Морфология и физиология микроорганизмов

Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные среды (тиогликолевую, Китта -- Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высокий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта -- Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (клостридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных клеток посторонней микрофлоры, которая может присутствовать в исследуемом материале

20. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологическая, генетическая

Идентификация - это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.

21. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных

продуктов.

Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:

а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;

б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);

в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

Протеазы -ферменты, разлагающие белки:

а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);

б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;

в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;

г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;

д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Ферменты-токсины: Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.

Цитотоксины - ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.

Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.

Ппазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше.

Оксидо-редуктазы:

1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).

2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.

3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки).

К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.

4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода.

Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.

В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов.

Схема идентификации включает следующие этапы:

В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа.

Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной микроорганизм.

22. Генетический аппарат бактерий (хромосомы, плазмиды) характеристика бактериальных транспозонов. Биологическая роль плазмид

Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех организмов, в том числе бактерий и вирусов, является ДНК. Исключение составляют только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК. Однако в отличие от хромосомы эукариот гены прокариот организованы в более простую структуру, представляющую собой молекулу ДНК, часто замкнутую в кольцо. Молекулярная масса ДНК у бактерий сравнительно велика: у Е. coli она равна 2 * 10⁹.

Наряду с описанной структурой, называемой бактериальной хромосомой, или нуклеоидом, генетический материал у бактерий содержится во внехромосомных генетических элементах -- плазмидах, которые могут находиться в автономном состоянии в цитоплазме клетки.

Гены, ответственные за синтез того или иного соединения, принято обозначать строчными буквами латинского алфавита, соответствующими названию данного соединения со знаком «+». Например, his⁺ -- гистидиновый ген, leu⁺⁺ -- лейциновый ген и т.д. Гены, контролирующие резистентность к лекарственным препаратам, фагам. ядам, обозначают буквой г (resistent -- резистентный). Например, резистентность к стрептомицину записывается знаком str^r, а чувствительность str. Фенотип бактерий обозначают теми же знаками, что и генотип, но с прописной буквы.

Генотип микроорганизмов представлен совокупностью генов, определяющих его потенциальную способность к фенотипическому выражению записанной в них информации в виде определенных признаков. Условия окружающей среды способствуют проявлению (экспрессии) генов или, наоборот, подавляют их функциональную активность, выраженную в образовании определенных ферментов.

У бактерий, имеющих определенный набор генов, функцию каждого из них определяют не прямым, а косвенным путем на основании изменения или утраты соответствующего признака при утрате какого-либо участка ДНК. Таким образом, заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения признака присущего исходному генотипу и штамму с мутировавшим геном. В генетических исследованиях мутировавшие гены служат маркерами, которые дают возможность судить об их передаче и функционировании. Сцепленность таких маркеров с другими генами устанавливается путем их передачи от донорных к реципиентным клеткам в опытах трансформации трансдукции и конъюгации. Это позволяет установить их локализацию на бактериальной хромосоме и составить генетическую карту.

23. Внехромосомные факторы наследственности

Внехромосомные факторы наследственности входят в состав многих микроорганизмов, особенно бактерий. Они представлены плаз-мидами, транспозонами и Is-последовательностями (англ. insertion -- вставка, sequence -- последовательность), которые являются молекулами ДНК, отличающимися друг от друга молекулярной массой, объемом закодированной в них информации, способностью к автономной репликации и другими признаками.

Плазмиды, транспозоны и Is-последовательности не являются генетическими элементами, жизненно необходимыми для бактериаль-ной клетки, поскольку они не несут информации о синтезе фермен-тов, участвующих в пластическом или энергетическом метаболизме. вместе с тем они могут придавать бактериям определенные селективные преимущества, например резистентность к антибиотикам.

Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное состояние), либо встроены в ее состав (интегрированное состояние). В автономном состоянии они самостоятельно реплицируются. Транс-позоны и Is-последовательности во всех случаях связаны с хромосомой и не способны к самостоятельной репликации.

Плазмиды: Плазмиды несут две функции -- регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации его функция восстанавливается за счет плазмидного реп-ликона.

Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку, например образованию пилей (F-плазмида), резистент-ности к антибиотикам (R-плазмида), выделению бактериоцинов (Col-плазмида) и т.д.

Переход плазмиды в автономное состояние и реализация записанной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. В некоторых случаях продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию несущих их бактерий. Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как Is-последовательностей и транс-позонов -- в любой ее участок.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F-плазмиды (от англ. transfer -- перенос), обеспечивающим ее конъюгативность. F-плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав последнюю некоторыми веществами, например акридиновым оранжевым, в результате чего клетки теряют свойств_э донора. Сравнительно легкая элиминация и очень быстрая и эффец. тивная передача F-плазмиды реципиентным клеткам дали основание считать, что она располагается в цитоплазме бактерий вне хромосо. мы. Однако F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромо. сому и находиться с ней в интегрированном состоянии.

R-плазмиды. Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарствен-ным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и услов-но-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапии вызываемых ими заболеваний.

R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входят: r-ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы -- Is-последовательности, транспозоны и /га-опероны.

Плазмиды биодеградации. Данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бакте-РИи используют в качестве источников углевода и энергии. Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизациц мочевины.

Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряд_а Сахаров (лактоза, сахароза, рафиноза и др.) и образовании протеолитических ферментов.

Транспозоны: Транспозоны представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации, а при перемещении -- делеции и инверсии. Транспозоны могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы. При этом новые копии транспозонов могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Кроме того, некоторые транспозоны, так же как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодирующую функции. В частности, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики.

Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить их не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами, находящимися в составе их хромосом.

ls-последовательности: Is-последовательности представляют собой транспозируемые элементы, которые также называются «вставки последовательностей оснований». Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более. В Is-последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, т.е. перемещения в различные участки ДНК.

Вследствие такого рода перемещений Is-последовательности могут выполнять ряд функций.

1. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и уме-енных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной летки и обеспечивать их рекомбинацию.

2. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция ^-последовательности («выключение» гена), либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий-реципиентов), который включает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию.

3. Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликации в 5-9 парах нуклеотидов при включении в бактериальную хромосому.

В свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены, что свидетельствует об их неспособности реплицироваться самостоятельно.

Умеренные и дефектные фаги: Факторами изменчивости бактерий могут быть умеренные или дефектные фаги, которые напоминают по своим свойствам плазмиды бактерий. Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают ли-зогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки.

Изменчивость лизогенных бактерий связана либо с приобретением генов, переносимых данными фагами от их предыдущих хозяев (бактерий-доноров), либо с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. В последнем случае фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий, рада клостридий и др.).

24. Виды изменчивости бактерий. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Понятие о популяционной изменчивости

Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков микроорганизма называют модификациями. В отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются.

Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микробных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся Условия окружающей среды. Такого рода изменчивость позволяет мик-робным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде сохранять на должном уровне свою жизнеспособность.

Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и многих других признаков с последующей их реверси, ей к первоначальному фенотипу после устранения действия фактор вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохранении данной модификации.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик.

К модификациям можно отнести включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чею происходит смена их антигенов (см. 13.3) в ходе инфекционного заболевания.

К модификациям можно отнести также запрограммированные изменения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определенные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Существует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приводит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы сифилиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.

Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образующиеся при этом 1-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. При выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактерио-статическими концентрациями антисептиков также можно получить их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или других признаков.

25. Мутационная изменчивость. Генетические рекомбинации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов. Понятие о генной инженерии и биотехнилогии

Мутации представляют собой изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака (признаков).

Мутации можно классифицировать по происхождению, характе ру изменений в первичной структуре ДНК, фенотипическим по-едствиям для мутировавшей бактериальной клетки и другим признакам.

По происхождению мутации можно условно подразделить на спонтанные и индуцированные. Первые составляют стественный, или спонтанный, фон, величина которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Они появляются в микробных популяциях in vitro и in vivo (в естественных биотопах организма человека) под влиянием самых разнообразных причин и событий, например ошибок в работе репарирующих ферментов (см. 6.6), или ДНК-полимеразы во время репликации ДНК. Мутации происходят в результате ошибочного включения в синтезируемую дочернюю цепь вместо одного азотистого основания другого, некомплементарного имеющегося в родительской цепи, например вместо аденина, комплементарного тимину, гуанина или цитозина.

Причиной изменения естественного фона могут быть инсертаци-онные мутации (англ. insertion -- вставка), которые возникают при встраивании в хромосому микробной клетки Is-последовательностей, транспозонов и плазмид. При этом фенотип мутации зависит от места их интеграции: если она происходит вблизи промотора, то нарушается функция регуляторного гена, а вблизи структурного гена -- синтез закодированного в нем продукта. При наличии у бактерий генов-мутаторов частота мутаций увеличивается в 100 и более раз.

Индуцированными называют мутации, которые получают в эксперименте под влиянием каких-либо мутагенов.

По количеству мутировавших генов различают генные и хромосомные мутации. Первые затрагивают один ген и чаще всего являются точковыми, вторые распространяются на несколько генов.

Точковые мутации представляют собой замену или вставку пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, вследствие чего вместо одной аминокислоты кодируется другая либо образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот. Последние называют нонсенс мутациями.

Мутации со вставками или выпадениями одной пары азотистых оснований ведут к изменению всех последующих кодонов. Такие мутации называются мутациями со сдвигом считывания. Они также затрагивают один ген.

У микроорганизма, несущего точковую мутацию в одном гене, Может возникнуть вторичная мутация в этом же гене, в результате которого произойдет восстановление дикого фенотипа. При этом пер-ВДчную мутацию, которая привела к.возникновению мутантного фенотипа, называют п р я м о й, а мутацию, обусловившую возврат к Дикому фенотипу, -- обратной. Это может произойти, если пря-мое мутационное изменение состоит в простой замене пары основа, ний в первично мутировавшем гене. Так, если прямая мутация ^ результат замены пары AT на ГЦ, то обратная мутация -- результат замены пары ГЦ на AT.

При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, н₀ и генотип. Восстановление одного фенотипа может произойти и _в результате супрессии, т.е. подавления мутантного фенотипа, которое выражается в исправлении мутационного изменения. Так, например₁ если при первой мутации произошла вставка или выпадение пары нуклеотидов в одном из участков ДНК одного и того же гена, а в другом мутация противоположного рода (выпадение или вставка), ю правильность считывания информации восстанавливается. Такая супрессия называется внутригенной.

При внегенной супрессии вторичные мутации, подавляющие выражение первичного мутационного изменения, локализованы в так называемых генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортных РНК (гРНК). Мутации в таком виде могут привести к изменению 7РНК, в результате чего в синтезируемый полипептид доставляется нужная аминокислота. При этом происходит восстановление фенотипа, но не генотипа.

Хромосомные мутации носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Они возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов (делеция), либо поворота участка ДНК на 180° (инверсия), либо повторения какого-либо фрагмента ДНК (дупликация). Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением Is-после-довательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот).

В результате возникает мутация, так как функция гена при включении транспозируемого элемента нарушается. При перемещении они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК -- дупликации в 6-9 пар нуклеотидов.

По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на нейтральные, условно-летальные и летальные. Нейтральны' мутации фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков, поскольку они заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента.

Мутации, которые приводят к изменению, но не к утрате функци ональной активности фермента, называют условно-летальным и. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот, утра чивать ее. Так, например, ts-мутанты (температурочувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов функционирующих при 37°С, но утрачивают этот признак при 42 С. В то же время у бактерий бмдерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурахх.

Детальные мутации характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент или ферменты. Чаще всего эти мутации возникают при обширных делециях, захватывающих группу генов, или при других видах хромосомных мутаций. К ним относятся также мутации в генвх, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз.

Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения _м0нфологических и биохимических признаков, например жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.

Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах, называются ауксотроф-н ы м и. Они могут сохранять способность к росту лишь в том случае, если утрата соответствующего фермента (ферментов) компенсируется наличием в среде готового продукта, образуемого при его непосредственном участии.

26. Молекулярная гибридизация. Полимеразная цепная реакция

Метод основам на выявлении в биоматериале от больного из внешней среды или препарат из чистых культур после донательноетъю нуклеиновых кислот (МЮ. определение их рода, вила и типа специфичности Применяют два метола:

I. Молекулярная гибридизация (MB) процесс, в котором одноцепочечная ПК исследуемою микроорганизма (мишень) при взаимодействии с комплементарным фрагментом ПК. включающей метку (зонд) образует двухцепочечный комплекс Назначение метода:

выявление степени сходства различных ДНК Применяется для идентификации микроорганизмов, особенно тех, которые трудно и медленно растут (микоплазмы. хламидии. вирусы )

Материал для исследования:

гной; кровь; отделяемое из уретры: моча, испражнении, биопунктаты тканей и органов: объекты окружающей среды (вода, почта). Методы гибридизации:

- в растворе,

- на фильтре,

- на стекле.

Зонд - это двухцепочечные или одноцепочечные фрагменты ДНК меченые затонной, флюорисцентной или ферментной.

II ПЦР (полимеразная цепная реакция) - что способ быстрого получения множественных копий специфической последовательности ДНК бактерий, грибов, вирусов до количество, достаточного для идентификации другими молекулярно-биологическими методами Назначение:

* индикация микроорганизмов в объектах внешней среды, пищевых продуктов, материале от больных,

* идентификация микроорганизмов.

* генетическое типирование,

* выявление генов вирулентности. Материал для исследования тог же Основные компоненты:

* исследуемая проба ДНК;

* смесь ДНТФ (дезоксинуклеотилтрифосфат),

* достраивание с помощью ДНК - полимеразы:

* праймеры - синтетические фрагменты ДНК;

* специфический буфер;

* минеральное масло;

* мембрана.

27. Учение об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Отличительные признаки инфекционных заболеваний. Типы инфекций

Инфекция (лат. infectio-- заражение), или инфекционный процесс, представляет собой совокупность физиологических и патологических адаптационных и репарационных реакций, которые возникают и развиваются в макроорганизме в процессе взаимодействия с патогенными микроорганизмами, вызывающими нарушения его внутренней среды и физиологических функций.

Отличия инфекционных заболеваний от неинфекционных:

1. Причина заболевания - живой агент, при этом каждая болнзнь имеет своего возбудителя.

2. Сложные процессы взаимодействия между патогенными микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности - токсинами, ферментами - с одной стороны, и клетками, тканями и органами организма хозяина с друой.

Условия возникновения:

1. Инфицирующая доза заболевания - минимальное количество микробных клеток, способных вызвать инфекционный процесс.

2. Микроб должен попасть во входные ворота, т.е. орган в котором он может размножаться.

3. Патогенность - способность микроба вызывать инфекционный процесс у хозяина.

4. Степень патогенности - вирулентность - индивидуальный штаммовый признак.

Типы инфекций:

1. В зависимости от хозяина:

а) инф. растений;

б) инф. животных;

в) инфекции людей

2. В зависимости от возбудителя:

а) бактериозы

б) микозы

в) вирусные болезни

г) протозоозы

д) паразитозы

3. В зависимости от тяжести:

а) микробоносительство

б) бессимптомные формы инфекций (латентная)

в) сама инфекция.

4. По длительности течения:

а) острые инфекции - короткий инкубационный период, выражены признаки заболевания, относительно короткое течение (2-3 месяца). Иммунный ответ хорошо выражен. (ангина)

б) первично-хронические инфекции - длительный инкубационный период, медленное начало, нет цикличности, иммунный ответ слабо выражен. (склерома)

в) вторично, или острохронические. 1-я стадия протекает остро, часть больных выздоравливает, а у части болезнь переходит в хроническую форму.

г) меделенные инфукции - вирусной или преонной этиологии. 100% летальность (СПИД).

5. По кратности заражения:

а) инфекция с однократным заражением организма

б) суперинфекция - заражение тем же микробом, но до выздоровления.

в) реинфекция - заражение тем же микроорганизмом, но после выздоровления.

г) рецидив - возврат клинических проявлений болезни без повторного заражения за счет оставшихся в организме возбудителей. (остеомиелит, возвратный тиф).

6. По числу возбудителей:

а) моноинфекции

б) смешанные инфекции

в) вторичная ифекция - вторичное заражение другим микробом на фоне продолжительного заболевания.

7. По пути проникновения:

а) экзогенная

б) эндогенная - активация микроба, содержащегося в организме.

в) аутоинфекция - за счет микробов, составляющих микрофлору.

8. По месту заражения:

а) внебольничные

б) внутрибольничные

9. По источнику заражения:

а) антропонозы (корь, коклюш)

б) зоонозы - истинные инфекции животных.

в) сапронозы - истинные заражения - внешняя среда.

28. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность Факторы патогенности

Микробы являются причиной инфекции. Возбудителями инфекций, или инфекционных процессов, являются патогенные, или болезнетворные, микроорганизмы, обладающие способностью прикрепляться (адгезироваться) к клеткам определенных органов, размножаться и колонизировать поражаемые участки, что в конечном итоге может привести к инфекционной болезни.

Патогенностыо называется способность определенных видов микроорганизмов вызывать инфекционный процесс у чувствительного к ним человека (животного). Патогенность определяется комплексом признаков, контролируемых многими группами генов. Таким образом, патогенность является полидетерминантным признаком, который обусловливается наличием в структуре микроорганизмов биологически активных веществ -- белков, полисахаридов, липидов и их комплексов, а также их способностью образовывать токсины и некоторые ферменты.

Патогенность характеризуется специфичностью, т. е. способностью вызывать типичные для данного вида возбудителя пато-морфологические и патофизиологические изменения в определенных тканях и органах при естественных для него способах заражения. ). Генотип патогенного микроорганизма фенотипически проявляется в его вирулентных и токсических свойствах. Наряду с патогенными существуют так называемые условно-патогенные микроорганизмы. Они чаще всего является естественными обитателями разных биотопов организма человека и вызывают заболевания только при резком снижении общего и местного иммунитета.

Вирулентность -- это степень патогенности, связанная с живой, активно метаболизирующей клеткой возбудителя, которую суммарно можно выразить в условно принятых единицах -- DLM и LD50. I DLM (лат. которое при определенном способе заражения вызывает гибель 95 % восприимчивых животных определенного вида, веса и возраста в течение заданного времени. LD5o, вызывающая гибель 50% зараженных животных, является более точной дозой. Вирулентность можно рассматривать как фено-типический признак, проявляющийся в организме хозяина в способности инфекционного агента прикрепляться к чувствительным клеткам, колонизировать и вызывать их поражение. Таким образом, различные проявления вирулентности можно назвать факторами вирулентности или патогенности данного микроорганизма.Dosis letalis minima) -- минимальная смертельная доза, равная наименьшему количеству микробных клеток,

К факторам вирулентности относится способность бактери! прикрепляться к эпителиальным клеткам (адгезия), размножаться на их поверхности (колонизация), проникать в эти клетки (пенетрация) ил'и в подлежащие ткани (инвазия), противостоять факторам неспецифической и иммунной защиты организма (агрессия). Их можно рассматривать как различные функциональные проявления вирулентных свойств, характеризующие патогенные микроорганизмы.

29. Роль макроорганизма, физической и социальной среды в инфекционном процессе

ь Восприимчивость:

- состояние нервной системы

- состояние эндокринной системы

- возраст

- особенности питания

- наследственная предрасположенность

- факторы внешней среды естественный фон радиации

ь социальные факторы

условия быта санитарная обстановка материальные возможности

Одним из важных защитных факторов макро организма является "нормальная" микрофлора, не допускающая контакта патогенных микроорганизмов с рецепторами хозяина

30. Биологический метод исследования задачи, оценка этапы

Биологический (экспериментальный) метод исследования: - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных. Этот метод преследует также ряд других целей:

Диагностика инфекционных болезней.

2. Выделение и идентификация чистой культуры.

3. Определение вирулентности.

4. Выделение и идентификация экзотоксинов.

5. Культивирование вирусов.

6. Получение иммунопрепаратов.

7. Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов (в т.ч. химиопрепаратов, иммунопрепаратов) и другие.

Этапы метода:

1. Забор материала (виды материала см. Бактериоскопический метод),

2. Обработка материала.

3. Выбор лабораторного животного, исходя из его чувствительности к предполагаемому возбудителю, его стандартизация и маркировка.

4. Заражение животных одним из способов (подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутримышечный, интрацеребральный, внутривенный, в желудок, интраназальный и др.) в зависимости от тропизма микроба.

5. Регистрация признаков болезни зараженного животного или его смерти.

6. Прижизненный забор материала от животного и проведение бактериологического и серологического исследования, постановка аллергической пробы.

7. Вскрытие, изучение патологоанатомической и патоморфологической картины, протокольный посев органов павших или убитых животных (для выявления обсемененности и выделения чистой культуры). Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов.

8. Идентификация выделенной культуры.

9. Заключение по результатам исследования.

Оценка метода:

Метод высокочувствителен, может быть использован на ранних этапах

болезни, но не всегда доступен, дорог, длителен, небезопасен.

31. Химиотерапия и химиопрофилактика. Антибиотики определение классификация

Химиотерепия - лечение инфекционных и паразитарных заболеваний при помощи веществ естественного или синтетическго происхождения, которые оказывают специфический эффект на возбудителя.

Химиопрепараты - это вещества природного или синтетического происхождения, которые в неизменном или после превращения оказывают статическое или цидное действие на м/о во внутренней среде организма хозяина.

Химиопрофилактика - исполтзование химиопрепаратов.

Санация - применение препаратов у бактерионосителей с целью прекращения выделения и носительства патогенного или условнопатогенного возбудителя.

Антибиотики - это химиопрепараты биологического, полусинтетического или синтетического происхождения, которые в малых концентрациях вызывают торможение или гибель чувствительных к ним микробов и опухолевых клеток во внутренней среде животного организма.

Классификация АБ:

1. По спектру действия:

а) супеузкого спектра - на 1 вид

б) узкого - на группу бактерий 1-2 вида

в) широкого (на несколько видов)

г) суперширокого (+ гельминты, грибы и простейших)

2. По происхождению:

а) микробного происхождения (из бактерий - грамецидин, полимиксин; из грибов - пенициллин, из актиномицетов - стрептомицин)

б) из высших растений (фитонциды) - из семян редиса - рафанин, из чеснока

в) из животных организмов (лизоцим, эритрин)

г) синтетические и полусинтетические

3. По типу действия:

а) микробостатическое - когда имеет место угнетение жизнедеятельности, но не гибель м/о

б) микробоцидное действие - когда антибиотики убивают м/о

По химическому составу антибиотики подразделяют на несколько групп.

Бета-лактамные антибиотики, или бета-лактамы, -- азотсодержащие гетероциклические соединения с бета-лактамным кольцом К ним относится группа пенициллина, включающая природный антибиотик бензилпенициллин и полусинтетические пенициллины (мети-циллин, оксациллин, ампициллин, карбенициллин и др.), и группа цефалоспорина (цефалоридин, цефалексин, цефамандо.т, цефурсксим. кефзол, мандал, кефлор и др.).

Тетрациклин и его полусинтетические производные: окситетрациклин, хлортетрациклин, морфоциклин, метациклин, диоксициклин, вибромицин. Они состоят из четырех конденсированных бензольных колец с разными радикалами.

Аминогликозиды, к которым относятся группа стрептомицина (стрептомидина сульфат и его производные, состоящие из трех частей: сгрептидина, стрептозы, N-метилглюкозамина) и аминогликозидные антибиотики, содержащие дезоксистрептамин: неомицин, мономицин, канамицин, амикацин, пентамипин, гобрамицин и др.

Макролиды -- соединения, содержащие макроциклическое лактонное кольцо (эритромицин, олеандомицин).

Левомицетин, представляющий собой синтетическое вещество, идентичное природному антибиотику хлорамфениколу, в состав которого входит нитрофенил, дихлорацетамин и пропандиол

Рифамицины. к которым относятся природный антибиотик рифамицин и его полусинтетическое производное рифампицин. Они имеют своеобразную сложную химическую структуру, в которую входит макроциклическое кольцо.

Полиеновые антибиотики нистатин, леворин, амфотерицин В, имеющие несколько сопряженных двойных связей (СН'СН

32. Механизм действия антибиотиков

1. Ингибиторы синтеза клеточной стенки. бета-лакткмные.

2. Ингибиторы синтеза белка (левомицитин, тетрациклин, аминогликозиды)

3. Ингибиторы синтеза ДНК и РНК (фторхинолоны, многие противоопухолевые антибиотики)

4. Ингибиторы функции цитоплазматической мембраны (нистатин, полимексины).

5. Подавление синтеза НК:

а) РНК на уровне РНК - полимеразы.

б) ДНК на уровне ДНК

в) разрушение ДНК - гиразы, хинолоновые.

33. Побочное действие антибиотиков

1. Аллергические реакции (наиболее частые).

2. Вызывают дизбактериозы.

3. Оказывают токсическое действие

4. Иммунодепрессивное действие.

5. Возникновение а/б устойчивых форм бактерий.

34. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам

1. Естественная

2. Приобретенная:

а) фенотипическая

б) генотипическая - связана с изменением генетической активности, носит стойкий наследственный характер.

Пути возникновения:

1. Спонтанные мутации в ДНК

2. эписомальный или плазмидный (наличие R плазмиды)

Культура считается устойчивой, если ее рост не подавляется теми минимальными концентрациями АБ, которые обычно подавляют бактерии этого вида.

Биохимические аспекты устойчивости:

1. Синтез ферментов, разрушающих АБ

2. Модификация мишени, на которую действуют антибиотики.

3. Изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика

4. Повышение скорости выведения антибиотика

5. Повышение скорости продукции субстрата.

35. Методы изучения чувствительности микробов к антибиотикам

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведений в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы.

В качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах животного организма после введения определенных доз препарата Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата (мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК).

Метод бумажных дисков Для его проведения нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определённой концентрации, и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе (густота 1 млрд микробных тел в I мл), которую затем разводят в 10 раз. На поверхность плотной среды наливают 1-2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки Инкубируют в термостате при 37°С - 24 часа

Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны н таблице.

Культуру относят к одной из трех категорий.

чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая

Укачанные категории предложены клинической химиотерапией, исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз. К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуть при введении максимальных доз препарата. Устойчивые - культуры, рост которых не подавляется при введении даже максимально допустимых доз препарата.

Указанный метод является полу количественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений. Метод серийного разведения антибиотика в бульоне. Готовят ряд убывающих разведений антибиотика в пробирках с бульоном (кратные 2) и добавляют испытуемую культуру.

Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотика Через сутки инкубации в термостате определяют МПК. которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста.

Для определения бактерицидного действия из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на сектора чашки Петри с МПА. За бактерицидную концентрацию принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной Среде. Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе); 2-й и 3-й концентрациями как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе); 3-й как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно); растущие на всех трех концентрациях, относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять).

Ускоренные методы. Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаше всего пользуются методом. основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика

Ход работы: при использовании метода бумажных дисков или серийных разведений антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид).

В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах. В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (посев тест-микроба в жидкую среду с антибиотиком, инкубация 4-6 часов с последующим определением прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными).

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Полуколичественный - диффузии в агар с применением бумажных дисков с антибиотиками. Учет -

диамметр зон задержки роста микроорганизмов вокруг диска. Оценка: устойчивость - отсутсвие зоны;

малая чувствительность - зона до 10 мм; чувствительность - зона более 10 мм Задача выбрать

эффективный аппарат.

Количественные:

а) разведение антибиотиков в мясо-пептонном бульоне;

б) разведение антибиотиков в мясо-пептонном агаре.

Учёт - наличие или отсутствие роста микробов в питательной среде с различными концентрациями препарата.

Оценка - минимальное количество препарата, подавляющее рост бактерий (мин в мкг'мм) Задача: позволяет рекомендовать эффект антибиотика и его дозу Ускоренный:

а) полуколичественный с дисками и индикаторами. Оценка - диаметр неокрашенных зон вокруг дисков

б) количественный разведение антибиотиков в МБП с углеводами и РН- индикаторами. Оценка- изменение цвета среды в пробирках

36. Экология микроорганизмов. Типы экологических связей

Важнейшим объектом изучения экологической микробиологии является микробиоценоз. В естественных средах (почва, вода, воздух, живые организмы) микроорганизмы живут в виде сообществ, образуя экологические связи как между собой, так и с растениями, животными и человеком, а также с абиогенными факторами окружающей среды

Популяции микроорганизмов состоят из особей одного вида, который характеризуется leiepoieHnocTbK), так как содержит различные варианты Отношения между ними носят преимущественно симбиотический характер, хотя в некоторых случаях, например при разных темпах размножения в среде с лимитирующим источником питания, имеет место конкуренция.

Межвидовые взаимоотношения сложны, многообразны и динамичны. Они могут быть разделены на несколько видов

Нейтрализм - форма межвидовых отношений, при которой обитающие в одном биотопе популяции не оказываю! друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия.

При симбиозе обе популяции извлекают для себя пользу. Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм). Мутуализм наблюдается в тех случаях, когда симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Например, одна популяция синтезирует продукт, которой является основой питания для другой популяции Симбиоз наблюдается между аэробами и анаэробами, организмом человека и его собственной (аутохтон-ной) микрофлорой.