Взятие крови из вен у морских свинок, крыс и мышей. У морских свинок кровь в количестве 0,3--0,5 мл получают после нанесения насечек на край уха или прокола мягких подушек лапы.

У белых крыс и мышей для получения 1--3 капель крови приходится прибегать к ампутации кончика хвоста после продолжительного прогревания его в воде температуры 45--50°С или протирания ксилолом. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода.

Есть способ, позволяющий получить у крыс 0,5--1 мл крови из венозного сплетения, лежащего в орбите, позади глазного яблока. Взятие крови производят стеклянной пипеткой с оттянутым капилляром (наружный диаметр 0,6 мл), острие которого сточено под углом 45°.

Животное берут I и II пальцами левой руки со стороны спины за шею и слегка сдавливают с боков, вызывая легкое выпячивание глаз. Вращательным движением пипетки делают прокол конъюнктивального мешка в медиальном углу глаза между глазным яблоком и орбитой. После прокола пипетку ведут в направлении гортани на глубину 4--5 мм. Попадание в венозное сплетение сопровождается заполнением капилляра пипетки кровью.

Получение дефибринированной крови. Кровь животного сливают в стерильную колбу со стеклянными бусами и непрерывно в течение 10--15 мин встряхивают. В результате встряхивания находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы, а дефибринированная кровь, слитая в другую колбу или пробирку, утрачивает способность свертываться.

Приготовление взвеси эритроцитов. Для освобождения от пленок фибрина дефибринированную кровь фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000--3000 об./мин. в течение 10--15 минут. Эритроциты оседают на дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует надосадочный слой. После центрифугирования уровень жидкости в пробирке отмечают карандашом, отсасывают плазму пастеровской пипеткой, эритроциты промывают, доливая до метки стерильный изотонический раствор хлорида натрия, и вновь центрифугируют. Промывание эритроцитов с добавлением свежего раствора производят 2--3 разa, чтобы последняя порция промывной жидкости была бесцветна.

Из промытых эритроцитов готовят 3% или 5% взвесь, прибавляя к 3--5 мл эритроцитов соответственно 97--95 мл изотонического раствора хлорида натрия (для получения меньших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьшают в одинаковое число раз).

Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3--4°С в течение 5--6 дней.

Приготовление сыворотки крови. Кровь, собранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20--30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37°С, так как в тепле кровь свертывается быстрее и лучше. Во время свертывания сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после взятия пробирок из термостата сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.

После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3--4°С. В течение 3--4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно отсосать стерильной пастеровской пипеткой. Для того чтобы во время отсасывания содержимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пипетку соединяют со стеклянной трубкой -- «мундштуком» (резиновая трубка длиной 20--25 см). При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты.

Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000--3000 об./мин. в течение 10--15 мин для осаждения форменных элементов крови.

При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими интервалами возникает иногда липемия, т. е. появление избытка жировых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время липемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, особенно реакции преципитации. Во избежание получения мутных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветление липемической плазмы наступает также при введении в кровеносное русло животного гепарина, способствующего повышению концентрации в крови фермента, называемого фактором просветления. С этой целью кроликам весом 2--2,5 кг в краевую вену уха вводят за 1--1,5 ч до обескровливания 60 мг гепарина.

Форменные элементы из крови удаляют центрифугированием. В слитой с осадка плазме через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уплотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Для удаления остатков фибрина и выявления полноты его удаления к сыворотке прибавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фибрина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полученная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.

Приготовление цитратной крови. Полученную из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5% раствором цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.

Приготовление плазмы крови. Цитратную кровь ставят на 18--20 ч в холодильник или подвергают центрифугированию. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета--плазмы.

Умерщвление и вскрытие лабораторных животных

В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю, безболезненную смерть животного. Мышей, крыс, морских свинок помещают в стеклянную, плотно закрывающуюся банку с кусочком ваты, пропитанным хлороформом или эфиром. Животные засыпают и гибнут в течение 3--5 минут. Кроликов умерщвляют посредством воздушной эмболии. Для этого в краевую вену уха по направлению к его основанию вводят иглу шприца. Появление капельки крови свидетельствует о том, что игла находится в вене. После этого иглу соединяют с пустым 10-граммовым шприцем, поршень которого вытянут до конца. При надавливании на поршень в кровеносную систему животного поступает находящийся в цилиндре шприца дух, вызывая эмболию и быструю смерть.

Вскрытие животных

Трупы лабораторных животных вскрывают с целью выяснения причин гибели, выделения введенного возбудителя, выявления механизма распространения микробов в организме и места их локализации, изучения патологоанатомических изменений, наступающих в результате перенесенной инфекции. Вскрытие трупов животных производят стерильными инструментами, соблюдая правила асептики.

На столе должны находиться стакан, наполненный до половины спиртом, стерильные ножницы, скальпель, анатомические и хирургические пинцеты, бактериальная петля, стерильные чашки Петри, пробирки и чашки с питательными средами, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, стерильный изотонический раствор хлорида натрия, банка с дезинфицирующим раствором, ватные тампоны, спички и горелки (спиртовая и газовая). Вскрытие трупов следует производить таким образом, чтобы предупредить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину тканей, а также перенос микробов из одного органа в другой. С этой целью рекомендуется вскрывать животных в агональном состоянии, усыпив их эфиром, или тотчас после наступления смерти, так как в ближайшие часы после нее проницаемость тканей нарушается, и бактерии из одного органа могут проникнуть в другой. Особую опасность в этом отношении представляет кишечник, содержимое которого изобилует микробами.

Труп животного брюшком кверху кладут на деревянную доску или лоток с пластинкой застывшего парафина, растягивают пинцетом все 4 лапы и в таком положении фиксируют их булавками или небольшими острыми гвоздиками к поверхности дерева или парафина. Грудь и брюшко протирают ватой, смоченной 5% раствором карболовой кислоты или 5% раствором хлорамина, или, лучше, смачивают спиртом и поджигают шерсть, чтобы содержащиеся на ней микробы, в том числе спороносные палочки, не разлетались и не загрязняли стерильные инструменты и органы вскрытия трупа. В процессе вскрытия придерживаются общепринятого порядка. Сначала исследуют наружные покровы и подкожную клетчатку, затем проводят вскрытие, исследование и взятие материала из органов грудной полости, а в последнюю очередь вскрытие, исследование и взятие материала из органов брюшной полости.

Обработанную кожу разрезают по средней линии живота протяженностью от симфиза до грудино-ключичного сочленения. На уровне передних и задних лап делают боковые надрезы. Кожные лоскуты отпрепаровывают от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны, прикалывая булавками к доске.

В протоколе вскрытия отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху и подмышечных впадинах. Подкожная клетчатка может быть развита сильно, слабо или умеренно. Подмышечные и паховые узлы обнаруживаются легко. При осмотре узлов обращают внимание на их величину, форму и цвет. Для бактериологического исследования лимфатические узлы раздавливают стерильным пинцетом и погружают в жидкую питательную среду или втирают в поверхность плотной питательной среды.

Сменив или простерилизовав использованные для вскрытия кожных покровов инструменты, приступают к вскрытию грудной клетки. Грудину, захваченную пинцетом, слегка приподнимают, делают под ней небольшой надрез, вводят в него браншу ножниц и перерезают ребра вначале с одной, а затем с другой стороны. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Вновь сменив ножницы или протерев их ватой, смоченной спиртом, разрезают перикард, обнажая поверхность сердца. Накаливают на пламени горелки бранши пинцета или скальпель, прижигают поверхность сердца, затем стерильным пинцетом оттягивают кверху ушко правого предсердия и после этого через прижженное место вводят в полость желудочка или предсердия капилляр пастеровской пипетки. Кровь, поднявшуюся по капилляру пипетки, засевают в питательную среду.

Далее приступают к осмотру органов, расположенных в грудной полости, регистрируя в протоколе имеющиеся в них изменения, например наличие экссудата в полости плевры, абсцессы, гиперемию (багрово-красное окрашивание) или, наоборот, ишемию (малокровие) в легких. Кусочки легкого с выявленными в нем изменениями вырезают для бактериологического исследования.

После этого, сменив инструменты, переходят к исследованию органов брюшной полости. Передний листок брюшины вскрывают ножницами. При наличии экссудата в брюшной полости делают из него мазок и производят посев в питательную среду. Затем осматривают печень, селезенку, почки, отмечая цвет, величину органов, характеризуя их консистенцию (нормальная, дряблая, уплотненная, хрупкая) и имеющиеся очаги поражения, например абсцессы.

При локализации инфекционного процесса в желудочно-кишечном тракте делают посев содержимого желудка и кишечника, набирая его в пастеровскую пипетку через прижженную желудочную и кишечную стенки. Таким же образом для посева берут экссудат, содержимое абсцессов, желчного и мочевого пузыря.

Из паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка) взятие материала и засев его производят одним из следующих способов.

У стерильной пастеровской пипетки обламывают кончик и проводят ее через пламя горелки. Затем капилляром пипетки прокалывают прижженный участок исследуемого органа и насасывают в нее тканевую жидкость, которую засевают в питательную среду. Пипетки после использования опускают в банку с дезинфицирующим раствором.

Прижженную поверхность органа надрезают стерильным скальпелем и из глубины надреза соскабливают бактериальной петлей небольшое количество материала, которое затем вносят в питательную среду.

На прижженной поверхности органа делают надрез, остроконечными ножницами из глубины его вырезают маленький кусочек, раздавливают между браншами пинцета и опускают в жидкую питательную среду или срезом кусочка делают отпечатки на поверхности плотной питательной среды.

Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа, а также результаты бактериологического исследования вносят в протокол вскрытия и бактериологического исследования трупного материала, составленный примерно по такому образцу:

Вид лабораторного животного, взятого в опыт.

Время заражения (месяц, число, час).

Материал, примененный для заражения (взвесь микробов с плотной питательной среды, бульонная культура, взвесь патологического материала и т. д.).

Время гибели животного (месяц, число, час).

Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов; изменения, найденные во внутренних органах.

Вид микроба, выделенного из трупного материала, его основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства.

После вскрытия трупы животных складывают в металлические бачки с плотно закрывающимися крышками и засыпают сухой хлорной известью. Трупы мелких лабораторных животных можно заливать раствором различных дезинфицирующих веществ: 5% раствором карболовой кислоты, 3--5% мыльно-карболовым раствором, 3--5% раствором хлорамина. Трупы животных, погибших от заражения споровыми формами микробов, заливают хлорно-известковым молоком или 5--10% осветленным раствором хлорной извести. В дезинфицирующем веществе трупы животных хранят до момента их сжигания.

Определение вирулентности микробов

Вирулентность -- биологическое свойство микроба, характеризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видовым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезновения под влиянием различных факторов внешней среды.

Для характеристики вирулентности пользуются количественными показателями, определяющими способность исследуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулентности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она определяется не только комплексом культурно-морфологических, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении вирулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.

Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболевания, пользуются другими видами животных: крысами, морскими свинками или кроликами.

Для определения вирулентности применяют молодую культуру микроба, так как старые культуры содержат большое количество мертвых клеток.

Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изотоническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по оптическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содержалось определенное количество микробных тел. В зависимости от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количество микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может колебаться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по каким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения минимальной летальной дозы из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д.

Исследуемую взвесь бактерий вводят различными способами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраназально--в зависимости от целей и задач исследования.

Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.

Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной дозы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие данные:

количество микробов, введенных в организм животного;

способ их введения;

масса тела зараженного животного;

сроки гибели после заражения.

Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:

Минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis minima), т.e. наименьшая доза микробов, которая при определенном способе заражения, в определенных условиях опыта вызывает гибель около 95% подопытных животных.

Наименьшая безусловно смертельная доза Dll (Dosis lerie letalis) -- наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт.

Средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis letalis 50%)--доза микробов, вызывающая гибель 50% зараженных животных.

Показатель LD50 позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практике экспериментальных исследований.

В отличие от Dlm и Dll, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с достаточно высокой точностью получаемых результатов.

Определение токсигенности микробов

В патологии человека большую роль играют токсигенные микроорганизмы, к которым относятся возбудители ботулизма, столбняка, газовой анаэробной инфекции, дифтерии, а также некоторые штаммы бактерий дизентерии Григорьев -Шига, стафилококка и стрептококка и некоторые другие.

Экзотоксины, вырабатываемые различными представителями этой группы микробов, обладают резко выраженной токсичностью, высокой избирательностью действия с поражением отдельных органов и тканей и способностью при парентеральном введении в организм вызывать образование антител--антитоксинов, способных нейтрализовать соответствующие им экзотоксины.

Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Бульонную культуру микроба выдерживают в термостате в течение 2--3 недель для накопления в ней токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит неразведенный токсин.

Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, являются минимальная смертельная доза (Dlm) и средняя смертельная доза (LD50).

Для определения Dlm и LD50 фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Каждую дозу токсина испытывают одновременно на 6--10 животных. Для постановки проб подбирают животных, наиболее чувствительных к исследуемому токсину. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин--на мышах.

При учете полученных результатов в протоколе опыта отмечают дозу введенного токсина, способ его введения, массу тела животного и время наступления его гибели после введения токсина.

бактерия микроорганизм лаборатория

Литература