Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Загальна характеристика роботи

слина холінергічній ацинарний підщелепний

Актуальність проблеми. Слина - важливий фактор підтримання здорового стану органів ротової порожнини (Zachariasen, 1996). Вона характеризується прямою бактерицидною, антивірусною та антигрибковою активністю, що сприяє нормальному функціонуванню слизової оболонки ротової порожнини, відіграє роль у формуванні смакових відчуттів, жуванні та мовленні (Jensen et al., 2004). Зменшення слиновиділення та зміни складу слини є причиною підвищення ймовірності карієсу, периодонтологічних захворювань та патологій слизової оболонки ротової порожнини (Porter et al., 2004). Відчуття сухості у роті (ксеростомія), зумовлене пригніченням здатності клітин слинних залоз синтезувати та виводити слину, є симптомом багатьох захворювань або побічним ефектом дії лікарських препаратів. Ксеростомія супроводжує С'йогрен синдром, цукровий діабет, радіаційне опромінення ділянок голови чи шиї, хемотерапію та ін. (Porter et al., 2004). Однак, незважаючи на чисельні клінічні дані, клітинні механізми розвитку ксеростомії залишаються нез'ясованими. Враховуючи це, дослідження механізмів, що опосередковують патологічні зміни функціонування слинних залоз є важливим завданням сучасної фізіології.

У ссавців секреція рідкої слини (як базальна, так і стимульована) для зволоження ротової порожнини здійснюється в основному підщелепною слинною залозою (Foskett et al., 1989). Враховуючи це, виникненя ксеростомії вірогідно пов'язане із порушенням функціонування ацинарних клітин саме цієї залози. Також відомо, що синтез і секреція компонентів слини є Са²⁺-залежними процесами, які регулюються змінами концентрації вільного кальцію в цитоплазмі ([Са²⁺]_i) та ендоплазматичному ретикулумі ([Са²⁺]_ЕР) (Ambudkar, 2001). Виходячи з цього, порушення кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози є вірогідною причиною розвитку ксеростомії. Підтримання гомеостазу кальцію досягається за рахунок узгодженого функціонування Са²⁺-транспортних систем плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел та їх взаєморегуляції. Проте дані про зміни кальцієвого гомеостазу при ксеростомії, а також навіть щодо механізмів взаємодії між Са²⁺-транспортними системами ацинарних клітин за фізіологічних умов практично відсутні, хоча очевидно, що вони відіграють ключову роль у регуляції слиновиділення.

Таким чином, вивчення механізмів [Са²⁺]_i та [Са²⁺]_ЕР сигналізації, вкладу у їх модуляцію інших внутрішньоклітинних органел, таких як мітохондрії, та їх взаємодії між собою зробить вагомий крок до більш детального визначення ролі кальцієвого гомеостазу та внутрішньоклітинних регуляторних органел у процесах слиновиділення та дасть змогу підняти на новий рівень методи терапії дисфункцій слинних залоз.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка: науково-дослідних тем БЛ-10Б «Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів», № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б «Механізми Са²⁺- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин», № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Об'єкт досліджень - кальцієвий гомеостаз в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

Предмет досліджень - механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.

Методи досліджень - фізіологічні тести, біофізичні, біохімічні, електронно-мікроскопічні та статистичні методи досліджень.

Мета роботи. Мета виконаної роботи полягала у вивченні механізмів взаєморегулюючого функціонування Са²⁺-транспортних систем плазматичної мембрани, ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій, а також їх вкладу в підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози в нормі та за умов ксеростомії.

Матеріали і методи досліджень

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар у віці 1-1,5 міс. Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком експерименту тварину наркотизували внутрішньо-очеревною ін'єкцією кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали за допомогою мікроканюлі, впритул підведеної до проток залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, б-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 320 од/мг), протягом 25-30 хв (35 С). Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (у мМ): NaCl - 140; KCl - 4,7; CaCl2 - 1,3; MgCl2 - 1,0; гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) - 10; глюкоза - 10; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка. Сумарний вміст кальцію в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу полягає у тому, що іони Са²⁺ утворюють з арсеназо III комплекс синього кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са²⁺ у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Реєстрація [Са²⁺]_i в ацинарних клітинах. [Са²⁺]_i в ацинарних клітинах реєстрували з використанням високоафінного флуоресцентного Са²⁺ барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкМ фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35 С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника. Для розрахунку [Ca²⁺]_i використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca²⁺]_i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: R_min=0,9, R_max=19, В=26. Параметр K_d становив 224 нМ (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Для пермеабілізації ацинарних клітин використовували детергенти дигітонін та -есцин. Концентрацію детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально. Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до внутрішньоклітинного (НДВ), який містив (у мМ): KCl - 120; NaCl - 20; MgSO4 - 2; HEPES - 10; АТР - 3; EGTA - 1; CaCl₂ - 0,75; рН 7,2. Концентрація іонізованого Са²⁺, розрахована за допомогою програми «WinMAXC v2.10» (Chris Patton, Stanford University), у такому розчині НДВ становила ~100 нМ. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах за виключенням окремо згадуваних з -есцином (40 мкг/мл) - 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4%) під світловим мікроскопом MP-3, а у випадку маг-фура-2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са²⁺-барвника.

Реєстрація [Ca²⁺]_ЕР в ацинарних клітинах. Для моніторингу концентрації Са²⁺ в ЕР ацинарні клітини завантажували низькоафінним флуоресцентним Са²⁺ барвником маг-фура-2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60 хв при 37 С, що забезпечує компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Для вимивання цитоплазматичної частки барвника проводили хімічну пермеабілізацію клітин. Зміни [Ca²⁺]_ЕР виражали як співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура-2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F₃₆₀/F₃₉₀), яке прямо пропорційне змінам [Ca²⁺]_ЕР (Hofer & Machen, 1994).

Одержання фракції мембранних везикул. Мембранні везикули підщелепної слинної залози щурів одержували методом диференційного центрифугування. Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив (мМ): сахароза - 250,0; ЕДТА - 1,0; трис-Сl - 10,0 (рН=7.1, t=4С); оуабаїн - 1,0; NaN3 - 1,0. Гомегенат відцентрифуговували (10 хв при 1600 g та 30 хв при 40000 g), кінцевий супернатант видаляли, а осад розводили буферним розчином та зберігали при t=-40^оС (Hurley & Martinez 1985). Топологію мембранних фрагментів визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1%). Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами діаметром 0,5±0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са²⁺-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили у розчин НДВ, який містив в мМ: NaCl - 50,0; KCl - 100,0; трис-Сl - 20,0 (рН=7.4, t=37 С); MgCl2 - 3,0; CaCl2 - 0,01. АТФ-гідролазну реакцію ініціювали додаванням 3 мМ АТФ і через 1,5 хв реакцію зупиняли додаванням 200 мкл 20% трихлороцтової кислоти. Вміст пробірок відцентрифуговували (10 хв, 1600 g) і в супернатанті фотоколориметрично визначали концентрацію Р_і (Nakamura et al., 2002). Вміст білка мембранного препарату визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951). Активність Са²⁺-АТФаз розраховували як різницю між АТФазною активністю в Са²⁺-вмістному та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са²⁺-АТФазну активність розділяли на тапсигаргін-нечутливу (Са²⁺-АТФаза ПМ) та - чутливу (Са²⁺-АТФаза ЕР) складові. Активність АТФаз виражали у мкмоль Р_і/год·мг білка.

Метод індукції експериментального діабету. Діабет викликали внутрішньоочеревинною ін'єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненого в 0,9% NaCl (80 мг/кг маси тіла тварини). СТЗ-ін'єктовані та контрольні тварини того ж віку утримували на однаковій дієті. Тварин використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін'єкції СТЗ. Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин становила 5-9 мМ, у хворих на стрептозотоцин-індукований діабет - 14-28 мМ.

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували (12 год, 20^оС) у суміші глютаральдегіду (2%) та параформальдегіду (2%), приготовлених на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1% OsO₄ у фосфатному буфері (1 год, 20^оС). Фіксовані клітини тричі промивали буферним розчином по 10 хв. Зразки зневоднювали у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи (60-70 мкм) отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із збільшенням 5000-40000.

Статистична обробка результатів. Оригінальні записи [Ca²⁺]_і та [Ca²⁺]_ЕР опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичне опрацювання результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

Результати досліджень

1. Са²⁺ сигналізація при активації холінорецепторів. Секреція рідинного компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, який реалізується медіатором ацетилхоліном (АХ). Зв'язування АХ із холінорецепторами ПМ призводить до підвищення [Са²⁺]_і за рахунок вивільнення Са²⁺ з депо та входу ззовні (Petersen et al., 2005). Однак, незважаючи на інтенсивне дослідження окремих процесів, які опосередковують [Ca²⁺]_і сигналізацію в ацинарних клітинах, механізми їх взаємодії залишаються нез'ясованими.

Характеристики АХ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів. В стані спокою [Ca²⁺]_i в ацинарних клітин підщелепної слинної залози становаить 954 нМ (n=124). Аплікація (10 с) до клітин АХ (5 мкМ) викликала [Ca²⁺]_i транзиєнти з амплітудою 215±22 нМ (n=124, рис. 1А). Амплітуда другого АХ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнту була меншою за першу на 15%, а при наступних прикладаннях АХ - не змінювалась (n=8), що свідчить про відсутність швидкої десинситизації холінорецепторів. Розрахована ЕС₅₀ для АХ складала 0,830,06 мкМ (рис. 1В, Г), причому АХ викликав глобальне підвищення [Ca²⁺]_i незалежно від діючої концентрації (рис. 1В). Аплікація АХ на фоні атропіну (10 мкМ) приводила до зменшення [Ca²⁺]_i транзиєнтів на 79±5% (n=8, p<0.001), що свідчить про основний вклад у їх формування мускаринових (М) холінорецепторів. При тривалій аплікації АХ (5 мкМ, 5 хв) виникав [Ca²⁺]_i транзиєнт тієї ж амплітуди, що й при короткочасному прикладанні, однак не спостерігалось відновлення [Ca²⁺]_i до вихідного рівня протягом дїї АХ (n=5, рис. 1Б). Новий стаціонарний рівень [Ca²⁺]_i в присутності АХ може відображати надходження в Са²⁺ цитоплазму через депо-керовані Са²⁺ канали ПМ. Ряд ефективності агоністів М-холінорецепторів можна розташувати у наступній послідовності: АХ > карбахолін (КХ) > пілокарпін. Розрахована ЕС₅₀ для КХ (негідролізуємого аналогу АХ) складала 4,70,6 мкМ.

Механізми формування АХ-індукованих [Ca²⁺] транзиєнтів. Для багатьох типів незбудливих клітин доведено, що при активації М-холінорецепторів формування висхідної фази [Ca²⁺]_і транзиєнтів забезпечується тільки за рахунок вивільнення Са²⁺ із депо ЕР (Ambudkar, 2001; Clapham et al., 2001). З метою вивчити вклад у формування амплітудно-часових параметрів АХ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів саме процесу вивільнення Са²⁺ із депо ЕР порівняно із входом Са²⁺ ззовні, ми прикладали до клітин АХ за умов безкальцієвого середовища (1 мМ ЕГТА). З'ясувалось, що на відміну від кальційвмісного середовища, внаслідок багаторазового прикладання АХ відбувалось значне зменшення амплітуди АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнтів та їх зникнення після 4-5 прикладань АХ (рис. 2А). Довготривала аплікація АХ (5 мкМ, 5 хв) за умов безкальцієвого середовища призводила до появи [Ca²⁺]_і транзиєнту, проте на відміну від такого у Са²⁺-вмісному розчині, спостерігалось відновлення початкового рівня [Ca²⁺]_і навіть у присутності АХ (рис. 2Б). Час напівспаду такого [Ca²⁺]_і транзиєнту складав 36±7 с (n=15). Таким чином, за умов неможливості перезаповнення депо ЕР АХ здатний повністю спустошувати доступний для вивільнення запас Са²⁺ в ЕР. Для оцінки вкладу перезаповнення депо Са²⁺ у АХ-індуковані [Ca²⁺]_і транзиєнти ми блокували Са²⁺-АТФазу ЕР (SERCA), яка є єдиною системою транспорту Са²⁺ в ЕР (Putney, 1985; Berridge, 2004). Для цього ми використовували блокатори SERCА: реверсивний - циклопіазонова кислота (СРА) та незворотний - тапсигаргін (TG). Ми виявили, що обидва блокатори викликали зростання [Ca²⁺]_i ~100 нМ (n=10), яке характеризувалось виходом на плато та зберігалось протягом усього часу присутності блокатора. В присутності СРА АХ-індуковані [Ca²⁺]_i транзиєнти зменшувались: перший на 31±8%, другий на 56±9%, а наступна дія АХ не викликала змін [Ca²⁺]_і (n=8). Після відмивання СРА АХ-індуковані [Ca²⁺]_i транзиєнти відновлювались до початкової амплітуди. При використанні незворотнього блокатора TG було виявлено зміни аналогічного характеру, за виключенням більш вираженого пригнічення амплітуди першого АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту (на 75±8%, n=8, рис. 3Б). Отже, переважний внесок у формування АХ-індукованих [Ca²⁺]_і відповідей належить процесу вивільнення Са²⁺ з ЕР.

За умови що вивільнення Са²⁺ з депо ЕР є єдиним механізмом формування [Ca²⁺]_і відповідей, не повинно було б спостерігатись відмінностей абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних у Са²⁺-вмісному та безкальцієвому середовищах.

Однак, виявлено: і) амплітуда АХ-індукованої [Ca²⁺]_і відповіді в безкальцієвому розчині зменшувалась на 36±9% (n=19; p<0,001, рис. 4А); іі) час напівзростання АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту складав 1,6±0,2 с та 1,1±0,1 с в Са²⁺-вмісному та безкальцієвому середовищах відповідно (n=19; p<0,001); ііі) час напівспаду складав 12±1 с та 6,2±0,6 с відповідно (рис. 4Б). Виявлені відмінності можуть бути зумовлені тільки активацією входу Са²⁺ ззовні, єдиним механізмом якого є депо-керований вхід Са²⁺ (Putney, 1986). З метою візуалізувати такий вхід Са²⁺ ми прикладали АХ (5 мкМ) у безкальцієвому середовищі, а після завершення АХ-індукованої [Ca²⁺]_і відповіді додавали до зовнішньоклітинного розчину Са²⁺ (2 мМ). При цьому відбувалось швидке зростання [Ca²⁺]_і з амплітудою 97±13 нМ та часом напівзростання 19,74,2 с (n=12, рис. 5). Підсумовуючи, ми вважаємо, що хоча ІnsP₃-індуковане вивільнення Са²⁺ з ЕР є первинним процесом, який ініціює появу АХ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнту, однак, його амплітудно-часові параметри визначаються суперпозицією двох процесів: вивільнення Са²⁺ з ЕР та більш повільного депо-керованого надходження Са²⁺ ззовні, яке активується вже під час висхідної фази [Ca²⁺]_i транзиєнту.

Вклад мітохондрій у регулювання АХ-індукованої [Ca²⁺]_і сигналізації. Відомо, що мітохондрії (МХ) також є депо Са²⁺, однак захоплення Са²⁺ низькоафінним Са²⁺-уніпортером ізольованих МХ активується лише при [Ca²⁺] 1 мкМ (Gunter et al., 2004). Враховуючи це, вклад МХ в АХ-індуковану [Ca²⁺]_і сигналізацію та взаємодія МХ з іншими механізмами формування [Ca²⁺]_і сигналів є незрозумілим. Для пригнічення захоплення Са²⁺ МХ ми використовували СCCP (10 мкМ) - протонофор, який порушує потенціал внутрішньої мембрани МХ, або ротенон (1 мкМ) - інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів в комбінації з олігоміцином (1 мкМ) - інгібітором АТФ-синтази. Нами виявлено, що припинення Са²⁺-акумулюючої функції МХ призводить до зростання [Ca²⁺]_і з амплітудою ~37 нМ, а блокування Na⁺/Ca²⁺-обмінника МХ за допомогою CGP 37157 (20 мкМ) на фоні СССР не призводить до змін [Ca²⁺]_i. Отже, в стані спокою МХ містять певну кількість Са²⁺, єдиним механізмом вивільнення якого є Na⁺/Ca²⁺-обмінник. Аплікація АХ (5 мкМ) на фоні блокування захоплення Са²⁺ МХ призводить до зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзиєнтів на 346% (рис. 6А) та часу їх напівзростання на 5912% (p<0,001; n=24). З метою з'ясувати, чи здійснюють МХ захоплення Са²⁺ під час висхідної фази АХ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнту ми прикладали СССР одразу після досягнення піку [Ca²⁺]_i транзиєнту. Виявилось, що за таких умов виникає додаткове транзиєнтне підвищення [Ca²⁺]_i з амплітудою 14732 нМ (n=15, рис. 6Б) в Са²⁺-вмісному та 389,6 нМ (n=15, рис. 6В) в безкальцієвому середовищі. Таке підвищення [Ca²⁺]_i свідчить про потужне захоплення Са²⁺ МХ вже під час висхідної фази [Ca²⁺]_i. Менш виражене СССР-індуковане підвищення [Ca²⁺]_i на спаді АХ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнту у безкальцієвому розчині ми пов'язуємо із відсутністю за цих умов входу Ca²⁺ ззовні. Оскільки АХ активує депо-керований вхід Са²⁺, ми припускаємо, що МХ розташовані близько до SOC каналів, що дає їм змогу захоплювати Са²⁺ безпосередньо з-під ПМ. З іншого боку, за умов відсутності захоплення Са²⁺ МХ порушується здатність АХ викликати [Ca²⁺]_i транзиєнт.

Отже, МХ відіграють важливу роль у формуванні амплітудно-часових характеристик АХ-індукованих [Ca²⁺]_i відповідей, що обумовлено їх здатністю захоплювати як Са²⁺, що входить ззовні, так і регулювати InsP₃-залежне вивільнення Са²⁺ із депо ЕР.

2. Роль пуринергічних рецепторів у [Ca²⁺]_i сигналізації. Незважаючи на те, що секреція рідинного компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, існують дані про ймовірну роль зовнішньоклітинних нуклеотидів у регулюванні функціонування ацинарних клітин слинних залоз (Soltoff et al. 1998; Turner et al. 1999).

Вклад Р2_Х та Р2_Y рецепторів у формуванні АТФ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів. Доведено, що у клітинах підщелепної слинної залози експресуються іонотропні Р2_Х та метаботропні Р2_Y нуклеотидні рецептори (Park & Turner 1998, Bruce et al. 2005), проте їх вклад у [Ca²⁺]_i сигналізацію залишається нез'ясованим. Ми показали, що аплікація (10 с) АТФ (100 мкМ) у Са²⁺-вмісному середовищі викликала [Са²⁺]_i транзиєнти з амплітудою 115±20 нМ (n=18), які не десенситизувались при кількаразовій дії АТФ. Розраховане ЕС₅₀ для АТФ становило 130±36 мкМ (рис. 7А, Б). Прикладання АТФ (100 мкМ) на фоні блокатора іонотропних Р2_Х рецепторів РРАDS (50 мкМ) призводило до зменшення амплітуди [Ca²⁺]_і транзиєнту на 72±7% (n=9; p<0,05; рис. 7В). Аплікація АТФ у безкальцієвому середовищі та при блокуванні SERCA (за неможливості перезаповнення депо ЕР) призводила до появи [Ca²⁺]_і транзиєнтів з амлітудою на 65±7% (n=10, p<0,001) нижчою. Прикладання ж АТФ (100 мкМ) після попереднього спустошення Са²⁺-депо ЕР внаслідок 20-ти хв дії TG (3 мкМ) у безкальцієвому середовищі не супроводжувалось змінами [Ca²⁺]_і (n=10). Одержані дані свідчать про вклад у формування АТФ-індукованих [Са²⁺]_і сигналів як Р2_Х, так і P2_Y рецепторів. Активація кожного із цих рецепторів призводить до підвищення [Са²⁺]_і, однак основний вклад у амплітуду АТФ-індукованих [Са²⁺]_і сигналів вносять Р2_Х рецептори, а P2_Y-опосередковане підвищення [Са²⁺]_і є менш вираженим і складає ~ 35%.