1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

- традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

- культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации).

2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

5. Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

2.4.4 Животные

То, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, стало понятно в начале XX века, когда смогли получить и поддерживать первые клеточные культуры.

Изначально культуры клеток животных применяли для выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Есть вирусы, которые можно размножать в эмбрионах куриного яйца, но их спектр очень невелик. Совершенствование методик культивирования клеток животных позволило использовать их для накопления больших количеств вирусного материала с целью производства из него вакцин. Сейчас же стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию, а также подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получают из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости одинаковы. Первое - дает возможность получения трансгенных клеток, тканей или организмов, второе - незаменимо для получения моноклональных антител.

Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток (Табл.5).

Таблица 5. Получение биотехнологических продуктов в культуре животных клеток

Продукт	Клетки или их источник
Гормон роста	Опухоль гипофиза
Коллаген	Фибробласты
Кортикостероиды	Опухоль надпочечника
Гистамин	Опухоль из тучных клеток
Меланин	Меланома радужной оболочки сетчатки
Мукополисахариды	Фибробласты
Фактор роста нервной ткани	Нейробластома

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.

В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты.

Основные этапы гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов - гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10-30 мг/мл моноклональных антител.

Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение. Таким образом, клеточная инженерия является эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.

3. Получение продуцентов для биотехнологических процессов

При создании промышленных штаммов-продуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах, возможны разные подходы. Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природной среды. Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры, то есть содержащей микроорганизмы одного вида, с дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением изолированного микроорганизма и определением его способности продуцировать нужный продукт. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов. Это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта является способность синтезировать целевой продукт и, главное, - уровень продукции. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые являются очень важными. Микроорганизмы должны: обладать высокой скоростью роста; утилизировать необходимые для их жизнедеятельности доступные субстраты; быть резистентными к посторонней микрофлоре. Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Однако такие продуценты («дикие» штаммы), как правило, не обладают способностью к сверхпродукции, которая делает производство прибыльным.

Для того чтобы извлечь из потенциала микроорганизмов все наиболее ценное, используют методы воздействия на геном, существенно расширяющие их производственные возможности - селекцию и мутагенез, а также генетическую инженерию.

3.1 Получение продуцентов методами селекции

Традиционно для получения более активных биологических агентов - продуцентов - применяли селекцию и мутагенез. Селекция - это направленный отбор мутантов - организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции - это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов.

Для изменения природных способностей микроорганизмов используют изменения генотипа - мутации, приводящие к усилению природных способностей микроорганизмов синтезировать и продуцировать нужные вещества, а также синтезировать вещество в избытке - сверх своих потребностей и продуцировать его. Мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих основных изменениях метаболизма клеток:

1) повышение скорости поглощения и утилизации субстрата;

2) повышение уровня синтеза и активности ферментов, участвующих в синтезе продукта;

3) блокирование синтеза побочных продуктов;

4) блокирование дальнейшего превращения продукта;

5) обеспечение экскреции (выделения) продукта из клетки.

Чаще требуется сочетание нескольких мутаций для сверхсинтеза продукта.

Мутации могут быть неконтролируемыми (спонтанными) и контролируемыми (индуцируемыми). Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 10⁶-10⁸, чтобы возникала мутация. К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома в десятки и тысячи раз). Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ультразвук, ряд химических соединений. К последним относятся окислители, способствующие окислительному дезаминированию азотистых оснований (азотистая кислота, гидроксиламин, перекись водорода), азотистые основания, ингибирующие синтез нуклеиновых кислот и приводящие к ошибкам включения (2-аминопурин, 5-бромурацил, 5-аминоурацил), алкилирующие агенты (металлоорганические соединения, формальдегид, этиленимин, диметилсульфат, нитрозогуанидин, нитрозоэтилмочевина). Применяют и биологические мутагены - вирусы, биотоксины.

Основные этапы селекции

1. Выбор исходного штамма для селекции

Выбирают природные продуценты нужных веществ или микроорганизмы, не продуцирующие нужные вещества, но обладающие другими ценными свойствами.

2. Подготовка исходного штамма к селекционной работе: ассе исходного штамма на чашки Петри, отбор колоний типичной формы с высокой продукцией целевого вещества.

3. Получение и отбор мутантов.

Мутагенами обрабатывают водные суспензии клеток в буферных растворах при оптимальном значении рН и заданном времени экспозиции. Дозу химического мутагена выбирают, ориентируясь на выживаемость микроорганизмов - отношение количества колоний, выживших после обработки мутагеном к контрольному количеству колоний, в %. Используют дозы, обеспечивающие выживаемость от 0,1 до 5-80%.

4. Отбор мутантов

а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по количественному признаку.

После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку. Работа эта требует больших трудозатрат и времени.

При открытии антибиотиков более 60 лет назад этот метод был единственно возможным. Классический пример такой селекции - получение современного продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum с применением физических и химических мутагенов. Штамм, выделенный А. Флемигом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц пенициллина в 1 мл культуральной жидкости (КЖ). Воздействие УФ-излучения и алкилирующих агентов позволило в 1960 г. передать в производство штамм, продуцирующий 5000 единиц и более в 1 мл КЖ. Сейчас используют штаммы с продукцией более десятков тысяч единиц/мл.

б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.

Фенотип (от греческого слова phaino - являю, обнаруживаю) - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития. Фенотип складывается в результате взаимодействия наследственных свойств организма (набора генов) - генотипа - и условий среды обитания. Этот метод используется, если известны пути синтеза и регуляции нужного вещества. Наиболее часто рассматривают следующие фенотипические варианты - морфологические изменения, резистентность к структурным аналогам метаболитов, резистентность к антибиотикам, наличие ауксотрофии (ауксотрофия - потеря организмом способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов и появление у такого организма дополнительных питательных потребностей). У мутантов с определенным фенотипом вероятность появления сверхпродуцентов резко возрастает, что уменьшает трудоемкость селекционной работы.

3.2 Получение продуцентов методами генетической инженерии

Ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или продуцентов практически ценных микроорганизмов:

1) нельзя скрещивать неродственные виды;

2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

3) нельзя предугадать, какое получится потомство.

Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.

Альтернативой классической селекции в получении организмов с заданными свойствами является генетическая инженерия, предмет которой - рекомбинация хромосом или отдельных генов вне организма, в пробирке (in vitro). Таким образом, преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры. Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro.

Возможности генетической инженерии:

1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.

2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.

3. Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

Прежде, чем перейти к изучению основных методов генетической инженерии, целесообразно рассмотреть общие принципы процесса и специальную терминологию.

3.2.1 Теоретические предпосылки генетической инженерии

3.2.1.1 Термины и определения

Ген - структурная единица наследственности - участок ДНК, кодирующий структуру определенного белка или РНК.

Репликон - единица генома , способная к автономной репликации ДНК; содержит точку инициации репликации.

Экспрессия генов -- это процесс, в котором наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт -- РНК или белок.

Транскриптон - участок ДНК, подвергающийся транскрипции.

Кодон - триплет нуклеотидов, кодирующий отдельную аминокислоту.

Генетический код - соответствие кодонов определенным аминокислотам.

Оперон - комплекс функционально связанных структурных генов и оператора.

Генная инженерия или техника рекомбинантных ДНК - конструирование in vitro (в пробирке) функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) путем переноса генетического материала из одного организма в другой.

Плазмида - кольцевая двухцепочечная внехромосомная ДНК, способная к автономной репликации.

Вектор - самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, например, бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии для переноса генов, часто в некотором числе копий) от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей (клонирующий вектор).

Клон - популяция клеток, идентичных родительской клетке.

Клонирование в биологии - это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена.

3.2.1.2 Важнейшие достижения молекулярной биологии

Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно. А что если попытаться проводить рекомбинацию хромосом или отдельных генов вне организма (in vitro), в пробирке? Первые удачные эксперименты такого рода проведены в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.

Фундаментальной базой генной инженерии явились открытые ранее механизмы экспрессии генов, внехромосомные молекулы ДНК - плазмиды, ферменты, позволяющие проводить рекомбинацию генов.

1. Молекулярные механизмы матричного синтеза.

Подробно механизмы матричного синтеза (репликации, транскрипции и трансляции рассматриваются в курсе «Основы биохимии»). Здесь мы коротко приведем основные положения.

Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией ДНК (ДНК ДНК). Репликация осуществляется полуконсервативным путем на каждой из двух родительских цепей. Фермент - ДНК-зависимая ДНК-полимераза - синтезирует нить ДНК, комплементарную родительской цепи (называемой матрицей), последовательно присоединяя к 3'-концу растущей цепи дезоксирибонуклеотиды, комплементарные дезоксирибонуклеотидам матрицы. В процессе репликации родительская двухцепочечная ДНК расплетается, образуя репликативную вилку. Для того, чтобы ДНК-полимераза могла начать синтез, необходимо существование готового фрагмента ДНК или РНК, комплементарного матрице и содержащего свободную 3'-ОН-группу. Этот фрагмент называют затравкой (праймером).

Процесс биосинтеза РНК в клетке называется транскрипцией ДНК (ДНК РНК). Транскрипция осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые используют ДНК в качестве матрицы. Цепь РНК растет в направлении 5'3'. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы способны к самостоятельной инициации синтеза РНК. Место инициации определяется специальными регуляторными участками ДНК - промоторами. Терминация синтеза также происходит на специальных участках ДНК - терминаторах. В клетках бактерий РНК синтезируется сразу в зрелом виде - в виде мРНК (матричная РНК), а у эукариотов - в виде предшественника мРНК, который должен подвергнуться процессингу - ферментативным превращениям, в результате которых образуется зрелая мРНК. Процессинг включает кэпирование (присоединение к 5'-концевому метилированному звену предшественника мРНК 7-метилгуанозина), полиаденилирование (присоединение к 3'-концу сегмента поли(А)), сплайсинг РНК (вырезание интронов и соединение экзонов - кодирующих последовательностей - в непрерывную последовательность).

Трансляция (мРНК белок) - многоступенчатый процесс синтеза белка согласно информации, заключенной в последовательности нуклеотидов мРНК. Трансляция осуществляется на клеточных органоидах - рибосомах, которые представляют собой нуклеопротеиды, в составе которых рибосомальная РНК (рРНК) и белок. При инициации происходит специфическое связывание рибосомы с мРНК и с первой аминоацил-тРНК, в результате чего образуется комплекс, способный к синтезу белка. При элонгации осуществляется последовательное связывание аминоацил-тРНК с образованием пептидных связей по программе, задаваемой последовательностью кодонов в мРНК. Терминация представляет собой отщепление готового белка от трансляционного комплекса. В ходе трансляции нуклеотидная последовательность мРНК считывается в направлении от 5'- к 3'-концу. Считывание происходит по законам генетического кода, согласно которым каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов (кодон), каждый кодон кодирует только одну аминокислоту, а последовательность кодонов мРНК определяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Функцию узнавания кодона осуществляет не сама аминокислота, а молекула транспортной РНК (тРНК), к которой она присоединена и которая содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную кодону - антикодон.

2. Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК.

Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.

Рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 - 6 пар нуклеотидов (сайты узнавания) и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис.16), а во втором - стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются «липкими», поскольку они могут как бы слипаться между собой в силу комплементарности. Примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично между нуклеотидами Г и А (рис.17). В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы соединяются водородными связями. Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу «липкие концы» (рис.17).

Рис. 16. а) схема действия фермента рестриктазы SmaI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с тупыми концами после разрезания ферментом SmaI.

Рис. 17. а) схема действия фермента рестриктазы EcoRI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoRI.

Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть «сшивает» между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.

Номенклатура рестриктаз базируется на названии микроорганизма, из которого она была впервые выделена. Первая прописная буква в обозначении рестриктазы соответствует первой букве названия рода, а последующие две или три строчные буквы берутся из первых букв названия вида этого микроорганизма. Далее может приводиться название штамма и, наконец, римская цифра обозначает порядковый номер фермента, отражающий хронологию его выделения из данного организма. Несколько рестриктаз и их сайты узнавания представлены в таблице 6.

Таблица 6. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности.

Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

3. Векторы для экспрессии и клонирования.

В качестве векторов, способных переносить в клетку-реципиент генетическую информацию, чаще используют плазмиды и бактериофаги.

Плазмидные векторы.

Внехромосомные двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-200 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в клетке, называются плазмидами. Плазмиды, как правило, присутствуют у бактерий и являются кольцевыми молекулами, хотя у некоторых растений и грибов известны линейные плазмиды. Плазмиды выполняют разнообразные функции. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации ORI, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.

На Рис. представлена генетическая карта плазмиды рВR322. Это одна из наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву «р» (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 -- цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 -- 41 т.п.н.



Рис.18. Генетическая карта плазмиды pBR322.

Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику. Таким образом, вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, требования, предъявляемые к векторам, включают: 1. Способность реплицироваться в клетке-хозяина; 2. Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации; 3. Легкость введения в клетку-хозяина; 4. Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор; 5. Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.

Бактериофаг в качестве вектора.

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Для клонирования более крупных фрагментов были разработаны векторы на основе бактериофага . Этот фаг является умеренным фагом E.coli К-12, содержащим двухцепочечную ДНК размером 48500 п.н. с одноцепочечными 5'-»хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами.

Примерно у 30% фаговых частиц ДНК интегрируется с бактериальной хромосомой и реплицируется вместе с ней (состояние лизогении, см. раздел 3.2).

Рис.19. Строение бактериофага

За способность к лизогении отвечает фрагмент около 20 т.п.н. Если этот фрагмент заменить фрагментом другой ДНК (кодирующей целевой белок), образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага , вставшего на литический путь развития.

В частицы фага можно упаковать 37-52 т.п.н. Учитывая размер «плеч» 15 т.п.н., размер вставки около 15 т.п.н. (Рис.19). Схема клонирования ДНК с использованием фага представлена на Рис.20.



Рис.20. Схема клонирования ДНК с использованием фага в качестве вектора.

Векторы космидные и фазмидные

Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Этого недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами.

Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага лямбда. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid) Рис. 21.

Рис.21. Космидный вектор для клонирования ДНК.

Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов лямбда-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 10⁵-10⁶ колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2-4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.

Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.

3.2.2 Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)

Этапы генетического конструирования in vitro (Рис.22 ):

1. Получение нужного гена;

2. Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;

3. Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli;

4. Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;

5. Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.

6. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.

3.2.2.1 Получение генов, кодирующих целевые белки

Получение генов для экспрессии в клетках прокариот и эукариот возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментативным синтезом или ферментативным синтезом на основе выделенной матричной РНК (мРНК).

Выделение нужных генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать рестриктазы для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Для соединения фрагментов ДНК используют также линкеры и адапторы. Линкер - это синтетический короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания ряда рестриктаз. Он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью рестриктазы. Например, линкер EcoR1 представляет собой d ^5'(ГГААТТЦЦ)^3'. Адаптор - это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, то есть адаптор предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами.

Рис.22. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках.

Химико-ферментативный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного соединения нуклеотидов, обычно 8-16-звенных, которые затем с помощью ферментов нуклеинового обмена (ДНК-лигаза, ДНК-полимеразы и др.) превращаются в двухцепочечные фрагменты ДНК. В настоящее время такой синтез осуществляют в автоматических синтезаторах олигонуклеотидов по заданной программе.

Ферментативный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК).

Наиболее актуальным в биотехнологии является получение эукариотических белков, таких как инсулин, интерфероны, соматотропин, с использованием прокариотических продуцентов, растущих быстро и использующих доступные субстраты. Проблема экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот заключается в сложном строении эукариотических генов, которые содержат участки, кодирующие белки (экзоны) и интроны - неинформативные участки, вырезаемые после транскрипции в процессе сплайсинга РНК. Поскольку у прокариот механизм сплайсинга отсутствует, для получения нужного гена используют мРНК, содержащую только информативные участки. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования, представлена на Рис.23.

Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3'-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.



Рис.23. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования.

Этот метод является в настоящее время наиболее распространенным методом получения эукариотических генов для экспрессии их в клетках прокариот.

3.2.2.2 Встраивание полученного гена в вектор

Рассмотрим процесс получения бактериального штамма, способного к экспрессии чужеродного (например, эукариотичекого) гена. Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой BamH1, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в гене устойчивости тетрациклину, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной (чужеродной) ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК (Рис.24). Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены осуществляют уже после клонировании в клетках E. coli.

Рис.24. Схема встраивания клонируемых фрагментов ДНК в плазмиду pBR322.

3.2.2.3 Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент

Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Для клонирования ДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ. Permission - разрешение). Особенности пермиссивных клеток:

1. Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

2. Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

3. Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

4. Сплайсинг РНК.

5. Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

6. Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например, обрабатывают клетки бактерий полиэтиленгликолем или хлористым кальцием на холоду. Обработанные таким образом клетки бактерий, подготовленные к трансформации, называются компетентными. Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией. Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы с диаметром отверстия 0,1-0,5 мкм. В некоторых случаях применяют упаковку рекомбинантной ДНК в липосомы (полые частицы, содержимое которых ограничено липидной мембраной). Заключенные в липосомы ДНК защищены от нуклеаз, легко проникают в клетки в результате слияния липосом и мембраны клеток или при поглощении их путем фагоцитоза.

Электропорация - перенос генетического материала через мембранные поры, образующиеся в результате воздействия на клетку высоковольтного импульса (350 В, 54 мс).

Для трансформации растительных клеток используют бомбардировку микрочастицами золота или вольфрама с адсорбированным на них генетическим материалом. Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

3.2.2.4 Идентификация и отбор клеток, которые приобрели нужный ген

В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI (в гене tet, см. Рис.18), специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген bla - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене tet плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген tet и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки (Рис.25).

Рис.25. Перенос клеток со среды с ампициллином на среду с тетрациклином методом перепечатки.

Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе.

3.2.3 Получение рекомбинантного инсулина

Инсулин -- гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Дефицит этого гормона в организме приводит к сахарному диабету. Инсулин -- небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника -- препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей (Рис.). После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис.26. Первичная структура инсулина человека.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека -- треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками. Первые лекарственные препараты инсулина были на основе животного инсулина, однако такие препараты вызывали у больных аллергические реакции и другие побочные эффекты. В 1972 г. был разработан метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты. Ограничения использования этого метода связаны с ограниченностью сырьевой базы - поджелудочной железы телят и свиней, поскольку для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг исходного сырья.

Рис.27. Структура инсулина человека: А) структура проинсулина; Б) третичная структура инсулина.

Поскольку известна структура инсулина, можно рассматривать синтетический метод получения инсулина. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 г. был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли в-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили рДНК (см. раздел ). Полученную рДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы (см. раздел 4.2.2.1). Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В генетической инженерии в качестве системы экспрессии эукариотических генов используют бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris, линии клеток млекопитающих, трансгенные животные. Исторически первыми были выбраны бактерии E. coli, которые имеют как преимущества, так и недостатки (Табл.7).

Таблица 7. Преимущества и недостатки Esherichia coli в качестве системы экспрессии эукариотических генов

Преимущества	Недостатки
Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции)	Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 кДа)
Относительно высокий выход целевого белка (100-2000 мг/л)	Нет системы гликозилирования
Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты)	Ограниченные возможности секреции белков
Низкая стоимость ферментации	Многие гетерологичные белки токсичны для клеток
Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения)	Затруднено образование дисульфидных связей (важно для восстановления третичной структуры белка)
	Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения

В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином (Рис.28).



Рис.28. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli: а) карта плазмиды pBR322; б) карта, полученная при определении последовательности рДНК рекомбинантной плазмиды в продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин после удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.

Рекомбинантный белок синтезировался бактериями внутриклеточно в виде так называемых телец включения (inclusion bodies), которые представляют собой агрегаты целевого белка в денатурированном неактивном состоянии (Рис.29). Благодаря этому целевой белок, находясь в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами.

Процесс получения инсулина включал следующие стадии (подробнее см. раздел):

1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере);

2. Отделение биомассы (клеток продуцента) методом центрифугирования;

3. Разрушение клеток с выделением телец включения;

4. Очистка рекомбинантного белка.



Рис.29. Микрофотография клеток Е. coli с тельцами включения.

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин на основе различных современных модификаций генно-инженерного метода. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животным инсулином.

Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly (США). Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 5000 кг.

4. Основные этапы биотехнологического процесса

В биотехнологии биологические объекты (продуценты) выращивают в условиях, оптимальных для биосинтеза целевых продуктов - культивируют. На первом этапе - предферментационном (Рис.30) - готовят питательную среду для культивирования продуцента, стерилизуют ее для полного удаления жизнеспособной посторонней микрофлоры, получают инокулят - посевную дозу продуцента, моют и стерилизуют оборудование для культивирования.

Основная стадия биотехнологического производства - стадия культивирования продуцента или ферментации (биотрансформации) (Рис.30). На этой стадии происходит рост продуцента и биосинтез целевых продуктов. Используют разные технологии культивирования - в жидкой питательной среде (глубинное культивирование) и на твердой питательной среде (поверхностное культивирование). Основным продуктом стадии глубинной ферментации является культуральная жидкость - суспензия клеток продуцента в питательной среде, содержащей растворимые продукты метаболизма (метаболизм - обмен веществ, химические превращения, протекающие от момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду). Целевой продукт может содержаться как в клетках (биомассе), так и в растворе (внеклеточные продукты). Этими вариантами определяется схема выделения и очистки продукта. Приведенная на Рис.30 схема иллюстрирует биотехнологический процесс.

Рассмотрим отдельные стадии биотехнологического процесса. Предферментационный этап складывается из следующих этапов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2. Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

Исходные ростовые вещества (субстраты).

Ростовые вещества используют в составе питательной среды, который подбирают таким образом, чтобы присутствовали все химические элементы для построения клетки в такой форме, в которой продуценты способны их усваивать. Количественный состав питательной среды зависит от многих факторов, главным из которых является стехиометрия клеточного роста. Основой конструирования питательных сред является простой материальный баланс превращения в процессе биосинтеза низкомолекулярных субстратов, например глюкозы и аммиака, в биомассу и внеклеточные продукты. Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан, метанол, диоксид углерода, моносахариды и заканчивая природными биополимерами. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др.). Как правило, эти компоненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные компоненты.

Для культивирования микроорганизмов используют специальные питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов.

Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.



Рис.30. Принципиальная схема биотехнологического процесса.

По составу питательные среды подразделяются на 2 группы - натуральные и синтетические.

Натуральными называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда. Среди натуральных сред широкое применение нашли: меласса - отход свеклосахарного производства, применяется как основной источник углерода, кукурузный экстракт, отруби и др.

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют.

По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие среды.

Жидкие среды широко применяют в биотехнологии для культивирования продуцентов. Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета микроорганизмов. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. Агар-агар - сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели которые плавятся при 100⁰С, а затвердевает при 40⁰С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их роста температуре.

Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.

Стерилизация питательных сред, оборудования и воздуха.

Стерилизация всех компонентов биотехнологического процесса, соприкасающимися с чистыми культурами микроорганизмов - важнейший этап. Под стерилизацией понимают полное удаление жизнеспособных организмов, что достигается двумя группами методов. Первая группа основана на воздействии летальных факторов - высокой температуры, ионизирующего излучения, химических веществ, вторая - на механическом отделении посторонних микроорганизмов (контаминантов) - стерилизующая фильтрация, герметизация аппаратов, коммуникаций, арматуры. Основным методом очистки и стерилизации воздуха, огромные объемы которого используют в процессе ферментации, является пропускание через фильтры - стерилизующая фильтрация. Для стерилизации жидких питательных сред и оборудования чаще применяют термическую стерилизацию. Большие перспективы для стерилизации жидких питательных сред имеет микрофильтрация. Также применяют химическую деконтаминацию и ионизирующее излучение, когда другие методы не могут быть использованы.