Морфология и физиология микроорганизмов

Размещено на http://allbest.ru

Пособие для самоподготовки к итоговому занятию по разделу

«Морфология и физиология микроорганизмов»

Минск 2005

1. Характеристика бактериоскопического метода исследования

Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования - совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных (способность окрашиваться) свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии.

Основная цель - установление этиологии болезни, морфологическая идентификация, а также определив чистоты выделенной чистой культуры.

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:

а) бактериологический мазок (препарат-мазок);

б) "висячая капля";

в) "придавленная капля";

г) тонкий мазок;

д)"толстая капля";

ж) препарат-отпечаток.

Этапы метода:

1. Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал и др.).

2. Транспортировка материала.

3. Приготовление микропрепаратов, фиксация и окраска (при необходимости).

4. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.

5. Заключение.

Оценка метода: Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен

(около 10⁴-10⁵ бактерий в мл) и специфичен (из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов), небезопасен.

2. Световые микроскопы. Принципы устройства простого, фазовоконтрастного, темнопольного, люминесцентного микроскопов и их применение в микробиологии. Техника иммерсионной микроскопии

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0.2 -- 20 мкм (чаще 0,5 -- 10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20 -- 30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы. В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые по способу использования и степени увеличения делятся на сухие и иммерсионные. Сухие объективы с относительно большим фокусными расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 -- 20 мкм), иммерсионные с фокусным расстоянием 1,5 -- 3 мм -- при исследовании более мелких микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или при их отсутствии в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты (мазки). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигаем 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Если тубус микроскопа раздвижной, его устанавливают на длину 160 мм, затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив х8 и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро-, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат, салфеткой удаляют масло с фронтальной линзы объектива, отводят его в сторону и опус кают к предметному столику.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе.

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив ным фазовым контрастом -- светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-1 или КФ4.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями -- флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследования живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.

3. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые методы окраски

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:

а) бактериологический мазок (препарат-мазок);

б) "висячая капля";

в) "придавленная капля";

г) тонкий мазок;

д)"толстая капля";

ж) препарат-отпечаток.

Этапы приготовления фиксированного мазка. Приготовление препаратов для микроскопического исследования.

Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.

Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель -- в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой.

После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1--1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке.

Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур, м/озмов фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Простые методы окраски мазков: Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1--2 мин) или метиленовым синим (3--5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

4. Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски

Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

1. По Леффлеру- гранулы валютина окрашиваются в темно- синий, а палочка дифтерийной каринобактерии в голубой.

2. По Нейсеру- валютин в сине-черный, а бактерия в желтый.

3. По Гинсу-Бурри- обнаружение капсул

4. По Шефферу- Фультону- окрашивание спор ( существует еще способ Пешкова).

5. Окраска по Цилю- Нельсену. Применяется для выявления кислото- и спиртоустойчивых микобактерий туберкулеза, лепры и некоторых актиномицетов, которые из-за большого количества в клеточных оболочках липилов, воска и оксикислот непроницаемы дл: разведенных растворов красителей.

Окрашивание их достигается, при помощи фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта. Кислоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, - в светло-синий цвет.

6. Окраска по Романовскому-Гимзе Осуществляется сложным красителем (в его состав входят метиленовый синий, эозин и азур), в результате он окрашивает бактерии (спирохеты), простейшие и форменные -элементы крови в различные цвета и оттенки. Так, под его воздействием цитоплазма простейших приобретает голубой цвет, а ядра - красный: боррелии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а трепонемы и лептоспиры - в слабо-розовый; эритроциты - в розовый цвет, ядра лейкоцитов - в фиолетовый, а их цитоплазма - в голубой (базофильная зернистость - в синий, эозинофильная - н красный, нейтрофильная - в сиреневый).

7. Окраска по Граму. Из-за неодинакового содержания пептидогликана (ПГ) в оболочках разных прокариот метод дает возможность подразделять их на грамположительные (фиолетовые, 90 % ПГ) и грамотрицательные (розовые, 5-20 % ПГ)

В соответствии с этим, во-первых, в царстве прокариот выделяют четыре раздела:

1. тонкостенные, грамотрицательные.

2. толстостенные, грамположительные.

3. лишенные стенок.

4. дефектные стенки, отсутствие пептидогликана.

Во-вторых, окраска по Граму позволяет также установить родовую и видовую принадлежность многих возбудителей инфекционных болезней. Например, известно, что все болезнетворные кокки (кроме гонококка и менингококка), бациллы и клостридии являются грамположительными. а энтеробактерии, вибрионы, трепонемы - грамотрицательными.

Техника окраски по Граму:

1) Наносим на фиксированный мазок через фильтровальную бумажку раствор генцианвиолетта на 2-3 минуты. У грам+ м/о генцианвиолет проникает вглубь клеточной стенки и образует прочный комплекс с трихоевыми кислотами и Mgниевыми солями РНК, у грам- краситель проникает в в клеточную стенку.

2) Промываем водой - для удаления излишков красителя

3) Наносим раствор Люголя на 1 минуту - для удаления остатков влаги и укрепления образовавшейся связи у грам+.

4) Сливаем, не промывая водой.

5) Наносим раствор этилового 96% спирта на 30 секунд, равномерно покачиваем для отхождения фиолетовых пятен. Из грам- вымывается краситель.

6) Промыть под водой

7) Наносим раствор фуксина на 2-3 минуты для окраски обесцветившихся грам- м/о

8) Промыть водой

-> грам- - красные, грам+ - синие.

5. Морфология бактерий. Отличия прокариотов от эукариотов. Основные формы бактерий

Пo форме клеток м/о собственно подразделяются на:

A) Шаровидные (кокки) правильной формы сферической или овальной формы:

а) микрококки располагаются беспорядочно.

б) диплококки - располагаются парами

в) стрептококки цепочки в виде пакетов из четырех кокков

г) тетракокки - располагаются в виде пакетов из четырёх кокков

д) сарцины - располагаются в виде пакетов из восьми кокков.

е) стафилококки - скопление кокков в форме виноградных гроздей.

Патогенные бактерии чаще всею представлены стафилококками, стрептококками, реже микрококками. Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют.

Капсулы имеют лишь S.pneumoniae. Стафилококки и стрептококки - грамположительные, диплококки - грамотрицательные.

Б) Палочковидные бактерии цилиндрической формы, различаются по расположению, размерам, форме клеток и их концов.

а) в виде одиночных клеток

б) диплобактерии - располагаются парами

в) стрептобактерии - располагаются в виде цепочек

Патогенные палочковидные бактерии располагаются в основном беспорядочно, попарно, многие палочковидные бактерии имеют жгутики и капсулы, бациллы и клостридии имеют споры. Коккобактерии и палочки окрашиваются грамотрицатсльно, бациллы, клостридии, корине- и микобактерии -грамположительно.

B) Извитые формы бактерий - представлены изогнутыми палочками с одним изгибом (холерный вибрион) или с несколькими изгибами (кампилобактерии)

Спор и капсул вибрионы не образуют. В мазке напоминают паутинку, окрашиваются грамотрицательно. Размеры бактерий измеряются в мкм, их органелл - в нм.

Отличия прокариот от эукариот:

1. У прокариот отсутствуют мембраны, ограничивающие органеллы бактериальной клетки(ядро. митохондрии, рибосомы) от цитоплазмы. Из мембран имеется только цитоплазматическая мембрана.

2. Ядро прокариот (нуклеоид) фибриальной структуры, ядерная оболочка отсутствует.

3. У прокариот отсутствуют митохондрии, хлоропласты, КГ. ЭПС.

4. Окислительно-восстановительные фрагменты локализованы в мезосомах (производных цитоплазматической мембраны)

5. У прокариот отсутствует митоз, размножаются путем бинарного деления.

6. Прокариоты имеют гаплоидный геном.

7. Отсутствует клеточный центр

8. Внутриклеточные перемещения цитоплазмы и амебоидное движение для прокариот нетипичны.

Специфические черты М/О:

1. Малые размеры, масса, объем и относительная простота строения.

2. Чрезвычайно высокие темпы размножения

3. Большое разнообразие способов получения энергии и путём обмена веществ, широкий спектр конечных продуктов метаболизма.

4. Способность к биодеструкции практически всех естественных и искусственных веществ.

5. Чрезвычайно высокая степень адоптации как результат высоких темпов изменчивости.

6. Массовая популяция и повсеместное распространение.

6. Структура и функции поверхностных образований бактериальной клетки. Капсула. Методы выявления

Бактериальная клетка окружена внешней оболочкой (рис. 3.2), которая состоит из капсулы, капсулоподобной оболочки и клеточной стенки. От их состава зависит способность клетки воспринимать анилиновые красители (тинкториальные свойства).

Капсулы в зависимости от степени выраженности подразделяют на микро- и макрокапсулы.

Первые обнаруживаются только при электронно-микроскопическом исследовании в виде микрофибрилл из мукополисаха-ридов, которые тесно прилегают к клеточной стенке.

Макрокапсулы представляют собой выраженный слизистый слой, снаружи покрыва ющий клеточную стенку. Он состоит из полисахаридов и редко из полипептидов (например, у сибиреязвенных бактерий). Как правило макрокапсулу образуют немногие виды патогенных бактерий (пнев мококки и др.) при неблагоприятных условиях среды, например в организме животных или человека.

Однако у некоторых видов (клебсиеллы пневмонии) макрокапсула обнаруживается постоянно.

Капсулоподобная оболочка -- липидо-полисахаридное образование, сравнительно непрочно связанное с поверхностью клетки, вследствие чего в отличие от капсулы может выделяться в окружающую среду.

Капсула или капсулоподобная оболочка может быть покрыта экзополисахаридами, которые образуются из углеводов окружающей среды под действием бактериальных ферментов. При этом глюканы и леваны обеспечивают прилипание бактерий к разным поверхностям, часто гладким.

Капсула несет различные функции:

1. Защитная, предохраняя клетку от неблагоприятных условий среды обитания,

2. адгезивная, способствуя «прилипанию» к поверхносш (рецепюрам) клетки хозяина.

3. Часто патогенные и антигенные свойства. Непатогенные бактерии также могут образовывать макрокапсулу, выполняющую, по-видимому, только защитную функцию.

7. Структура и функции клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Формы бактерий с дефектами клеточной стенки

Клеточная стенка (КС)- биогетерополимер сложною химического состава, покрывающий всю поверхность прокариотической клетки.

Основа клеточной стенки- пептидогликан, обеспечивающий ригидность и эластичность КС.

Структура пептидогликана паралелльные полисахаридные(гликановые) цепи состоящие из чередующихся звеньев [\'-ацетил1 лнжозамина и N-ацетилмурамовой к-ты. С каждым остатком N-ацетидмурамовой к-ты ковалентно связан трипептид

Различии между Грам+ и Грам- бактериями.

Группа	1'рамм -*-	Грамм -
Окраска по Граму	фиолетовые	розовые
Толщина КС	20-60 нм	10-20 нм
% содержание липидов	1,6%	22,6%
Структура пептидогликана	Пептиды пептидогликанов связаны через пептидильный мостик из 5 , остатков глицина	Ацетилмурамовые к-ты каждой гликановой цепи связаны через два однотипных тетрапептида
% содержание пептидогликана	40-90% Многослойный	5-10% Однослойный
Наличие тейхоевых кислот	Имеются	Отсутствуют
Особеность выделения ферментов	Ферменты выделяются непоследственно в окружающую среду	Ферменты выделяются в периплазматическое пространство, находящееся между КС и ЦМ
Представители	Все болезнетворные кокки, кроме гонокка и менингококка, бациллы, иклострпдии	Энтеробактерии, вибрионы, трепонемы

Функции КС:

1. Придает клетке определенную форму.

2. Защищает её от воздействия окружающей среды

3. Несет на поверхности разнообразные рецепторы, к которым прикрепляются некоторые фаги, колишины и химические соединения.

4. Через КС в клетку поступают питательные вещества и выделяются продукты обмена

5. Сдерживает высокое внутриклеточное осмотическое давление.

КС грам- бакт. представлена трехслойной внешней мембраной (пептидогликан + липополисахарид + липопротеиды). Некоторые белки (норины), пронизывая внешнюю мембрану, образуют поры, через которую проходят гидрофильные в-ва с низкой молекулярной массой.

Пептидогликан - мишень действия некоторых антибиотиков (пенициллина) и ферментов (лизоцима). Пенициллин нарушает образование тетрапепдидных связей, лизоцим разрушает гликозидные связи между мурамовой к-той и ацетилглюкозамином.

При действии пенициллина на на растущую бак. культуру образуются безоболочечные формы бактерий:

1. Пртопласты- полностью лишены КС.

2.Сферопласты- частично лишены КС

И протопласты, и сферопласты подвергаются плазмолизу в изотонической среде, н в пшерюнической среде проявляютслабую метаболическую активность, ! утрачивают способность к размножению.

3.L- формы- полностью или частично лишены КС, сохраняют способность к размножению.

а) стабильные- способны к реверсии в исходный вид.

б) нестабильный-не способны к реверсии

8. Цитоппазматические структуры бактерий, функции, методы выявления. Кислотоустойчивые микробы. Метод окраски

Жгутики. На поверхности ряда бактериальных клеток располагаются жгутики. В их состав входит белок флагелин, который по своей структуре относится к сократимым белкам типа Миозина.

Жгутики прикрепляются к базальному телу, состоящему из системы нескольких дисков, вмонтированных в цитоплазматическую мембрану и КС. Количество и расположение жгутиков у разных бактерий неодинаково.

Монотрихи имеют на одном из полюсов клетки только один жгутик,

лофотрихи -- пучок жгутиков,

амфитрихи - жгутики расположены на обоих полюсах клетки,

перитрихов -- По всей ее поверхности.

Жгутики обладают антигенными свойствами.

Пили -- тонкие полые нити белковой природы длиной 0,3-10 мкм, толщиной 10 нм, покрываю щие поверхность бактериальных клеток. В отличие от жгутиков не выполняют локомоторную функцию. По своему функциональному назначению подразделяются на несколько типов.

Пили 1 общего типа обусловливают прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина. Их количество велико -- от нескольких сотен до нескольких тысяч на одну бактериальную клетку. Адгезия является первоначальной стадией любого инфекционного процесса.

Пили 2 типа (синоним: конъюгативные, или половые, пили -- sex pili) участвуют в конъюгации бактерий обеспечивающей перенос части генетического материала от донорной клетки к реци-пиентной. Они имеются только у бактерий-доноров в ограниченном количестве (1-4 на клетку).

Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является жизненно необходимым структурным компонентом бактериальной клетки. Она ограничивает протопласт, располагаясь непосредственно под клеточной стенкой. ЦМ в химическом отношении представляет собой липопротеин, состоящий из 15-30% липидов и 50-70% протеинов.

Кроме того, в ней содержится около 2-5% углеводов и незначительное количество РНК. В состав мембранных липидов входят главным образом нейтральные липиды и фосфолипиды. У некоторых бактерий встречаются гликолипиды, а у микоплазм -- стеролы.

Липидный состав мембран непостоянен в качественном и количественном отношении. У одного и того же вида бактерий он изменяется в зависимости от условий ее культивирования на питательной среде и возраста культуры. Разные виды бактерий отличаются друг от друга по липидному составу своих мембран.

Мембранные белки разделяются на структурные и функциональные. К последним относятся ферменты, участвующие в биосинтезе разных компонентов КС, который происходит на поверхности ЦМ, а также окислительно-восстановительные ферменты, пермеазы и др.

ЦМ является сложно организованной структурой, состоящей из трех слоев, которые выявляются при электронно-микроскопическом исследовании.

Двойной фосфолипидный слой пронизан глобулинами, которые обеспечивают транспорт веществ в бактериальную клетку.

ЦМ выполняют жизненно важные функции, нарушение которых приводит бактериальную клетку к гибели. К ним относится прежде всего регуляция поступления в клетку метаболитов и ионов, участие в метаболизме, репликации ДНК, а у ряда бактерий в спорообразовании и т.д.

Мезосомы являются производными ЦМ. Они имеют неодинаковое строение у разных бактерий, располагаясь в разных частях клетки либо в виде концентрических мембран, либо пузырьков, трубочек, либо в форме петли, характерной в основном для грамотрица-тельных бактерий.

Мезосомы связаны с нуклеоидом. Они участвуют в делении клетки и спорообразовании.

Цитоплазма у прокариот, так же как и у эукариот, представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (около 75%), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений.

Нуклеоид является эквивалентом ядра эукариот, хотя отличается от него по своей структуре и химическому составу. Он лишен ядерной мембраны, не содержит хромосом, не делится митозом. В составе нуклеоида отсутствуют основные белки -- гистоны. Исключение составляют только некоторые бактерии.

В нем содержится двунитевая молекула ДНК, а также небольшое количество РНК и белков. Молекула ДНК с молекулярной массой (2-3) х 10⁹ представляет собой замкнутую кольцевую структуру, в которой закодирована вся наследственная информация клетки, т.е. геном клетки. По аналогии с хромосомами эукариот бактериальная ДНК часто обозначается как хромосома. При этом следует помнить, что она представлена в клетке в единственном числе, поскольку бактерии являются гаплоидными. Однако перед делением клетки число нуклеоидов удваивается, а во время деления увеличивается до 4 и более.

Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы двунитевой ДНК с меньшей молекулярной массой, которые получили название плазмид.

В них также закодирована наследственная информация. Однако она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки.

Рибосомы у бактерий представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц 30S и 50S. Перед началом синтеза белка происходит объединение этих субъединиц в одну -- 70S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть.

Бактериальные рибосомы, являющиеся белоксинтезирующими системами клеток, могут стать «мишенью» для действия многих антибиотиков.

Включения являются продуктами метаболизма про- и эука-РИотических микроорганизмов, которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ.

К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др. У некоторых бактерий, например дифтерийной палочки, включения волютина имеют дифференциально-диагностическое значение. Они обладают способностью к метахромазии (окрашиваются в иной цвет, чем цвет красителя).

9. Покоящиеся формы микробов. Спорообразование у бактерий, стадии, методы выявления спор

В процессе жизни микробов наблюдаются 2 стадии:

а) вегетативная - размножающаяся и жизнедеятельная.

б) покоящаяся - жизнеспособная, но не жизнедеятельная.

Особенности покоящейся стадии:

1. Особенности физико-химического строения более толстая оболочка, меньшее содержание воды.

2. Слабая проницаемость для различных химических веществ (устойчивость к красителям)

3 Более высокая устойчивость к повреждающим факторам среды(к антибиотикам и др.)

4 Пониженный уровень метаболизма(анабиоз).

5. Пониженная способность к выделению БАВ

Споры и спорообразование. Споры бактерий можно рассматривать как форму сохранения наследственной информации бактериальной клетки в неблагоприятных условиях внешней среды.

Способностью к спорообразованию обладает сравнительно небольшое число как патогенных, так и непатогенных бактерий. К первым относятся бактерии родов Bacillus, Clostridium, ко вторым -- сапрофитные представители упомянутых родов и некоторые кокки.

Процесс спорообразования начинается с формирования спорогенной зоны внутри бактериальной клетки, представляющей собой уплотненный участок цитоплазмы с расположенным в нем нуклеоидом.

Затем происходит образование проспоры путем изолирования спорогенной зоны от остальной части цитоплазмы с помощью врастающей внутрь клетки ЦМ. Между внутренним и наружным слоями последней образуется кортекс, состоящий из особого пептидогликана.

В дальнейшем внешняя сторона мембраны покрывается плотной оболочкой, в состав которой входят белки, липиды и другие соединения, не встречающиеся у вегетативных клеток.

К ним относится дипиколиновая кислота, обусловливающая термоустойчивость споры, и др. Затем вегетативная часть клетки отмирает, и спора сохраняется во внешней среде в течение длительных сроков, измеряемых многими месяцами и годами.

Способность ряда патогенных бактерий образовывать длительно сохраняющиеся во внешней среде споры, обладающие высокой термоустойчивостью, обусловлена низким содержанием воды, повышенной концентрацией кальция, структурой и химическим составом ее оболочки.

Чрезвычайно высокая устойчивость спор к физическим и химическим факторам имеет существенное эпидемиологическое значение, поскольку способствует сохранению источника инфекции и загрязнению окружающей среды.

Споры многих патогенных бактерий выдерживают кратковременное кипячение, устойчивы к действию небольших концентраций дезинфектантов. Загрязнение спорами патогенных бактерий поврежденных участков кожи может привести к возникновению раневой инфекции и столбняка.

В благоприятных условиях спора прорастает в вегетативную клетку. Спора набухает, что связано с увеличением в ней количества воды, активированием ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме.

Далее происходит разрушение оболочки споры и выход из нее ростовой трубки, после чего завершается синтез клеточной стенки и сформировавшаяся вегетативная клетка начинает делиться.

Прорастание споры происходит в течение 4-5 ч, в то время как образование спор продолжается до 18-20 ч.

Вместе с тем способность бактерий образовывать споры, различающиеся по форме размерам и локализации в клетке, является таксономическим признаком, который используется для их дифференцировки и идентификации.

10. Подвижность бактерий, методы выявления подвижности

Бактерии, образующие жгутики - подвижны. Поэтому о подвижности бактерий можно судить но наличию жгутиков.

Методы выявления подвижности:

1. Окраска жгутиков по Леффлеру.

2. Исследование интактной культуры:

а) метод "раздавленная капля" - на середину предметного стекла наносят каплю суточной культуры бактерий и осторожно накрывают ее предметным стеклом так, чтобы жидкость не растеклась за его края и в нее не попадали пузырьки воздух.

б) метод 'висячая капля" каплю бактерий наносят на середину покровного стекла, накладывают на него специальное предметное стекло с углублением, смазанным вокруг вазелином так, чтобы капля находилась в центре лунки, затем препарат осторожно переварачивают.

Далее культуру исследуют в тёмном поле микроскопа или фазовом контрасте.

11. Принципы систематики микробов. Систематическое положение микробов. Таксономические категории. Понятие и критерии вида

Систематика устанавливает положение живых существ в органическом мире, а также разрабатывает принципы, методы, правила классификации, номенклатуры и идентификации микроорганизмов.

1) Монофилитический принцип - все живое от одного предка.

2) Генетический принцип - установление связи между организмами на генетическом уровне и их иерархии, деление на группы, связи между собой.

Подходы систематики: геносистематика, хемосистематика, феносистематика и др.

Номенклатура установление соподчинённости и связи между МБ.

Органический мир делится на: надцарства, царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды,

внутринидовые категории

Все таксоны до вида определяются одним словом, вид - бинарное название(первое слово родовое название, второе - видовое), подвид три елова(род, вид, название подвида).

Реально существует только вид - совокупность свободно скрещивающихся популяций, происходящих от одного предка, обладающих общим генофондом, экологическим единством и репродуктивной изоляцией.

Подвидовые категории: варианты у бактерий типы у вирусов.

Критерии вида:

а) морфологический;

б) территориальные свойства (способность окрашиваться);

в) биохимический,

г) серологический (антигенная структура);

д) биологический;

е) экологический,

ж) географический

Классификация микроорганизмов:

I. надцарство Прокариот

1 царство бактерий

тип Скотобактерии

класс Бактерии

порядок Истинные бактерии

порядок Спирохеты

порядок Акгиномицеты

класс Рикетти

порядок Рикетти

порядок Хламидии

класс Моликутес

порядок Микоплазмы

II.надцарсгво эуокариот

III. Царство Вирусов

1. царство Грибов

2. царство Простейшие.

По классификации Берджи царство Прокариот делится на четыре отдела:

1. Gracilicutes-тонкостенные, грамотрицательные

2. Firmicutes - толстостенные, граммположительные

3. Tenericutes лишены клеточной стенки(сюда включены микоплазмы)

4. Mendosicutes - архебактерии, стенки дефектные, лишены пептидогликана, особенности строения рибосом, мембраны и РНК.

12. Морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий. Методы изучения

Признак	Спирохеты	Актиномицеты	Микоплазмы	Риккетсии	Хламндии
Грампринадлежность	Грам -	Грам+	Не имеют клеточной стенки. Грам-	Грам -	Грам -
Мегоды диагностики	окраска по Романовскому-Гимте, метод серебрения по Морозову, темнопольная или фазово-контрастная микроскопия	Простые методы, окраска по Граму, Цилю-Нильсону	Фазово-контрастная микроскопия Куртуральный и серотологические методы	По методу Здродовского, по Граму, эл.микроскопия	По Романовскому-Гимзе.
Морфология	Тонкие спирально извитые нити, изогнутые вокруг центральной оси, до 50 мкм	Нитевидные витвистые клетки, имеющие вид палочки	Мелкие или крупные сферические, овоидные или нитевидные клетки	Мелкие полиморфные бактерии кокковидной, палочковидной или нитевидной формы	Элементарные тельца сферической формы (вне человека) и ретикулярные тельца (внутриклеточные)
Особенности структурной организации	Her типичной КС , нет спор	Не имеют жгутиков, капсул эндоспор	Нет типичной КС, не образует спор и не имеет жгутиков	КС построена по типу Грамм бактерии	Безкапсульная
Представители	Патогенные и сапрофит; трепонемы(8-12 завитков), боррелии (3-8 завитков), лептоспиры(20-30 завитков)	Большинство сапрофитов, патогенными являются роды Актиномицеты и Нокардии	Патогенные и не патогенные формы, широко распространены в природе	Облигатные внутриклеточные паразиты	Облигатные паразиты
Вызываемые заболевания	Сифилис, возвратный тиф, лептоспироз	Нокардиоз, кожные мицетомы	ОРЗ, атипичная пневмония и тд	Риккетсиозы, сыпной тиф	Трахома, орнитоз. паховый лимфогранулематоз

13. Питание микробов. Источники углерода, азота, ростовых факторов и зольных элементов. Способы питания. Способы проникновения питательных веществ в клетку через мембрану

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

Источники углерода и типы питания. Все микроорганизмы по своей способности усваивать разнообразные источники углерода делятся на две группы -- автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы синтезируют все углеродсодержашие компоненты клетки из СО₂ как единственного источника углерода. Гетеротрофы не могут существовать только за счет ассимиляции СО₂. Они используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения -- гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, реже углеводороды. Многие микроорганизмы в качестве источника углерода используют аминокислоты, органические кислоты и другие соединения.

Источники энергии и доноры электронов. В зависимости от источников энергии и природы доноров электронов микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезируюшие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезрующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций. К фототрофам относятся исключительно сапрофитные микроорганизмы. В патологии человека ведущую роль играют хемосинтезирующие микроорганизмы.

В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на хемолитотрофы (хемоавтотрофы) и хемоорганотрофы (хемогетеротрофы).

Источник азота. Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии) или неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов. Другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из глюкозы и солей аммония, называются прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из указанных соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы Mg, К, Са, Fe и другие микроэлементы.

Факторы роста. К факторам роста относят аминокислоты, пуриновые и пи-римидиновые основания, липиды, витамины, железопорфирины (гем) и другие соединения. Некоторые микроорганизмы самостоятельно синтезируют необходимые им ростовые факторы, другие получают их в готовом виде из окружающей среды.

Потребность того или другого микроорганизма в определенных ростовых факторах является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Аминокислоты. Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например клостридии -- в лейцине, тирозине, стрептококки -- в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофны-ми по тем аминокислотам или другим соединениям, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеоти-дах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов -- жирные кислоты, нужны для роста некоторых стрептококков, микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим стеринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы В, входят в состав кофер-ментов или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам.

Например, коринебактерии дифтерии, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав НАД и НАДФ, золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы -- тиамине (В,), входящем в состав пирофосфата, некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка -- в пантотеновой кислоте, являющейся составной частью кофермента КоА и т.д.

Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также темы -- компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Транспорт питательных веществ:

В бактериальную клетку. Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить им источниками питания только после расщепления экзоферментами до более простых соединений.

Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку тремя путями:

1) Пассивная диффузия. Протекает без энергетических затрат, по градиенту концентрации. Таким путем в клетку поступают Н₂О, О₂, СО₂, N₂.

2) Облегченная диффузия. Не требует энергетических затрат. Протекает при участии мембранных белков-транслоказ.

3) Активный транспорт. Протекает с энергетическими затратами против градиента концентрации:

а) при участии специальных белков-пермеаз. При этом каждая пермеаза переносит в клетку определенное соединение,

б) при участии мембранных белков-транслоказ и фосфорилировании переносимой молекулы в процессе ее прохождения через мембрану.

Таким путем переносится глюкоза.

Из бактериальной клетки: Синтезируемые в бактериальных клетках соединения выходят из них тремя путями:

1) Фосфотрансферазная реакция. Происходит при фосфорилировании переносимой молекулы.

2) Контрансляционная секреция. В этом случае синтезируемые молекулы должны иметь особую лидирующую последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через который молекулы белка смогут выйти в окружающую среду

Таким образом выходят из клетки соответствующих бактерий токсины столбняка, дифтерии и другие молекулы.

3) Почкование мембраны. Молекулы, образующиеся в клетке, окружаются мембранным пузырьком, который отшнуровывается в окружающую среду.

14. Дыхательный аппарат бактерий. Пути биологического окисления. Классификация микробов по этому признаку

Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами требуется достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.

Мир микроорганизмов очень разнообразен. Некоторые из них могут получать энергию даже из минеральных соединений. ак, например, железобактерии получают энергию, выделяющуюся при непосредственном окислении ими железа (Fe²⁺ в Fe³⁺), которая используется для фиксации СО₂, бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений.

Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования.

Аэробы для этой цели нуждаются в свободном кислороде. Облигатные (строгие) аэробы (например, некоторые виды псевдомонад) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, поскольку они используют его в качестве акцептора электронов. олекулы АТФ образуются ими при окислительном фосфорили-ровании с участием цитохромоксидаз, флавинзависимых оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ.

При этом, если конечным акцептором электронов является О₂, выделяются значительные количества энергии (схема 4.4).

Анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода путем ускоренного, но не полного расщепления питательных веществ. Облигатные анаэробы (например, возбудители столбняка, ботулизма) не переносят даже следов кислорода.

Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков и липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется сравнительно небольшое количество энергии.

Существуют факультативные анаэробы, которые могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании.

Выделяют получение энергии путем субстратного фосфорилирования и окислительного фосфорилирования

15. Способы размножения микробов. Механизм и фазы клеточного деления

Простое деление- это поперечное деление клетки на дне новых дочерних клетки. Специального аппарата митоза нет.

Механизм и фазы клеточного деления

1. Рост,

2. Удвоение нуклеоида и генетического материала - кариогенез

3. Цитокинез деления клетки

4. Расхождение особи.

До определенной степени зрелости происходит рост. Из созревшей цитоплазмы поступает сигнал. ^г)гоч сигнал активирует ген-инициатор на ДНК микроорганизмы пол действием гена синтезируют белок инициатор, который действует на ген-репликатор - что специальный участок ДНК, с которого начинается ее удвоение ДНК делится на две нити.

Этот процесс происходит с помощью ДНК-полимеразы. С её помощью достраивается вторая нить. Две молекулы связываются в одной точке. Получается два генома после цитокинеза. Включающие системы, индуцировали синтез перегородки. Из точки на мезосоме сперва строится цитоплазматическая мембрана и между ней встраивается следующая клетка. В результате наступает деление клетки.

16. Характеристика бактериологического метода исследования

бактерия микроб клеточный размножение

Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).

Этапы метода:

1. Забор материала для исследования.

2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.

3. Заключение.

Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).

Выделение чистой культуры. Включает 3 или 4 этапа:

1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения.

В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой.

Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.

2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.

3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).

4(5). Идентификация чистой культуры.

Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.

Оценка метода: достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам; недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.

17. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация

Требования:

1. среды должны быть питательными

2. должны иметь определенные ph

3. должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.

4. должны быть влажными и не слишком жидкими

5. должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом

6. должны быть стерильными

7. должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

Питательные среды можно разделить:

А) По происхождению:

1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);

2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;

Б) По назначению:

1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;

2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);

3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).

Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:

1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;

2) для получения изолированных колоний;

3) накопления чистой культуры;

В) По консистенции:

1) жидкие;

2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);

3) плотные - выше 1%.

18. Методы выделения чистых культур аэробов

Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов. Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18--24 ч.

Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

19. Методы выделения чистых культур анаэробов

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными