа размножения грибов - половое и бесполое. Большинство грибов размножаются обоими способами. Бесполое размножение осуществляется обычно при помощи спор, путем почкования или фрагментации. Наиболее широко распространено спорообразование. На концах гиф отшнуровываются конидиоспоры и дают начало новому организму.

Половое размножение у грибов включает слияние двух ядер, образование зиготы и мейоз или редукционное деление, при котором число хромосом уменьшается до исходного (гаплоидного).

Наибольшее значение для биотехнологии имеют одноклеточные грибы - дрожжи и мицелярные - плесневые грибы.

2.4.1.2 Дрожжи

Дрожжи - внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Объединяет около 1500 видов, относящихся к аскомицетам и базидиомицетам.

Дрожжи относятся к царству грибов (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes), наилучшие углеводные субстраты для них - сахароза, глюкоза. Дрожжи встречаются в природе всюду, где есть поддающиеся сбраживанию сахаристые соки - на фруктах, на листьях, цветках, содержатся в почве, водоемах, пищеварительном тракте человека. Большинство дрожжей - сапрофиты, но встречаются и патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикоза человека из рода Candida.

Для дрожжей характерно бесполое размножение почкованием. При этом на материнской клетке образуется выпуклость - почка, в которую переходит 1 ядро, после чего почка отшнуровывается.

Дрожжи рода Saccharomyces способны к спиртовому брожению - в отсутствии кислорода они используют органические вещества в качестве акцепторов электронов и продуцируют этанол. В качестве источников углерода сахаромицеты утилизируют простые сахара, поэтому для использования доступных субстратов - крахмала, зерна - их гидролизуют ферметнами (амилазами).

Рис.15. Строение дрожжевой клетки:

Кст - клеточная стенка;

Мит - митохондрия;

Ж - жировая капелька;

ПМ - плазматическая мембрана;

Яш - ядрышко;

ЭР - эндоплазматический ретикулум;

П - гранулы полифосфата.

Д - диктиосомы, одна из форм аппарата Гольджи.

Спиртовое брожение лежит в основе таких промышленных процессов как виноделие, пивоварение, хлебопечение.

Дрожжи богаты белками, их содержание может доходить до 66 %, при этом 10 % массы приходится на незаменимые аминокислоты. Дрожжевая биомасса может быть получена на отходах сельского хозяйства, гидролизатах древесины, её выход не зависит от климатических и погодных условий. Поэтому её использование чрезвычайно выгодно для обогащения белками пищи человека и корма сельскохозяйственных животных.

Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris успешно применяют в качестве систем экспрессии эукариотических белков в генетической инженерии. биотехнология междисциплинарный генетическая инженерия

2.4.1.3 Мицелиальные грибы

Важнейшими представителями мицелиальных грибов являются грибы родов Penicillium, Aspergillus и некоторые другие. Плесени продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и другие), органические кислоты лимонную, глюконовую, щавелевую, итаконовую, фумаровую (Aspergillus niger) и антибиотики - пинициллины, цефалоспорины (грибы родов Penicillium и Cephalosporium). Антибиотик гризеофульвин продуцирует нитчатый гриб Penicillium griseofulvum, антибиотик трихотецин - грибом Trichothecium roseum. Плесневые грибы применяют и в производстве сыров, например, камамбера и рокфора (грибы рода Penicillium), соевого соуса (Aspergillus oryzae).

2.4.2 Простейшие

Простейшие (Protozoa) - это одноклеточные животные организмы, их рассматривают в курсах зоологии, но благодаря своим микроскопическим размерам они являются объектом микробиологии. Простейшие являются самими многочисленными представителями мира животных и характеризуются чрезвычайным разнообразием форм и поведения. Среди них есть и фотосинтезирующие организмы (эвглена), и хищники, поглощающие за счет фагоцитоза бактерии или других простейших. Некоторые из них быстро плавают в воде, другие - прикрепляются к другим объектам.

Практическое значение простейших связано с тем, что многие из них являются возбудителями болезней человека и животных, например плазмодий малярии, дизентерийная амеба. Для биотехнологии важно, что простейшие являются важнейшим компонентом активного ила (активный ил - естественно возникший биоценоз в аэрируемых очистных сооружениях - аэротенках и биофильтрах). Поглощая большое количество бактерий, простейшие способствуют выходу бактериальных экзоферментов, концентрирующихся в слизистой оболочке и тем самым принимать участие в деструкции загрязнений. В активных илах встречаются представители четырех классов простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории (Mastigophora), реснитчатые инфузории (Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria).

Показателем качества активного ила является коэффициент протозойности, который отражает соотношение количества клеток простейших микроорганизмов к количеству бактериальных клеток. В высококачественном иле на 1 миллион бактериальных клеток должно приходиться 10-15 клеток простейших.

Простейшие обладают разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе. Использование простейших в этом направлении уже началось.

2.4.3 Растения

Растения (царство Plantae) как объект биотехнологии рассматривает раздел биотехнологии - фитобиотехнология. В отличие от растениеводства - отрасли сельского хозяйства, фитобиотехнология оперирует с клетками и тканями растений, а также с биологически активными молекулами растительного происхождения. Интересно, что в культуре растительные клетки являются хемогетеротрофами.

Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Для культивирования используют клетки каллуса - неорганизованной массы дифференцированных растительных клеток.

Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Скорость размножения растительных клеток невелика - время удвоения их числа равно 1-3 суткам, тогда как время удвоения бактерий или дрожжей обычно 20-30 мин. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности (алкалоиды кодеин, хинин, атропин, винкристин, сердечный гликозид дигоксин, стероид диосгенин и другие). В настоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств, синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный - источник диосгенина, диоскорея дельтовидная - стероидные гликозиды, равольфия змеиная - продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д.

Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений: