Размещено на http://www.allbest.ru/

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научно-методический центр пищевых инфекций

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин,

А.А. Щербаков, Л.В.Карпунина

Ульяновск 2007

УДК 619:616

Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии.

Предназначено для студентов факультета по специальности «Микробиология», специализаций: «Ветеринарный врач-бактериолог», «Ветеринарный врач-ветсанэксперт».

Ульяновск, ГСХА, 2008, 130 с.

Составители:

Дмитрий Аркадьевич Васильев, Сергей Николаевич Золотухин, Анатолий Анисимович Щербаков, Лидия Владимировна Карпунина.

Рецензент:

доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией микробиологии ВНИИЗЖ В.С. Русалеев.

Предлагаемое учебно-методическое пособие не может заменить практическую работу в лаборатории кафедры, и это не лабораторный практикум в его классическом понимании, но оно позволит студентам лучше подготовиться к экзаменам по всему курсу микробиологии. Данное учебно-методическое пособие подготовлено применительно к вузовскому курсу по специальности «Микробиология», специализаций: «Ветеринарный врач-бактериолог», «Ветеринарный врач-ветсанэксперт».

Пособие написано заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ Ульяновской ГСХА, д.б.н., профессором Васильевым Д.А., руководителем курса микробиологии Ульяновской ГСХА, профессором, д.б.н., Золотухиным С.Н, заведующим кафедрой микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., профессором Щербаковым А.А, профессором кафедры микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., Карпуниной Л.В.

Составители будут признательны получить отзывы, исправления, дополнения по адресу: 432002, Ульяновск-71, а/я 2683, Д.А. Васильеву.

Переиздание, 2008.

© Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Щербаков А.А., Карпунина Л.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Подобно общей части любой другой науки, общая бактериология рассматривает не конкретные вопросы (скажем, идентификацию отдельных видов бактерий), а проблемы в целом; ее методология охватывает основные процедуры, которые находят широкое применение в самых разнообразных лабораторных исследованиях. Данное учебно-методическое пособие не нацелено на идентификацию какой-либо группы микроорганизмов. Это задача следующих изданий - по частной и санитарной микробиологии. Однако методы, приведенные в нем, могут быть полезными в любой области, где приходится иметь дело с бактериями, и могут применяться для решения практических задач, включающих выделение и типизацию бактерий.

Бактериология стала наукой только после того, как были разработаны уникальные методы, благодаря которым она продолжает оказывать влияние и проникать в такие появившиеся позднее области науки, как вирусология, иммунология и молекулярная биология. Разработанная Р. Кохом техника использования чистых культур и впервые примененные Л. Пастером иммунологические реакции и химический анализ и сейчас не утратили своего значения.

Методология общей бактериологии отражена в данном издании с помощью такого построения, которое типично для стандартных учебных пособий по этой дисциплине. Однако, в отличие от лабораторных практикумов по курсу микробиологии для вузов, она по некоторым разделам изложена более детально и носит справочный характер. Данная структура учитывает особенность подготовки и специализации врачей-бактериологов и ветсанэкспертов. Часто материал излагается произвольно, поэтому некоторые методы упоминаются несколько раз, что обусловлено стремлением продемонстрировать их взаимосвязь.

Бактериологическая лаборатория

Бактериологические лаборатории как структурные единицы организуются в составе областных, районных, межрайонных ветеринарных лабораториях, а также в структуре зональных ветеринарных лабораторий. Они также организованы при центрах санитарно-эпидемиологического надзора, в инфекционных больницах, больницах общего типа, некоторых специализированных стационарах (например, в туберкулезных, ревматологических, кожно-венерологических), и в поликлиниках. Бактериологические лаборатории входят в состав специализированных научно-исследовательских учреждений. Бактериологические лаборатории постоянно используются для подтверждения или установления оценки пригодности мяса на пищевые цели по ВСЭ.

Объектами исследования в бактериологических лабораториях являются:

Выделения из организма: моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, патологический и трупный материал.

Объекты внешней среды: вода, воздух, почва, смывы с предметов инвентаря, корма, технологическое сырьё получаемое от убоя сельскохозяйственных животных.

Продукты питания, образцы мяса и мясопродуктов, молока и молокопродуктов, которым необходимо дать оценку на пригодность для пищевых целей.

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места

Специфика микробиологических работ требует, чтобы помещение, отведенное под лабораторию, было изолировано от жилых комнат, пищевых блоков и других непрофильных производственных помещений.

В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и зараженной посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; бактериологическая кухня - для приготовления, разлива, стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

Перечисленные подсобные помещения как самостоятельные структурные единицы входят в состав крупных бактериологических лабораторий. В небольших лабораториях бактериологическую кухню и стерилизационную объединяют в одной комнате; специальное помещение для содержания подопытных животных отсутствует.

Помещения микробиологических лабораторий по степени опасности для персонала разделяются на 2 зоны:

I. "Заразная" зона - помещение или группа помещений лаборатории, где осуществляются манипуляции с патогенными биологическими агентами и их хранение, персонал одет в соответствующий тип защитной одежды.

II. "Чистая" зона - помещения, где не проводят работу с биологическим материалом, персонал одет в личную одежду.

Под лабораторные комнаты, в которых производят все бактериологические исследования, отводят наиболее светлые, просторные помещения. Стены в этих комнатах на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской или покрывают кафелем. Пол застилают релином или линолеумом. Такого рода отделка позволяет пользоваться при уборке помещения дезинфицирующими растворами.

В каждой комнате должна быть раковина с водопроводной подводкой и полкой для бутыли с дезинфицирующим раствором.

В одной из комнат оборудуют застекленный бокс - изолированное помещение с тамбуром (предбоксником) для выполнения работ в асептических условиях. В боксе ставят стол для посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбокснике помещают шкаф для хранения стерильного материала. Окна и двери помещений "заразной" зоны должны быть герметичными. Имеющаяся вытяжная вентиляция из "заразной" зоны должна быть изолирована от других вентиляционных систем и оборудована фильтрами тонкой очистки воздуха.

Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок и реактивов.

Очень большое значение для работы имеет правильная организация рабочего места врача-бактериолога и лаборанта. Лабораторные столы устанавливают около окон. При размещении их нужно стремиться к тому, чтобы свет падал спереди или сбоку от работающего, лучше с левой стороны, но ни в коем случае не сзади. Желательно, чтобы комнаты для проведения анализов, особенно для микроскопирования, имели ориентацию окон на север или северо-запад, так как для работы необходим ровный рассеянный свет. Освещенность поверхности столов для работы должна быть 500 лк. Для удобства дезинфекции поверхность лабораторных столов покрывают пластиком или обивают железом. За каждым сотрудником лаборатории закрепляют отдельное рабочее место размером 15060 см.

Все рабочие места оборудуют предметами, необходимыми для повседневной бактериологической работы, перечень которых дан в таблице 1.

Таблица 1.

Необходимые предметы для бактериологической работы

Наименование предмета	Примерное количество
Набор красок и реактивов для окраски	1
Стекла предметные	25--50
Стекла покровные	25--50
Стекла с лунками	5--10
Штатив под пробирки	2
Петля бактериальная	1
Шпатели стеклянные	10
Шпатели металлические	1
Банка с ватой	1
Пипетки, градуированные на 1, 2, 5, 10 мл	По 25 каждого объема
Пипетки пастеровские	25--50
Пинцет, ножницы, скальпель	По 1
Емкости с дезинфицирующими растворами	2
Микроскоп с осветителем	1
Лупа 5	1
Масленка с иммерсионным маслом	1
Фильтровальная бумага	3--5 листов
Банка с дезинфицирующим раствором для пипеток	1
Спиртовая или газовая горелка	1
Установка для окраски препаратов	1
Песочные часы на 1 или 2 минуты	По 1
Груша с резиновой трубкой	1
Карандаш по стеклу	5
Банка со спиртовыми ватками	1
Необходимая стерильная посуда	-

Правила работы и поведения в лаборатории

Особенностью бактериологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, зараженными животными и выделениями больных. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать правила работы, которые обеспечивают стерильность и предупреждают возможность возникновения аварий - нештатных ситуаций, при которых создается реальная или потенциальная возможность выделения патогенного агента в воздух производственной зоны, окружающую среду или заражения персонала.

1. В помещение бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды - халата, белой шапочки или косынки, сменной обуви.

2. Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

3. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

4. В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания.

5. Весь материал, поступающий в бактериологическую лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный.

6. При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или в кюветы.

7. Перенос жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят пипеткой с грушей.

8. О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или при пролитии жидкого заразного материала надо немедленно сообщать заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязненных патогенным материалом платья, частей тела, предметов рабочего места осуществляются немедленно.

9. При исследовании зараженного материала и работе с патогенными культурами микробов необходимо строго соблюдать общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом.

10. Зараженный материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день. Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас после их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места.

11. При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют, а заразный материал и культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят на хранение в запирающийся рефрижератор или сейф.

12. Работники бактериологических лабораторий подлежат обязательной вакцинации против инфекционных болезней, возбудители которых могут встретиться в исследуемых объектах.

Детальнее техника безопасности при работе в бактериологических лабораториях описана в методических указаниях, составленных Д.А. Васильевым и А.А. Нафеевым

Уборка лабораторного помещения

Помещение лаборатории ежедневно до начала работы следует убирать влажным способом. Пыль с поверхностей протирают увлажненной тряпкой, смоченной дезинфицирующим раствором. После окончания работы стены, покрытые метлахскими плитками или окрашенные масляной краской, моют горячей водой с мылом или стиральным порошком. Полы моют 3-5% раствором дезинфектанта. Потолки, карнизы, верхнюю часть стен, окрашенные клеевой краской, не реже одного раза в неделю очищают от пыли пылесосом.

Подготовка бокса к работе. Помещение бокса регулярно обрабатывают следующим образом: ежедневно перед началом работы полы протирают дезинфицирующим средством (2%-5% раствором хлорамина); воздух обеззараживают бактерицидными лампами, установленными на высоте 2--2,5 м от поверхности пола, из расчета одна лампа БУВ-ЗО (1,5--2,5 Вт) на 1 м3 помещения. При указанных условиях бокс облучают 2--3 ч. Перед началом работы лампы выключают. При отсутствии бактерицидных ламп непосредственно перед работой производят дезинфекцию бокса, протирая помещение 5% раствором хлорамина.

Чтобы предотвратить заражение бокса, образцы материалов, подлежащие исследованию, вносят в бокс после предварительного тщательного протирания 3% раствором формалина. По этим же соображениям работа в боксе проводится в стерильных халатах, защитных масках и тапочках, специально предназначенных для бокса.

Воздух в боксе следует регулярно, не менее 2 раз в неделю, проверять на бактериальную обсемененность.

Для проверки чашки с мясо-пептонным агаром и средой Сабуро оставляют открытыми в течение 15 минут. Посев на мясо-пептонном агаре выдерживают в термостате 48 ч при 37°С, чашки со средой Сабуро -- 96 ч при 22°С. Допустимым ростом считается не более 5 колоний на чашках. Количество колоний, превышающее 5 при 15-минутной экспозиции, является показателем высокой обсемененности воздуха бокса. В этих случаях помещение бокса нуждается в дополнительной, более тщательной обработке. Не менее одного раза в неделю помещение бокса моют горячей водой с мылом, дезинфицирующими средствами и протирают досуха.

Уборка рабочего места. По окончании работы берут пинцетом кусок ваты, смачивают его в 5% растворе хлорамина или в 5% растворе формалина и протирают им поверхность стола на рабочем месте. Такого рода повседневная дезинфекция носит профилактический характер.

Мытье и обработка лабораторной посуды

Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований -- и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных результатов.

Для мытья лабораторной посуды в микробиологических лабораториях отводится отдельное помещение -- моечная, или специальное рабочее место, которое обеспечивается большой раковиной с подводкой горячей и холодной воды, нагревательными приборами: газовой или электрической плитой.

В моечной необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щетки и доски с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую сетку, чтобы предупредить засорение канализационной сети частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды.

Надписи, сделанные на стекле восковым карандашом, легко снимаются щеткой либо кусочком влажной марли с меловым порошком или содой.

Для устранения налета белого цвета, нередко появляющегося на стекле, посуду помещают на 30--40 минут в 5--10% раствор соляной кислоты.

Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают в хромовой смеси. Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых или газообразных продуктов. Перед употреблением хромовую смесь подогревают до температуры 45--50°С, а затем заливают ею грязную посуду. Работать с хромовой смесью необходимо с осторожностью, в фартуке и резиновых перчатках, после тщательно промывать посуду.

Мытье новой лабораторной посуды. В ведре с теплой водой растворяют хозяйственное мыло, чтобы образовалось небольшое количество пены, погружают в нее посуду и ставят на слабый огонь. После 15-минутного кипячения посуду вынимают, ополаскивают чистой водой, погружают в теплый 1--2% раствор соляной кислоты, доводят до кипения и вываривают 10--15 минут, чтобы нейтрализовать избыток щелочи, который мог остаться при изготовлении стекла. После кипячения в кислоте посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной.

При мытье посуды, служащей для постановки серологических реакций, кислоты и щелочи использовать не рекомендуется, так как даже следы этих веществ, оставшиеся на стенках, могут исказить результат реакции. Такую посуду моют горячей водой, кладут на сетки, чтобы с нее стекла вода, затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу.

Мытье лабораторной посуды, бывшей в употреблении. Посуда, в которой содержался зараженный материал, поступает в мойку после предварительной дезинфекции, гарантирующей гибель находящихся в ней патогенных микробов. Перед мытьем из пробирок, чашек и матрацев обеззараженную жидкость выливают в канализацию. Не очень загрязненную посуду моют ершом в горячей воде с мылом, содой или в растворе горчицы. Посуду со следами агара, желатина или другой питательной среды за сутки перед мытьем заливают 2--2,5% раствором едкого натра или едкого кали. Очень загрязненную жирную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, заливают на 30--40 минут хромовой смесью, а затем в течение продолжительного времени промывают сначала проточной водопроводной, затем -- дистиллированной водой.

Надежный способ мытья и обеззараживания лабораторной посуды предложен Г.П. Кирсановым (1972). Отработанную лабораторную посуду (пробирки, чашки Петри, предметные стекла с мазками после иммерсионной микроскопии и пр.) стерилизуют в автоклаве в течение 2 ч при 2 атм. Далее посуду загружают в бак и заливают раствором, содержащим на 100 мл дистиллированной воды 5 мл нашатырного спирта и 3 г порошка для стирки хлопчатобумажного и льняного белья. Лабораторная посуда хорошо отмывается и обезжиривается в течение 30 минут кипячения в указанном растворе, затем ее прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. После этого посуду высушивают в сушильном шкафу. Для обработки посуды, применявшейся для выращивания микобактерий туберкулеза на яичных питательных средах, А.В. Ивановым и соавт. (1974) предложен простой способ. Использованные пробирки со средами автоклавируют при 1,5 атм в течение 30 минут, затем по 250--300 штук укладывают в бачки или эмалированные ведра с плотной крышкой, заливают 1% раствором едкого натра и кипятят 2 ч. Во время кипячения остатки питательной среды растворяются и образуется однородная жидкая мыльно-щелочная смесь, способствующая освобождению пробирок от плотных остатков среды. После 2 ч кипячения мыльно-щелочной раствор сливают для повторного использования (раствор может быть использован 3--4 раза). Прокипяченные отмытые пробирки несколько раз прополаскивают водопроводной водой и высушивают.

Посуду, используемую для приготовления и хранения питательных сред и культивирования микробов, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами, так как даже следы их делают питательную среду непригодной для размножения микроорганизмов.

Мытье градуированных пипеток. Пипетки и другая градуированная посуда, поступающая для работы, должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. На стенках плохо обезжиренной посуды при выливании жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления.

Новые градуированные пипетки, не бывшие в употреблении, моют следующим образом. С помощью резинового баллончика, надетого на пипетку, насасывают в нее горячую мыльную воду и затем погружают в сосуд с такой же водой. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответствовать высоте пипеток. Выдержав 20--30 минут в мыльном растворе, пипетки прополаскивают водопроводной водой и переносят в 1--2% раствор соляной кислоты, который постепенно доводят до кипения. Далее пипетки обрабатывают так же, как и остальную стеклянную посуду.

Пипетки, бывшие в употреблении, тщательно протирают тонкой упругой проволокой, на конец которой плотно накручивают кусочек ваты или марли в виде сливы. Для того чтобы загрязнения снимались быстрее и легче, пользуются горячей мыльной водой, раствором питьевой соды или стирального порошка.

Закупорившийся канал пипетки прочищают тонкой проволокой или мандреном от тонких игл шприцев. Промытые пипетки складывают в таз, заливают теплым раствором горчицы или мыльной водой и ставят на слабый огонь. После 20--30-минутного кипячения пипетки вынимают и несколько раз ополаскивают сначала теплой проточной, а затем дистиллированной водой.

Сильно загрязненные пипетки также очищают вначале ершом с мылом или содой, а затем погружают в хромовую смесь, налитую в ванночку или банку, по высоте соответствующую длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдерживают 20--30 минут, затем в течение нескольких минут промывают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой.

Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи.

Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после ополаскивания заливают смесью Никифорова (этиловый спирт:эфир в соотношении 1:1). Если стекла, вынутые через 2--3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2--5% раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20--30 минут. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10--15 минут в 5--10% раствор соляной кислоты, и затем промывают проточной и дистиллированной водой.

Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим способом:

- опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой;

- заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое кали или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в течение 30--40 минут.

Силиконирование лабораторной посуды. Тщательно вымытую и обезжиренную посуду высушивают и заливают на несколько минут при комнатной температуре 3% раствором полиметилсилоксановой жидкости (марка ПMC-200 или ПМС-300) в хлороформе. При этом на поверхности стекла образуется тончайшая органосиликоновая пленка с хорошими гидрофобными и адгезивными свойствами. Жидкость можно использовать многократно. Обработанную таким образом посуду помещают на 2 ч в сушильный шкаф при температуре 180--210°С, после этого посуда готова к употреблению. Пленка не смывается водой и не разрушается кислотами. Для ее удаления посуду следует в течение 2 ч кипятить в 10% растворе щелочи.

Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Высушенную посуду просматривают на свет. Стекло ее должно быть совершенно прозрачным, без матового налета и пятен.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре (холодная сушка) или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 100--105°C.

Чисто вымытую и высушенную посуду, закрытую пробками с бумажными колпачками или без них, хранят в местах, надежно защищенных от пыли, лучше всего в плотно закрывающемся шкафу.

Дезинфекция

Дезинфекцией является уничтожение микроорганизмов в объектах внешней среды.

В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразным материалом, сотрудники бактериологических лабораторий производят профилактическую дезинфекцию рук и рабочего места.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (кал, моча, мокрота, различного вида жидкость, кровь) перед выбрасыванием его в канализацию.

Загрязненные патологическим материалом или культурой микробов градуированные и пастеровские пипетки, стеклянные шпатели и металлические инструменты тотчас после их употребления опускают в стеклянные банки с дезинфицирующим раствором, находящиеся на столе у каждого рабочего места.

Обязательной дезинфекции подлежат также использованные в работе предметные и покровные стекла, так как даже в фиксированном и окрашенном мазке иногда сохраняются жизнеспособные микроорганизмы, которые могут явиться источником внутрилабораторного заражения. Не обрабатывается дезинфицирующими средствами только та посуда, в которой выращивались микроорганизмы. Ее складывают в металлические бачки или биксы, пломбируют и сдают на автоклавирование.

Выбор дезинфицирующего вещества, концентрация его раствора, соотношение между количеством дезинфицирующего вещества и обеззараживаемого материала, а также продолжительность срока дезинфекции устанавливаются в зависимости от конкретных условий, учитывающих в первую очередь устойчивость обеззараживаемых микробов, степень предполагаемого загрязнения, состав и консистенцию материала, в котором они находятся.

Дезинфекция рук после работы с заразным материалом и при попадании его на кожу. По окончании работы с заразным материалом руки профилактически дезинфицируют. Ватный шарик или марлевую салфетку смачивают 1% раствором хлорамина, протирают сначала левую, затем правую кисть руки в такой последовательности: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. Таким образом, сначала обрабатывают места наименее загрязненные, затем переходят к участкам кожи, загрязненным наиболее сильно. Протирают руки в течение 2 минут двумя тампонами последовательно. При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материалом в первую очередь дезинфицируют загрязненные участки кожи. С этой целью их покрывают на 3--5 минут ватой, увлажненной 1% раствором хлорамина, затем вату сбрасывают в бачок или ведро с отработанным материалом, а руки обрабатывают вторым тампоном так же, как и при профилактической дезинфекции. После обработки хлорамином руки моют теплой водой с мылом. При работе с бактериями, образующими споры, обработка рук производится 1% активированным хлорамином. При попадании на руки заразного материала экспозицию дезинфицирующего вещества увеличивают до 5 минут.

Стерилизация

Стерилизация, в отличие от дезинфекции, предусматривает уничтожение в стерилизуемом объекте всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.

Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования

Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1--10 штук. Пастеровские пипетки по 3--15 шт. заворачивают в оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2--2,5 см и длиной 50--70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 180°С и 160°С соответственно 1 ч и 150 минут.

б) в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 60 минут, для уничтожения споровой микрофлоры - 90 минут при 2 атм.

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобранном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидрокарбоната натрия 30 минут. При работе со спороносной микрофлорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2°С (2 атм.) в течение 20 мин, при 126±2°С (1,5 атм.) -- 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, предварительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) стерилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.

Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание в целом занимает 5--7 с.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 минут; при загрязнении спороносной микрофлорой--в автоклаве при давлении 1,5--2 атм. в течение 30 или 20 минут. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком для предохранения их от склеивания. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помещают в биксы.

Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 минут при давлении 1 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале. При уничтожении культур микробов I и II групп патогенности, а также материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с отработанным материалом переносят на металлических подносах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.

Виды стерилизации

Стерилизация кипячением. Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы--в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне 30-60 минут. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.

Стерилизация сухим жаром. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С - 1 ч, при 180°С - 40 мин, при 200°С - 10-15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизация паром под давлением. Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутренний -- стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые проходит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава герметически привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для определения давления, создающегося в стерилизационной камере. Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 2).

Таблица 2.

Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды

Показания манометра, атм.	t кипения воды,°C	Показания манометра, атм.	t кипения воды,°C
0,0	100°	0,8	117°
0,2	105°	0,9	119°
0,4	110°	1,0	121°
0,5	112°	1,5	127°
0,6	114°	2,0	134°
0,7	116°

Красная черта на шкале манометра определяет максимальное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, то есть, давление, при котором нужно производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления.

На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты -- нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой камере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилизации, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, нарушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала.

Правила работы с автоклавом. Перед началом работы осматривают автоклав и контрольно-измерительную аппаратуру. В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: нижнюю стрелку ставят на 0,1 атм. ниже, верхнюю--на 0,1 атм. выше рабочего давления, водопаровую камеру заполняют водой до верхней отметки мерного стекла. В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла. Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку (или дверцу) автоклава закрывают, плотно закрепляя центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса, болты завинчивают крест-накрест (по диаметру). Затем включают источник подогрева (электрический ток, пар), закрывая вентиль на трубе, соединяющей источник пара со стерилизационной камерой. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку (удаление воздуха из стерилизационного котла). Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают, и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления.

Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку автоклава.

Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.

Контроль температуры в стерилизационной камере осуществляется периодически с помощью бактериологических тестов. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями ЦСЭН. В случае непрохождения данных тестов производят проверку технического состояния автоклава.

Стерилизация текучим паром. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколько небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют, главным образом, питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеззараживания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 минут ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация. Тиндализация--дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемoгo материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60--65°С в течение 5 дней или при 70-- 80°C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерии.

Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3--5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: «Ф» (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии, и «СФ» (стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерии. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.

Бактериальные фильтры различаются по величине пор и обозначаются порядковыми номерами (табл. 3).

Таблица 3.

Бактериальные фильтры

No фильтра	Средний диаметр пор, мкм
1	0,3
2	0,5
3	0,7
4	0.9
5	1,2

Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-- 60°С, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 минут, меняя 2--3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Для фильтрации жидкостей бактериальные фильтры монтируют в специальные фильтровальные приборы, в частности, в фильтр Зейтца.

Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней--опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой находится в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации места соединения различных частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному нacocy. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают насос, создающий вакуум в приемном сосуде. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.

Микроскопические методы исследования

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например, метиленового синего или фуксина. Вторые предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух и более красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения), помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным группам.

Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов

Для исследования живых бактериальных клеток разработан ряд методов. При микроскопии можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения. Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причиной ряда морфологических изменений.

Ниже мы приводим методы, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.

Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05--0,1 мл) помещают на чистую обезжиренную поверхность предметного стекла (толщиной 0,8--1,0 мм), затем накрывают ее покровным стеклом. Последнее имеет форму квадрата со стороной 22 мм, толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или 11/2). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смещение или высыхание, зазор между покровным и предметным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного воска) или прозрачным лаком для ногтей.

В течение короткого промежутка времени в этих препаратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород истощится, бактерии прекращают движение.

Для рассматривания влажных препаратов рекомендуется фазово-контрастная микроскопия, причем для получения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промокательной бумаги, положенный поверх покровного стекла для герметизации, способствует выводу излишнего количества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения. Тепло от источника света может нарушить оптимальные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в течение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, даваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом наблюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, заполненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора (50 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды).

Поступательное перемещение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев иммерсионный масляный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками. Чтобы убедиться в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.

Если используется обычный конденсор и масляно-иммерсионный объектив, для улучшения контраста количество света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наиболее демонстративный) способ наблюдения за подвижными микроорганизмами при малом увеличении--это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специальные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контрастного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контрастных) объективов с увеличением 10 или 45. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а положение конденсора, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным увидеть под малым увеличением даже спирохеты.

Некоторым бактериям присущ особый тип поступательного движения при контакте с твердой поверхностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возобновляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие наружных локомоторных органелл. Такого типа подвижность можно предположить, если при микроскопическом обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.

Скольжение следует отличать от роения, которое выражается в движении за счет жгутиков в особых условиях. Роение--это распространение микроорганизмов по относительно сухой поверхности, например, агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний. У наблюдаемых при этом скоплений постоянно меняются очертания -- от коротких языковидных выступов и изолированных групп до переплетающихся полос, чередующихся с пустотами. В местах этих пустот видны следы движения, часто рассматриваемые в качестве признака скольжения и хорошо сохраняющиеся фиксацией по Боуэну in situ. Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообразные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступательное перемещение путем скольжения происходит со скоростью 10--15 мкм/с.

Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования пузырьков. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.