В условиях же инкубации проб ткани при 37єС, полученные величины активности аланинаминотрансферазы в пробах из больших полушарий не отличались от контроля; в пробах из ствола активность этого фермента была немного ниже, тогда как в пробах из мозжечка - выше контроля. Активность аспартатаминотрансферазы в пробах из всех исследованных отделов мозга превышала контроль. При выходе из зимней спячки активность аланинаминотросферазы в мозгу сразу восстанавливалось до нормального летнего уровня, а активность аспартатаминотрансферазы оставалась еще ниже величины интактных, эутермных животных (Даудова, 1975). Активность глутаматдекарбоксилазы во время зимней спячки увеличивалась (Robinson, Bradley,1963; Исмаилов, Эмирбеков, 1980). Активность ГАМК аминотрансферазы была значительно снижена (Исмаилов, 1985). В отношениях увеличения количества ГАМК снижение активности ГАМК аминотрансферазы действовало синергично с повышением активности глутаминдекарбоксилазы.

Было установлено, что активность ферментов, участвующих в обмене низкомолекулярных азотистых веществ в головном мозгу, при зимней спячке сусликов изменяется в зависимости от глубины и продолжительности гибернации, но в общем сохраняется на довольно высоком уровне (Эмирбеков, Мукаилов, 1971; Эмирбеков, Даудова, 1977; Исмаилов, Эмирбеков, 1980; Эмирбеков, Львова 1984).

1.2 Роль катепсина Д во внутриклеточном распаде белков

Внутриклеточную деградацию белков долгое время считали неспецифическим процессом. Белок выполняет закрепленную за ним функцию, а затем в определенный момент клетке необходимо от него избавиться. Последнее обусловлено рядом причин: во-первых, дальнейшая активность белка может навредить клетке, а во-вторых, нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы полипептидами является источником апоптоза.

Настоящим прорывом в данной области послужило открытие убиквитинового сигнального пути. В рамках этого пути, деградация белка, которая осуществляется крупным белковым комплексом - протеосомой, предшествует присоединение к нему «цепочки» молекул небольшого пептида убиквитина. Полиубиквитиновая цепочка навешивается в строго определенный момент и является сигналом, свидетельствующим о том, что данный белок подлежит деградации (Rati Verma, Deshais, 2000).

Процессы деградации белка зависят от его синтеза. Так, в печени крыс деградация некоторых ферментов замедляется при введении ингибиторов синтеза РНК и белка. Нельзя не отметить, что белковый обмен требует затрат энергии для поддержания структурной целостности органелл (Huisman, 1974).

Необходимы также структурная целостность органелл (например, лизосом), участвующих в процессе переваривания белка, а также затраты энергии для захвата белков лизосомами и поддержания низких значений рН внутри частиц.

Более доступны деградации белки с большей молекулярной массой, аполярные кислые белки, имеющие различия в конформации, а так же «ошибки» в последовательности аминокислот («аберрантные» белки) (Дин, 1981).

Достаточно быстро расщепляются денатурированные белки; однако, после взаимодействия белка с лигандами - кофакторами, ионами металлов, субстратами - этот процесс происходит более медленно (Dean, 1980).

Молекулярные шапероны и протеиназы контролируют сворачивание белков, узнавая неправильно свернутые и поврежденные белковые молекулы по наличию на их поверхности гидрофобных участков, обеспечивают правильное сворачивание белков и предотвращают их агрегацию, в то время как необратимо поврежденные белки расщепляются протеиназами (Day, Hinds, 2002).

Исследуя расщепление нативных белков, Д.Коффи и Х. де Дюв (Coffey, de Duve, 1968) пришли к выводу, что денатурация - необходимое условие переваривания белка лизосомными ферментами.

Лизосомные протеиназы участвуют в осуществлении внутриклеточного распада белков и регуляции их кругооборота, а так же в реализации сложнейших биологических процессов, таких как рост, развитие организма, морфогенез, метаморфоз. Эти процессы, реализуемые кооперированным взаимодействием различных типов клеток, сопровождаются деструкцией ткани, которая происходит под действием освобождающихся внутриклеточных ферментов (Покровский, Тутельян, 1976; Дин, 1981).

Вполне возможно, что лизосомные ферменты расщепляют в нативных белках некоторые связи, белки частично разворачиваются и появляются связи, более доступные перевариванию. При отсутствии таких связей, например, у инвертазы, белки стабильны, находясь внутри лизосом. Вероятно, если лизосомы играют существенную роль в обмене белков, скорость «исчезновения» определенных белков из клетки должна зависеть и от скорости их поступления в лизосомы.

На основании экспериментов с использованием аминокислот и различных ингибиторов (лизосомотропные амины, лейпептин, химостатин, ванадат, винбластин, метиламинопурин) в культуре изолированных гепатоцитов крысы в лаборатории Сеглена были выделены, по меньшей мере, пять возможных путей деградации эндогенного белка.

С помощью двух нелизосомных (устойчивых к действию аминокислот) механизмов преимущественно подвергаются деградации короткодвижущие белки; один из этих механизмов энергозависим и чувствителен к действию химостатина, другой - нет. Из трех лизосомных путей (чувствительных к действию аминов и аминокислот) один, имеющий меньшее значение, относительно устойчив к действию аминокислот; он обеспечивает деградацию лабильных (короткодвижущих) белков. Два других пути, чувствительных к действию аминокислот, обеспечивают катаболизм относительно долгоживущих белков, причем один из них подавляется лейцином (очевидно, он соответствует образованию аутофагосом, определенному электронно-микроскопически), другой - ответственен за иной тип аутофагии, ингибируемый аспарагином и глютамином (Gordon, 1985).

При исследовании переваривания белка в лизосомах показано синергическое действие катепсинов А, В, и С с одной стороны, и катепсина Д - с другой (Huang, Tappel, 1971; Barrett, 1980). Многие авторы едины во мнении, что во время деградации денатурированных белков ферментами лизосом первый «удар» наносится катепсином Д, а образующиеся крупные пептидные фрагменты расщепляются протеиназами и пептидазами (Короленко, 1983; Громакова, Коноваленко, 2003; Tappel, 1969; Colgberg et al., 1976).

Активность протеиназ определяет скорость элиминации дефектных белков (ошибочно транслированных, модифицированных, чужеродных), а также содержание функционально активных белков, в том числе ферментов и гормонов. Протеолитические ферменты обеспечивают субстратами многочисленные метаболические процессы, такие как глюконеогенез, трансметилирование, синтез белков и т.п. (Сологуб и др., 1992; Yamao, 1999; Sorimachi et el., 1997).

К протеолитическим ферментам лизосом относятся различные катепсины и лизосомальные экзопептидазы (лизосомальные аминопептидазы, карбоксипептидазы А и В). Лизосомные протеиназы большинства клеток представлены ферментами, относящимися к аспартильным (катепсин Д), цистеиновым (катепсины B, H, L и некоторые другие) и сериновым (катепсин G, эластаза) пептидгидролазам (Дин, 1981, Покровский, Тутельян, 1976). В лизосомах некоторых клеток обнаружены и металлопротеиназы (эластаза макрофагов).

Регуляция множества клеточных процессов осуществляется при участии протеолитических ферментов.

Нарушение регуляции и нормального функционирования протеолитических ферментов приводит к развитию многих патологических состояний. Такие из них, как инвазия и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, эмфизема легких, цирроз печени, мышечная и нервная дегенерация и т.д. сопровождаются локальной деструкцией ткани (Mullins, Rohrlich, 1983; Havemann, Gramse, 1984). Существенную роль в этих процессах играют лизосомные протеиназы, освобождающиеся из клетки. Так, в развитии мышечной дистрофии участвуют катепсины Д, В, L.

Катепсин Д совместно с другими тканевыми протеиназами в опытах in vitro деградируют протеогликаны хряща и кожи (Roughley, 1977; Pearson et al., 1978). Показано так же, что катепсин Д расщепляет гемоглобин, иммуноглобулин G микрофагов (Barrett, 1980).

Катепсин Д, по-видимому, ответственен за деградацию миофибриллярных белков (Schwartz et al., 1977) и солюбилизацию коллагена в коже (Scott, 1977).

Впервые получены данные о состоянии и роли протеолитических ферментов и их ингибиторов у лиц плавсостава в условиях меридиональном и трансмеридиональном направлениях при быстрой смене поясов и климатических зон (Мунтяну, 1996).

В смешанной группе риска отмечено повышение объема слюны и активности протеиназы-катепсина Д по сравнению с группой, обладающей хорошими адаптивными возможностями (Мунтяну, 1996).

В настоящее время внимание исследователей сконцентрировано на изучении протеолитических ферментов, которые принимают участие в реакциях организма, в пролиферации и делении клеток (Коо, 1983), их злокачественной трансформации, процессах инвазии и метастаз. В организме протеолитические ферменты обеспечивают протекание специфических процессов - овуляции, регрессии желтого тела. В ткани существует баланс между содержанием ферментов и их ингибиторов, который нарушается при возникновении патологических процессов, одним из которых является канцерогенез (Веремеенко и др., 1986).

Интерес к изучению протеолитических ферментов при злокачественных новообразованиях обусловлен их разнообразным влиянием на процессы канцерогенеза (Вовчук и др., 2001). Так, проведенные Вовчук и др. исследования показали, что в ткани доброкачественных опухолей яичника, по сравнению со здоровой, значительное повышение активности катепсин Д - подобных протеиназ. Проведено также сравнительное изучение протеиназной активности сыворотки крови у женщин с онкологическими заболеваниями эндометрия.

У пациенток постклимактерического возраста со злокачественными опухолями эндометрия II-ой стадии обнаружено повышение активности катепсин - Д-подобных и трипсиноподобных протеиназ (Вовчук и др., 2001).

Снижение протеиназной активности в сыворотке крови при наличии доброкачественной опухоли и увеличении этого показателя в случае злокачественной опухоли, может свидетельствовать, с одной стороны, о неспецифичности ответной реакции организма, а с другой - об отличии протеиназ тканей доброкачественной и злокачественной.

Определение катепсина Д в раке молочной железы показали высокую способность достоверно предсказывать рецидив заболевания, продолжительность свободного интервала и общую выживаемость. Катепсин Д так же является независимым фактором прогнозирования (Fulco et al., 1998).

Цистеиновые протеиназы (катепсины B и L) и аспартильная протеиназа (катепсин Д) вовлечены в развитие злокачественных заболеваний человека (Turk et al., 2002).

Секреция катепсинов B и L клетками опухоли приводит к деструкции внеклеточного матрикса и лизису базальной мембраны, что является необходимым условием для клеточной инвазии опухоли.

Повышенная экспрессия, увеличение содержания и активности катепсинов B, L и Д отмечены при карциноме груди, раке легкого, желудка, раке кишки, и т.д. (Kos et al., 1997).

При исследовании изменения активности цистеиновых (катепсинов B, L) и аспартильных протеиназ в опухолевой ткани при развитии чувствительного и резистентного вариантов лимфосаркомы мышей, показали, что резистентный к терапии циклофосфаном вариант лимфосаркомы, по сравнению с чувствительным, характеризуется более низкой активностью катепсинов B, L и Д в опухолевой ткани. При применении высокой дозы циклофосфана, у мышей с резистентным вариантом лимфосаркомы отмечен более значительный подъем данных показателей, чем при чувствительном варианте. Сульфоэтилированный в-1,3-Д-гликан потенцировал действие циклофосфана при лечении мышей с обоими вариантами лимфосаркомы, причем наиболее эффективной была минимальная дозировка 10 мг/кг (Усова и др., 2003).

Цистеиновые и аспартильные протеиназы связаны с системой каспаз и взаимодействуют при регуляции апоптоза. Ингибирование катепсинов B и Д их специфическими ингибиторами в клетках нейробластомы человека приводит к индукции апоптоза последних (Castino et al, 2002). Катепсин В играет важную роль в TNF-a- индуцированном апоптозе гепатоцитов, Д является медиатором апоптоза фибробластов (Roberg et. al., 2002.), катепсин L принимает участие в апоптозе сперматогоний, индуцированном пролактином. Ингибирование катепсина L в клетках глиомы человека снижает их инвазивный потенциал и значительно усиливает апоптоз данных клеток, вызванный стауроспорином (Levicаr et al., 2003).

Активность лизосомальных ферментов, на долю которых приходится 70% общей деградации белков, находится под гормональным контролем. Показано участие инсулина, глюкагона, адреналина, тиреоидных гормонов в регуляции лизосомного пути белковой деградации. (Короленко, 1990; Громакова, Коваленко, 2003).

Известно, что тиреоидные гормоны (йодтиронины) оказывают непосредственное влияние на синтез и регуляцию активности многих ферментов (Протасова, 1975), в том числе лизосомальных протеиназ, активных при кислых значениях рН - катепсинов. Так, при некрозоподобных изменениях в миокарде, вызванных изопреналином, у крыс наблюдалось снижение уровня трийодтиронина и тироксина в крови на 55,6 и 21,4% соответственно. В этих условиях обнаружено значительное увеличение активности кальпаинов в сердце (на 34,1%). Вместе с тем седиментируемая активность катепсина Д в миокарде уменьшается на 21,8%, неседиментируемая - возрастает на 20%. Уровень йодтиронинов в организме влияет на изменения активности протеиназ при повреждении миокарда. У эутермных животных действие изопреналина на миокард сопровождается активацией кальпаинов и лабилизацией лизосом, что, очевидно, связано с увеличением внутриклеточной концентрации Ca²⁺. Трийодтиронин и тироксин ингибируют кальпаины и стабилизируют лизосомальные мембраны в сердце интактных крыс (Строев и др., 1992).

Исследование возрастной динамики содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови и активности лизосомальных протеиназ (катепсинов В и Д) в органах песца (Alopex logopus L) в раннем постнатальном онтогенезе, показало наличие отрицательной корреляции между возрастной динамикой содержания тироксина в сыворотке крови и активностью лизосомальных протеиназ в некоторых органах этих животных. Полученные результаты, свидетельствуют о преобладании анаболической функции гормонов щитовидной железы у щенков песцов (Рендаков и др., 2003).

Данные литературы о влиянии тиреоидных гормонов на активность катепсинов противоречивы, причем лишь некоторые из них свидетельствуют о том, что йодтиронины увеличивают активность катепсинов в органах (Satav et al., 1981). Японские исследовали (Yoshikawa, Terayama, 1984) утверждают, что сывороточный фактор, стимулирующий высвобождение катепсина Д из лизосом in vitro, содержится только в щитовидной железе. По данным Строева и Рязановой (1992), введение тироксина приводило к возрастанию неседиментируемой активности катепсина Д в поврежденном миокарде крыс и снижению ее в нормальном миокарде.

Класс аспартильных протеиназ включает семейства эволюционно родственных ферментов - семейство пепсина, к которому относятся не только все пепсины и химозины животных, но и значительно более сложный в структурном отношении катепсин Д, ренин и обширное подсемейство карбоксильных протеиназ микроскопических грибов.

Каталитический центр пепсиноподобных ферментов содержит две карбоксильные группы, одна из которых специфически блокируется ингибиторами, содержащими диазоацетильную группу, в присутствии Cu ²⁺ (у пепсина эта группа принадлежит Asp-215). Специфическими ингибиторами пепсина и пепсиноподобных ферментов являются также природные соединения типа пепстатина (пепстатин А, ацетилпепстатин) (Андреева, Гинодман, 1995).

Карбоксильная группа играет важную роль в функциях активного центра многих лизосомных ферментов. Так, содержание карбогидрата в кислой фосфатазе может быть неодинаковым, что дает различные мультиформы фермента. Эффект действия pH на активность катепсина Д говорит о том, что его активность может зависеть от двух карбоксильных групп, также как и для пепсина (Barrett, 1972). Следовательно, карбоксильные группы могут принимать участие в образовании мультиформ катепсина Д.

Пентапептид пепстатин, полученный из культуры актиномицетов (Aoyagi, Umezawa, 1975; Barrett, 1980), являясь высокоспецифичным конкурентным ингибитором пепсина, в низких концентрациях избирательно подавляет активность катепсина Д мозга свиньи и крысы. Гемоглобин - расщепляющий фермент головного мозга быка и свиньи ингибируется пепстатином из сульфатной фракции в отличие от фермента из печени (Казакова, Орехович, 1972).

Предполагается также участие катепсина Д в реакциях ограниченного протеолиза (Локшина, 1977; 1979). Так, например, катепсин Д обладает специфической кининогеназной активностью, которая ингибируется кислотостабильным ингибитором протеиназ сыворотки крови (Оглоблина и др., 1980).

Описаны различные типы ингибиторов: ингибитор триптазы, эглины (ингибирующие L-химотрипсин, субтилизин, химозин и протеиназы гранулоцитов - эластазу и катепсин G) и др. (Баскова, Завалова, 2001).

Аспартатные протеиназы играют исключительно важную роль в самых различных физиологических процессах, таких как пищеварение, процессинг гормонов и нейропептидов, утилизации белков (Davies, 1990).

К аспартатным протеиназам относятся протеиназы большинства ретровирусов, включая вирус иммунного дефицита человека (ВИЧ) и аналогичные вирусы животных. Активный центр аспартативных протеиназ образован двумя каталитически активными остатками аспарагиновой кислоты (Dunn et al., 2002).

Изучен мобильный генетический элемент Vlysses, обнаруженный у Drosophila Virilis. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей аспартатных протеиназ ретровирусов и ретротраспазонов позволили сделать предположение о первичной структуре протеиназы Vlysses (Волков и др., 2004).

Исследование транспозонов (мобильных генетических элементов, широко представленных в геномах бактерий, растений, животных и человека) показало, что они содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, гомологичные ретровирусным аспартатным протеиназам (Archipova et al., 1995).

Роль протеиназ в данном случае, по-видимому, заключается в процессинге полибелков-предшественников - продуктов трансляции соответствующих мобильных генетических элементов, по аналогии с ретровирусными аспартатными протеиназами (Dunn et al., 2002) и высвобождении тем самым функционально активных белков, ответственных за транспозицию мобильного элемента.

Лизосомы нервной ткани содержат ряд специфических пептид-гидролаз, ответственных за деградацию белков мозга. Они занимают центральное место в обмене белков, регулируя их распад в соответствии с уровнем метаболизма и физиологическим состоянием нервной системы (Рева и др., 1982). Протеолиз белка в клетках нервной ткани в кислой зоне рН осуществляется с помощью набора гидролитических пептид-гидролаз, для которых в 1928 г. был предложен термин «катепсины». Поддержание низких значений рН внутри лизосом требует энергии, которая необходима для превращений мембран.

В отличие от лизосом других тканей и органов (печень, селезенка), для лизосом мозга характерен более узкий спектр катепсинов. Из 4-х основных катепсинов лизосом в мозге преобладает аспарагиновая протеиназа - катепсин Д (Рева и др., 1982).

Катепсин Д является внутрилизосомальной протеиназой, проявляющей активность исключительно при кислых значениях рН и преимущественно расщепляющей пептидные связи в белке близи гидрофобных аминокислотных остатков (Barrett, 1980).

Показано также, что катепсин Д из мозга деградирует и превращает ряд специфических для мозга белков и пептидов: соматостатин и вещество Р (Akopyan et al., 1978), опиатные пептиды (Marks et al., 1980), основной белок миелина (Whitaker, Seyer, 1979), тубулин (Bracco et al., 1982).

Проведено иммунохимическое изучение деградации сывороточных гликопротеинов и нейроспецифического мембранного гликопротеина Д₂ катепсином Д из мозга человека. При действии катепсина Д на фрагменты мембран мозга также наблюдается линейный характер деградации мембранного гликопротеина Д₂, которая сопровождается появлением растворимой иммунореактивной формы белка Д₂ (Березин и др., 1984).

Катепсин Д (КФ 3.4.23.5) является протеиназой нервной ткани, обеспечивающей 2/3 и более протеолитической активности. Из всех исследованных органов и тканей катепсин Д мозга наименее изучен.

Иммуногистохимическим методом катепсин Д обнаружен практически во всех нейронах и в некоторых глиальных клетках ЦНС крысы (Bernstein et al., 1985). Особенно богаты ферментом эпедимные клетки хорноидного сплетения; высокий уровень катепсина Д обнаружен в нейронах магноцеллюлярных ядер гипоталамуса, прозрачной перегородки и ствола головного мозга, а также пирамидных клетках гиппокампа, клетках Пуркинье и в нейронах гипоталамуса (Bernstein et al., 1985; 1987).

Иммунохимически доказано, что катепсин Д появляется в глиальных клетках мозолистого тела на восьмой день постнатального развития, уровень фермента достигает максимума на 15-ый день, после чего содержание фермента в глиальных клетках резко снижается, исчезая к 21-ому дню с одновременным увеличением содержания катепсина Д в нейронах, что авторы связывают с процессом миелинизации (Bernstein et al., 1985).

Региональное распределение катепсина Д в головном мозге человека изучено иммунохимически. Показано, наличие катепсина Д во всех нейронах гиппокампа и гипоталамуса и в некоторых глиальных клетках; уровень фермента максимален в нейронах pn. Supraopticus paraventricularis и в пирамидных клетках гиппокампа и незначителен в эпендимных клетках хориоидного сплетения человека; в спинном мозге фермент обнаружен только б- и г-мононейронах (Bernstein et al., 1985).

В ходе нейроонтогенеза катепсин Д впервые обнаруживается на 12-ой неделе внутриутробного развития в корковой пластинке височного отдела теленцефалона, гиппокампе, эмбриональной нейроэпителии и б-мононейронах шейного отдела спинного мозга (Muller et al., 1987). Позднее к указанным отделам присоединяются эпендимные клетки хориоидного сплетения, а к 18-ой неделе развития катепсин Д появляется в нейробластах развивающегося продолговатого мозга и в клетках Пуркинье. Топография катепсина Д в зрелом и развивающемся мозге человека идентична, исключение составляет мозжечок: у взрослого индивидуума ферментом богаты клетки Гольджи и горизонтальные клетки, тогда как в развивающемся мозге - клетки Пуркинье (Miiller et al., 1987).

Электрогистохимическим методом исследована локализация катепсина Д и эластазы в матке крыс. Активность обеих протеиназ была выявлена в миометрии в лизосомах гладкомышечных клеток, макрофагов и фибробластов (Рывняк и др., 2003).

Катепсин Д (КФ 3.4.23.5) был впервые описан в 1940 г. Ансоном (Anson, 1940). В настоящее время фермент выделен из разных источников (Barrett, 1977; Barrett, 1980). Для получения высокоочищенных препаратов катепсина Д применяется аффинная хроматография на гемоглобин - сефарозе (Smith, Turk, 1974), пепстатин - сефарозе и т.д.

Катепсин Д обычно существует в виде множественных форм, число которых колеблется до двенадцати. По мнению Танга и соавт., их существование обусловлено: а) микрогетерогенностью тяжелой цепи фермента - положение 228 может занимать как остаток лизина, так и серина, а положение 241- остатки глицина и глутамина; б) микрогетерогенностью олигосахаридов, связанных с остатком Asn-70 (Азарян, 1989).

По-видимому, существование множественных форм катепсина Д в головном мозге обусловлено гетерогенностью популяции нейронов в коре больших полушарий.

Молекулярная масса катепсина Д из разных источников в большинстве случаев равна 44000 или 50000 Д; фермент встречается в двух формах -одноцепочной (мол. масса 44000 или 50000) и двухцепочной (мол. масса соответственно 30000 и 14 000 или 35000 и 15000) (Barrett, 1977; Barrett, 1980; Tang, Wong, 1987). Расшифрована первичная структура белковой и олигосахаридной части двухцепочечной формы катепсина Д из селезенки свиньи: легкая цепь состоит из 97, тяжелая - из 242 аминокислотных остатков (Tang, Wong, 1987).

Гель-хроматография на колонке с сефадексом G-150 экстрактов мозга крыс выявила две основные молекулярные формы катепсина Д: 45000 Д и 110000 Д (Нурмагомедова и др., 1983). Они имеют различное субклеточное распределение. Высокомолекулярный предшественник обнаруживается в микросомальной фракции. Катепсин Д с молекулярной массой 45000 появляется в цитозоле вследствие нарушения целостности лизосомальной мембраны вторичных лизосом. Ранее, при гельэлектрофорезе на ПААГ, было показано, что молекулярная масса катепсина Д из мозга крысы равна 45000 (Hackenthal et al., 1978). Высокомолекулярный предшественник, обнаруженный в микросомальной фракции (Нурмагомедова и др., 1987) может быть агрегированной формой катепсина Д. Однако пик катепсина Д молекулярной массой около 110000 Д обнаружен в конечном супернатанте тканей мозга гипотермированных крыс. Этот факт может быть связан как солюбилизацией катепсина Д в условиях охлаждения, вследствие нарушения целостности лизосомных мембран, так и активацией изоферментной системы (Нурмагомедова и др., 1987).

С помощью изоэлектрического фокусирования в коре больших полушарий мозга человека установлено 6 форм эндопептидазы (катепсин Д), а в гипоталамусе быка катепсин Д присутствует в виде 5 изоферментов (Бархударян, 1980).

Еще в 1960 году Е. Пресс и сотрудники сообщили о существовании, по крайней мере, 10 форм фермента, выделенных из селезенки быка и изменяющихся в интервале рН 5,5-8,4. Гетерогенность кислой гемоглобин расщепляющей протеиназы была выявлена при исследовании фермента из печени крыс методами хроматографии на ионообменнике и разделения на колонке с сефадексом G-100 (Huang, Tappel, 1971).

О наличии в животных тканях множества молекулярных форм катепсина Д свидетельствует широкий спектр молекулярных масс фермента, определенных в различных тканях. Так молекулярная масса катепсина Д выделенного из мозга крыс равна 60 000 Да (Marks, Lajtha, 1965).

Катепсин Д (3.4.23.5) растворимая лизосомальная аспарагиновая протеиназа. Она синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме как препрокатепсин Д (Vetvicka et al., 2000).

Протеаза - катепсин Д активна, в макрофаге эндосом и лизосом. Катепсин Д синтезируемая, как 53 кДа, неактивный предшественник белка, превращается в активную 46 кДа протеазу, проходя через коппартменты аппарата Гольджи (Hasilik, Neufeld, 1980). Приблизительно половины 53 кДа предшественников присутствует в растворимой форме и секретируются прямо в среду без дальнейшего процессинга. Мембраносвязанная протеаза 53 кДа превращается в растворимую форму внутриклеточно, минуя аппарат Гольджи, транспортируется в эндосомы (Diment et al., 1988).

Эндосомальный катепсин Д может быть предшественником лизосомальной протеазы с высвобождением мембраносвязывающей протеазы, служащей сигналом для их сортировки или транспорта в лизосомы. Молекулярные механизмы, ответственные за ассоциацию протеазы с мембранами окончательно не идентифицированы. Имея на конце манноза-6-фосфат, прокатепсин Д узнается манноза-6-фосфат рецептором (Fusek, Vetvicka 1994; Vetvicka et al., 2000). Остатки маннозо-6-фосфата присутствуют на N-алигосахаридных цепях катепсина Д и стимулируют связывание протеазы с рецепторами моннозо-6-фосфата (Komfeld et al., 1989).

Активная форма каптесина Д образуется in vivo при удалении 44-членного N-концевого пропептида. Зрелый катепсин Д и псевдо-катепсин Д (частично активированная форма катепсина Д с удаленными 25 N-концевыми остатками пропептида) связываются с иммобилизованными пропептидом, а прокатепсин Д не связывается. На этой основе разработан одностадийный метод очистки аспартатпротеиназ, позволяющий отделить активные формы ферментов от неактивных предшественников (Wiltlin et al., 1998).

Исследованию молекулярной гетерогенности лизосомных ферментов мозга посвящены единичные работы. Показано, что на разных стадиях очистки, катепсин Д мозга дает множество молекулярных форм фермента, свойства, и функции которых не изучены (Лишко, 1964; Marks, Lajitha, 1965, 1971). Кислые протеиназы в норме, in vivo, не проявляют максимальной активности. А. Лайта (Lajtha, 1964) вычислили, что достаточно 1\10 содержащихся в ткани активных катепсинов для поддержания динамического состояния белков мозга.

Фермент не принадлежит к группе сериновых, сульфгидрильных протеиназ или металлопротеиназ, так как цистеин, йодоцетамид, п-ХМБ, ЭДТА и динзопропилфторфосфат не влияют на его активность.

По данным Баррета (1980), у представителей большинства видов молекула катепсина Д содержит 4 дисульфидные связи и не имеет SH-группы. CN-конца полипептидной цепи аминокислотная последовательность состоит из асп-вал-лей (Whitaker, 1979).

Катепсин Д проявляет свою активность специфически, гидролизуя предпочтительно связи между остатками аминокислот, с ароматическими боковыми цепями, например, фенилаланина.

Катепсин Д и пепсин принадлежат к общей группе протеиназ со сходным механизмом действия. Катепсин Д, так же как и пепсин, причем более доступным для обоих ферментов, являются связи фенилаланина. С другой стороны катепсин Д расщепляет большие пептиды, чем те, на которые действует пепсин. Возможно, это указывает на различия в активном центре катепсина Д и пепсина. Эти различия касаются главным образом субстратсвязывающих участков фермента (Мжальская, Орехович, 1964, Казакова и Орехович, 1972). Считают, что при действии катепсина Д на природные субстраты оказываются связанными не менее шести аминокислотных остатков фермента, из которых гистидину отводится особое место. Катепсин Д синтезируется в виде неактивного предшественника, что биологически целесообразно для защиты других внутриклеточных белков от неспецифического протеолиза этим ферментом до его доставки в лизосомы (Erickson, Blobel, 1979; Erickson et al., 1981).

Синтез катепсина Д контролируется стероидными гормонами. Прогестерон и его производные увеличивают скорость матричного синтеза катепсина Д, и в линиях раковых клеток молочной железы экспрессия катепсина Д регулируется эстрогенами, которые взаимодействуют на уровне промотера. В отличие от других членов семейства аспарагиновых протеиназ, которые в основном являются секреторными белками, прокатепсин Д сортируется лизосомами (Vetvicka et al.,1993; 1997).

При нормальных физиологических условиях, ни прокатепсин Д, ни катепсин Д не секретируются и каждый из них найден только внутриклеточно (Fulco et al., 1998; Короленко, 1990).

В эндоплазматическом ретикулуме клеток прокатепсин Д секретируется после стимуляции эстрогена (Vetvicka, 1998; 1999).

Изучение человеческих макрофагов, используя слабые основы, предполагает наличие альтернативного механизма в сторону от маннозо-6-фосфат рецептора для сортинга протеазы в лизосомы этих клеток. Ассоциация протеазы с мембранами может быть связана с этим альтернативным сортингом или процессом транспорта (Braulke, Geuze et al., 1987).

При исследовании температурной зависимости общей амилолитической и протеолитической активности, а так же активности сахарозы и катепсина Д у 7 видов пресноводных животных (олигохеты, моллюски, личинки комаров), установлены различия температурной функции указанных ферментов у представителей разных таксонов (температурный оптимум процесса гидролиза полисахаридов у моллюсков равен 40, у личинок комаров 50, у олигохет 60⁰С). Наиболее высокая относительная активность в зоне низких температур характерна для катепсина Д у всех исследованных видов. Наименьшие величины энергии активации ферментов отмечены в зоне температур, превышающих 10 или 20⁰С. Однако при температуре среды обитания рыб по своим характеристикам наиболее эффективен катепсин Д, обеспечивающий процессы индуцированного аутолиза (Кузьмина, 1999).

Определена кислая пептидгидролазная активность в гомогенате, растворимой и митохондриально-лизосомальной фракциях тканей мозга крыс, перенесших глубокую гипотермию после их «активного» согревания в течение 1, а так же на 1, 2, 3 и 7-ые сутки после самосогревания. «Активное» согревание крыс, перенесших глубокую гипотермию (19-20⁰С), приводит в течение суток к восстановлению активности кислой пептидгидролазы в субклеточных фракциях тканей мозга, при самосогревании активность исследуемого фермента восстанавливается через 7 суток. В динамике постгипотермического периода, на 2-е и 3-и сутки, происходит изменение распределения активности кислой пептидгидролазы во фракциях (Нурмагомедова, 1987).

Фундаментальная роль катепсина Д это распад внутриклеточных и интернализованных белков. Предполагается, что катепсин Д принимает участие в процессинге антигена и ферментативной генерации пептидных гормонов. Тканеспецифическая функция катепсина Д связана с процессингом пролактина. Крысиные молочные железы используют этот фермент для ассоциации биологически активных фрагментов пролактина. Катепсин Д функционален в различных тканях во время их регрессии и во время апоптоза (Fusek, Vetvicka, 1994).

Биологическая важность эндосомальных протеаз определяется их участием в распаде ряда специфических белков внутри этих везикул. Катепсин Д вовлекается в эндосомальный протеолиз гормонов, токсинов и иммунологически важных антигенов. Макрофаги интернализует бычий паратиреоидный гормон и разрушает этот белок в эндосомах до биоактивных фрагментов (Diment, Martin et al., 1989).

Протеолиз этого гормона осуществляется при низкой рН эндосом и катализируется катепсином Д (Blum, Fiani et al., 1989).

Наиболее распространенный взгляд на функцию катепсина Д в клетке состоит в том, что он является начальным звеном в цепи процессов, ведущих к распаду белков.

В то же время начинают накапливаться данные о внелизосомальных, более специфических функциях катепсина д. В частности, высказывалась гипотеза, что катепсин Д может участвовать в ремоделинге синаптических контактов уже после завершения синаптогенеза (Suopanki et al., 2000). Известно, что цитоскелет нейронов претерпевает переходы между статическим и динамическим режимами роста дендритов и их шипиков. Поэтому можно предположить, что одной из функций катепсина Д может быть участие в процессах регуляции состояния цитоскелета при периодических пробуждениях.

Глава II. Материалы и методы исследования

2.1 Обоснование выбора объекта исследования и постановка эксперимента

Малые суслики - типичные представители зимоспящих животных. В опытах использованы животные, примерно, одного веса и возраста. Исследования вели на ненаркотизированных животных.

В течение лета и до середины октября суслики содержались в стандартных условиях вивария, на смешанном растительно-зерновом рационе (трава, капуста, пшеница, подсолнечник). С середины октября животных переносили в неотапливаемое, темное помещение и переводили на сухие корма. По мере снижения температуры воздуха, животные становились вялыми, сворачивались в клубок. После снижения температуры воздуха до 8-6єС, животные укладывались в стеклянные балоны с подготовленной подстилкой. В течение 3-4 суток суслики погружались в зимнюю спячку.

Сусликов исследовали перед погружением в спячку в октябре и выходе из спячки в апреле. Также в апреле исследовали животных, неспавших в течение зимы.

Следующие группы исследуемых животных были взяты: 1) в подготовительный период, 2) при пробуждении после баута спячки и 3) при выходе из спячки.

Исследование седиментируемой (лизосомально-митохондриальной) и неседиментируемой (водорастворимой) форм катепсина Д проводили при следующих состояниях животных:

1) бодрствующие животные перед залеганием в спячку (ноябрь, температура тела 37-38єС);

2) животные в состоянии зимней спячки (декабрь, температура тела 5-6єС);

3) перед первым баутом пробуждения (декабрь, температура тела 10-11єС);

4) перед выходом из спячки (апрель, температура тела 10-11єС);

5) выход из спячки (апрель, температура тела 30-31єС).

Так как в один сезон не удавалось провести все серии исследований, в каждом случае для сравнения брали свой контроль.

2.2 Биохические методы исследования

2.2.1 Приготовление гомогенатов тканей мозга и печени и выделение фракций

Животное, находящееся в соответствующем состоянии для исследования, декапитировали, извлекали мозг, промывали ледяным физиологическим раствором. Для определения протеолитической и автолитической активности гомогенаты готовили на физиологическоя растворе (1 : 9 вес/объем) на холоду в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Для выделения фракций мозг гомогенизировали в 0,32 М растворе сахарозы. Гомогенат центрифугировали при 1000 g, в течение 10 мин. Супернатант-1, полученный после первого центрифугирования, центрифугировали при 20 тыс. g в течение 30 мин. Супернатант-2 представлял собой водорастворимую фракцию мозга и содержит неседиментируемую активность фермента, а осадок - лизосомально-митохондриальную фракцию и содержит седиментируемую активность фермента.

2.2.2 Определение активности катепсина Д

Активность катепсина Д измеряли по методу Ансона с некоторыми модификациями (Нурмагомедова и др., 1983). Активность катепсина Д определяли по скорости расщепления гемоглобина (используемого в качестве субстрата) с образованием тирозильных концевых групп, образующихся пептидных фрагментов.

Состав инкубационной среды: в 0,5 мл исследуемой фракции или гомогената добавляли 1 мл 2% раствора гемоглобина в мединал-ацетатном буфере рН 3,8. Пробы инкубировали в течение 30 или 60 минут. Затем реакцию останавливали добавлением к пробе 2 мл 0,2 М трихлоруксусной кислоты. Через 30 мин пробы центрифугировали при 1 тыс. g в течение 10 мин. В супернатанте определяли содержание свободного тирозина. Активность фермента выражали в мкг тирозина на мг белка.

Белок во фракциях определяли по методу Лоури (Кочетов, 1980) с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

2.2.3 Исследование температурной зависимости активности катепсина Д

Для изучения температурной зависимости активности катепсина Д пробы инкубировали при 5, 10, 15, 20 и 37єС. Время инкубации во всех случаях составляло 60 мин. Полученные результаты представлены в Аррениусовских координатах lg V - 1/Т, где V - скорость реакции, Т - температура инкубации. Для водорастворимой фракции температурная зависимость имеет линейные участки, что позволяет охарактеризовать этот температурный диапазон эффективной энергией активации.

В каждой серии опытов было использовано 4-6 животных. Вычисляли среднее арифметическое и ошибку средней. Достоверность различий средних проверяли с помощью критерия Стьюдента.

Для проверки используемой нами методики была определена константа Михаэлиса. Для этого была измерена концентрационная зависимость активности катепсина Д в диапазоне 0,04-2,0 мМ в расчете на одну субъединицу гемоглобина, молекулярный вес которой принят равным 16000. К_m определяли по графику Лайнуивера-Берка. Полученное значение К_m (45 мМ) для катепсина Д близко к литературным данным (60 мМ - [Whittaker et al., 1979]).

На графиках в Аррениусовских координатах вычисляли положение точки излома и энергии активации выше и ниже излома.

• Глава III. Результаты и их обсуждение

3.1 Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга суслика и крысы

Суслики зимой впадают в спячку, снижая температуру тела и метаболизм, летом, как и крысы, поддерживают температуру тела на уровне 37-39єС.

Исследование летом температурной зависимости активности катепсина Д из мозга крысы и суслика выявило следующие результаты (табл. 1, рис. 1).

Активность фермента в гомогенатах больших полушарий мозга суслика и крысы при низких температурах инкубации: 5, 10, 15 и 20єС достоверно не отличается. При 30 и 37єС активность катепсина Д суслика достоверно снижена, по сравнению с активностью фермента из мозга крысы и составляет, соответственно, 24 и 31.5%. При низких температурах инкубации (5-20єС) графики температурной зависимости фермента из мозга обоих зверьков параллельны. С повышением температуры инкубации до 30єС, затем до 37єС кривые температурной зависимости резко расходятся. При этом значения активности катепсина Д из мозга суслика при 30 и 37єС равны значениям активности фермента из мозга крысы при 20єС. Таким образом, летом температурная зависимость активности катепсина Д мозга суслика не представлена прямой и отличается от температурной зависимости фермента мозга крысы.

3.2 Автолитическая и протеолитическая активность внутриклеточных протеиназ головного мозга и печени суслика

Автолитическая активность тканей характеризует как активность ферментов распада белков (внутриклеточных протеиназ), так и состояние эндогенных белков, их атакуемость протеиназами.

Таблица 1

Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга крысы и суслика (в мкг тирозина/мг белка)

Температура инкубации, єС	Гомогенат больших полушарий мозга
	крысы	суслика
5 10 15 20 30 37	1,050,014 2,24±0,08 2,84±0,26 3,87±0,27 5,14±0,24 6,13±0,21	1,10±0,16 1,88±0,17 2,60±0,21 3,25±0,23 3,91±0,34* 4,20±0,27*

Примечание: * - различия достоверны, по отношению к активности фермента из мозга крысы.

А

5 10 15 20 30 37 °С

Рис. 1. Температурная зависимость активности катепсина Д мозга

бодрствующего суслика (лето) и крысы:

- крысы;

- суслик.

Исследования температурной зависимости автолиза показали, что при температуре инкубации 5єС продукты автолиза не определяются независимо от состояния животного: бодрствующего, проснувшегося от спячки или не спавшего зимой. Поэтому исследования температурной зависимости автолитической активности проводили при четырех температурах инкубации: 10, 20, 30 и 37єС (табл. 2, рис. 2).

Как видно из табл. 2, при 10єС на 1 мг белка за 60 мин инкубации определяется 1-1,5 мкг тирозина. Повышение температуры инкубации на 10⁰С и измерение автолиза при 20єС приводит к увеличению автолиза в мозгу в 2 раза и не зависит от состояния животного (2-3 мкг тирозина на 1 мг белка за 60 мин инкубации).

Дальнейшее повышение температуры инкубации повышает активность автолиза в мозгу неравномерно.

Таблица 2

Температурная зависимость автолитической активности в гомогенатах ткани мозга суслика (в мкг тирозина на мг белка за 60 минут инкубации)

Состояние животных	Температура инкубации, в єС
	10	20	30	37
Бодрствующие (контроль) октябрь	1,190,01	2,050,23	2,590,13	3,670,14
После спячки, апрель	1,470,17	2,910,48	5,210,83*	8,580,98*
Неспавшие, апрель	1,010,24	2,40,26	5,320,49*	6,91,08*

Примечание: * - значения достоверны относительно контроля.

У контрольной группы это повышение при 30 и 37єС по сравнению с данными при 20єС составляет 29 и 80%, соответственно. У животных после зимней спячки повышается на 79% при 30єС и на 194% при 37єС. В данном случае состояние животных, перенесших зимнюю спячку, определяет необходимость повышения автолитической активности тканей мозга при пробуждении

и столь значительное повышение при ее температурах инкубации 30 и 37єС. Это может быть связано с двумя процессами: во-первых, с синтезом определенных пептидов, активируемых при выходе из спячки, во-вторых, с деградацией модифицированных и выполнивших свою функцию белков.

Усиление синтеза белка, при пробуждении сусликов, перенесших зимнюю спячку, связывают с необходимостью новых функциональных и структурных белков или же синтеза новых изоформ ферментов (Жегунов, Микулинский, 1987).

У сусликов, вышедших из зимней спячки, при сравнении с бодрствующими, автолитическая активность в мозгу довольно высокая: при 30⁰С инкубации она выше на 101%, а при 37єС - на 133%. У животных же бодрствующих в течение зимы при 30 и 37єС инкубации, по сравнению с животными, вышедшими из зимней спячки, особых различий в автолитической активности не наблюдается. При 30єС инкубации активность фермента почти одинакова, а при 37єС на 24% ниже, чем у бодрствовавших в течении зимы, чем у переживших зимнюю спячку сусликов.

Определение активности автолиза в печени (табл. 3, рис. 3) показало, что при 10єС инкубации, как и в мозгу, независимо от состояния животных, особых различий в автолитической активности нет. За 60 мин инкубации на 1 мг белка определяется 1,2-1,6 мкг тирозина. Повышение температуры инкубации до 20єС приводит к повышению автолиза у контрольных и лишенных зимней спячки сусликов в 2 раза, а у животных вышедших из зимней спячки, по сравнению с бодрствующими (контроль), активность на 82% выше.

При дальнейшем увеличении температуры инкубации активность автолиза повышается в печени, как и в мозге, неравномерно. Так, у контрольной группы повышение автолиза при 30 и 37єС инкубации выше, чем при 20єС на 58 и 152% соответственно. У сусликов, вышедших из зимней спячки, автолитическая активность при 30⁰С инкубации выше на 53,8%, по сравнению с данными при 20єС, а при 37єС на 98,6%. У животных, находившихся в активном состоянии в течение зимы при 30 и 37єС инкубации как и в мозге по сравнению со спавшими, особых различий в активности автолиза нет.

Таблица 3

Температурная зависимость автолитической активности в гомогенатах ткани печени суслика (в мкг тирозина на мг белка за 60 минут инкубации)

Состояние животных	Температура инкубации, в єС
	10	20	30	37
Бодрствующие (контроль) октябрь	1,290,17	2,060,12	3,270,29	5,20,22
После спячки, апрель	1,170,07	3,750,6*	5,770,36*	7,450,67*
Неспавшие, апрель	1,580,46	2,310,17	4,280,12*	6,00,51*

Примечание: * - значения достоверны относительно контроля.

У животных, лишенных зимней спячки, наблюдается достоверное повышение автолиза по сравнению с бодрствующими, однако оно ниже, чем у переспавших зимой сусликов. При 30єС инкубации автолитическая активность тканей мозга у животных вышедших из спячки на 76,4% выше, чем у бодрствующих (контроль), а у животных лишенных спячки на 30,9%. При 37єС инкубации автолитическая активность у этих животных на 43,3 и 15,3% выше, соответственно.

Автолитическая активность у бодрствующих сусликов имеет тканевую специфичность, которая проявляется лишь при инкубации в диапазоне 30-37єС. В печени она выше, чем в мозге при 30 и 37єС, а при 10 и 20єС на одном уровне с автолизом в мозге. Так при 30єС в печени уровень автолиза выше, чем в мозге на 26,6%, а при 37єС инкубации на 41%.

Таким образом, лишь при температуре, характерной для теплокровного организма, проявляется тканевая специфичность автолиза.

У животных, которые вышли из зимней спячки в печени и в мозге при 10єС активность почти одинаковая, а при 20 и 30єС в печени активность автолиза выше на 28 и 10% соответственно. При 37єС инкубации в мозге наблюдается повышение автолиза на 15% по сравнению с печенью. У сусликов, лишенных зимней спячки при 10 и 20єС инкубации различий в автолитической активности в тканях печени и мозга не наблюдается, а при 30 и 37єС в мозге она выше на 24 и 15% соответственно. Таким образом, в тканях животных, перенесших зимнюю спячку и лишенных зимней спячки, несмотря на значительные колебания автолитической активности, достоверных различий в мозге и в печени не наблюдается. Интересно отметить, что при всех температурах инкубации автолитическая активность гомогенатов ткани мозга и печени сусликов, лишенных зимней спячки выше значений у бодрствующих сусликов и меньше, чем у проснувшихся после спячки.

При температуре 37єС, характерной для теплокровного организма, автолитическая активность внутриклеточных протеиназ сусликов имеет тканевую специфичность. Температурная зависимость автолиза в мозге имеет в координатах Аррениуса схожие кривые у спавших и бодрствовавших зимой сусликов, и отличается от таковой у контрольных животных.

Протеолитическая активность катепсина Д, определяется в мозгу сусликов при 5єС в пределах 2,0-3,6 мкг тирозина на мг белка. При выходе из зимней спячки активность фермента на 57%, а у неспавших сусликов на 73% выше, чем в контроле (табл. 4, рис. 4).

Повышение температуры инкубации до 10єС приводит к повышению активности фермента в 3 раза у животных, перенесших зимнюю спячку, а у не спавших сусликов активность фермента повышается в 2 раза.

Таблица 4

Температурная зависимость протеолитической активности (катепсина Д) в гомогенатах мозга суслика (мкг тирозина на мг белка)

Состояние животных	Температура инкубации, в єС
	5	10	20	30	37
Бодрствующие (контроль) октябрь	2,070,43	4,100,26	8,211,00	11,441,00	16,161,19
После спячки, апрель	3,260,51	9,250,56*	12,051,45	17,841,94*	21,990,91*
Неспавшие, апрель	3,580,28	6,350,54	10,40,70	13,92,57	17,94,6

Примечание: * - значения достоверны относительно контроля.

По сравнению с контролем активность катепсина Д у спавших сусликов при инкубации 10єС повышается на 125%, у не спавших - на 54%. При инкубации 20єС наибольшая протеолитическая активность определяется в мозгу сусликов, перенесших спячку (она выше, по сравнению с контролем на 46%). Закономерное повышение активности катепсина Д с повышение температуры инкубации отмечается и при температурах 30 и 37єС. В обоих случаях сохраняется более высокая активность фермента у сусликов, проснувшихся от спячки, как по сравнению с контролем, так и с группой животных, не впадавших в состояние гибернации. Таким образом, в мозгу сусликов, перенесших гибернацию, протеолитическая активность выше, чем у контрольных (осенний и зимний). Хотя у животных, содержавшихся зимой на полном рационе в условиях вивария, про

 lg A

1 1 - спавшие;

2 2 - неспавшие;

3 3 - контроль.

3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 1/Т10^-3

Рис. 4. Температурная зависимость активности катепсина Д в мозге.

теолитическая активность также выше, чем в контроле, но она ниже, чем у сусликов после зимней спячки. Протеолитическая активность печеночной ткани отличается от таковой в мозге (табл. 5, рис. 5).

Таблица 5

Температурная зависимость протеолитической активности (катепсина Д) в гомогенатах печени суслика (в мкг тирозина на мг белка)

Состояние животных	Температура инкубации, в єС
	5	10	20	30	37
Бодрствующие (контроль) октябрь	5,921,18	9,261,27	13,932,23	18,602,45	23,661,50
После спячки, апрель	5,870,49	8,420,85	14,241,03	16,680,50	23,681,69
Неспавшие, апрель	3,950,43	8,641,14	13,641,31	15,620,69	20,842,93

В мозге она ниже, чем в печени при всех исследованных температурах, независимо от группы животных. После выхода из состояния гибернации, активность протеолиза в мозге возрастает, а в печени она не изменяется за исключением снижения активности на 33% при 5єС. Эти различия в протеолитической активности ткани мозга и печени наглядно иллюстрируют Аррениусовские графики температурных зависимостей (рис. 4 и 5).

В мозге контрольных сусликов на графике температурной зависимости катепсина Д имеется излом при 20єС, у неспавших зимой сусликов этот излом отсутствует, а у зверьков, проснувшихся после зимней спячки, излом смещается в область температуры 10єС и между 30 и 10єС образуется плато. Столь существенные и интересные сдвиги в температурной зависимости активности ка-