Висновки

У представленій роботі відповідно до поставленої мети та завдань дослідження проведено комплексний аналіз механізмів підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. З одержаних результатів зроблено наступні висновки:

1. Природній медіатор парасимпатичної нервової системи АХ незалежно від концентрації викликає глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення [Ca²⁺]_i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів атропіном. Амплітудно-часові параметри [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ із внутрішньоклітинних депо, надходження Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР Са²⁺-АТФазою вже під час висхідної фази [Ca²⁺]_і транзиєнту.

2. Важлива роль у регуляції процесу АХ-індукованого вивільнення Са²⁺ з ЕР належить МХ, які попереджують Са²⁺-залежну інактивацію InsP₃ рецепторів за механізмом позитивного зворотного зв'язку, що можливо завдяки їх просторовій колокалізації з ЕР, яку показано методом електронної мікроскопії.

3. У ПМ ацинарних клітин підщелепної слинної залози наявні функціонально активні пуринорецептори Р1 та Р2 типів. Активація Р1 рецепторів аденозином не призводить до змін [Ca²⁺]_і, проте супроводжується потенціацією [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, в основі якої лежить цАМФ-залежна модуляція ФЛЦ-InsP₃ сигнального шляху, оскільки цей ефект відтворюється за умов прямої активації АЦ. Активація Р2 рецепторів АТФ викликає [Ca²⁺]_і транзиєнти з ЕС₅₀=13636 мкМ. Природа АТФ-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів переважно іонотропна, а вклад метаботропних Р2Y рецепторів складає ~ 35%.

4. Шляхом прямої реєстрації амплітудно-часових змін концентрації іонізованого Ca²⁺ всередині ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози вперше показано, що як АХ, так і екзогенний ІnsР₃ викликають транзиєнтне вивільнення Са²⁺ з ЕР, яке повністю пригнічується блокатором ІnsР₃ рецепторів - гепарином. ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР дзвоноподібно залежить від Са²⁺ з максимумом в межах його фізіологічних концентрацій у цитоплазмі (100-400 нМ), потенціюється АТФ у низьких (<1 мМ) концентраціях і пригнічується - у високих. Кофеїн модулює ІnsР₃-чутливе вивільнення Са²⁺ із ЕР шляхом конкуретної взаємодії з АТФ-зв'язуючим центром молекули рецептора.

5. Вперше показано вклад ріанодинових рецепторів у [Ca²⁺]_i сигналізацію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Активація ріанодинових рецепторів кофеїном призводить до транзиєнтного зменшення [Ca²⁺]_ЕР (ЕС₅₀=7,31,1 мМ), яке блокується ріанодином, дзвоноподібно залежить від Са²⁺ (з максимумом при 100 нМ), однак не супроводжуться виникненням генералізованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів в інтактних клітинах. Це зумовлено швидким захопленням Са²⁺, який вивільняється із ріанодинових рецепторів, мітохондріями та частково Са²⁺-АТФазами EР чи ПМ. Шляхом прямої реєстрації [Ca²⁺]_ЕР, [Ca²⁺]_i та методом електронної мікроскопії одержано докази колокалізації ріанодинових рецепторів, мітохондрій та Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР.

6. Вперше доведено наявність постійного пасивного витоку Са²⁺ із ЕР ацинарних клітин, який за фізіологічних умов компенсується рівноважним захопленням кальцію Са²⁺-АТФазою ЕР. Пасивне вивільнення Са²⁺ не опосередковується ІnsР₃ та ріанодиновими рецепторами, або реверсивним режимом роботи Са²⁺-АТФази, а здійснюється через транслоконовий комплекс мембрани ЕР.

7. Депо-керований вхід Са²⁺ є основним шляхом надходження Са²⁺ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози, активація якого відбувається незалежно від способу спустошення депо ЕР (InsP₃-залежного чи InsP₃-незалежного). Амплітуда депо-керованого входу Са²⁺ пропорційна мірі спустошення ЕР, а однакова кінетика розвитку депо-керованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів незалежно від способу спустошення ЕР свідчить про єдиний механізм їх виникнення.

8. Вперше показано, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са²⁺, здійснюючи контроль за станом депо-керованих каналів ПМ шляхом попередження їх Са²⁺-залежної інактивації за механізмом позитивного зворотного зв'язку. Блокування Са²⁺-уніпортеру мітохондрій призводить до пригнічення входу Са²⁺ як у випадку InsP₃-незалежного, так і InsP₃-чутливого способу спустошення депо. Блокування захоплення Са²⁺ мітохондріями при InsP₃-чутливому спустошенні ЕР викликає більш виражене пригнічення депо-керованого входу Са²⁺, що відображає як регуляцію мітохондріями безпосередньо каналів ПМ, так і додатково InsP₃ рецепторів. Така регуляція можлива завдяки просторовій локалізації мітохондрій безпосередньо під ПМ та оточених ламелами ЕР, що показано методом електронної мікроскопії.

9. Вперше показано, що транс-мітохондріальне переміщення Са²⁺ є необхідним для підтримання депо-керованого входу Са²⁺ та процесу перезаповнення депо ЕР. Вклад МХ в перезаповнення депо ЕР залежить від тривалості стимуляції клітин. За умов спустошенння ЕР короткочасною дією АХ, його перезаповнення здійснюється, в основному, за рахунок прямого захоплення Ca²⁺ в EР і, додатково, за рахунок транс-мітохондріального транспорту Са²⁺. За умов тривалої стимуляції клітин, депо-керований вхід Са²⁺ здійснюється лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюють Са²⁺ з-під вустя SOC каналів. Кальцій, захоплений МХ, після транс-мітохондріального переміщення вивільняється до ділянок його захоплення Са²⁺-АТФазою ЕР, що і відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP₃.

10. В експериментах по визначенню параметрів слиновиділення in vivo виявлено, що у щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно знижується швидкість слиновиділення, активність амілази та концентрація білка слини порівняно до таких у контрольних тварин.

11. Вперше виявлено зміни гомеостазу кальцію у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету. Показано зростання [Са²⁺]_і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів до АХ та КХ та зниження активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР. Виявлені зміни є причиною розвитку цитоплазматичної кальцієвої перегрузки та сповільненої кінетики спаду [Са²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів.

12. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз кальцію у Са²⁺ депо таких як ЕР та МХ. Показано зменшення вивільнення Са²⁺ із ЕР незалежно від механізму його активації (агоніст-, ІnsР₃ - чи кофеїн-індукованого, або рецептор-незалежного). Також виявлено зростання пасивного вивільнення кальцію через транслоконову пору ЕР. Виявлені зміни свідчать про зменшення кількості Са²⁺ в ЕР. За умов діабету виявлено відсутній у здорових тварин шлях пасивного вивільнення Са²⁺ із мітохондрій, опосередкований порою перемінного проникнення. Комплекс змін кальцієвого гомеостазу, виявлений нами в мітохондріях та ЕР, є найбільш ймовірною причиною пригнічення процесів синтезу та секреції компонентів слини при діабеті.

13. Загалом, одержані дані свідчать про те, що підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітин підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок комплексної взаємодії між Са²⁺-регулюючими системами ПМ, ЕР та мітохондрій. Взаємодія між Са²⁺-регулюючими системами здійснюється за рахунок процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки їх просторової колокалізації. Порушення функціонування систем підтримання гомеостазу кальцію є ймовірною причиною розвитку патологічних станів слинних залоз.

Список статей опублікованих за темою дисертації

1. Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Kopach O.V., Vats Ju.O., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Сhanges in functioning of rat submandibular salivary gland under streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of calcium signaling and calcium transporting pumps // Biochem. Biophys. Acta. - 2006. - Vol. 1762, №3. - Р.294-303.

2. Копач О.В., Кругликов І.А., Костюк П.Г., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Властивості інозитолтрифосфат-чутливого депо Ca²⁺ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. - 2006. - Т. 52, №1. - С. 30-40.

3. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. АТФ-індукована кальцієва сигналізація в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2005. - Т. 37, №5/6. - С. 395-402.

4. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Модулюючий вплив аденозинових Р1 пуринорецепторів на кальцієву сигналізацію, викликану активацією холінорецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози // Вісн. Харк. ун-ту ім. В.Н. Каразіна, №716. Біофіз.вісник. - 2005. - Вип. 2 (16). - С. 75-79.

5. Копач О.В., Кругликов И.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федирко Н.В. Механизмы утечки кальция из эндоплазматического ретикулума экзокринных клеток // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2005. - Т. 37, №4. - С. 339-346.

6. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Тапсигаргінчутливе та нечутливе внутрішньоклітинне кальцієве депо в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. - 2005. - Т. 51, №1. - С. 62 -70.

7. Вац Ю.О., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Кінетичні характеристики Са²⁺, Mg²⁺-ATPаз клітин підщелепної слинної залози щурів // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т. 76, №6. - С. 44-54.

8. Копач О.В., Федірко Н.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Зміни функціонування підщелепної слинної залози щурів за умов експериментально-індукованого діабету // Клінічна та експериментальна медицина. - 2004. - Т. 3, №2. - С. 462-463.

9. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Зміни внутрішньоклітинного вмісту Са²⁺ в екзокринних клітинах підщелепної слинної залози щурів за гіперкалієвої деполяризації їх мембрани // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 236-244.

10. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Адренергічна регуляція Са²⁺-гомеостазу та секреторної активності підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія Біологічна. - 2004. - Вип. 38. - С. 171-177.

11. Копач О.В., Федірко Н.В. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин слинних залоз при дії агоністів холінергічної природи // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 37. - С. 205-212.

12. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федірко Н.В. Пермеабілізовані клітини слинних залоз, як модель для вивчення кальцій-транспортних систем мембрани ендоплазматичного ретикулуму // Фізіол. журнал. - 2003. - Т. 49, №5. - С. 31-42.

13. Fedirko N., Kopach O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Imaging of intrareticular calcium concentration in permeabilized cells // Neurophysiology. 2003. - Vol. 35, №3/4. - P. 345-346.

14. Пасович О.Б., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Стаціонарний та депо-керований вхід кальцію у секреторні клітини підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2003. - Вип. 32. - С. 195-202.

15. Федирко Н.В., Вац Ю.А., Kригликов И.A., Войтенко Н.В. Изменения функционирования Са²⁺-АТФаз экзокринных клеток крыс при экспериментальном диабете // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2003. - Т. 35, №5. - С. 355-360.

16. Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko. N. Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. - 2002. - P. 144-147.

17. Вац Ю., Федирко Н., Клевец М., Войтенко Н., Роль SH-групп в функционировании кальций-транспортных АТФаз, регулирующих кальциевый гомеостаз и экзоцитоз // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2002. - Т. 34, №1. - С. 7-17.

18. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са²⁺-активованої, Mg²⁺-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2002. - Вип. 28. - С. 303-310.

19. Petersen O.H., Fedirko N.V. Calcium signalling: store-operated channel found at last // Current Biology. - 2001. - Vol. 11, №13. - P. 520-523.

20. Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Біофізичний вісник. - 2001. - Т. 1 (8), №525. - С. 54-57.

21. Fedirko N., Klevetz M., Kruglikov I., Voitenko N. Mechanisms supporting calcium homeostasis in rat submandibular salivary gland acinar cells // Neurophysiology. - 2001. - Vol. 33, №4. - Р. 252-259.

22. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Вплив еозину Y і ортованадату на базальну секрецію та стаціонарний вхід Ca²⁺ у секреторні клітини екзокринних залоз // Фізіол. журнал. - 2000. - Т. 46, №6. - С. 3-9.

23. Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the investigation of the Ca²⁺-transporting system of the secretory cell membranes // Neurophysiology. - 2000. - Vol. 32, №3 - P. 183-184.

24. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Докази cтаціонарного входу Ca²⁺ у клітини слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. larvae та його роль у базальній секреції // Фізіол. журнал. - 1999. - Т. 45, №4. - Р. 84-91.

Размещено на Allbest.ru