Для стерилизации оборудования применяют термическую стерилизацию паром под давлением 1 ати (121^оС).

Подготовка инокулята.

Для сокращения лаг-фазы (непродуктивной фазы задержки роста, см. раздел 3.3.3) количество посевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объема среды культивирования в нем. Накопление производственной культуры проводят за 2 - 6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м³

Ферментация.

Культивирование (ферментация) является основной стадией биотехнологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства продуктов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, такой способ культивирования называют поверхностным.

При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной аэрации и перемешивания.

Аппараты для глубинного культивирования называют ферментерами (ферментаторами), конструкции их очень разнообразны. На Рис.31 представлен ферментер для периодического культивирования - питательная среда и все компоненты загружаются сразу и до окончания культивирования в ферментер ничего не добавляется и не выводится (кроме воздуха - источника кислорода). Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (несколько суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента. Ферментеры такой конструкции изготавливают объемом от 1,25 до 160,0 м³. Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментер через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки.

Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают стерильную питательную среду, вносят посевной материал, включают систему аэрации и перемешивающее устройство.

Рис.31. Ферментер периодического действия: 1- турбинная трехъярусная мешалка, 2 - охлаждающий змеевик, 3 - секционная рубашка, 4 - отражательная перегородка, 5 - барботер, П-пар; I -XI - материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I - посевная линия, II - подача стерильного сжатого воздуха, III - подача пара, IV - удаление отработанного воздуха, V - загрузочная линия, VI - линия введения добавок, VII - подача пеногасителя, VIII - подача моющего раствора, IX - пробоотборник, X - выдача продукта, XI - выдача в канализацию через нижний спуск).

Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С. Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.

Процесс культивирования контролируют по следующим параметрам - температура, давление, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса). В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры.

Выделение и очистка продукта.

Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многокомпонентную систему. В водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, неутилизированные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира, пузырьки воздуха, мел. В свою очередь водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое число органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости - до 17% и более. Содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8-10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1,5%, что составляет менее 10% сухого остатка. В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и др.) используются схемы производства различной степени сложности, при этом учитывают и место накопления целевого продукта - внутриклеточно, в биомассе или внеклеточно - в культуральной жидкости.

При локализации продукта в биомассе для ее выделения применяют такие методы, как седиментацию и декантацию, фильтрование, центрифугирование, отстаивание, флотацию. Если целевым продуктом является внеклеточный метаболит, его выделяют из культуральной жидкости методами экстракции, сорбции, осаждения, хроматографии, с применением мембранных методов - ультрафильтрации, диализа, обратного осмоса.

5. Вопросы для подготовки к зачету

1. На какие науки опирается, и по каким направлениям развивается биотехнология?

2. Основные цели и задачи биотехнологии.

3. Какие методы используют биотехнологи для достижения целей и задач биотехнологии?

4. Отличие биотехнологии от традиционной химической технологии.

5. Объекты (продуценты) биотехнологических исследований.

6. Биотехнологический процесс и его компоненты.

7. Основные этапы биотехнологического производственного процесса.

8. Приведите примеры наиболее часто используемых в биотехнологических производствах микроорганизмов-продуцентов. Какие продукты с их помощью получают?

9. Классификация живых организмов по царствам и надцарствам.

10. Какие организмы-эукариоты относят к микроорганизмам?

11. Какие организмы относят к микроорганизмам? Их преимущества при использовании в качестве продуцентов в биотехнологическом процессе?

12. Чем занимается наука систематика (таксономия)?

13. Перечислите основные различия между прокариотами и эукариотами. Подробно объясните различия, касающиеся а) формы клеток, б) локализации генетического материала.

14. Классификация микроорганизмов по способам питания (по трофике). Приведите примеры.

15. Способы питания животных и растений. Чем они отличаются?

16. Цели и принципы культивирования дифференцированных клеток человека и животных in vitro.

17. Систематика (таксономия) микроорганизмов. Систематические категории.

18. Что такое систематика (таксономия) микроорганизмов? С помощью каких признаков описываются таксономические категории?

19. Биотехнологическое производство, его преимущества перед традиционными технологическими процессами?

20. Общие структурные компоненты клетки.

21. Строение животной и растительной клеток. Общее и различия. Какие органеллы этих клеток имеют двойные мембраны?

22. Классификация бактерий по Берги.

23. Окраска по Граму и строение клеточной стенки бактерий.

24. Селекция и генетическая инженерия, определения.

25. Вирусы. Живые ли они? (если «да» или «нет», то почему?). Их место в классификации всех организмов по царствам и надцарствам.

26. Альтернативные пути репликации вирусов (на примере бактериофага l).

27. Понятие о вирулентных и умеренных фагах.

28. Генетическая инженерия микроорганизмов. Основная цель и этапы работы.

29. Генно-инженерные методы получения инсулина.

30. Генетическая инженерия микроорганизмов. Перечислите основные этапы работы.

31. Строение гена и биосинтез белка в прокариотической клетке.

32. Строение гена и биосинтез белка в эукариотической клетке

33. Методы конструирования продуцентов - селекция и генно-инженерный подход.

34. Понятия: промотор, терминатор, транскриптон, оперон.

35. Генетическая инженерия (ГИ). Этапы конструирования продуцентов (сверхпродуцентов) методами ГИ.

36. Выбор микроорганизма-продуцента, методы получения генов - из ДНК биологического источника, химико-ферментативные способы получения генов.

37. Метод получения генов на основе м-РНК.

38. Конструирование векторов для клонирования на основе плазмид, фага l.

39. Клонирование в космидах.

40. Рестриктазы, классы рестриктаз. Примеры использования рестриктаз.

41. Методы трансформации ДНК.

42. Особенности транскрипции и трансляции прокариот и эукариот.

43. Ген и его экспрессия.

44. Селекция, традиционные методы. Генетическая инженерия (определение).

45. Селекция и генетическая инженерия. Ограничесния применения методов селекции в биотехнологии.

46. Пиведите примеры белков эукариот, получаемых клонированием генов в микроорганизмах.

47. Принципиальная схема биотехнологического производства.

48. Субстраты и продукты биотехнологических процессов.

49. Состав питательных сред для культивирования продуцентов.

50. Что представляет собой инокулят и как его получают?

51. Методы стерилизации питательных сред, оборудования и воздуха.

52. Методы культивирования продуцентов в биотехнологии.

53. Методы выделения и очистки продуктов в биотехнологии.

54. Конструктивные особенности ферментеров для глубинного культивирования.

Рекомендуемая литература

Основная:

1. Елинов Н.П. Основы биотехнологии/ Н.П. Елинов.- СПБ.: Наука 1995. 600с.

2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1988.

3. Биотехнология. В 8 кн. под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. - М.: Высшая школа. 1987-1988 гг.

4. Биотехнология. Принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. - М.: Мир.1988. 479с.

5. Шлегель Г. Общая микробиология. -М.: Мир. 1987. 566с.

6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2000. - 456 с.

Дополнительная:

7. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х т. - М.: Мир, 1988.

8. Егорова Т.А. Основы биотехнологии. Учеб. пособие для вузов. - М.: Академия, 2005. - 208 с.

9. Дерябин Д.Г. Функциональная морфология клетки. Учебое пособие. М.: УНИВЕРСИТЕТ Книжный дом. 2005. 317с.

10. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с анг./Под ред. ДЖ.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж. Стейли, С.Уилльямса - М.: Мир, 1997. - 800с.

11. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.: Бином-Пресс, 2004.

12. Промышленная микробиология/ ред. Н.С. Егорова.- М.: Высшая школа, 1989.- 688с.

13. Виестур У.Э. Системы ферментации/ У.Э. Виестур, А.М. Кузнецов, В.В. Савенков.- Рига: Зинатне, 1986.- 174с.

14. Манаков М.Н. Теоретические основы технологии микробиологических производств/, Д.Г. Победимский - М.: Агропромиздат, 1990.- 272 с.

15. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. Учеб пособие для вузов. - М.: Колосс, 2004. - 296 с.;

16. Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. Акад. РАСХН С. Шевелухи. - М.: Высшая школа, 2003. - 265 с.

17. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа, 1990 г., 296 с.

18. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар. 2000. 512 с.

19. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. В 2-х томах. М.: Мир, 1989.

20. Живухина Е.А., Загоскина Н.В., Калашникова Е.А., Назаренко Л.В. Биотехнология: теория и практика. М.: Оникс. 2009. 496с.

Издание учебное.

Пшеничникова Анна Борисовна.

Основы биотехнологии.

Учебное пособие.

Подписано в печать_______ Формат 60х84/16. Бумага писчая. Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1.

Тираж 200 экз.

Заказ № ____________

Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр.

119571 Москва, пр. Вернадского 86.

Размещено на Allbest.ru