Методы общей бактериологии
Помещение бактериологической лаборатории, оборудование рабочего места. Приготовление препаратов для микроскопирования живых микроорганизмов. Сущность и характеристика различных методов исследования бактерий. Изучение биохимических свойств микроорганизмов.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | учебное пособие |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 11.11.2012 |
| Размер файла | 1,3 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. По одну сторону линии (края) видно множество мельчайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверхности покровного стекла, по другую сторону линии фон равномерно серого цвета -- искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильную (40 или иммерсионную) систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.
Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопии толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных--0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения остается совершенно темным, а микробные тела, отражающие лучи света, освещены очень ярко.
Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. При отсутствии специального берут обычный конденсор Аббе, развинчивают и вкладывают между его линзами кружок черной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.
При микроскопии препаратов в темном поле зрения на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кедрового или вазелинового масла, поверх которой очень осторожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопии с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись.
Метод висячего агарового слоя. Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление -- пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. Покровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло.
Негативное окрашивание. Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли-(р)-оксимасляной кислоты, и о спорах. При его осуществлении взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток. Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерения длины и ширины клеток, так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.
В растворах нигрозина могут появиться посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора.
Приготовление мазков
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.
Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.
Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.
Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жидкого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.
Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе -- шлифованное -- стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.
Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.
Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.
После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.
Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени и приступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.
Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают последовательно несколько раз поверхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.
Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I - II групп патогенности.
Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.
Таблица 4.
Вещества для химической фиксации
|
Фиксирующее вещество |
Время фиксации, мин |
|
|
Безводный метиловый спирт |
5 |
|
|
Этиловый спирт 96% |
10--15 |
|
|
Жидкость Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1) |
10--15 |
|
|
Жидкость Карнуа (этанола 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл) |
10-15 |
|
|
H2O2 3% в 96% спирте (для фиксации споровых микроорганизмов) |
30 |
Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.
Окраска мазков
Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А.И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящей бумаги в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.
Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 22 см. В течение всего времени окрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.
Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя.
Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенный промежуток времени. Чаще всего для простой окраски применяют спирто-водный (1:10) фуксин Пфейффера, леффлеровскую метиленовую синьку и сафранин. Эозин, как кислая краска, употребляется только для окраски цитоплазмы клеток и подкраски фона. Кислый фуксин совершенно непригоден для окраски бактерий.
При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спирто-водными растворами красок.
Для трудно воспринимающих окраску микробов (например, возбудитель туберкулеза) или их частей (споры, жгутики и пр.) приходится применять более интенсивные (форсированные) методы окраски.
Форсировать окраску можно: а) повышением красящей способности основных красок, б) удлинением срока окраски и в) действием протрав.
Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски.
Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.
Протравами являются вещества, облегчающие проникновение краски внутрь клеток: фенол, танин, уксусная и хромовая кислоты, щелочи и др. Механизм действия протрав различен: в одних случаях протравы действуют на краски, в других--на способность клеток к восприятию окраски. Протравами воздействуют на мазок или перед действием краски (например, при окраске жгутиков), или совместно с краской (фенол в фуксине Циля), или же после действия краски (люголевский раствор в методе Грама).
При окраске мазков, кроме красок, применяются еще так называемые обесцвечивающие или раскрашивающие вещества. Последние служат для удаления излишка краски из всей микробной клетки или же из ее части при слишком энергичной адсорбции краски материалом или при перекрашивании его с применением нагревания и т. п.
В качестве обесцвечивающих веществ применяются: спирт, 5% водный раствор серной кислоты, 20--30% водный раствор азотной кислоты, 3% раствор соляной кислоты в абсолютном алкоголе и др.
Для окраски мазков необходимо иметь на рабочем столе набор красящих растворов во флаконах (лучше оранжевого стекла) с пипетками и резиновыми баллончиками. Флаконы должны быть снабжены этикетками с соответствующими обозначениями; во избежание быстрого загрязнения красками этикетки рекомендуется пропитывать расплавленным парафином (при помощи кисточки). Флаконы с красками помещают в деревянный штатив - колодку (рис. 2).
Рис. 2. Флаконы для красок
Для смывания красок и ополаскивания мазков необходимы бутыль с тубусом на подставке для дистиллированной воды и кристаллизатор (сливная чашка) с подставкой-мостиком для мазков. Подставка-мостик представляет собой две стеклянные трубки или палочки, соединенные на концах отрезками резиновых трубок. Ширина подставки должна быть меньше длины предметного стекла. Кроме того, для окраски мазков необходимы спиртовая (или газовая) горелка и пинцет Корнэ для предметных стекол. При окраске с подогреванием предметное стекло захватывают пинцетом и выдерживают определенное время над пламенем. При продолжительной окраске употребляют кюветки или небольшие стаканчики, куда наливают краску и погружают в нее мазок. При одновременной окраске в кюветке нескольких мазков, для того, чтобы стекла не слипались, их соединяют по два намазанной стороной наружу и укрепляют резиновыми кольцами, нарезанными из трубок. После окраски мазки промывают водой и тщательно высушивают фильтровальной бумагой.
Работами последних лет выявлена возможность сохранения при окраске жизнеспособности микробов, главным образом, спороносных. Поэтому необходима достаточная фиксация мазков. Промывные воды (при окрасках) нужно сливать в специальный сосуд с последующим обезвреживанием, отработанную фильтровальную бумагу (после просушки мазков) не выбрасывать, а сжигать, использованные мазки дезинфицировать.
Простые методы окраски мазков
При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спирто-водного или водного раствора краски на 1--2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин (1:10) или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно фуксином (1:10) красят 10--30 секунд, а метиленовой синькой - 2-10 минут. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно, а при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще, продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.
Готовят два раствора:
Окраска по Муромцеву
|
Фуксин основной |
0,15 г. |
|
|
Спирт-ректификат 96% |
20 мл |
|
|
Карболовая кислота (кристаллическая) |
10 г. |
|
|
Метиленовая синька |
2,5 г. |
|
|
Дистиллированная вода |
200 мл. |
После растворения краски оба раствора смешивают и профильтровывают через бумажный фильтр. Краска сохраняется долгое время. Мазки красят через полоски фильтровальной бумаги в течение 15 - 30 секунд.
Фиксацию мазков автор рекомендует производить смесью спирта (80 частей) с формалином (20 частей) в течение 3--10 минут.
При данной окраске мазков в микробных клетках выявляются включения, биполярность, капсулы и споры. Метод удобен для окраски мазков из органов, крови, культур на средах с нативным белком и на полужидком агаре.
Фон препарата из указанных субстратов розовый; клетки ткани и микробные тела окрашиваются в голубовато-синие цвета.
Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков
Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной (основной) краской, а другое - дополнительной (контрастной). После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивыx.
Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.
Окраска по Граму
При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.
Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1--2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1--2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30--60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2--3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные -- в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).
Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отразиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы остался необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.
Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2--3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.
Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам контрольные препараты -- один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой -- из грамотрицательных.
При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно наливать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом стекающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10--30 секунд, в зависимости от толщины мазка.
Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.
Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По данным Саватеева, достаточно добавить 2--4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.
Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнительная окраска фуксином Пфейффера.
Видоизменения метода окраски по Граму
Как уже упоминалось выше, окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделить бактерии на две группы: грамположительные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор, как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубликованы многочисленные модификации окраски по Граму. Мазок бактерий для окрашивания на предметном стекле получают прямым методом из культуры на жидкой или твердой среде, но лучше всего приготовить его из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 5%-ном (объем/объем) формалине, сбор и промывку их центрифугированием, окупаются тем, что размер и форма клеток хорошо сохраняются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспорядочно разбросанные преципитаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендуется высушивать мазок на воздухе и фиксировать его нагреванием, как для простого окрашивания. Важно стандартизировать методику окраски по Граму. Одинаковые результаты дают еще два способа окраски -- в модификации Хукера и в модификации Берка.
Окраска по Граму в модификации Хукера
|
Раствор А для приготовления красящего реактива: |
||
|
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества) |
2,0 г |
|
|
Этанол 95% (объем/объем) |
20 мл |
|
|
Раствор Б для приготовления красящего реактива: |
||
|
Щавелевокислый аммоний |
0,8 г |
|
|
Дистиллированная вода |
80 мл |
Растворы А и Б смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.
|
Протрава: |
||
|
Йод |
1,0 г |
|
|
Йодистый калий |
2,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
300 мл |
Йод и йодистый калий размельчают в ступке и медленно добавляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока йод не растворится. Хранят в темной склянке.
|
Растворитель для обесцвечивания: |
||
|
Этанол 95% (объем/объем) |
||
|
Дополнительный краситель: |
||
|
Сафранин О [2,5% (вес/объем) в 95% (объем/объем) этаноле] |
10 мл. |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
Выполнение метода:
Высушенный на воздухе фиксированный нагреванием бактериальный мазок погружают на 1 минуту в красящий раствор кристаллического фиолетового.
Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.
Мазок помещают в йодную протраву на 1 минуту.
Промывают его в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего подсушивают промокательной бумагой.
Погружают мазок на 30 с в 95%-ный этанол, взбалтывая последний, после чего мазок подсушивают промокательной бумагой.
Погружают мазок на 10 с в дополнительный краситель.
Промывают мазок в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего подсушивают промокательной бумагой.
Окраска по Граму в модификации Берка
|
Раствор А: |
||
|
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества) |
1,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
|
|
Раствор Б: |
||
|
Двууглекислый натрий |
1,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
|
|
Йодная протрава: |
||
|
Йод |
1,0 г |
|
|
Йодистый калий |
2,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
Протраву готовят так же, как для модификации Хукера
|
Растворитель для обесцвечивания: ( осторожно, легко воспламеняется!) |
||
|
Этиловый эфир |
1 объем |
|
|
Ацетон |
3 объема |
|
|
Дополнительный краситель: |
||
|
Сафранин О (с 85% содержанием сухого вещества) |
2,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
Выполнение метода:
Высушенный на воздухе фиксированный нагреванием мазок погружают в раствор А, добавляют 2--3 капли раствора Б и выдерживают в течение 2 минут.
Отмывают мазок йодной протравой, после чего покрывают его на 2 минуты свежей протравой.
Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с. Поверхность вокруг мазка подсушивают промокательной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания.
На мазок при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий растворитель до тех пор, пока в стекающем со стекла растворителе не исчезнет окраска. После этого мазок подсушивают на воздухе.
На 5--10 с мазок погружают в дополнительный краситель.
Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают фильтровальной бумагой.
При использовании любой методики грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолетовый цвет, а грамотрицательные--в красный.
Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальный мазок слишком толст, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок чересчур обесцвечен; это особенно характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды рода Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если механически нарушена целостность их клеточных стенок в результате гибели клеток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажнения. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные мазки (со слабой замутненностью) из молодых, активно растущих культур, так как более старые культуры могут показывать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.
Модификация по Синеву.
Вариант Синева: вместо карболового или анилинового раствора генцианвиолета берут полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные следующим раствором:
|
Кристаллвиолет |
1 г |
|
|
Спирт 96° |
100 мл |
|
|
Глицерин (не обязательно) |
5 мл |
Кристаллвиолет может быть заменен метилвиолетом или генцианвиолетом в равных количествах. Через сутки стояния раствор краски готов и может сохраняться долгое время. Фильтровальную бумагу (один слой), помещенную на стекло, обливают указанным раствором краски, высушивают и режут на полоски размером 2040 мм; бумажки хранят в темной склянке с притертой пробкой.
Клемпарская предлагает для окраски препаратов по методу Грама в модификации Синева при отсутствии фильтровальной бумаги пропитывать 10% спиртовым раствором генцианвиолета полоски обыкновенной газетной бумаги (типографская краска не мешает). Техника окраски та же.
Техника окраски. На фиксированный мазок наливают 2--3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумаги, приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты смывают водой или, лучше, снимают пинцетом. Дальше производится обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска.
Модификация по Синеву особенно удобна для походных лабораторий, в экспедиционной работе и т. п.; получаются хорошие препараты, свободные от осадков, при малом расходе краски.
Клемпарская рекомендует готовить красящие бумажки для метода Грама и Циль-Нильсена по следующей прописи: для основной окраски (кристаллвиолет, генцианвиолет и метилвиолет) к 1 г краски добавить 10 мл спирта и 0,5 мл глицерина (краску всыпать в спирт и добавить глицерин), для фуксина -- 10 мл спирта; для дополнительной окраски (сафранин, метиленовая синька)--к 1 г краски добавить 10 мл нагретого до 45--50° спирта, 1 мл насыщенного водного раствора буры и 0,5 мл глицерина (сначала нагревают спирт, добавляют буру и глицерин, а затем краску); для раствора Люголя -- к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодистого калия и 10 мл дистиллированной воды.
Модификация по Эткинсу.
Для данной модификации можно применять любую из красок, относящихся к производным парарозанилина (кристаллвиолет, генцианвиолет или метилвиолет), с раствором сернокислого анилина. Растворы красок получаются очень стойкие и совершенно не дают осадков. Для окраски необходимы следующие растворы:
|
I. Генцианвиолет |
||
|
Насыщенный спиртовой раствор |
1 часть |
|
|
Сернокислый анилин (1% водный раствор) |
3 части |
При отсутствии готового сернокислого анилина таковой может быть приготовлен следующим образом. К 100 мл 5% водного раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обильный рыхлый белый осадок отфильтровывают, снимают с фильтра и разбавляют в 30 мл 95° спирта, а затем снова отфильтровывают и осадок высушивают.
|
II. Раствор йода |
||
|
Кристаллический йод |
2 г |
|
|
Едкий натр (4%) |
10 мл |
После растворения прибавляют 90 мл дистиллированной воды.
Для дополнительной окраски применяют спирто-водный сафранин (можно везувин или пиронин): 1 часть насыщенного спиртового раствора краски на 10 частей дистиллированной воды.
Техника окраски:
1) окрасить мазок раствором I в течение минуты,
2) промыть водой,
3) обработать раствором II в течение минуты,
4) обесцветить спиртом в течение 5 минут,
5) дополнительно окрасить в течение 10 секунд,
6) промыть водой и высушить.
Окраска кислотоустойчивых микробов
Кислотоустойчивость микробов зависит не только от наличия в них значительного количества липидов (около 36%), но и от ряда других химических и физических факторов. Так, например, установлено, что при нарушении целостности фиксированных клеток возбудителя туберкулеза путем растирания их между стеклами эти микробы теряют кислотоустойчивость.
Окраска по методу Циль-Нильсена
Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2--3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и промывают мазок водой.
Обесцвечивают препарат 5--10% водным раствором серной кислоты в течение 3--5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.
Мазок тщательно промывают водой.
Споласкивают 96°спиртом.
Снова промывают водой.
Докрашивают в течение 3--5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором (1:1000) малахитовой зелени или метиловой зелени.
Краску смывают водой, препарат высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки -- рубиново-красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото- и спиртоустойчивых сапрофитов -- синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл + 96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото- и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото- и спиртоустойчивы.
Окраска в модификации Синева.
Фильтровальную бумагу пропитывают 2% спиртовым раствором основного фуксина, сушат и нарезают на полоски. На фиксированный мазок наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают полоску окрашенной бумаги, нагревают до появления паров и далее обрабатывают по оригинальной прописи Циль-Нильсена.
Мирохин (1941) рекомендует при отсутствии основного фуксина окрашивать мазки на туберкулез по видоизмененному способу Чистовича:
1. окраска генцианвиолетом или метилвиолетом на анилиновой воде с подогреванием -- 2 минуты,
2. промывание водой,
3. обесцвечивание 2-5% азотной кислотой 8--10 секунд,
4. промывание водой,
5. обесцвечивание спиртом до побледнения,
6. промывание водой,
7. докрашивание 0,1% сафранином несколько секунд,
8. промывание водой и высушивание.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки -- фиолетовые на красном фоне. Кислотоустойчивость того или иного микроорганизма можно определить флуоресцентным методом. У этого метода есть преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается присутствие, например, микобактерий, можно просматривать под объективом с увеличением 60, а не 100; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время.
Метод Труанта для окрашивания на кислотоустойчивость
|
Реактив для флуоресцентной окраски: |
||
|
Аурамин О, С141000 |
1,5 г |
|
|
Родамин В, С1 749 |
0,75 г |
|
|
Глицерин |
75 мл |
|
|
Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) |
10 мл |
|
|
Дистиллированная вода |
50 мл |
Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фенолом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова перемешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4°С или при комнатной температуре.
|
Растворитель для обесцвечивания: |
||
|
Этанол 70% (объем/объем) |
99,5 мл |
|
|
Соляная кислота (концентрированная) |
0,5 мл |
|
|
Дополнительный краситель: |
||
|
Марганцевокислый калий |
0,5 г |
|
|
Дистиллированная вода |
99,5 мл |
Выполнение методики:
Погружают фиксированный нагреванием бактериальный мазок на 15 минут в реактив для флуоресцентной окраски при 20--37°С.
Промывают мазок под слабой, падающей под углом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.
На 2--3 минуты погружают мазок в обесцвечивающий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.
Погружают мазок в дополнительный краситель на 2--4 минуты.
Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают фильтровальной бумагой.
Просматривают образцы в люминесцентный микроскоп с использованием возбуждающего светофильтра типа BG-12 и запирающего светофильтра типа OG-1. Клетки кислотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оранжевым светом на темном фоне.
Для микроскопической дифференциальной диагностики туберкулезных палочек от спиртоподатливых сапрофитов существует несколько методов.
Метод Гонзеля
Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании до кипения в течение 2 минут.
Промывают водой и высушивают.
Обесцвечивают смесью соляной кислоты (3 части) и абсолютного или 95° алкоголя (97 частей) в течение 10 минут.
Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки, разбавленным водой в 2 раза.
Промывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки--красные.
Метод Бунге и Траутенрота
Помещают препарат на 3 часа в абсолютный алкоголь (для извлечения жира).
Наносят на мазок 5% водный раствор хромовой кислоты на 15 минут.
Промывают водой.
Окрашивают при подогревании карболовым раствором фуксина.
Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 минут.
Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки не менее 5 минут.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки--красные.
Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость)
Препарат окрашивают карболовым фуксином при подогревании до появления паров, промывают водой, а затем окрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2--3 минут. Мазок обмывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки -- красные на синем фоне, а кислотоустойчивые, но спиртоподатливые палочки -- синие.
Если требуется проверить в уже окрашенном по Циль-Нильсену мазке обнаруженные кислотоустойчивые палочки на спиртоустойчивость, нужно: удалить с препарата кедровое масло бензином или ксилолом, докрасить мазок насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2-5 минут, обмыть водой и высушить. Кислото- и спиртоустойчивые палочки сохраняют свой красный цвет, а спиртоподатливые окрасятся в синий цвет.
Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)
1. На фиксированный мазок наливают профильтрованную смесь из 10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета и 100 мл 2% карболовой воды (смесь пригодна 3 дня) и нагревают до кипения 4--5 раз, постоянно добавляя свежий раствор краски, или же оставляют на 24-48 часов при комнатной температуре;
2. Не промывая водой, на мазок наливают раствор Люголя на 10--15 минут;
3. Промывают водой;
4. Обесцвечивают сначала 5% раствором азотной кислоты в течение минуты, затем:
5. Обесцвечивают 3% раствором соляной кислоты в точение 10 секунд
6. Обесцвечивают смесью спирта и ацетона (1:1) до полного обесцвечивания мазка (до прекращения растворения краски);
7. Дополнительно окрашивают разведенным (1:10) фуксином или 1% водным раствором сафранина в течение нескольких секунд;
8. Ополаскивают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: на красном (коричневом) фоне -- сине-фиолетовые палочки и резко ограниченные зерна.
Модификация окраски Грам--Муха
Мазок сначала окрашивают смесью из 3 частей карболового раствора фуксина с 1 частью метилвиолета по Муху (см. выше), затем продолжают окраску по оригинальной прописи.
Микроскопическая картина: палочки -- красного цвета, зерна -- темно-фиолетовые.
Способ Нейссера
(Используется для окраски метахроматических зерен -- волютина).
|
Раствор А |
||
|
Метиленовая синька |
0,1 г |
|
|
Этиловый спирт 95° |
2 мл |
|
|
Ледяная уксусная кислота |
5 мл |
|
|
Дистиллированная вода |
100 мл |
|
|
Раствор Б |
||
|
Кристаллвиолет |
1 г |
|
|
Этиловый спирт 95° |
10 мл |
|
|
Дистиллированная вода |
300 мл |
Для окраски смешивают 2 части раствора А с 1 частью раствора Б.
Техника окраски. На фиксированный мазок наливают смесь растворов А и Б, через минуту краску сливают, мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем промывают водой и докрашивают в течение 2--3 минут раствором хризоидина (1 г краски в 300 мл дистиллированной горячей воды), промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: зернистость -- темно-синяя, тела бактерий --светло-желтые.
Метод Пью (окраска метахроматических зерен)
К 2 мл этилового спирта добавляют 0,2 г толуидиновой синьки, а затем 100 мл 5% раствора уксусной кислоты (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл воды). Раствор хорошо хранится. На фиксированный мазок наливают краску и нагревают 1--2 минуты, до появления паров. Дают остыть, смывают водой, высушивают и исследуют. При микроскопии с искусственным освещением метахромазия заметна особенно резко.
Микроскопическая картина: тела палочек -- синего цвета, метахроматические зерна -- красновато-фиолетовые.
Модификация Саватеева.
Приготовление красящих бумажек.
0,2 г толуидиновой синьки растирают в ступке с 5,8 г кристаллической лимонной кислоты (предварительно растертой в порошок) до получения равномерной синевато-сиреневой окраски всего порошка; затем, продолжая растирать, постепенно добавляют 10 мл дистиллированной воды. Когда вся смесь растворится, прибавляют 1 мл чистого глицерина и, хорошо размешав смесь пестиком, добавляют еще 10 мл дистиллированной воды; содержимое выливают в чашку и смачивают им узкие полоски (5 см длиной) фильтровальной бумаги, высушивают их при комнатной температуре, режут и хранят в темноте.
Техника окраски. На фиксированный мазок наносят 8--10 капель воды, кладут бумажку и нагревают 1 минуту до появления паров, что повторяют 3--4 раза с добавлением воды. Дают мазку остыть, смывают водой бумажку с краской, сушат и исследуют.
Результат тот же, что и при оригинальном методе Пью.
Окраска по Романовскому-Гимза
Лучше применять краску фабричного изготовления. Перед самой окраской готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды нейтральной реакции (определение рН воды см. ниже).
Разведенную краску наливают в чашку, на дно которой положены кусочки предметного стекла (подставка). Мазок, фиксированный химически чистым метиловым спиртом, кладут намазанной стороной вниз на поверхность слоя краски, опирая концы препарата на кусочки стекла (подставки), и оставляют в таком положении от 30 минут до 2 часов, в зависимости от качества краски, затем промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении.
Указанный способ особенно хорош для окраски спирохет, биполяров и мазков крови.
Простой способ нейтрализации дистиллированной воды. В два химических стакана (колбы) наливают по 200 мл исследуемой воды и добавляют в каждый по 1--2 капли 1% раствора нейтральрота в дистиллированной воде (индикатор). При рН воды 5,4--5,5 (кислая реакция) получается свекловично-красная (рубиновая) окраска. Тогда в один из стаканов, тщательно размешивая, прибавляют по каплям 1% раствор углекислой соды до получения ясной разницы в окраске по сравнению с водой в другом (контрольном) стакане. Моментом нейтрализации считается появление заметного оранжевого оттенка; если через 10--30 секунд цвет не изменится до первоначального --нейтрализация считается достигнутой. Нельзя добавлять соду до получения ясно оранжевого или, тем более, желтого цвета; в таких случаях вода окажется сильно щелочной. Зная, сколько капель раствора соды пошло на усреднение 200 мл исследуемой пробы, легко подсчитать, сколько надо взять капель для нейтрализации любого количества той же порции воды. Для окраски лучше применять воду с рН 6,8 - 7,0.
Окраска капсул
Капсулы микробов состоят главным образом из полисахаридов и гликопротеидов. Капсульными можно считать те микробы, у которых капсула обнаруживается при окраске каким-либо методом на капсулы. Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Лучше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации. Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является метод Дюгида.
Метод окраски капсул по Дюгиду
На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помещают таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.
Сложенной в несколько раз фильтровальной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жидкости между ними. Препарат смотрят под большим увеличением, применяя безиммерсионные и иммерсионные объективы.
Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-черном фоне.
Метод окраски капсул по Гиссу
Взятую петлей бактериальную суспензию смешивают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.
Высушивают мазок на воздухе и мягко фиксируют его нагреванием.
Покрывают мазок красящим реактивом кристаллического фиолетового (кристалический фиолетовый 0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.
Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4 5H2O). Подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микроорганизмы -- темно-фиолетовыми.
Метод окраски капсул по Антони
Высушенный на воздухе мазок окрашивают в течение 2 минут 1% (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.
Краситель отмывают 20% (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4 5H2O), удаляют избыток последнего и подсушивают фильтровальной бумагой.
Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы -- темно-фиолетовыми.
Способ Михина
Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2--3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.
Микроскопическая картина: капсулы -- светло-розовые, бактерии --темно-синие.
Способ Гисса
Тонкий мазок, зафиксированный на пламени, окрашивают раствором основного фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора краски + 19 частей дистиллированной воды) с нагреванием до отхождения паров, затем оставляют в покое на 30 секунд. После этого краску смывают большим количеством 20% водного раствора медного купороса и обсушивают без промывания водой между листами фильтровальной бумаги.
Микроскопическая картина: капсулы -- голубого цвета, тела микробов --темно-красного, эритроциты -- розового, плазма лейкоцитов -- голубого, ядра лейкоцитов -- темно-красного.
Способ Ольта
Мазок окрашивают 2--3% водным раствором сафранина в течение 1--3 минут с последующим быстрым смыванием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости. Благодаря прохождению световых лучей через слой воды усиливается разница в лучепреломлении капсулы и тела бактерии; под микроскопом отчетливо видны окрашенные капсулы.
Микроскопическая картина: капсулы -- бледно-желтого, а бактерии --коричневого цвета.
Модификация способа Ольта.
После окраски сафранином (по оригинальной прописи) мазок докрашивают 1% водным раствором метиленовой синьки в течение 2 минут. Быстро смывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: палочки -- синие, капсулы -- розовые.
Способ Ребигера
Этот простой и демонстративный способ окраски состоит в том, что препарат фиксируют не пламенем, а формалином, причем фиксация происходит одновременно с окраской. Для этой цели готовят следующий раствор: 15--20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40% формалина, дают раствору постоять несколько часов. Затем этот насыщенный при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированный мазок указанным выше раствором в течение 15--20 секунд, быстро промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: капсулы -- красновато-фиолетовые, бактерии -- темно-фиолетовые.
С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) на 15--20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: капсулы -- бледно-розового цвета, бактерии -- синие.
Способ Гусельниковой
Для выявления капсульных микробов в культурах предлагается следующий способ: каплю 3--4% водного раствора конгорот нанести на абсолютно обезжиренное предметное стекло, добавить к ней одну каплю исследуемой культуры, тщательно размешать и оставить на 5--7 минут; затем каплю размазать по стеклу, как при изготовлении мазка крови, высушить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.
Подобные документы
Изучение особенностей микроорганизмов. Микроэкологический риск при использовании высоких технологий. Характеристика технологии приготовления препаратов и опытов. Правила микроскопирования. Влияние гигиенических навыков на распространение микроорганизмов.
научная работа [23,6 K], добавлен 06.09.2010Свойства прокариотных микроорганизмов. Методы определения подвижности у бактерий. Участие микроорганизмов в круговороте азота в природе. Нормальная и анормальная микрофлора молока. Культивирование анаэробных микроорганизмов в условиях лаборатории.
шпаргалка [50,2 K], добавлен 04.05.2009Методы изучения морфологии микроорганизмов. Правила работы в микробиологической лаборатории. Микроскопия в светлом поле. Установка света по Келеру. Изображения фиксированных препаратов, полученные в результате исследования метода изучения морфологии.
лабораторная работа [925,0 K], добавлен 14.05.2009Изучение предмета, основных задач и истории развития медицинской микробиологии. Систематика и классификация микроорганизмов. Основы морфологии бактерий. Исследование особенностей строения бактериальной клетки. Значение микроорганизмов в жизни человека.
лекция [1,3 M], добавлен 12.10.2013Исследование основных типов микроорганизмов: бактерий, грибов и водорослей. Анализ условий, необходимых для роста микроорганизмов. Механизм образования микробиологических отложений. Изучение методов микробиологического тестирования и приборов мониторинга.
презентация [707,5 K], добавлен 23.10.2013Изучение морфолого-физиологических свойств чистых культур целлюлозолитических микроорганизмов. Изучение усвоения углеводов: сорбита, сахарозы, маннита, лактозы, мальтазы, глюкозы. Посев на среду Гисса. Методы выделения культуры бактерий из короедов.
реферат [1012,3 K], добавлен 11.03.2012Химический состав бактериальной клетки. Особенности питания бактерий. Механизмы транспорта веществ в бактериальную клетку. Типы биологического окисления у микроорганизмов. Репродукция и культивирование вирусов. Принципы систематики микроорганизмов.
презентация [35,1 M], добавлен 11.11.2013Схожесть и отличия прокариотических и эукариотических клеток. Строение муреина у бактерий. Характеристика микроорганизмов по способам питания. Химическое строение, структурная организация вирусов, морфология, особенности взаимодействия с клеткой-хозяином.
шпаргалка [3,2 M], добавлен 23.05.2009История микроскопа и изучение морфологии микроорганизмов как собирательной группы живых организмов: бактерии, археи, грибы, протисты. Формы, размер, морфология и строение бактерий, их классификация и химический состав. Строение и классификация грибов.
реферат [130,0 K], добавлен 05.12.2010Понятие и значение селекции как науки о создании новых и улучшении существующих пород животных, сортов растений, штаммов микроорганизмов. Оценка роли и значения микроорганизмов в биосфере, и особенности их использования. Формы молочнокислых бактерий.
презентация [1,1 M], добавлен 17.03.2015
