Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

«Динамика активности катепсина Д в тканях суслика после индуцированного пробуждения»

Содержание

Глава I. Обзор литературы

1.1 Физиологические и биохимические изменения при зимней спячке

1.2 Роль катепсина Д во внутриклеточном распаде белков

Глава II. Материалы и методы исследования

2.1 Обоснование выбора объекта исследования и постановка эксперимента

2.2 Биохимические методы исследования

2.2.1 Приготовление гомогенатов тканей мозга и печени и выделение фракций

2.2.2 Определение активности катепсина Д

2.2.3 Исследование температурной зависимости активности катепсина Д

Глава III. Результаты и их обсуждение

3.1 Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга суслика и крысы

3.2 Автолитическая и протеолитическая активность внутриклеточных протеиназ головного мозга и печени суслика

3.3 Динамика изменения активности катепсина Д в отделах головного мозга суслика на разных этапах зимней спячки

3.4 Температурная зависимость неседиментируемой и седиментируемой активности катепсина Д из мозга суслика в динамике зимней спячки.

Заключение

АДФ - аденозиндифосфат

АМД - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГМФ - гамма-монофосфат

ПС - парадоксальный сон

РНК - рибонуклеиновая кислота

Т_м - температура мозга

Т_т - температура тела

ЦНС - центральная нервная система

Mb - миоглобин

Введение

Актуальность проблемы. Зимняя спячка млекопитающих уникальное биологическое явление, при котором естественным путем резко снижаются метаболизм и функции организма (Пантелеев, 1983).

В динамике зимней спячки механизмы терморегуляции сохраняются, но они поддерживают температуру тела на более низком уровне. При этом биохимические процессы, работа органов и систем организма гибернантов перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Карманова, 1995).

При спячке, несмотря на низкую температуру тела, в головном мозгу происходят весьма сложные специфические биохимические процессы, и протекание этих процессов обеспечивается функционированием мембранных структур и ферментативного аппарата клетки, в котором белки мозга играют существенную роль. Нервная ткань зимоспящих обладает высокой толерантностью к низким температурам (Демин и др., 1988; Шугалей, 1992). Существенную роль в приспособлении клеток гетеротермных животных к функционированию в различных температурных условиях может играть процесс синтеза новых, или модификация структуры и функции имеющихся в клетке белков (Белик, 1962; Жегунов и др., 1991). Зимняя спячка мелких грызунов - прерывистый процесс, сопровождающийся периодическими пробуждениями с разогревом тела до 37єС.

Знание нейрохимических изменений в течении зимней спячки прокладывает мост к практическому использованию этого уникального состояния организма - гипобиоза. Полученные данные могут быть положены в основу разработки методов создания управляемой, при помощи естественных механизмов, гипотермии, что чрезвычайно важно для клиники, когда требуется поддержать организм более или менее длительное время в состоянии значительно сниженных физиологических функций (Демин и др., 1988; Карманова, 1995).

Возможность длительного обратимого изменения физиологического статуса организма и проблема управляемого гипобиоза имеют глубокий теоретический и практический интерес. В природных условиях эти задачи естественным путем решаются у гибернирующих животных, в тканях и плазме которых содержатся низкомолекулярные биологически активные вещества, способствующие как снижению активности различных систем организма при погружении животного в спячку, так и быстрой активации их до исходного уровня при пробуждении (Ашмарин и др., 1999).

Особенности регуляции метаболизма у зимоспящих связаны с повышением регуляторной нагрузки продуктов деградации белков - пептидов, производных аминокислот и мочевины. Мишенью для регуляторных воздействий служат клеточные и субклеточные мембраны, которые обладают уникальной способностью сохранять свою целостность при резком изменении температуры тела (Шортанова и др., 1986; Демин и др., 1988).температурный зависимость мозг печень суслик

Активность лизосомальных ферментов может служить чувствительным тестом уровня метаболизма организма.

Из лизосомальных ферментов нервных структур особый интерес представляет протеолитические ферменты, с функционированием которых связаны как образование, так и инактивация многих биологически активных пептидов.

Нарушение сложной системы внутриклеточного протеолиза является причиной многих заболеваний и патологий (Wichner, 1999).

Одной из основных лизосомальных протеиназ мозга является кислая протеиназа (катепсин Д, КФ 3.4.23.5), отличающаяся широким спектром действия и играющая важную роль в метаболизме различных белков и пептидов, в том числе кортикотропина, -липотропина, -эндорфина, соматостатина, люлиберина, ангиотензиногена, вещества Р и других пептидов. Накапливаются данные о внелизосомных, специфических функциях катепсина Д. В мозге катепсин Д в основном локализован в нейронах. Естественно предположить важную роль катепсина Д в выполнении информационной функции.

Высказывается гипотеза, что катепсин Д может участвовать в ремоделинге синаптических контактов уже после завершения синаптогенеза (Suopanki et al., 2000).

В динамике зимней спячки в мозге суслика периоды покоя сменяются интенсивным биосинтезом макромолекул, который должен сопровождаться соответствующим распадом.

В связи с изложенным выше, представляется весьма актуальным исследовать изменения активности катепсина Д в мозге суслика в ходе зимней спячки. Эти изменения должны отражать процессы регуляции биохимических процессов в мозге при переходе от гипобиоза к интенсивной физиологической и биосинтетической активности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение температурной зависимости активности катепсина Д из мозга суслика в период бодрствования и в динамике зимней спячки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать температурную зависимость активности катепсина Д в гомогенатах мозга суслика в период летнего бодрствования.

2. Определить температурную зависимость автолитической и протеолитической активности гомогенатов тканей мозга и печени сусликов: осенью, перед вхождением в спячку и весной, в период пробуждения.

3. Изучить температурную зависимость активности катепсина Д в различных отделах мозга (больших полушариях, среднем мозге и мозжечке) суслика на этапах гибернационного периода: подготовки к спячке, пробуждения после баута спячки, выхода из длительной спячки.

4. Выяснить влияние зимней спячки у сусликов на седиментируемую и неседиментируемую активность катепсина Д мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга суслика и из мозга крысы отличается только в режиме инкубации 30 и 37єС.

2. У сусликов, перенесших зимнюю спячку, как в мозге, так и в печени происходит значительное повышение автолиза. Однако протеолитическая активность катепсина Д возрастает лишь в мозгу у пробудившихся от зимней спячки сусликов.

3. Температурная зависимость активности катепсина Д, выраженная в координатах Аррениуса, в больших полушариях мозга суслика при подготовке к спячке в условиях инкубации 20єС имеет излом, а при пробуждении от зимней спячки - плато, при температурах инкубации 10-30єС.

Значительные изменения в больших полушариях и мозжечке мозга суслика наблюдаются при пробуждении после баута спячки, в то время как в среднем мозге таких изменений на этапах зимней спячки не обнаруживаются.

4. Выявлена отрицательная температурная зависимость активности катепсина Д в неседиментируемой фракции мозга при 5єС инкубации при пробуждении после баута спячки и при полном пробуждении от зимней спячки.

5. Установлена связь между сезоном года и температурной зависимостью активности катепсина Д из мозга суслика: весной, при пробуждении от зимней спячки активность фермента выше, чем осенью при всех исследованных температурах инкубации (5, 10, 20, 30 и 37єС).

На температурную зависимость активности катепсина Д из печени суслика сезон года не влияет.

Научная новизна. В данной работе впервые исследована температурная зависимость пептидгидролазной активности в мозге сусликов на разных этапах погружения в зимнюю спячку, при глубокой зимней спячке и выходе из нее.

Измерена температурная зависимость катепсина Д из мозга крысы и суслика в норме.

Установлена связь между сезоном года и температурной зависимостью активности катепсина Д мозга зимоспящего животного как для экзогенного, так и для эндогенного субстрата.

Выявлен факт изменения активности катепсина Д в больших полушариях мозга и мозжечке и изменения в распределении солюбилизированной и несолюбилизированной форм данного фермента в динамике зимней спячки.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов регуляции зимней спячки, расширяют наши представления о роли катепсина Д во внутриклеточном обмене белков и контроле за состоянием белков в динамике зимней спячки. Выявленные температурные зависимости активности катепсина Д в разные периоды спячки в больших полушариях мозга и мозжечке могут быть использованы для контроля состояния гомойотермного животного при искусственной гипотермии и постгипотермическом периоде.

Результаты и методические разработки данного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии Дагестанского государственного университета, при чтении курсов «Энзимология», «Экологическая биохимия» и «Эволюционная биохимия» и при проведении биохимических практикумов.

Глава I. Обзор литературы

• 1.1 Физиологические и биохимические изменения при зимней спячке
• Для многих видов мелких млекопитающих выживание в зимний период обеспечивается за счет особого физиологического состояния организмов - гибернации (зимней спячки) (Lyman, 1982; Калабухов, 1985).
• Зимняя спячка является феноменом, связанным с переживанием животными неблагоприятных условий окружающей среды и характеризующимся частичной или полной потерей чувствительности и двигательной активности, резким снижением температуры тела и интенсивности метаболизма. Понижение температуры тела приводит к подавлению активности всех функций и систем организма: кровообращения, дыхания, пищеварения, водно-солевого обмена, гормонального статуса, размножения (Карманова, 1995). Необходимо заметить, что подавление метаболизма гибернирующих животных в зимний период не является простым следствием влияния низких температур на скорость биохимических реакций. Наоборот, снижение температуры тела происходит в результате хорошо скоординированного подавления обменных процессов в органах и тканях (Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992).
• Зимняя спячка - это закреплённая в ходе эволюции уникальная способность к минимизации жизненных функций организма, позволяющая ряду видов млекопитающих в течение многих месяцев переживать холод, бескормицу, сокращение светлого периода суток. Более того, гибернация представляет собой не непрерывный процесс, а состоит из нескольких периодов глубокого оцепения длительностью 2-4 недели, так называемых баутов спячки, и кратковременных (20-30 ч) периодов (баутов) пробуждения.
• Баут спячки состоит из входа в спячку, пребывания в ней и выхода. Период эутермии, растянутый от нескольких часов до нескольких дней, продолжается до входа в другой баут (Wang, Lee, 1996). Во время баутов пробуждения температура тела очень быстро (за 4-6 ч увеличивается от 0-5 до 37єС) и некоторое время поддерживается на этом уровне, после чего животное вновь впадает в состояние оцепенения. В отличие от оцепенения, характерного в холодный период для пойкилотермов, зимоспящие сохраняют контроль центральной нервной системы (ЦНС) за жизнедеятельностью организма. Снижение уровня физиологических и обменных процессов при вхождении в очередной баут, их регуляция в состоянии спячки, и нарастание при пробуждении, происходит сбалансировано и под контролем ЦНС (Heller, 1979).
• За регуляцию состояния спячки и выхода из нее ответственны структуры мозга, такие как гипоталамус, ретикулярная формация и гиппокамп.
• Известно, что при зимней спячке электрическая активность коры больших полушарий мозга исчезает первой, в то время как в гипоталамусе и связанных с ним структурах сохраняется достаточно высокая активность (Белоусов, 1993).
• Электрическая активность в ЭЭГ различных областей головного мозга при погружении в спячку обычно исчезает в следующей последовательности: кора мозга, ретикулярная формация, таламус, лимбическая система мозга (септум, гиппокамп, гипоталамус) (Виноградова, 1975.). В лимбической системе наблюдается почти постоянная электрическая активность, на протяжении всего баута (Штарк, 1970; Strumwasser, 1959; South et al., 1969).
• Эти данные подтверждены и гистологическими исследованиями, показавшими, что в состоянии гибернации наблюдается обильное кровенаполнение гипоталамической области (Козлова, Юрченко, 1996). Обнаружено, что под влиянием гипоталамических сигналов, начиная уже с летнего периода эутермии и вплоть до вхождения в торпор, происходят пробные понижения температуры мозга, приводящие к подготовке организма к состоянию гибернации (Пастухов, 1999). Мозжечок также играет немаловажную роль в реализации зимней спячки, а его активность регулирует позу животного в зависимости от температуры (Калабухов, 1985).
• Суслики обладают широким динамическим диапазоном циклических изменений температуры тела. Показано, что локальное нагревание медиальной приоптической области переднего гипоталамуса у двух видов сусликов - Citellus major и Сitellus suslicus на 1єС длительностью 10 мин вызвала запуск эффекторных реакций терморегуляции и изменение структуры цикла бодрствование-сон. В течение 1 ч после воздействия наблюдается увеличение частоты возникновения и общей длительности парадоксального сна. Результаты исследования позволяют предположить, что система терморегуляции и цикл бодрствование-сон, являясь новыми приобретениями эволюции, имеют общее звено регуляции, которым является термосенсорная область переднего гипоталамуса (Белявский, Федорова, 1999).
• При первых погружениях в спячку сусликов Citellus parryi Rich, выявлены периодические остановки процесса, особенно при переходе к стадии умеренной и глубокой торпидности ("критические" периоды), значительно увеличивающие энергозатраты в фазе вхождения. Для критического периода характерны околочасовые высокоамплитудные колебания общего времени бодрствования и стадии сна, сократительной мышечной активности, потребления кислорода, частоты сердцебиений, температуры мозга, а также концентрации тиреоидных гормонов в крови; в конце периода и на выходе из него отмечено значительное увеличение времени глубокого медленноволнового сна: парадоксальный сон в критическом периоде не идентифицирован (Пастухов, Невретдинова, 1991).
• Широко распространена точка зрения, что температуры "ядра" тела и мозга (Т_м) у гомойотермов снижаются только во время медленноволнового сна (МВС). Предполагается, что МВС эволюционировал, как способ снижать энергозатраты в неактивную фазу суток (Berqer, Phillips, 1995) и, что его основной функцией является периодическое охлаждение мозга и тела (Мс Ginty, Szymusiak, 1990).
• Показано, что снижение температуры мозга (гипоталамуса) до нижней границы ''нормотермии'' (36-35єС) у гибернирующих больших сусликов Citellus major в отличие от эутермных видов животных происходит не только во время медленноволнового сна, но и в части эпизодов парадоксального сна (ПС). Полученные данные свидетельствуют о повышении роли ПС в инициации снижения T_м в начале сезона гипометаболизма (в условиях длительного спонтанного голодания) в сравнении с сезоном эутермии (при потреблении пищи), что обусловлено увеличением пропорции эпизодов ПС с более значительным снижением Т_м. В наибольшей степени такая функция ПС усиливается в период непосредственно предшествующий вхождению в торпор или гибернацию. Предполагается, что снижение Т_м в эпизодах ПС, повторяющиеся с интервалами 10-30 мин, может способствовать синхронизации и ''раскачке'' ритмов Т_м и висцеральных функций и переходу от ''нормотермии'' к состояниям гипометаболизма. В нейрохимическом отношении механизм начала зимней спячки оказался близким к тем же самым процессам, которые проявляются в ЦНС при обычной смене активного бодрствования дремотой, переходящей к медленноволновой фазе сна. Как при естественном сне, так и при вхождении в зимнюю спячку в головном мозгу имеют место активации серотонинергических структур (прежде всего в стволовой части мозга, особенно дорсального ядра шва) и торможение адренергических (Попова и др., 1978; Попова, 1979, 1986; Муравьева, Буданцев, 1983; Тимофеев, Константинов, 1985).
• Если возбуждение серотонинергических структур головного мозга входит в механизм, как естественного сна, так и инициации зимней спячки, а так же снижения уровня теплопродукции, возможно и повышения теплоотдачи при уменьшении термогенеза, то возбуждение адренергических структур приводило к противоположным результатам, в частности усиливая теплопродукцию и, по-видимому, снижая теплоотдачу. Так, Майерс и др. (Myers, Vaksh, 1972) обнаружили, что внутрижелудочковое введение серотонина, норадреналина и адреналина в мозг кошкам вызывало у них изменения температуры тела. На основе полученных данных эти авторы выдвинули концепцию, что терморегуляция осуществляется балансом между катехоламинами и серотонином в переднем отделе гипоталамуса. Катехоламины могут увеличивать теплопродукцию, стимулируя окислительные процессы со значительным повышением доли свободного окисления. Связанное с норадреналином саморазогревание при пробуждении (на примере сусликов, летучих мышей) происходит через -адренорецепторы (Пастухов, 1974) .
• На холоду усиливается выделение кортикотропных гормонов, влияющих на обмен катехоламинов, как в надпочечниках, так и в ткани головного мозга (Милушева, 1976; Рыжаков и др., 1994), при охлаждении происходит активация центральных адренергических структур, что сопровождается высвобождением катехоламинов (Myers, 1974). Синтез и распад серотонина в мозгу крыс усиливается при действии тепла и снижается при холодовом воздействии, а его внутривенное введение вызывает гипотермический эффект (Арутюнян и др., 1990).
• В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о вероятных механизмах, обеспечивающих уникальные адаптационные возможности мозга зимоспящих млекопитающих к низким температурам (Кулинский, Ольховский, 1992; Mc Nulty et al., 1990; Batzri-Izraeli et аl., 1992).
• Известно, что стрессорные воздействия любой этиологии приводят к неспецифическим ультраструктурным перестройкам в нейронах и синапсах сенсомоторной коры крыс (Саркисов и др., 1987; Менджерицкий и др., 1992). При исследовании ультраструктуры сенсомоторной коры головного мозга сусликов в норме и при искусственной гипотермии получены результаты, свидетельствующие о том, что в процессе адаптации к снижению температуры в нейронах гетеротермных животных активируется опосредованный рецепторами эндоцитоз. Выявлены своеобразные рекомбинации синаптоархитектоники - появление активных аксоно-аксонных синапсов, входящих в состав синаптических регуляторных комплексов. (Мационис и др., 1996). Гибернация млекопитающих - высоко регулируемый набор событий, что заключается в значительной консервации энергетических затрат, во время высоких метаболических запросов и минимальных источников пищи. Неспособность негибернирующих видов переживать состояния похожие на пролонгированную гипотермию и метаболическую депрессию, подтверждают, что гибернанты должны преодолеть значительный физиологический риск, что обеспечивает выживание во время и после сезона гибернации. Механизмом, который может сокращать такой риск на клеточном уровне, является индукция стрессовых белков или белков «теплового шока» (Carey et al., 2000).
• Весьма актуальным и перспективным является поиск и изучение специфических эндогенных химических факторов, способствующих развитию зимней спячки, а так же веществ, препятствующих ей. Доу и Сперриер (Dawe, Spurrier, 1972) в крови сусликов (Cittellus tridecem lineatus), находившихся в спячке, обнаружили фактор, который может играть роль триггера спячки, и описали его. Концентрация этого фактора в крови начинала возрастать осенью. Искусственное введение диализата, полученного из оттаявшей после замораживания сыворотки крови зимнеспящих, вызывало спячку у эутермных взрослых особей того же вида, которым спячка вообще не свойственна.
• Из фракции уксуснокислого экстракта мозга гибернирующего длиннохвостого суслика Citellus unduatus выделено более 20 индивидуальных пептидов и установлены их структуры (Зиганшин, 1994). Для части из них осуществлен химический синтез и изучен спектр биологического действия. Найдено, что один из выделенных пептидов, неокиоторфин (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg), известный ранее как слабый анальгетик обладает кардиотропной и терморегуляторной активностью. Неокиоторфин активирует in vitro потенциалозависимые кальциевые (предположительно через каналы L-типа) и блокирует АТР-зависимые калиевые токи предсердных волокон лягушки. Внутрибрюшинное введение этого пептида сусликам, находящимся в состоянии зимней спячки, вызывает резкое увеличение частоты сокращений сердца и потребления кислорода, приводя к пробуждению животного. Внутрибрюшное и интраназальное введение неокиоторфина крысам вызывает у них увеличение температуры тела в термонейтральных (26-28єС) условиях, не оказывая заметного воздействия при низкой (4-6єС) и высокой (31-32єС) температурах окружающей среды (Зиганшин и др., 1994). Возможность длительного обратимого изменения физиологического статуса организма и проблема управляемого гипобиоза имеют глубокий теоретический интерес. В природных условиях эти задачи естественным путем решаются у гибернирующих животных, в тканях и плазме которых содержатся низкомолекулярные биологически активные вещества, способствующие как снижению активности различных систем организма при погружении животного в спячку, так и быстрой активации их до исходного уровня при пробуждении животных.
• Фракции из ткани гибернантов не обладают узкой видовой специфичностью, а потому оказывают влияние и на незимоспящих (Ашмарин, Гомозков 1999). Иммунизация мышей к плазме крови сусликов, забранной в период погружения в спячку и при пробуждении, вызывала гипотермию у мышей, при чем у животных иммунизированных к плазме просыпающихся сусликов гипотермия была более выражена и иногда фатальна. Иммунизация крыс к киоторфину активирует систему теплопродукции и сердечно-сосудистую систему. Иммунизация к неокиоторфину приводит к противоположным изменениям (Ашмарин и др., 1999).
• Как допускали еще Кальтер и Фольк (Kalter, Folk, 1979), к индукции зимней спячки могут иметь отношение и гибернационный фактор крови, анаболон мозга, и такие нейропептиды, как опиаты, эндорфины и бомбензин (Демин и др., 1988). Кроме этого, на роль эндокринных регуляторов сезонных изменений физиологических функций могут претендовать холестоцитокинин, тиролиберин, соматостатин, нейротензин. Физиологический спектр действия этих пептидов не перекрывает всю феноменологию зимней спячки и заставляет вести поиск новых регуляторов, в первую очередь в тканях зимоспящих и адаптированных к холоду животных, способных резко снижать уровень метаболизма (Сухова и др., 1990).
• Наиболее значительные изменения в цикле бодрствования-спячка наблюдаются в работе сердечно-сосудистой системы; диапазон этих изменений достигает нескольких порядков. Частота сердцебиений некоторых видов сусликов в глубокой спячке составляет всего 2-3 уд/мин. и достигает 400 уд/мин. при пробуждении в фазе повышенного термогенеза; резкое падение частоты сердцебиений характеризует начало входа в спячку (Калабухов, 1985; Игнатьев и др., 2001).
• Известно, что именно снижение частоты сердечных сокращений у зимоспящих млекопитающих является первым сигналом о начале вхождения животного в состояние спячки (Dawe, Morrison, 1955). Исследования ионного транспорта в миокарде зимоспящих животных показали, что изменение физиологического состояния животного при впадении в спячку сопряжено со значительными изменениями в электрогенезе миокардальных клеток: в состоянии спячки в них практически полностью подавлен потенциалзависимый Са²⁺-ток L-типа. (Сухова и др., 1990; Сухова и др., 1992; Алексеев и др., 1997; Alekseev et al., 1994; Kokoz еt al., 1997). Используя электрофизиологический тест для скрининга биологической активности фракций, из уксуснокислого экстракта мозга зимоспящих сусликов, выделено несколько коротких (2-6 а.о.) пептидов, обладающих способностью изменять потенциалзависимый Са²⁺-ток в изолированных миокардиоцитах пойкилотермных и гомеотермных животных (лягушка, крыса, суслик) (Зиганшин и др.,1994; Mikhaleva еt al.,1993; Ziganshin еt al., 1996). Было так же показано, что ТSКУ - один из выделенных пептидов блокаторов Са²⁺ -тока, обладает выраженной способностью подавлять частоту и интенсивность сокращений сердца 36-часового куриного эмбриона (Kramarowa еt al., 1996). Изучено влияние пептида TSKY на частоту сердечных сокращений суслика Citellus undulotus, при выходе из спячки. При провокации пробуждения в первой половине баута гибернации (3-4-е сут спячки), внутрибрюшинное введение пептида в дозе 1мг/кг вызывало замедление скорости повышения ЧСС и увеличивая время перехода животного в состояние нормотермии; во второй половине баута спячки (5-7-е сут), этот эффект не наблюдали. Исследование кардиотропной активности пептида на изолированном сердце лягушки не выявило у TSKY достоверно значимой активности (Игнатьев и др., 2001). Отсутствие выраженного влияния TSKY на изолированное сердце лягушки всё таки не исключает возможность прямого действия пептида на сердечную мышцу в условиях столь далеких от физиологической нормы, каковыми являются переходные периоды цикла спячка - эутермия.

В подавлении функции сердечно-сосудистой системы у зимоспящих и в кардиотронных эффектах экстрактов из тканей гибернантов наряду с другими установленными биологически активными веществами-пептидами и гормонами принимают участие нуклеотиды. Активность нуклеотидов усиливается при их кооперативном действии на сердце (Ляшков, 1999). Субфракции полученные из тканей летнеактивных сусликов, стимулировали механическую и ритмическую активность сердца. Химический анализ субфракций, выполненный в Институте биоорганической химии, показал, что в их состав входят вещества как пептидной, так и не пептидной природы. Последние были идентифицированы как пуриновые нуклеотиды (АМФ, АДФ, АТФ, ГМФ). При этом было обнаружено разное количественное соотношение данных нуклеотидов в составе субфракции из тканей летнеактивных и гибернирующих животных. Для зимних животных характерно повышенное содержание 5'-АМФ и 5'-ГМФ, а для летних - 5'-АДФ (Зиганшин и др.,1994). Наиболее выраженным седативным действием обладал экстракт из мозга зимоспящих. Сделано заключение, что нуклеотиды и их смесь обладают собственным действием на сердце. Они могут участвовать в кардиотропных эффектах субфракции из мозга зимоспящих животных, но ингибирующее действие этой субфракции не сводится к действию нуклеотидов. На изолированном сердце лягушки в условиях круговой перфузии и регистрации механической активности сердца сравнивали действие низкомолекулярной субфракции, полученной из мозга гибернирующих сусликов Citellus undulates, с действием нуклеотидов (АМФ, ГМФ) и их смеси в типичных для данной субфракции отношениях. Было показано, что фракция, АМФ и смесь нуклеотидов обладали разной динамикой гибернирующего действия на изолированное сердце лягушки, а ГМФ стимулировал работу данного органа.

Одной из важнейших физиологических систем мышечной клетки является система переноса и депонирования кислорода, в которой особая роль принадлежит миоглобину. Считается, что Мb в качестве депо кислорода потребляемого цитохромоксидазой, представляет единственный хорошо известный механизм, позволяющий полностью сохранять работоспособность и высокую эффективность системы окислительного фосфорилирования при длительном отсутствии кислорода. (Верболович, 1961; Стародуб и др., 1992). Поскольку Мb, по-видимому, локализируется в клетке преимущественно вблизи митохондрий, не исключается его прямое участие в функционировании дыхательной цепи. Найдено, что содержание миоглобина в мышцах суслика в зимний период, независимо от состояния, в 2,5-3 раза превышает его содержание летом. Предполагается, что наибольшая вероятность увеличения содержания миоглобина у сусликов зимой связана с обеспечением потребности мышц в кислороде на первом этапе пробуждения от около нулевых температур до 10-12єС (несократительный термогенез или терморегуляторный тонус), когда кислородзависимые процессы в мышцах протекают в условиях отключенного периферийного кровотока и неработающей системы анаэробного гликолиза (Постникова и др., 1997).

При гибернации энергетический метаболизм животных резко замедляется за счет подавления как гликолиза (Hachimi et al., 1990), так и окислительного фосфорилирования (Fedotcheva et al.,1985). К снижению скорости гликолиза приводит фосфорилирование протеинкиназами фосфофруктокиназы и пируваткиназы, изменяющее их активность и кинетические характеристики (Storey, 1987). В комбинации с изменением ряда метаболитов (аллостерических активаторов и ингибиторов гликолитических ферментов) это приводит к эффективному подавлению катаболизма углеводов и одновременно резко увеличивает использование жиров в качестве основного источника энергии при гибернации (Nevredinova et al., 1992).

Подавление окисления углеводов в цикле Кребса достигается за счет ингибирования пируватдегидрогеназы при ее фосфорилировании протеинкиназами (Storey, 1997), а общее снижение скорости окислительных процессов при гибернации связано также с уменьшением активности и изменением регуляторных свойств ряда ферментов цикла Кребса и компонентов дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Резкое снижение активности Na⁺,K⁺-АТРазы плазматических мембран скелетных мышц сусликов в зимний период является результатом фосфорилирования фермента (Mc Donald, Storey, 1999).

Увеличение степени олигомеризации белка Са⁺²-АТРазы, а так же изменение белкового состава и/или свойств липидного бислоя мембран ретикулума могут быть причинами снижения активности фермента при гибернации (Малышева и др., 2001).

Стратегия зимней спячки заключается не в полном отключении метаболизма, а в существенном его снижении. Это значит, что вполне определенная физиологическая активность должна сохраняться и при температуре тела, близкой к 0єС. Ни одна из клеточных функций не может осуществляться без участия мембран, поэтому структура и динамические свойства мембран должны обеспечить функциональную активность при низких температурах. При зимней спячке большинство функций подавлено и лишь в ограниченных участках мембран должна сохраняться активность, необходимая для выживания. Поэтому вряд ли следовало предполагать наличие крупномасштабных изменений в химическом составе клеточных мембран при зимней спячке, направленных на поддержание всех клеточных функции. Для сохранения энергии при гибернации необходимо максимально снизить пассивную проницаемость мембран для ионов Na⁺, K⁺, Ca²⁺ и, в то же время, сохранить достаточную активность ионных насосов для поддержания осмотического равновесия. Для усиления барьерной функции мембран необходима плотная упаковка липидного бислоя. На подвижность структурных элементов мембраны может оказывать влияние не только химическое строение липидов, но и количество белков в мембране, их химическая модификация. Преимущество этих факторов в том, что они действуют локально и, кроме того, их результат легко обратим, что важно при выходе из спячки (Эмирбеков, Абдуллаев, 1990; Эмирбеков и др., 2004). Поддержание всех процессов даже на замедленном уровне должно сопровождаться расходованием запасных веществ (Калабухов, 1985). Первичным источником топлива во время покоя являются липиды. Состав отложенного жира изменяется в сторону высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот, что позволяет липидам поддерживать текучесть и метаболизироваться при температуре тела, близкой к 0єС (Storey, 2001).

Увеличение жидкостности мембран, способствующее поддерживанию относительно высокой активности связанных с ними ферментов при низкой температуре, может быть следствием как повышения ненасыщенности жирнокислотных радикалов липидов, так и уменьшения длины их углеводных цепей, включения промежуточных молекул (холестерина), повышения содержания фосфолипидов с более низкой температурой плавления - фосфатидилхолина вместо фосфатидилэтаноламина, а также изменения и ряда других свойств липидов (Крепс, 1981). Все подобные изменения снижают температуру фазовых переходов липидов, при этом жидкостность мембран определяется, в основном, характером жирнокислотных остатков главных фосфолипидов. Такие сдвиги липидной матрицы мембран, видимо, служат одной из основ компенсаторного механизма, поддерживающего необходимые для процессов жизнедеятельности свойства клеточных мембран.

Сдвиги физико-химических свойств липидных компонентов мембранных структур при зимней спячке, включая изменения жидкостности мембран, изменяют их микровязкость (Goldman, 1975). Так, при исследовании обогащенных Na⁺,K⁺-АТФазой фракций ткани головного мозга находившихся в спячке хомяков (Cricetus sp), было показано, что микровязкость этих мембранных препаратов, действительно, в широком температурном диапазоне была ниже, чем контрольных проб, соответствующих препаратов мозга эутермных животных (Goldman, Albers, 1979).

Это коррелировало с повышением содержания ненасыщенных жирно-кислотных остатков в мембранах при зимней спячке.

К существенным адаптационным изменениям липидного состава мембранных структур при зимней спячке привлек внимание и А.М. Белоус (1985), указав на повышение при этом состоянии содержания в мембранах остатков ненасыщенных жирных кислот, а также на изменения фосфолипидных компонентов с увеличением у них количества фосфатидилхолина, содержание же сфингомиелина в мембранах снижалось.

Существенным фактором для достаточно эффективной функциональной активности мембранных структур в условиях низких температур тела, характерным для зимней спячки, является все же относительно высокая их жидкостность. Достижение необходимой степени жидкостности, несомненно, связано с определенными перестройками именно липидных компонентов мембран (Aloia, 1980; 1981). Кроме повышения в фосфолипидах содержания остатков ненасыщенных жирных кислот, чем достигается снижение температуры плавления, основным фактором повышения жидкостности служит снижение Ван-дер-ваальсовых сил между липидными компонентами мембран, что является следствием, в частности увеличения количества ненасыщенных остатков. Снижение Ван-дер-ваальсовых сил при взаимодействии между липидами мембран имеет место так же при относительном повышении содержания фосфатидилхолиновых молекул при уменьшении фосфатидилэтаноламиновых. Метаболизм низкомолекулярных азотистых веществ имеет большое биологическое значение для функции головного мозга.

Особенности регуляции метаболизма у зимнеспящих связаны с повышением регуляторной нагрузки продуктов деградации белков - пептидов, аминокислот, мочевины. Для белков мозга сусликов при зимней спячке характерно своеобразное физико-химическое состояние, которое изменяется при пробуждении (Дерий, Штарк, 1983). Можно утверждать, что в становлении физико-химической конфигурации белковых молекул в мозгу при поддержании зимней спячки решающую роль играют процессы дезамидирования и амидирования белков.

Изменение в содержании амидных групп белковых фракций и общего количества белка при зимней спячке подтверждают мысль (Головина и др., 1985) о том, что метаболизм и физико-химическое состояние, как отдельных белков мозга, так и общего содержания белка в мозге, обеспечивают вхождение организма в зимнюю спячку, ее поддержание и выход из неё (Гусейнов, 1992).

Основой поддержания метаболизма клеток и функций органов является постоянный синтез и обмен белков, остановка которого означает гибель животных, а нарушения ведут к различным патологиям. Во время гипотермии животных происходит нарушение процессов утилизации аминокислот, а также синтеза и обмена белков (Жегунов и др., 1992). Если через 1-1,5 ч наблюдается незначительное включение метки в белки после введения меченых аминокислот охлажденным в течение 2 ч сусликам, то позже этого времени синтез белков прекращается практически полностью. Не отмечено какого-либо заметного включения метки в белки грызунов, гипотермированных в течение 12 ч. Тем не менее, суслики в состоянии глубокой гипотермии могут находиться до 96 ч с последующим разогревом и восстановлением всех функций. Это говорит о способности зимоспящих животных в течение нескольких суток гипотермии обходиться без синтеза и обмена белков. Так как у сусликов продолжают функционировать на пониженном уровне все функции и ткани, то следует предположить, что в условиях гипотермии обмен функционально важных молекул белков, поддерживающий гомеостаз клеток, сильно заторможен, т.е. при гипотермии зимоспящих существенно удлиняется время жизни белков. Следует предположить, что именно способность белковых молекул длительное время функционировать без нарушений и определяет способность зимоспящих выдерживать длительное искусственное охлаждение в отличие от гомойотермных крыс, перенесших охлаждение только до 19-20єС не более чем в течение 24 ч (Жегунов и др., 1992).

Выход из спячки готовится заранее. Еще в состоянии оцепенения в нейронах гиппокампа активным образом идет синтез, накопление и выход в цитоплазму РНК. Резко повышен синтез белка (Гордон и др., 1987).

Т.М.Семешина (1973) детально изучала динамику содержания РНК в различных отделах головного мозга зимоспящего животного - краснощекого суслика (Citellus erythrogenys) - в течение полного годичного цикла, включая период зимней спячки, помесячно (с мая одного года по июнь следующего включительно); были исследованы передняя и задняя зоны коры больших полушарий, гиппокамп и гипоталамус. В результате установлено, что во всех исследованных отделах головного мозга концентрация РНК при зимней спячке (с температурой тела 5-7єС) с октября по март уменьшалась по сравнению со средней величиной для всего годичного цикла. При этом, по динамике сдвигов концентрации РНК, исследованные отделы отличались между собой. Так, в гиппокампе ее уменьшение начиналось раньше, чем в других отделах, а в гипоталамусе и, особенно, в средней зоне коры больших полушарий, величина концентрации РНК возвращалась к прегибернационному значению еще за 1-2 мес до пробуждения. Пробуждение в течение первых 2 ч сопровождалось значительным повышением концентрации РНК; уже через 24 ч она снижалась, а в течение 7 дней снова достигала уровня установленного при спячке.

Метаболизм РНК в головном мозгу суслика (Citellus suslicus) при зимней спячке и выходе из нее исследовали Р.А.Гордон и соавт. (1986) с использованием внутрижелудочковых инъекций 3/1-уридина. Через 2 ч после введения, его накопление в нуклеотидном пуле при спячке и пробуждении было одинаковым; это свидетельствует о том, по словам авторов, что в мозгу зимоспящих происходит такая адаптационная перестройка клеточных мембран, которая делает систему транспорта нуклеозидов резистентной к снижению температуры. Включение же уридина в быстро метаболизирующие РНК во время спячки снижалось в 10 раз, а через 2 ч после пробуждения восстанавливалось до 70% от уровня у эутермных животных. Содержание РНК в целом мозгу в цикле эутермия-гибернация не менялась.

Тонкий цитохимический метод исследования клеток ЦНС Т.М. Семешиной и Л.З. Певзнером (1975) был применен при зимней спячке краснощеких сусликов (Citellus erytrogenys). Исследовали отдельные клетки супраоптического ядра гипоталамуса, клетки гиппокампа и передних рогов спинного мозга. Было найдено, что с углублением зимней спячки снижалось и содержание РНК в цитоплазме нейронов всех исследованных отделов ЦНС. Наибольшее и наиболее длительное его уменьшение имело место в цитоплазме нейронов гиппокампа с максимумом в декабре и последующим повышением еще за 1-2 мес до пробуждения. Сразу после пробуждения был зарегистрирован резкий подъем содержания РНК выше летнего уровня. Во время зимней спячки значительно уменьшалось содержание РНК и в цитоплазме нейронов супраоптического ядра, причем также с максимумом в декабре и с еще более высоким повышением содержания РНК даже за 1-2 мес до пробуждения. Выход из спячки сопровождался значительным подъемом содержания РНК в глиальных клетках - сателлитах. В цитоплазме нейронов передних рогов спинного мозга в течение глубокой зимней спячки не было изменений содержания РНК, но был отмечен его подъем в период перед пробуждением и после него. Эти биохимические сдвиги в клетках, в общем, коррелировали с данными по электрогенезу в тех же объектах (Штарк, 1970), особенно гиппокампе. Раннее накопление РНК в нейронах супраоптического ядра до пробуждения было расценено как отражение подготовки терморегуляционного центра гипоталамуса к приближающемуся саморазогреванию животных при переходе из гипобиоза к активному эутермному состоянию. Такая сложная картина была выявлена при зимней спячке также в результате исследований количества белков и РНК в отдельных клетках супраоптического ядра гипоталамуса и дорсального ядра шва головного мозга малых кавказских сусликов (Citellus pygmaeus Pallas) (Головина и др.,1985; 1988; Демин и др., 1986, 1987).

Итак, в период глубокой зимней спячки в супраоптическом ядре резкое падение абсолютного содержания, как белков, так и РНК в цитоплазме нейронов четко коррелировало с такими же изменениями количественных характеристик РНК и в глиоцитах, но на фоне близких к соответствующему контролю количественным величинам белков в этих клетках. Такие отношения в системе нейрон-нейроглия могут указывать на выраженное угнетение белково-нуклеинового метаболизма в нейронах, несмотря на поддержание достаточно высокой концентрации белков в глиальных клетках-сателлитах.

При зимней спячке была установлена и определенная динамика изменений аминокислотного состава суммарных белков головного мозга сусликов (Абдуллаев, 1982). Видимо, это имеет место в результате сдвигов соотношения между содержанием отдельных компонентов с неизмененным аминокислотным составом, хотя не исключается полностью возможность и синтеза в условиях спячки некоторых новых белковых фракций. При определениях через 7, 15 и 30 дней после начала спячки было обнаружено, что в общей массе белков содержание остатков гистидина, треанина и аланина увеличивалось, а серина уменьшалось. Содержание же остатков глутамата, аспартата, пролина и глицина вначале изменялось, а на 30-й день спячки не отличалось от летних данных. Аминокислотный состав фракции водорастворимых белков изменялся больше, чем водонерастворимых; в последних он изменялся лишь к 30-му дню спячки. При этом соотношение между дикарбоновыми и диаминовыми аминокислотами изменялось также только через 30 дней после наступления спячки. С углублением спячки повышалось соотношение между суммарным количеством гидрофильных и гидрофобных аминокислот. Можно полагать, что все эти изменения были связаны в основном со сдвигом между компонентами фракции водорастворимых белков. Так, в них они были больше, чем установленные при анализе препаратов суммарных белков. Изменения аминокислотного состава белковых препаратов головного мозга сохранялись в течение длительного периода (до 30-45 дней) после пробуждения.

При зимней спячке и в состоянии искусственно вызванной гипотермии, как и при переходе организма животных из гипотермического в нормотермическое состояние, в метаболических фондах ткани мозга происходят значительные изменения в содержании свободных аминокислот. Эти изменения не только отражают характер и интенсивность метаболических превращений самих аминокислот, но и являются следствием изменения скоростей синтеза и распада тканевых белков. Происходящие сдвиги касаются главным образом таких функционально важных для нервной ткани аминокислот, как глутаминовая, аспарагиновая, ГАМК и глутамин.

Установлено, что при зимней спячке суслика, содержание свободного аспартата уменьшается в 2 раза, а содержание свободной ГАМК увеличивается в 2 раза. При этом соотношение свободного и связанного глутамата практически не меняется (Пашаева, 1996). Показано также, что у бодрствующих сусликов в больших полушариях преобладают свободные формы аминокислот глутаминовой группы, причем отношение свободные связанные аминокислоты в них больше, чем у крыс, у которых связанные формы превышают таковые у сусликов в 2 раза, что говорит об особенностях гетеротермных животных.

Обнаружено повышение содержания и таких метаболитов цистеина, как таурин и цистотионин, также обладающих тормозящими нейромедиаторными свойствами; в стволе мозга повышалось содержание глицина. Далее наблюдали падение содержания аргинина: в больших полушариях - на 39%, в стволе на 30%; в этих отделах мозга перед вхождением животных в спячку значительно снижалось количество гистидина и фенилаланина (40%-50%). Было показано, что в начале самой зимней спячки, когда температура тела сусликов опускалась пока лишь до 23-24⁰С, в больших полушариях и в мозжечке содержание аммиака уже резко увеличивалось соответственно на 40-30% (Эмирбеков, 1969). Одновременно происходило и повышение количества продукта связывания аммиака-глутамина, причем концентрация свободного глутамата была стабильна, несмотря на повышение количества его метаболита - тормозного нейромедиатора ГАМК. Данные процессы, очевидно, специфичны для гибернантов и генетически детерминированы.

Анализ описанных данных подтверждает мысль о том, что система освобождения и связывания аммиака у гибернантов лучше приспосабливается к гипотермическим условиям, чем у незимоспящих животных (Эмирбеков, Львова, 1984). По-видимому, она входит в регуляторные механизмы биохимических процессов в мозгу обеспечивающие адаптацию зимоспящих животных к условиям их существования при зимней спячке, прежде всего - к низкой температуре тела. Так, в изменении содержания биоактивных, низкомолекулярных, азотистых компонентов мозга при гибернации у сусликов прослеживалось некоторое сходство с изменениями, наблюдаемыми в мозгу и незимоспящих животных - крыс, адаптированных к холоду в результате многократных периодов охлаждения (Эмирбеков, 1969; Эмирбеков, Тананакина, 1976), а также в мозгу при искусственной гипотермии зимоспящих животных летом. Так, у тех и других, в частности, происходило значительное увеличение в мозгу содержания аммиака в начале спячки при повышенном, либо неизмененном количестве глутамина у подопытных животных.

Анализ литературных данных показывает, что в головном мозгу охлажденного организма сдвиги в содержании ГАМК, глутамина, глутаминовой и аспарагиновой кислот являются результатом изменения энергетического и нейромедиаторного обмена, а также следствием изменения скорости синтеза и распада тканевых белков (Березин, Белик, 1990).

Такие аминокислоты, как глутаминовая, аланин и ГАМК можно рассматривать как своеобразный энергетический фонд головного мозга, поскольку содержание их в нервной ткани в 5 раз превосходит запасы гликогена и глюкозы. Они не только участвуют в окислительных процессах, но и превращаются в глюкозу в реакциях глюкогенеза.

Аминокислоты, как глутаминовая, аспарагиновая и ГАМК активно участвуют в биосинтезе полиаминов и опосредованно принимают участие в регуляторных процессах деятельности мозга, в приспособительных реакциях (Basic Neurochemistry, 1999).

При понижении температуры тела биохимические реакции замедляются в определенной зависимости от глубины гипотермии. Повреждения на молекулярном уровне, характерные для критической низкой температуры, должны были бы приводить (и в определенных случаях приводят) к гибели теплокровных организмов, если не функционировали бы компенсаторные, молекулярные механизмы, использующие адаптационную функцию метаболического аппарата белков (в частности, ферментов), нуклеиновых кислот, липидов (прежде всего мембранных) и их комплексов.

Проведенные А.А.Кричевской и соавт. (1969) исследования показали, что при глубокой зимней спячке в головном мозгу сусликов (Citellus pigmaeus Pallas) активность глутаминазы-1, определяемая при 14-16єС, оказалась на 39% ниже установленной при 37єС, а при определениях при 3єС на 60%; соответствующие величины активности глутаминазы-2 снижались гораздо больше - на 85 и 92 %.

Авторы сделали вывод, что, видимо, освобождение аммиака из глутамина при гибернации осуществляется глутаминазой-1. Было установлено, что у сусликов того же вида изменения в активности глутаминсинтетазы и глутаминазы-1 в головном мозгу наступали в 1-е же сутки глубокой зимней спячки, когда температура тела достигала 10-11єС (Эмирбеков, Мукаилов, 1971).

Можно полагать, что в больших полушариях и в стволе мозга зимняя спячка вызывала тенденцию к снижению активности глутаминсинтетазы, независимо от прямого тормозящего действия понижения температуры in vitro, а в отношении глутаминазы-1, это может касаться ее активности в мозжечке.

В начальном периоде гибернация приводила в головном мозгу к снижению активности глутаминсинтетазы и в меньшей мере глутаминазы, а в случае аминотрансфераз - к активированию аспартатаминотрансферазы и несколько слабее аланинаминотрансферазы. Причина сдвигов активности этих ферментов в исследованных отделах головного мозга при зимней спячке - влияние разных факторов. В дальнейшем в динамике зимней спячке активность этих ферментов изменялась (Эмирбеков, Даудова, 1977; Исмаилов, Эмирбеков, 1980).

Так активность глутаминазы-1 в пробах мозга, измеренная при температуре инкубаций 37єС к 2-х недельному сроку спячки (при температуре тела 10-11єС) была выше на 18%, а к месячному сроку разница достигла 47% (Эмирбеков, Даудова, 1977). Аланинаминотрансферазная и аспартатаминотрансферазная активность в больших полушариях, стволе и мозжечке при 2-недельной спячке сусликов, измеренная при 5єС, была ниже установленной у эутермных животных.