Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Пілокарпін (2 мг/кг ваги) стимував секрецію слини як у здорових, так і у хворих тварин, проте його стимулюючий ефект був значно більш вираженим при діабеті (швидкість слиновиділення зростала у 7,8±1,1 разів (p<0,001)), при цьому у контрольних тварин лише на 75±9% (p<0,001). В той же час, загальна інтенсивність стимульованої пілокарпіном секреції слини у діабетичних щурів була все ж значно нижчою, ніж у здорових тварин (на 43±8%; p<0,001; табл. 2). Аналогічно після стимуляції вміст загального білка у слині діабетичних щурів зростав в 9,1±0,9 раз (p<0,001), а у контрольних тварин - на 47±6% (p<0,001), при цьому загальна кількість білка у слині після стимуляції пілокарпіном достовірно не відрізнялась у хворих та здорових тварин (табл. 2). Враховуючи, що синтез та секреція компонентів слини регулюється змінами [Ca²⁺]_і, ми вивчали перебіг процесів [Ca²⁺]_і сигналізації за умов СТЗ-індукованого діабету.

Зміни Са²⁺-гомеостазу в ацинарних клітинах за умов цукрового діабету.

Нами виявлено, що у тварин хворих на діабет [Ca²⁺]_i в стані спокою на 604% (n=80; p<0,001) вища, ніж у здорових тварин. Крім того, у діабетичних тварин амплітуда [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних АХ у кальцієвмісному розчині на 23±3% (n=75; рис. 20A, Б) перевищувала таку у здорових тварин, а стала часу фази їх спаду () збільшувалась на 5711% (p<0,01). При цьому крива концентраційної залежності АХ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів істотно зміщувалась вліво та мала вищий максимум (рис. 16В). Розрахована ЕС₅₀ для АХ складала в 0,830,06 мкМ та 0,530,05 мкМ для клітин здорових та діабетичних тварин відповідно (рис. 20А, Б).

ІnsР₃-чутливий та нечутливий шляхи вивільнення Са²⁺ з ЕР за умов діабету. З метою з'ясувати, чи змінюється за умов діабету функціонування Са²⁺ депо ЕР, ми використовували агоністи М-холінорецепторів: АХ та КХ, які аплікували в безкальцієвому середовищі. Ми виявили, що за таких умов АХ (5 мкМ) викликав [Ca²⁺]_i транзиєнти з амплітудою 13511 нМ, що було на 14±4% (n=21; p<0,05) менше за таку у здорових тварин (рис. 21В, Г). Крім того, за умов діабету значно зменшується й амплітуда [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних КХ (5 мкМ) у безкальцієвому середовищі (на 32±3%; p<0,001; рис. 21В, Г). Як і при дії АХ, нами виявлено сенситизацію [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних КХ. Зокрема, ЕС₅₀ для КХ складала 4,70,6 мкМ в контролі та 3,00,5 мкМ при діабеті. Виявлене зменшення ампілутди АХ - та КХ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів у безкальцієвому середовищі за умов діабету може бути викликане зменшенням вмісту Са²⁺ в ЕР. З метою перевірити це припущення ми використовували іономіцин - кальцієвий іонофор, який за відсутності зовнішньоклітинного Са²⁺ вивільняє Ca²⁺ з ЕР, незалежно від активації рецепторів (Albert, Tashjian, 1986). Виявилось, що іономіцин (500 нМ)-індуковане вивільнення Ca²⁺ із ЕР складало 95±12 нМ (n=10) в контролі та 47±7 нМ при діабеті (p<0,01; n=16; рис. 21А, Б).

Зміни кальцієвого гомеостазу в ЕР за умов діабету. З метою вивчення внутрішньоретикулярного кальцієвого гомеостазу за умов діабету ми реєстрували [Ca²⁺]_ЕР у пермеабілізованих клітинах при рецептор-опосередкованому та пасивному вивільненні Са²⁺. Ми показали, що за умов діабету виражено пригнічується як ІnsР₃-, так і кофеїн-індуковане вивільнення Ca²⁺ із ЕР. Зокрема, ІnsР₃ (3 мкМ) викликав зменшення [Ca²⁺]_ЕР з амплітудою на 38±10% нижчою, ніж у клітинах контрольної групи тварин (n=20; рис. 22А). Кофеїн (10 та 20 мМ) викликав зменшенням [Ca²⁺]_ЕР, яке на 35±5% та 53±14% було меншим за таке у клітинах здорових тварин відповідно. Крім того, пуроміцин-індуковане вивільнення Ca²⁺ за умов діабету зростало на 45±7% (n=6; рис. 22Б). Загалом одержані дані є свідченням того, що за умов діабету відбувається зменшення в ЕР кількості Са²⁺, здатного вивільнятись при стимуляції ацинарних клітин агоністами, а ймовірним механізмом цього є посилення пасивного вивільнення Са²⁺ через транслоконову пору.

Функціонування МХ за умов цукрового діабету. Ми показали, що за умов діабету пригнічення захоплення Са²⁺ МХ одночасно із блокуванням його вивільнення через Nа⁺/Ca²⁺-обмінник за допомогою CGP3157 супроводжувалось вираженим ростом [Ca²⁺]_i на 21139 нМ (n=5; p<0,01), якого не спостерігається за аналогічних умов у здорових тварин. Це ймовірно свідчить про активацію, за умов діабету, додаткового шляху вивільнення Са²⁺ із МХ, можливим механізмом якого є пора перехідного переміщення, яка, як відомо, активується при патологіях (Brini, 2003; Duchen, 2004). Крім того, ми показали, що за умов діабету змінюється вклад МХ у формування АХ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів. Так, припинення захоплення Са²⁺ МХ за умов діабету призводило до зменшення АХ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнту на 6610% (p<0,001; n=10), що вдвічі більше такого зменшення у контролі. З іншого боку, прикладання СССР на спаді АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту, призводило до додаткового підвищення [Ca²⁺]_i, яке достовірно не відрязнялось від такого у здорових тварин. Таким чином, ми не спостерігали змін здатності МХ акумулювати Ca²⁺ під час агоніст-індукованого вивільнення Ca²⁺ із ЕР при діабеті, тому зменшення [Ca²⁺]_і транзиєнту викликаного АХ після на фоні СССР вірогідно зумовлене швидкою Са²⁺-залежною інактивацією ІnsР₃ рецепторів ЕР (як наслідок потенціювання за умов діабету процесу вивільнення Са²⁺ із МХ).

Зміни функціонування Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР за умов діабету. Виявлене нами за умов діабету підвищення рівня [Ca²⁺]_і в стані спокою та сповільнення [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, може бути зумовлене порушенням роботи Са²⁺-АТФаз. Проте, відомості про зміни функціонування Са²⁺-AТФаз ПМ та ЕР клітин слинних залоз за умов діабету відсутні. Нами вперше показано, що при СТЗ-індукованому діабеті пригнічується робота обох Са²⁺-АТФаз. Зокрема, зменшення активності Са²⁺-AТФази ПМ та ЕР ацинарних клітин хворих тварин складала 88±3% та 53±6% (n=9; р<0,05) порівняно з їх величиною у здорових тварин (табл. 3). Виявлено, що за умов діабету знижується Р_max та V₀ Са²⁺-залежного гідролізу АТФ на 52±6% (n=9; p<0,05) та 50±7% (n=9; p<0,05) відповідно (табл. 3). Такі зміни прямо свідчать про зниження ефективності функціонування цих систем. Крім того, нами виявлено, що за умов діабету знижується V_max високоаффінного центру зв'язування АТФ Са²⁺-АТФазами ПМ та ЕР на 22±2% та 48±7% (p<0,05), а низькоаффінного центру - на 45±7% та 83±8% (p<0,05) відповідно (табл. 3). При цьому спостерігалось підвищення K_АТФ високоафінного центру Са²⁺-АТФази ПМ на 74±7% (p<0,05). Не змінювалася n_н обох центрів зв'язування АТФ для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР, що свідчить про однакову кооперативність молекули ферменту до субстрату у хворих і здорових тварин. Показано також достовірне зменшення величин V_max, K_Ca для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР на 50±5%, 84±7% та 27±4%, 74±7% (n=6; р<0,05) відповідно та підвищення кооперативності низькоаффінного центру зв'язування Са²⁺ Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР в середньому на 63±6% та 58±5% (n=6; p<0,05; табл. 4) відповідно. Таким чином, нами виявлено, що за умов цукрового діабету змінюються параметри, які характеризують залежність Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР від субстрату ферментативної реакції та транспорту: підвищується спорідненість молекул Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕР у низькоафінному центрі зв'язування для Са²⁺ і у високоафінному центрі зв'язування для АТФ. Виявлені зміни можуть бути фізіологічним механізмом компенсування пригніченої функції Са²⁺-АТФаз клітин слинних залоз за умов дібету.

Аналіз та узагальнення результатів досліджень

Функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, що за фізіологічних умов здійснюється медіатором АХ (Anderson et al., 1993; Liu et al., 2001). Регуляція секреції рідкого компоненту слини опосередковується АХ-індукованим підвищення [Ca²⁺]_і, яке досягається за рахунок вивільнення Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо та входу Са²⁺ ззовні (Ambudkar 2001). У даній роботі проведено комплексний аналіз механізмів перебігу [Ca²⁺]_і сигналізації, опосередкованої активацією М-холіно- і пуринорецепорів, (як таких, що здатні викликати виражене підвищення [Ca²⁺]_і, необхідне для підтримання довготривалої секреції) та вкладу інших Са²⁺-транспортних систем у їх регуляцію. Враховуючи, що Са²⁺-залежні К⁺ - та Сl^--канали, які відіграють ключову роль у здійсненні секреції рідкого компоненту слини, розташовані у діаметрально протилежних ділянках поляризованих ацинарних клітин, для їх активації необхідне глобальне підвищення [Ca²⁺]_і у цитоплазмі. Однак питання щодо його виникнення тривалий час залишалось дискусійним. Ми виявили, що незалежно від концентрації АХ, а також інші агоністи М-холінорецепторів - КХ та пілокарпін, викликають глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення [Ca²⁺]_i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів атропіном. Таким чином, наші дані та результати інших авторів (Larina & Thorn, 2005) свідчать, що за фізіологічних умов АХ викликає глобальне підвищення [Ca²⁺]_і, яке першопочатково виникає в апікальній області ацинарних клітин підщелепної слинної залози, проте швидко досягає базального полюсу. Відомо, що активація М-холінорецепторів призводить до вивільнення Са²⁺ з ІnsР₃-чутливого депо (Ambudkar, 2001). Однак, якщо вивільнення Са²⁺ з депо ЕР є єдиним механізмом, що відповідає за формування [Ca²⁺]_і відповідей, то не повинно спостерігатись відмінностей абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованої [Ca²⁺]_і відповіді при стимуляції клітин у Са²⁺-вмісному та безкальцієвому середовищах. Однак такі відмінності існують: 1) зменшується амплітуда АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту у безкальцієвому середовищі; 2) прискорюється кінетика як висхідної, так і низхідної фази [Ca²⁺]_і транзиєнтів, викликаних АХ у безкальцієвому середовищі; 3) довготривала стимуляція клітин АХ призводить до розвитку [Ca²⁺]_i транзиєнта тієї ж амплітуди, що й при короткочасному прикладанні, однак при цьому не спостерігається відновлення [Ca²⁺]_i до вихідного рівня протягом всього часу дїї АХ. Виявлені явища свідчать про накладання на швидке вивільнення Са²⁺ з ЕР більш повільного процесу - входу Са²⁺ ззовні. Проведена пряма реєстрація депо-керованого входу Са²⁺ в ацинарні клітини при спустошенні депо ЕР АХ показала, що його амплітуда є більшою за різницю між амплітудами АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту у Са²⁺-вмісному та безкальцієвому середовищах, що свідчить про захоплення Са²⁺ Са²⁺-АТФазою ЕР вже під час висхідної фази АХ-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту. Отже, незважаючи на те, що ІnsP₃-індуковане вивільнення Са²⁺ з ЕР є первинним процесом, що ініціює появу [Ca²⁺]_i транзиєнту (Petersen, 1992), амплітудно-часові параметри [Ca²⁺]_i відповідей при активації М-холінорецепторів визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са²⁺ з депо ЕР, входу Са²⁺ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР Са²⁺-АТФазою.

Незважаючи на те, що секреція рідкого компоненту слини знаходиться в основному під парасимпатичним контролем, наявні дані, які опосередковано свідчать про роль зовнішньоклітинних нуклеотидів у регулюванні функцій клітин слинних залоз (Soltoff et al., 1998; Turner et al., 1999). Нами вперше доведено наявність активних іонотропних Р2Х та метаботропних P2Y рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози, що раніше було виявлено для клітин інших типів слинних залоз (Turner et al., 1999). Вклад Р2Х-рецепторів у амплітуду АТФ-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів є переважним і складає 65%. Фармакологічний аналіз природи [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних активацією Р2Х рецепторів, відсутність їх десенситизації та значення ЕС_50(АТФ) свідчить про переважний (72%) вклад у [Ca²⁺]_i сигналізацію Р2Х₇ підтипу пуринорецепторів (Ralevic & Burnstock 1998; Turner et al. 1999). Виявлена нами метаботропна компонента АТФ-ідукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів, ймовірно, опосередкована активацію P2Y₂ рецепторів, оскільки у клітинах підщелепної слинної залози дорослих тварин експресується лише цей підтип рецепторів (Turner et al., 1999). За фізіологічних умов екзогенна АТФ швидко гідролізується екто-АТФазами (Murphy et al., 1994) відповідно до послідовності: АТФ>АДФ> АМФ>аденозин. Тому цілком доцільно припустити наявність клітинних ефектів є чутливими до кінцевого продукту гідролізу АТФ - аденозину, що для досліджуваних клітин невідомо. Аденозин активує Р1 рецептори, різні підтипи яких спряжені з ФЛЦ або аденілатциклазою (Ralevic & Burnstock, 1998). Ми не виявили функціонально активних Р1 рецепторів, спряжених із ФЛЦ, оскільки аденозин per se не викликав змін [Ca²⁺]_і. Однак ми вперше виявили здатність аденозину модулювати [Ca²⁺]_і відповіді, викликані активацією М-холінорецепторів. Аденозин потенціював [Ca²⁺]_і транзиєнти, причому цей ефект маскувався прямою активацією аденілатциклази (АЦ) форсколіном. Отже, ефект аденозину опосередкований Р1 рецепторами, спряженими з АЦ, що може призводити до активації протеїнкіназ та фосфорилювання InsP₃-рецепторів ЕР. У клітинах слинних залоз експресуються три підтипи InsP₃-рецепторів, однак переважаючими є InsP₃RII та InsP₃RIIІ, фосфорилювання яких протеїнкіназою А може призводити до посилення вивільнення Са²⁺ через рецептор, як показано на інших об'єктах (Straub et al., 2004). Сумісна активація АЦ - та ФЛЦ-сигнальних шляхів дійсно є фізіологічним явищем для клітин слинних залоз, що спостерігається, наприклад, за умов одночасної симпатичної та парасимпатичної стимуляції клітин і призводить до посилення секреції слини. Однак ми вперше виявили наявність новітнього механізму синергічної регуляції секреції, не пов'язаного із симпатичною стимуляцією, який може відображати шлях ауторегуляції, оскільки АТФ (і як результат - аденозин) виводиться у міжклітинний простір із вмістом секреторних везикул (Burnstock, 2004).

Останнім часом все більше уваги приділяється здатності МХ регулювати процеси перебігу [Ca²⁺]_i сигналізації за фізіологічних умов, що зумовлено ефективним захопленням ними Са²⁺ у ділянках із локально високою концентрацією Са²⁺, зокрема, біля місць його входу у клітини або вивільнення з ЕР (Rizzuto & Pozzan, 2006). Наявність таких локальних мікродоменів високої [Са²⁺] (1-6 мкМ) показано для багатьох типів клітин (Berridge et al., 1996; Cancela et al., 2002) і забезпечує активацію низькоафінного Са²⁺-уніпортеру МХ. З використанням методу електронної мікроскопії нами виявлено наявність у досліджуваних клітинах двох угруповань МХ, локалізованих безпосередньо під ПМ та впритул оточених ламелами ЕР. Така локалізація може передбачати їх вклад у регулювання депо-керованого входу Са²⁺ та механізмів вивільнення Са²⁺ з ЕР, суперпозиція яких, як ми показали, визначає амплітудно-часові параметри Ca²⁺ сигналів у досліджуваних клітинах. При аналізі вкладу МХ у кальцієвий гомеостаз досліджуваних клітин ми виявили, що у стані спокою припинення їх Са²⁺-акумулюючої функції призводить до вивільнення у цитоплазму значної кількості Са²⁺, яке опосередковується тільки Na⁺/Ca²⁺-обмінником мембрани МХ, тоді як пора перемінного проникнення (PTP) за фізіологічних умов не бере участі у цьому процесі. Відсутність витоку Са²⁺ через PTР за фізіологічних умов показано і на інших об'єктах (Duchen, 2004). Крім того, нами виявлено здатність МХ безпосередньо захоплювати Са²⁺, який у певній кількості проникає ззовні в стані спокою клітини, що свідчить про активний вклад МХ у підтримання кальцієвого гомеостазу навіть за відсутності стимуляції. За умов стимуляції клітин АХ нами доведено вклад МХ у формування агоніст-індукованих [Ca²⁺]_i сигналів. Припинення роботи МХ призводить до істотного зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзиєнту, що зумовлене локальним підвищенням [Ca²⁺]_i поблизу вустя ІnsР₃ рецептора, викликаним відсутністю його захоплення МХ, колокалізованими з ЕР, що викликає швидку Са²⁺-залежну інактивацію ІnsР₃ рецептора. Ця гіпотеза підтверджується також результатами експериментів з прямою реєстрацією [Ca²⁺]_ЕР, які виявили драматичне зменшення InsP₃-індукованого вивільнення Са²⁺ з ЕР при припиненні захоплення Са²⁺ МХ. Явище Са²⁺-залежної інактивації ІnsР₃-індукованого вивільнення Са²⁺ з ЕР при блокуванні захоплення Са²⁺ МХ було описане раніше для незбудливих клітин ендотелію судин (Malli et al., 2005) та епітеліальних клітин нирок (Landolfi et al., 1998).

Підтримання внутрішньоретикулярного кальцієвого гомеостазу, яке досягається за рахунок узгодженого перебігу процесів вивільнення Са²⁺ та перезаповнення ЕР, є необхідним для нормального перебігу синтезу і дозрівання секреторних білків та здійснення секреції рідкої слини (Berridge, 2002). Однак ці механізми є остаточно нез'ясовано навіть за фізіологічних умов, що обумовлено складністю проведення таких досліджень через вибіркову проникність ПМ. Для цього ми проводили пряму реєстрацію [Ca²⁺]_ЕР на пермеабілізованих ацинарних клітинах, завантажених низькоафінним Са²⁺ індикатором маг-фура-2/АМ. Використання такого підходу дало змогу: і) виявити наявність у досліджуваних клітинах тапсигаргін-чутливого та нечутливого депо Са²⁺, обидва з яких є InsР₃-залежними; іі) охарактеризувати властивості та шляхи модуляції InsР₃-індукованого вивільнення Са²⁺ цитоплазматичним Са²⁺ та АТФ; ііі) довести наявність активних ріанодинових рецепторів у досліджуваних клітинах. Наявність тапсигаргін-чутливого та нечутливого депо Са²⁺ у досліджуваних клітинах свідчить про гетерогенність InsР₃-чутливого депо, що описано раніше для інших об'єктів (Blaustein & Golovina, 2002). Виявлена нами дзвоноподібна Са²⁺-залежність активності InsР₃ рецептора з максимумом при фізіологічних концентраціях Са²⁺ також свідчить на користь висловленої гіпотези щодо необхідності захоплення Са²⁺ близько розташованими МХ для підтримання відносно низької [Са²⁺] біля вустя InsР₃ рецептора. Крім того, виявлений біфазний вплив АТФ на функціонування ІnsР₃ рецептора свідчить про здатність АТФ у високих концентраціях конкурентно інгібувати його ІnsР₃-зв'язуючий центр (Bezprozvanny & Ehrlich, 1993).

У даній роботі вперше доведено наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів (RyR), вклад яких у [Cа²⁺]_і сигналізацію у клітинах слинних залоз залишався нез'ясованим (Melvin et al., 2005). На користь наявності RyR-чутливого депо ЕР свідчить виявлене: і) кофеїн-індуковане транзиєнтне зменшення [Ca²⁺]_ЕР; іі) залежність його амплітуди від [Cа²⁺]_і; ііі) здатність алкалоїду ріанодину у високих концентраціях блокувати, а у середніх - переводити канал у напівпровідний стан, що співпадає з характеристиками RyR, описаними раніше (Buck et al., 1992; Verkhratsky, 2005). Однак, потужне вивільнення Са²⁺ з ЕР при активації RyR не супроводжується глобальним підвищенням [Cа²⁺] у цитоплазмі. Ґрунтуючись на результатах кальційметричних експериментів та даних електронної мікроскопії, ми запропонували гіпотезу про колокалізацію МХ, Ca²⁺-ATФaз ПМ та ЕР і RyR, яка відображає їх скоординовану участь у формуванні кофеїн-індукованої [Cа²⁺]_і відповіді (рис. 23). Внутрішньоклітинні події, пов'язані з активацією RyR, можна представити у наступній послідовності: Са²⁺, що вивільняється через RyR, захоплюється МХ, які колокалізовані з структурами ЕР > захоплений Са²⁺ починає повільно вивільнятись через Na⁺/Са²⁺-обмінник МХ як у простір біля ЕР, так і до ПМ за рахунок трансмітохондріального транспорту > вивільнений таким чином Са²⁺ виводиться з цитоплазми Са²⁺-АТФазами ПМ та ЕР. При припиненні захоплення Са²⁺ МХ відбувається перерозподіл Са²⁺, вивільненого при активації RyR, між Ca²⁺-ATФaзами ПМ та ЕР і підвищенням [Cа²⁺]_і. При цьому Са²⁺-АТФази ПМ та ЕР визначають форму [Ca²⁺]_i транзиєнту. Вважається, що фізіологічна роль RyR у різних типах клітин полягає у поширенні [Ca²⁺]_i хвиль за механізмом Са²⁺-індукованого вивільнення Са²⁺ (Verkhratsky, 2005). Виявлене нами узгоджене функціонування RyR та Са²⁺-захоплюючих систем може відігравати важливу роль у глобалізації [Ca²⁺]_і хвиль, що є необхідним для активації Са²⁺-залежних іонних провідностей апікального та базального полюсів та підтримання довготривалої секреції рідкої слини.

Додатковим механізмом, що може впливати на кальцієвий гомеостаз в ЕР є постійне пасивне вивільнення Са²⁺ «каналами витоку». Наявність потужного пасивного витоку, який можна візуалізувати шляхом блокування захоплення Са²⁺ Са²⁺-АТФазою ЕР (SERCA), вважається характерною особливістю клітин із добре розвиненим гранулярним ЕР: фібробластів (Hofer et al., 1996), панкреацитів (Mogami et al., 1998), клітин простати (Van Coppenolle, 2004). Нами вперше вивчено молекулярні механізми, які опосередковують функціонування таких «каналів пасивного витоку» Са²⁺ у досліджуваних клітинах. При вивченні пасивного витоку Са²⁺ з'ясувалось, що він виражено потенціювався пуроміцином (інгібітором трансляції, що від'єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу (Pestova et al., 2001)) та пригнічувався анізоміцином (інгібітором пептидил трансферази). Ці дані свідчать, що пасивний витік Са²⁺ здійснюється через пору транслоконового комплексу, участь якої у забезпеченні витоку Са²⁺ з ЕР показана на панкреацитах (Lomax et al., 2000) та клітинах раку простати (Van Coppenolle et al., 2004). Таке пуроміцин-індуковане вивільнення поліпептидних ланцюгів із рибосомально-транслоконового комплексу спричинює спустошення ЕР за механізмом незалежним від InsP₃ рецепторів, RуR та SERCA. Маскування ефекту пуроміцину за умов блокування пептидил трансферази (а, отже, порушення пептидного зв'язку між рибосомою та ЕР) свідчить про перехід транслоконового комплексу у непроникний для Са²⁺ стан (незважаючи на відсутність білків у каналі транслоконового комплексу). Таким чином, за фізіологічних умов механізм пасивного вивільнення Са²⁺ з ЕР полягає у вивільненні Са²⁺ через транслоконовий комплекс у період часу між завершенням трансляції (тобто після вивільнення новосинтезованих поліпепдидів всередину ЕР) та від'єднанням рибосоми від транслокону. На користь останнього свідчать дані Potter та Nicchitta (2002), які показали, що після завершення процесу трансляції деякий час зберігається зв'язок рибосоми з транслоконовим комплексом ЕР. Загалом, одержані дані є першим експериментальним підтвердженням гіпотези щодо ролі транслоконового комплексу у забезпеченні пасивного витоку Са²⁺ через мембрану ЕР клітин слинних залоз протягом білок-синтетичного циклу.

Крім вивільнення Са²⁺ з депо ЕР, істотний вклад у підтримання внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу вносить депо-керований вхід Са²⁺, який є основним шляхом перезаповнення Са²⁺ депо ацинарних клітин (Putney, 1986; Shuttleworth, 2004). При вивченні механізмів такого входу ми показали, що його потужність визначається мірою спустошення депо ЕР (тапсигаргін>АХ>>кофеїн). Крім того, наявність депо-керованого входу Са²⁺ при спустошенні ріанодин-чутливого депо підтверджує функціональну роль RyR у кальцієвій сигналізації та свідчить про роль CICR в її активації. Виходячи з аналізу кінетики депо-керованого підвищення [Ca²⁺]_i, механізм його активації не залежить від способу спустошення ЕР (InsP₃-залежного чи - незалежного). Це ймовірно зумовлене тим, що у досліджуваних клітинах депо-керовані (SOC) канали є гетеромерами, які сформовані декількома ізоформами TRPC білків, а саме TRPC₃/TRPC₆ в апікальному полюсі та TRPC₁/TRPC₆ - у базолатеральному (Liu et al., 2005). Як і вивільнення Са²⁺ з депо ЕР, депо-керований вхід Са²⁺ у досліджувані клітини також виражено залежить від функціонального стану МХ. Про це свідчить його драматичне зменшення та сповільнення при блокуванні як захоплення, так і вивільнення Ca²⁺ МХ. Виявлені ефекти не залежали від способу спустошення депо ЕР (InsP₃-залежного чи InsP₃-незалежного), а, отже, відображають безпосередньо регуляцію МХ SOC каналів. Враховуючи наявність у досліджуваних клітинах угрупування МХ, розташованих на відстані порядка 10 нм від ПМ, ми вважаємо, що за фізіологічних умов вони відіграють роль сенсорів мікродоменів високої [Ca²⁺] біля вустя SOC каналів ПМ та здійснюють швидке захоплення Са²⁺ одразу після його входу у клітини. Оскільки припинення захоплення Са²⁺ МХ різко пригнічує депо-керований вхід Са²⁺, а не потенціює його (що можна було б очікувати у випадку, якби МХ виконували роль бар'єру для Са²⁺), ми вважаємо, що роль МХ полягає у забезпеченні позитивного зворотнього контролю над функціонуванням SOC каналів шляхом попередження їх Са²⁺-залежної інактивації. Все це забезпечує умови для повноцінного перезаповнення депо ЕР після стимуляції. Загалом, одержані нами дані є першим експериментальним свідченням того, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози МХ, локалізуючись безпосередньо під ПМ, здійснюють захоплення Са²⁺ одразу після його надходження у клітини та відіграють важливу фізіологічну роль у підтриманні депо-керованого входу Са²⁺ (рис. 24).

Динаміка зареєстрованого нами депо-керованого Са²⁺ транзиєнту та дані високороздільної конфокальної мікроскопії для інших незбудливих клітин (Malli et al., 2003) свідчать, що створені швидким захопленням Са²⁺ в МХ мікродомени низької [Са²⁺] у субплазматичному просторі, існують щонайменше кілька хвилин. Проте підвищення [Ca²⁺]_МХ, викликане захопленням Са²⁺ МХ при активації SOC каналів, має транзиєнтний короткочасний характер (Glitsch et al., 2002; Malli et al., 2005), що свідчить про транс-мітохондріальне переміщення захопленого Са²⁺ та його вивільнення у більш віддалені ділянки цитоплазми. Ми виявили, що припинення вивільнення Са²⁺ з МХ після активації депо-керованого [Ca²⁺]_i транзиєнту, призводило до істотного зменшення його амплітуди, що зумовлено накопиченням Са²⁺ у МХ та наступним припиненням його захоплення, що, у свою чергу, призводить до Са²⁺-залежної інактивації SOC-каналів. Враховуючи виявлені тісні контакти між МХ та ЕР, а також показану для інших об'єктів структурно-функціональну взаємозалежність перебігу [Ca²⁺]_і сигналізації в ЕР та МХ (Arnaudeau et al., 2001; Bowser et al., 2002), фізіологічна роль транс-мітохондріального транспорту Са²⁺ полягає, ймовірно, у спрямуванні вхідного потоку Са²⁺ від ПМ до EР для його перезаповнення. Шляхом прямої реєстрації [Ca²⁺]_ЕР нами виявлено, що блокування роботи Na⁺/Ca²⁺-обмінника дійсно призводило до часткового пригнічення процесу перезаповнення ЕР. Крім того, при повторній стимуляції клітин АХ за умов блокування Na⁺/Ca²⁺-обмінника вивільнення Са²⁺ з ЕР складало ~70%. Останнє може свідчити про те, що при спустошеннні ЕР короткочасною дією АХ його перезаповнення здійснюється в основному за рахунок роботи SERCA і додатково за рахунок транс-мітохондріального транспорту Са²⁺. На основі цих результатів та даних, одержаних на інших об'єктах (Malli et al., 2005), ми пропонуємо гіпотезу, згідно якої при короткочасному процесі InsP₃-індукованого вивільнення Ca²⁺ домени ЕР, наближені до ПМ, імітують функцію МХ, попереджуючи Са²⁺-залежну десенситизацію SOC-каналів шляхом прямого захоплення Ca²⁺ в люмен EР (рис. 24). Завдяки наявності в ацинарних клітинах потужного інтралюметального транспорту Са²⁺ (Tinel et al., 1999; Petersen, 2005) фізіологічна роль такого захоплення Са²⁺ в ЕР може полягати у транспорті Са²⁺ в більш віддалені від ПМ ділянки клітини.

За фізіологічних умов підвищення тонусу нервових центрів парасимпатичної нервової системи супроводжується зростанням частоти нервових імпульсів, що призводить до довготривалого підвищення рівня АХ в області навколо ацинуса. Підтримання довготривалої секреції за таких умов потребує постійного перезаповнення депо ЕР та входу Са²⁺ ззовні, тому нас цікавило, чи змінюється перебіг цих процесів за умов тривалої стимуляції клітин. Ми виявили, що за таких умов механізм перезаповнення депо ЕР істотно відрізняється від такого при короткочасній стимуляції клітин: і) припинення роботи SERCA за таких умов не викликало достовірних змін депо-керованого [Ca²⁺]_і транзиєнту; іі) блокування як захоплення, так і вивільнення Са²⁺ МХ викликало значно більш виражене пригнічення процесу перезаповнення депо ЕР; ііі) попарне пригнічення SERCA та Na⁺/Ca²⁺-обмінника МХ призводило до практично повного зникнення депо-керованого [Ca²⁺]_і транзиєнту. Виявлені ефекти ми пов'язуємо з тим, що за умов потужної стимуляції клітини у субплазматичному просторі між ЕР та ПМ створюється високий градієнт Ca²⁺ за рахунок його вивільнення через InsP₃ рецептори, локалізовані у поверхневих доменах ЕР (Larina & Thorn, 2005), що буде призводити до локальної Ca²⁺-залежної інактивації SOC каналів. За цих умов депо-керований вхід Са²⁺ може здійснюватись лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюючи Са²⁺ з-під вустя SOC каналів підтримують депо-керований вхід Са²⁺. Захоплений мітохондріями Са²⁺ транс-мітохондріально переміщується та вивільняється Na⁺/Ca²⁺-обмінником у напрямку до ділянок локалізації SERCA, що й відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP₃ (рис. 24). Таким чином, вклад МХ у процес перезаповнення депо ЕР у значній мірі залежить від тривалості стимуляції клітин. Присутність InsP₃ є ключовим моментом, що визначає залежність чи, навпаки, відносну автономність процесу перезаповнення депо ЕР від транс-мітохондріального транспорту Са²⁺. Підсумовуючи, одержані дані доводять важливу фізіологічну роль МХ у регуляції кожного з процесів, суперпозиція яких визначає особливості формування агоніст-індукованих [Са²⁺]_і транзиєнтів в ацинарних клітинах.

Загалом, у роботі показано, що підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок комплексної взаємодії між Са²⁺-регулюючими системами ПМ, ЕР та МХ. Взаємодія між Са²⁺-регулюючими системами здійснюється за рахунок процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки просторовій колокалізації цих систем.

Са²⁺-залежні механізми порушення функціонування ацинарних клітин підщелепної залози за умов цукрового діабету. Згідно клінічних даних більш, ніж у 50% пацієнтів хворих на цукровий діабет, виявлено ксеростомію (відчуття сухості у роті), виникнення якої зумовлене зменшенням секреції слини (Zachariasen 1996; Stegeman, 2005). У стані спокою (за відсутності стимуляції) основним джерелом слини для зволоження ротової порожнини є її виведення підщелепною слинною залозою (Ferguson, 1999). Виявлено, що як структура, так і функції підщелепної слинної залози за умов діабету зазнають значно більш виражених змін, ніж привушної та під'язикової залоз (Anderson, 1998). Крім того, згідно клінічних даних у пацієнтів хворих на діабет ІІ типу виявлено порушення функціонування саме підщелепної, а не привушної чи під'язикової слинних залоз (Dodd et al., 2000). Виходячи з цього, вивчення функціонування підщелепної слинної залози при діабеті може пояснити причини виникнення симптомів ксеростомії. В експериментах на тваринах, хворих на цукровий діабет, виявлено драматичне зниження величини основних параметрів як нестимульованого слиновиділення, так і стимульованого агоністами М-холінорецепторів. Крім того, ми виявили, що стимулюючий ефект пілокарпіну на швидкість слиновиділення та вміст секретованого білка у слині був більш вираженим за умов діабету, ніж у контролі. Це може бути пов'язано з виникненням на даній стадії захворювання пристосувальних механізмів, таких як, збільшення густини і/або чутливості М-холінорецепторів. Незважаючи на те, що такий феномен не було виявлено раніше для слинних залоз, він зареєстрований для ряду інших тканин, зокрема, серця (Carrier & Aronstam, 1987), гладеньких м'язів клубової кишки (Carrier & Aronstam, 1990), vas deferens (Kamai et al., 1994) та сечового міхура (Kamata et al., 1992). Загалом дані, отримані в експериментах in vivo, свідчать, що захворювання на діабет модулює механізми, які опосередковують секрецію слини. Оскільки перебіг [Са²⁺]_i сигналізації у цитоплазмі та люмені ЕР забезпечує регуляцію секреції компонентів слини та їх синтез (Lodish et al., 1990; Ambudkar, 2000), їх зміни повинні відігравати важливу роль у виявлених порушеннях слиновиділення за умов діабету.

Дійсно, проведені нами дослідження виявили наявність істотних змін кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів за умов діабету. Зокрема, нами виявлено підвищення базального рівня [Са²⁺]_і та зміни перебігу [Са²⁺]_і сигналізації, опосередкованої дією АХ, а саме зростання за умов захворювання чутливості М-холінорецепторів. Останнє підтверджує висловлену нами гіпотезу щодо сенситизації холінорецепторів при діабеті. З іншого боку, ми виявили, що за умов діабету зменшується амплітуда всіх [Ca²⁺]_і відповідей, опосередкованих вивільненням Ca²⁺ з депо ЕР, зокрема, [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних АХ, КХ чи іономіцином у безкальцієвому середовищі. Загалом, виявлені нами зміни можуть бути зумовлені накладанням декількох процесів: збільшенням чутливості/густини М-холінорецепторів та зниженням вмісту Ca²⁺ всередині люмену ЕР. Останнє підтверджується зменшенням за умов діабету InsP₃ - та кофеїн-індукованого вивільнення Са²⁺, а також посиленням пасивного витоку Са²⁺ через транслоконовий комплекс, що показано шляхом прямої реєстрації [Ca²⁺]_ЕР. На основі цих даних ми вважаємо, що за умов діабету зменшується кількість Са²⁺ в ЕР, здатного вивільнятись при стимуляції клітин агоністами, а одним із механізмів цього є посилення пасивного вивільнення Са²⁺ через транслоконову пору. За умов діабету нами також виявлено виражене пригнічення функціонування Ca²⁺-АТФаз ПМ та ЕР, а також активацію пори перемінного проникнення МХ. Причиною пригнічення активності Са²⁺-АТФаз при діабеті може бути зменшення кількості обертів молекули ферменту у результаті посилення перекисного окислення ліпідів (Pekiner et al., 2002) і/або зміни конформаційних переходів E1-E2 станів, викликані неферментативним глікозилюванням молекули ферменту (Gonzalez-Flecha et al., 1999). Підсумовуючи, одержані дані свідчать, що за умов діабету в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози спостерігаються драматичні зміни процесів підтримання кальцієвого гомеостазу. Зменшення активності обох Ca²⁺-ATPaз, посилення пасивного витоку Са²⁺ з ЕР та активація РТР є причинами підвищення базального рівня [Ca²⁺]_i і, так званого, перевантаження клітини кальцієм. Таке тривале перевантаження клітин Са²⁺ призводитиме до його акумуляції в МХ (Campanella et al., 2004), виснаження клітинних запасів АТФ та токсичного ефекту (Duchen, 2004). Зменшення активності SERCA та посилення пасивного витоку Са²⁺ через транслоконовий комплекс призводитиме до зменшення вмісту Са²⁺ у люмені ЕР та порушення [Ca²⁺]_ЕР гомеостазу. Останнє призводитиме до порушення посттрансляційного формування білків в ЕР (Kuznetsov et al., 1992), їх дозрівання та подальшого виведення і, як наслідок, пригнічення секреції слини, що підтверджується нашими експериментами in vivo. Узагальнююча схема, яка відображає порушення механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози для умов діабету, представлена на рис. 25.

Загалом, проведені дослідження дають змогу розширити фундаментальне розуміння механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у нормі та їх зміни при патологічних станах слинних залоз, а також може бути використане для розробки нових клінічних методів їх корекції.