В течении опыта постоянно велись наблюдения за состоянием здоровья животных, выраженностью их аппетита. При помощи общих методов исследования, а именно осмотра, пальпации, перкуссии, аускультации и термометрии исследовали дыхание, пульс, состояние слизистых оболочек, лимфатической и пищеварительной систем. Обращали внимание на состояние кожи, полости рта, глотки, пищевода. Исследовали органы дыхания.

Пальпацию применяли с целью определения болезненности, а также изучения физических свойств тканей и органов дыхания, топографических соотношений между ними, количества и качества пульса.

По характеру получаемого звука при перкуссии позволял судит о границах и физических свойствах органов и тканей под перкутируемой поверхностью, определяли увеличение или уменьшение области печеночного притупления, болезненность печени.

При аускультации исследовали звуки, образующихся в функционирующих органов.

Температура измерялась в прямой кишке ртутным термометром. Перед измерением термометр был смазан вазелином. Измерялась температура 10 минут. Показатели термометрии позволили следить за ходом болезни и результатами лечения.

При клиническом наблюдении, учитывали сроки клинического выздоровления, количество павших, вынужденно убитых и выздоровевших животных.

Эффективность лечения оценивали как разницу между выздоровевшими и павшими/выбракованными животными, выраженную в процентах.

Исследование общетоксических свойств препарата «Азитронит» проводили в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического государственного комитета («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2005).

Подготовку к опыту животных проводили в соответствии с указаниями ОФС «испытание на токсичность» ГФ XI [50].

Определение острой пероральной токсичности азитронита на белых мышах

Каждая опытная группа мышей состояла из 10 животных. Азитронит вводили белым беспородным мышам-самцам в нативном виде без разведения однократно с помощью желудочного зонда в дозах 15000; 25000 и 30 000 мг/кг, что соответствует 0,15; 0,25 и 0,3 мл/10 г массы животного. Всего в опыте использовали 30 опытных и 30 контрольных белых мышей.

Определение острой токсичности Азитронита при внутримышечном введении белым беспородным мышам

Каждая опытная группа мышей состояла из 10 животных. Препарат вводили мышам однократно, внутримышечно, в нативном виде в дозах 5000; 10000 и 15000 мг/кг, что соответствует 0,05; 0,1 и 0,15 мл/10 г массы животного. Всего в опыте участвовало 60 мышей (30 опытных и 30 контрольных особей).

В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием и поведением животных, проявлением симптомов интоксикации, возможной гибелью мышей.

Значение LD₅₀ и других токсикологических параметров препарата определяли по методу Миллера-Тейнтера [27,59]. Устанавливали максимально переносимую (LD₀), среднесмертельную (LD₅₀) и абсолютно смертельную (LD₁₀₀) дозы для мышей и крыс в мг/кг массы животного, а также учитывали (LD₁₆) и (LD₈₄) для определения доверительных границ.

Уровень опасности препарата оценивали согласно ГОСТ 12.1.007-766 «Вредные вещества, классификация, требования безопасности».

Исследование подострой токсичности Азитронита при внутримышечном введении белым крысам - самцам.

Опыт проводили на 40 крысах - самцах. Животных разделили на 4 равноценные группы по 10 крыс в каждой.

Азитронит в виде нативного раствора вводили внутримышечно, ежедневно, в течение 14 суток трем опытным группам крыс в дозах: 1/10; 1/20 и 1/50 от LD₅₀ (930; 465 и 186 мг/кг) установленного при внутримышечном введении белым мышам. Животным контрольной группы вводили воду для инъекций в дозе 3,0 мл на крысу.

Введение исследуемого препарата проводили по следующей схеме:

Таблица 2

Группа	Количество крыс	Доза, мг/кг
1	10	930 (1/10 от LD50)
2	10	465 (1/20 от LD50)
3	10	186 (1/50 от LD50)
4	10	раствор для инъекций (контроль)

В течение всего периода введения препарата наблюдали за общим состоянием и поведением животных, приемом корма и воды, видимыми физиологическими функциями и возможной гибелью крыс. Ежедневно у крыс регистрировали массу тела на весах ВР-05 МС-3/0,5-БР (Россия).

В конце опыта через 1 сутки после последнего введения Азитронита животных убивали декапитацией и отбирали пробы крови (с и без антикоагулянта) для определения гематологических и биохимических показателей.

Основные показатели периферической крови крыс определяли на гематологическом анализаторе PCE 90-vet (Китай); лейкограмму - общепринятым методом.

Биохимические показатели крови определяли на анализаторе Biosystems A-15 (Испания).

Массу внутренних органов (сердца, печени, легких, селезенки и почек) определяли на весах «AND HL400» (Япония) и рассчитывали их массовые коэффициенты.

Для проведения макро - и микроскопических исследований органов у всех крыс каждой группы отбирали образцы печени, легких, почек, сердца, селезенки и мышц. Материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы готовили на микротоме «Microm HM325» (Германия) и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопические препараты исследовали под микроскопом «Micros» (Австрия); увеличение 90х10.

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программы «Student-200».

Определение раздражающего действия препарата «Азитронит» на кожу и слизистую глаз лабораторных животных

Определение местного раздражающего действия проводили методом кожной и конъюнктивальной проб на 10 кроликах породы шиншилла согласно методическим указаниям «Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи» (1979, Текст документа по состоянию на июль 2011 года) [48].

За 1 - 2 суток до эксперимента у кроликов тщательно выстригли ножницами на спине участки размером 7 x 8 см на симметричных участках спины по обе стороны от позвоночника, оставляя шерстяной покров между ними в 2 см. Правый бок служил для аппликации раствора препарата, левый - для контроля. На время экспозиции для исключения слизывания препарата с кожи животных фиксировали воротником из пластика.

Исследуемый препарат наносили в нативном виде на выстриженный участок на правом боку кролика из расчета 1 мл на 1 кг массы животного. На левый бок наносили такое же количество дистиллированной воды. Время экспозиции составляло 4 часа. Повторные экспозиции проводили ежедневно в течение 20 дней. После окончания эксперимента за животными вели наблюдение в течение 14 суток. Выраженность эритемы определяли визуально и оценивали в баллах по шкале С.В. Суворова: 0 - отсутствие эритемы; 1 - слабая (розовый тон); 2 - умеренно выраженная(розово - красный тон); 3- выраженная ( красный тон) 4- резко выраженная (ярко- красный тон).

Изучение раздражающего действия на слизистую оболочку глаз проводили с помощью «конъюнктивального теста» [48] на тех же 10 кроликах. Животным в конъюнктивальный мешок правого глаза закапывали по 1 капле нативного раствора препарата. Левый глаз был контрольным, в него закапывали стерильный изотонический раствор хлорида натрия. Наблюдение за животными вели в течение 7 суток. Оценку реакции учитывали по шкале: 0 - видимая реакция отсутствует; 1 -легкое покраснение конъюнктивы; 2 - покраснение конъюнктивы и частично склеры; 3 - сильное покраснение конъюнктивы и всей склеры; 4- гнойный офтальмит.

Определение аллергизирующих свойств препарата Азитронит

Оценку аллергизирующего действия препарата проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ [70].

Оценку аллергизирующих свойств Азитронита проводили при помощи реакции гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) на белых мышах и конъюнктивальной пробы на морских свинках. В экспериментах использовали 2 группы каждого вида животных по 10 голов в каждой.

Мышей первой (опытной) группы сенсибилизировали путем однократного внутрикожного введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии препарата в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) и растворе Хенкса. Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку одной из задних лап вводили 40 мкл 10 мМ раствора препарата в растворе Хенкса (рН 7,5). Через 6, 22, 24 часа измеряли величины обеих лап мышей с помощью микрометра. Разница в величине лап характеризует величину отека и интенсивность ГЗТ.

Мышей контрольной группы обрабатывали по такой же схеме, при этом эмульсия ПАФ не содержала препарата.

Конъюнктивальную пробу ставили на 20 морских свинках, которых разделили на 2 группы - опытная и контрольная. Морских свинок сенсибилизировали в правую заднюю лапу препаратом в смеси с ПАФ в соотношении 1:1 в количестве 0,4 мл. Контрольной группе вводили 0,4 мл ПАФ.

Для постановки пробы одну каплю препарата вводили с помощью пипетки в правый глаз под верхнее веко опытным и контрольным свинкам в положении лежа на спине. Во второй глаз вводили 1 каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия.

Реакцию учитывали через 15 минут (быстрая гиперчувствительность) и через 24 и 48 часов (гиперчувствительность замедленного типа).

Исследование токсичности повышенных доз препарата на телятах.

Животных разделили по принципу аналогов на 4 группы по 5 голов в каждой.

Препарат «Азитронит» вводили внутримышечно в течение 9 суток в следующих дозах:

I группа - терапевтическая доза (1,0 мл/20 кг массы);

II группа - доза, превышающая терапевтическую в 3 раза (3,0 мл /20 кг);

III группа - доза, превышающая терапевтическую в 5 раз (5,0 мл/20 кг);

IV группа - контрольная; телятам вводили внутримышечно воду для инъекций.

Максимальный объем препарата вводимого в одно место составлял не более 10 мл.

Наблюдение за животными продолжали в течение 14 суток после окончания курса обработки.

В ходе эксперимента ежедневно учитывали клиническое состояние животных (осморт, пальпация, перкуссия, аускультация, термометрия). Еженедельно (1, 7 и 14 сутки после прекращения введения препарата) проводили гематологические исследования, определяли уровень гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов и определяли лейкограмму-общепринятыми методами.

Для оценки функционального состояния печени проводили исследование общего белка сыворотки крови, определяли уровень активности аспарат- и аланинаминотрансфераз, определяли уровень билирубина. Исследование уровня мочевой кислоты в сыворотке крови служило критерием функционального состояния почек.

Основные показатели периферической крови (яремной вены) определяли на гематологическом анализаторе PCE 90-vet (Китай); биохимические показатели крови определяли на анализаторе Biosystems A-15 (Испания).

Исследование фармакокинетики азитромицина в организме телят

Фармакокинетику азитромицина после однократного применения препарата Азитронит изучали на 4 телятах. В опыт отбирали клинически здоровых животных.

В течение 14 дней, до начала введения Азитронита, телята не получали никаких химиотерапевтических препаратов. Накануне опыта каждого теленка взвешивали и рассчитывали индивидуальную дозу препарата. Перед введением препарата телятам ставили внутривенный катетер и отбирали контрольные пробы крови (0 срок исследования).

Азитронит вводили телятам однократно, внутримышечно, из расчета 1,0 мл на 20 массы животного, что соответствует 5 мг азитромицина на 1 кг массы.

Пробы крови отбирали до и через 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после введения препарата в этикетированные полиэтиленовые центрифужные пробирки с предварительно добавленным антикоагулянтом. Пробирки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, отделяли плазму крови и замораживали пробы при -20°С до момента исследования.

Определение сроков выведения остаточных количетсв азитромицина из организма телят

Остаточные количества азитромицина в органах и тканях после курсового применения препарата Азитронит определяли на 17 клинически здоровых телятах.

В течение 14 дней до начала введения «Азитронита» телята не получали никаких химиотерапевтических препаратов. Перед началом эксперимента животных взвешивали и распределяли по принципу аналогов на 4 группы по 4 животных в каждой. 1 теленок служил контролем, ему препарат не вводили.

«Азитронит» вводили телятам внутримышечно в суточной дозе 1 мл на 20 кг массы животного (5 мг/кг по азитромицину) трехкратно, с интервалом 24 часа.

Через 20, 30, 35 и 40 суток после отмены препарата проводили убой телят (по 4 теленка на каждый срок) и отбирали образцы печени, почек, легких, сердца, жировой ткани и мышечной ткани с места инъекции.

Контрольного теленка забивали в конце опыта. Отобранные пробы замораживали и хранили при -20 °С до момента исследования.

Разработка метода определения действующего вещества препарата Азитронит в плазме крови и тканях телят

Исходя из анализа литературных источников, нам представлялось целесообразным использовать метод хроматомасс-спектрометрического детектирования для определения содержания азитромицина в биологических жидкостях и тканях.

Принцип метода заключался в хроматомасс-спектрометрическом определении азитромицина в экстрактах плазмы крови или ткани телят, полученных твердофазной экстракцией аналита при помощи ABN-картриджей (Biotage, Швеция), и обработки полученных данных с помощью программно-аппаратного комплекса AnalystSoftware 1.4.2. Нами были подобраны оптимальные условия хроматографии, обеспечивающие получение стабильных результатов при анализе проб, содержащих низкие концентрации антибиотика.

При постановке опыта использовали следующие реактивы, посуду и оборудование:

1. Весы лабораторные ShinkoDenshi HTR-220CE.

2.Хроматомасс-спектрометрическая система, включающая градиентный микронасос и автосемплер PerkinElmer Series 200 и квадрупольный масс-спектрометр AppliedBiosystems 3200 QTrapLC/MS/MS.

3. Обращённофазовая предколонка С 18 Kromasil.

4. Хроматографическая обращённофазовая колонка Kromasil Eternity 2.5 C18 (Ш сорбента - 5 мкм), 250 х 4,6 мм.

5. Концентрирующие ABN-картриджи («Biotage», Швеция).

6. Гомогенизатор SilentCrusher M («Heidolph»).

7. Центрифуга Eppendorf 5810R и бакет-ротор A-4-81.

8. Вортекс Микроспин FV-2400 («BioSan»).

9. Генератор азота ГЧА-18 (НПП «ХимЭлектроника», Россия)

10. Полипропиленовые пробирки с крышками объёмом 1.5 мл («Greiner Bio»).

11. Посуда мерная, лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770.

12. Вода для LC-MS («Sigma-Aldrich»).

13. Ацетонитрил для LC-MS («Sigma-Aldrich»).

14. Метанол для HPLC («Fluka»).

15. Муравьиная кислота для LC-MS 98%, 56302 («Fluka»).

16. Стандартный образец: азитромицин («Sigma-Aldrich») серия № Y0000306.

Хроматографические условия

Разрешение компонентов проводили на колонке Kromasil Eternity 2.5 C18. Подвижная фаза имела следующий состав: 0.5% водный раствор муравьиной кислоты: 0.5% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле, взятые в соотношении 20:80. Скорость потока составляла 350 мкл/мин. Объем вкола - 2,5 мкл.

Масс-спектрометрические условия

Параметры ионизации:

Метод ионизации: положительный электроспрей

Температура источника: 450 °C

Параметры ионизации: DP = 20,0 В, EP = 10,0 В. CUR = 25; GAS1 = 45; GAS2 = 45.

Напряжение источника +5500 В.

Q1=749.5, Q3=749.5/591.5 (основной ион), CE = 40 эВ, CXP = 23 В; 749.5/375.2 (характеристический ион 1); 375.2/158.1 (характеристический ион 2), CE = 47 эВ, CXP = 11,5 В) (рисунки №1-№3).

Калибровочная кривая

Для построения калибровочной кривой в 10 мл элюента был приготовлен раствор азитромицина с концентрацией 1 мг/мл (с учетом содержания азитромицина в стандарте 94.4%). Путем последовательных разбавлений из данного раствора были получены растворы азитромицина в элюенте с концентрациями: 1, 10, 100 и 1000 нг/мл. Процедуру градуировки азитромицина повторяли дважды (в разные дни).

Экстракция азитромицина из плазмы крови

Твердофазную экстракцию проводили с использованием SPE-картриджей Evolute ABN («Biotage», Швеция), которые предварительно промывали 1 мл метанола и затем 2 мл воды. К 250 мкл плазмы крови добавляли 1 мл воды - перемешивали и наносили на картридж со скоростью 1 капля/секунду. После нанесения колонку промывали 1 мл воды. Снятие проводили 250 мкл элюента, состоящего из 0.5% водного раствора муравьиной кислоты: 0.5% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (20:80). Элюат переносили в виалы автосемплера. Объем вкола составлял 2,5 мкл.

Для определения степени извлечения азитромицина из плазмы крови в образцы плазмы, полученные от контрольного теленка, вносили стандартный раствор азитромицина таким образом, чтобы получить в плазме крови концентрации аналита 1, 10, 100 и 1000 нг/мл. Затем проводили экстракцию этих растворов по описанной выше методике.

Строили график корреляции площади хроматографического пика и концентрации азитромицина в плазме крови телят и рассчитывали степень извлечения (Си) азитромицина по следующей формуле:

Си = Sоб. / К * Сст., где:

Sоб. - площадь пика азитромицина в модельной пробе, counts;

К - градуировочный коэффициент (рассчитан по градуировочному графику в элюенте 2-й день);

Сст. - внесенная концентрация азитромицина в пробе, нг/мл.

Для определения точности и воспроизводимости методики с помощью построенной калибровочной кривой были определены концентрации в растворах азитромицина, приготовленных на контрольной плазме крови телят. К 1 мл плазмы крови телят добавляли раствор стандартного образца азитромицина до достижения конечных концентраций: 20, 100 и 1000 нг/мл. В соответствии с описанными выше методиками осуществляли экстракцию и анализ содержания азитромицина в пробах.

Предел обнаружения (LOD) и предел измерения (LOQ) азитромицина в плазме крови телят устанавливали экспериментально на основании полученных пустых хроматограмм. Предел обнаружения LOD анализируемого соединения определяли как концентрацию, соответствующую (по градуировочному уравнению) утроенному значению стандартного отклонения шума:



Предел количественного детектирования LOQ анализируемого соединения определяли как концентрацию, соответствующую (по градуировочному уравнению) значению стандартного отклонения шума, умноженному на 9:

где а - угловой коэффициент градуировочного графика для азитромицина.

Расчёт концентрации азитромицина в плазме крови телят проводили по уравнению, полученному для линии тренда градуировочного графика стандартного раствора азитромицина в плазме крови.

Определение действующего вещества препарата Азитронит в образцах органов и тканей телят

Определение азитромицина в образцах органов и тканей телят проводилось методом хроматомасс-спектрометрии, как это было описано выше для определения азитромицина в плазме крови телят.

Полный список использованных реактивов, посуды, оборудования приведен выше, в разделе, посвященном определению азитромицина в плазме крови телят.

Разрешение компонентов проводили при хроматомасс-спектрометрических условиях и с помощью методики масс-спектрометрического исследования, описанных выше, в разделе, посвященном определению азитромицина в плазме крови телят.

Калибровочная кривая

В качестве калибровочной кривой азитромицина в элюенте использовали калибровку, полученную ранее при определении данного лекарственного вещества в плазме крови телят.

Для определения степени извлечения азитромицина из органов и тканей телят в контрольные образцы тканей, полученные от необработанного теленка, вносили стандартные растворы азитромицина, чтобы получить концентрации в ткани: 1, 10, 100 и 1000 нг/г.

Экстракция азитромицина из образцов тканей

Азитромицин экстрагировали из органов и тканей телят ацетонитрилом. Для этого к 1 г ткани добавляли 2 мл ацетонитрила и гомогенизировали с помощью гомогенизатора SilentCrusher M ("Heidolph"). Далее к гомогенату добавляли 3 мл ацетонитрила и интенсивно встряхивали на вортексе до образования однородной массы. Полученную смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 минут. Далее нижнюю органическую фракцию переносили в чистую пробирку и повторяли экстракцию 6 мл ацетонитрила. Органическую фракцию собирали и упаривали в токе азота при 30°C. Полученный сухой остаток растворяли в 1 мл элюента и переносили в стеклянные виалы автосемплера.

Расчёт количества действующего вещества азитромицина препарата Азитронит в экстрактах органов и тканей телят проводили при помощи уравнений, полученных для линий тренда градуировочных графиков по экстрактам:

C = S/X, где:

C - искомая концентрация азитромицина в образце органа или ткани, нг/г;

S - площадь пика азитромицина в пробе, counts;

X - градуировочные коэффициенты линий трендов градуировочных графиков азитромицина.

Предел обнаружения (LOD) и предел измерения (LOQ) азитромицина в ткани устанавливали экспериментально на основании полученных пустых хроматограмм. Предел обнаружения LOD анализируемого соединения определяли как концентрацию, соответствующую (по градуировочному уравнению) утроенному значению стандартного отклонения шума:

Предел количественного детектирования LOQ анализируемого соединения определяли как концентрацию, соответствующую (по градуировочному уравнению) значению стандартного отклонения шума, умноженному на 9:

где а - угловой коэффициент градуировочного графика для азитромицина.

Исследование терапевтической эффективности препарата Азитронит при болезнях органов дыхания телят.

Болезни органов дыхания телят диагносцировали с учетом эпизоотической обстановки в хозяйстве, данных общего клинического (осмотр, пальпация, перкуссия, аускультация и термометрия), патологоанатомического и бактериологического исследований. Материалом для бактериологических исследований служили пораженные легкие и слизистая оболочка бронхов от 2-х павших телят болевших подострой бронхопневмонией и гнойно-катаральной пневмонией.

Определение оптимального режима дозирования Азитронита при лечении острой катаральной бронхопневмонии телят

Оптимальную терапевтическую дозу препарата определяли в опытах на 52 больных телятах в возрасте от 2 суток до 4 месяцев.

Из 52 телят с диагнозом острая катаральная бронхопневмония были сформированы контрольная группа из 12 животных и 4 опытных группы по 10 животных в каждой.

Каждой опытной группе телят с диагнозом острая катаральная бронхопневмония применяли препарат Азитронит внутримышечно, в заднюю область лопатки в следующих дозах: 0,5; 0,8; 1,0; и 1,5 мл/20 кг массы животного. Препарат в дозе 0,5 мл на 20 кг массы животного вводили трехкратно с интервалом 24 часа; в дозах 0,8 и 1,5 мл/20 кг массы животного, дважды, с интервалом 48 часов и в дозе 1,0 мл на 20 кг массы животного двукратно с интервалом 24 часа.

Контрольным животным применяли Энромаг 10% подкожно в дозе 0,5 мл на 10 кг массы животного, трехкратно, с интервалом 24 часа. Препарат вводили в одно место не более 5,0 мл.

Изучение терапевтической эффективности Азитронита при подострой бронхопневмонии телят.

Терапевтическую эффективность Азитронита при подострой бронхопневмонии телят бактериальной и микоплазменной этиологии изучали в сравнении с препаратом аналогичного назначения Энромагом 10%.

Для оценки эффективности лечения подострой бронхопневмонии телят Азитронитом в опыт было подобрано 28 больных животных в возрасте 2-3 мес. Телят условно распределили на 2 равноценные группы, по 14 животных в каждой. Животным 1 группы применяли Энромаг 10% подкожно, в дозе 0,5 мл на 10 кг массы животного, трех и пятикратно, с интервалом 24 часа.

14 телятам 2 группы применяли внутримышечно «Азитронит» в дозе 1,0 мл/20 кг массы животного, двукратно, с интервалом 48 часов.

Изучение терапевтической эффективности Азитронита при хронической бронхопневмонии телят

Для оценки эффективности лечения хронической бронхопневмонии телят Азитронитом в опыт было подобрано 22 больных животных в возрасте 2-4 месяцев, которых разделили на опытную и контрольную группы. 8 больным телятам применяли внутримышечно препарат Энромаг 10%, пятикратно, с интервалом 24 часа, в дозе 0,5 мл на 10 кг массы животного. Остальным 14 телятам применяли внутримышечно Азитронит в дозе 1,0 мл/20 кг массы животного трехкратно, с интервалом 48 часов.

Изучение терапевтической эффективности Азитронита при остром трахеобронхите телят

Терапевтическую эффективность препарата при остром трахеобронхите телят определяли на 50 больных животных 2,5 - 3,5 месяцев, из которых были сформированы 2 опытные группы, по 25 особей в каждой. Телятам 1 группы применяли Азитронит внутримышечно, в дозе 1 мл на 20 кг массы животного, двукратно, с интервалом между введениями 24 часа. Животным 2 группы препарат вводили внутримышечно в той же дозе двухкратно с интервалом 48 часов.

Изучение терапевтической эффективности Азитронита при остром бронхите телят.

Эффективность препарата изучали на 50 больных телятах, в возрасте 2 - 4 месяцев, из которых были сформированы 2 группы. Первой группе телят (n=30) Азитронит вводили внутримышечно в дозе 1 мл на 20 кг массы животного, трехкратно, с интервалом 24 часа. Второй группе животных (n=20) препарат применяли в той же дозе двукратно с интервалом между введениями 48 часов.

Определение терапевтической эффективности Азитронита у телят при серозно - катаральной пневмонии, осложненной гастроэнтеритом.

Опыты проводили на 39 больных телятах, в возрасте 3 - 4 месяцев, которых условно разделили на 2 группы. Первой группе, в количестве 22 телят препарат применяли внутримышечно в дозе 1 мл на 20 кг массы животного от 3 до 5 введений, с интервалом 24 часа. Второй группе животных, в количестве 17 голов, применяли внутримышечно препарат Флорон 30% в дозе 1 мл на 15 кг массы животного, трижды, с интервалом 48 часов.

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Исследование острой и подострой токсичности Азитронита на белых мышах и крысах

Определение острой токсичности Азитронита при пероральном введении белым мышам

Результаты перорального введения Азитронита белым беспородным мышам приведены в таблице 3.

Таблица № 3

Доза, мг/кг по препарату	Общее количество животных (павших/выживших)
15000	0/10
25000	0/10
30000	0/10

Анализ таблицы 3 свидетельствует о том, что доза 30000 мг/кг была максимально возможной для перорального введения белым мышам. Гибели опытных животных не регистрировали ни от одной из вводимых доз. Более того, проявление признаков интоксикации опытных животных не регистрировали на протяжении всего периода наблюдений (14 суток). Согласно общепринятой гигиенической классификации препарат относится к 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76.

Определение острой токсичности Азитронита при внутримышечном введении белым беспородным мышам

Результаты гибели белых мышей после внутримышечного введения Азитронита приведены в таблице 4.

Таблица № 4

Доза препарата, мг/кг	Общее количество животных (павших/выживших)
5000	0/10
10 000	2/8
15 000	10/0

Следует отметить, что сразу после введения дозы 5000 мг/кг в правую заднюю конечность наблюдали общее угнетение, отек в месте введения, конечность была вытянута и не реагировала на прикосновения. Через сутки после введения препарата все животные оставались живы. В месте инъекции препарата наблюдали отек, уплотнение, животные начали реагировать на прикосновения к лапе.

При введении препарата в дозе 10000 мг/кг наблюдали аналогичную картину интоксикации, только более выраженную. Животные были сильно угнетены, не реагировали на внешние раздражители, через 1 час одно животное пало, через сутки погибла еще одна особь. У остальных животных этой группы признаки угнетения и вялости регистрировали в течение 5 суток. Отек, уплотнение, болезненность в месте инъекции наблюдали в течение 10 суток.

Введение дозы 15000 мг/кг привело к быстрой гибели в течение 1-2 часов всей опытной группы животных. Практически сразу после инъкции развивались сильное угнетение, атаксия, а затем паралич и гибель белых мышей.

В таблице 5 приведены параметры острого токсического действия Азитронита на мышах, рассчитанные методом Миллера - Тейнтера.

Таблица № 5

LD0	LD16	LD50	LD84	LD100
мг/кг
5000	7800	9300 (7888ч10712)	10900	15000

Исследование подострой токсичности Азитронита при внутримышечном введении крысам

Отрицательное влияние препарата на организм крыс при длительном введении в повышенных дозах оценивали на основании изменения массы тела, определения массовых коэффициентов внутренних органов, гистологического исследования, гематологических и биохимических показателей.

В таблице 6 приведены результаты динамики прироста массы тела у крыс в сравнении с контролем.

Введение Азитронита во всех дозах отразилось статистически значимым образом на текущих значениях привесов. Изменения массы животных начинали фиксировать на пятые сутки введения. Начиная с 5 суток и на протяжении всего опыта, животные всех опытных групп неохотно потребляли корм и воду в сравнении с контрольной группой. Отрицательный прирост по отношению к исходной массе статистически достоверен в дозах 930 и 465 мг/кг: 82,12 и 88,41% соответственно. От дозы 186 мг/кг, крысы хотя и прибавили в весе по сравнению с исходной массой, но тем не менее отставали от контрольной группы (различие статистически достоверно).

Таблица № 6

Динамика прироста массы тела у крыс при внутримышечном введении Азитронита в трех дозах в течение 14 суток (n=10, p?0,5)

Неделя	Контроль ( вода для инъекций)	Дозы препарата, мг/кг
		930	465	186
0	239,67±10,71	241,83±3,37	235,00±3,37	241,83±2,73
1	263,53±3,26	232,94±3,83*	208,05±2,69*	241,30±2,81*
2	295,87±2,92	207,87±3,72*	209,96±3,45*	276,53±3,12*
Процент к исходной массе тела	129,95±4,18	82,12±1,59*	88,41±2,46*	114,58±2,72

?- p?0,05 при t_крит.=2,18

Как видно из представленных данных в первую наделю введения препарата отмечали резкое снижение массы крыс в дозах 930 и 465 мг/кг. При введении дозы 465 мг/кг во вторую неделю масса крыс практически не менялась, а максимальная доза 930 мг/кг вызвала дальнейшее и резкое снижение массы животных. Крысы в этой группе были более вялыми и менее опрятными, в месте инъекции отмечали припухлость, отечность, после 2-3 инъекций - болезненность при пальпации.

Массовые коэффициенты

Относительная масса органов является простым, но очень наглядным показателем токсического действия препаратов при их длительном введении.

Результаты исследований приведены в таблице 7.

Таблица № 7

Влияние Азитронита на массовые коэффициенты внутренних органов крыс (n=10, p?0,5)

Орган	Контроль (вода для инъекций)	Дозы препарата, мг/кг
		930	465	186
сердце	1,26±0,05	1,08±0,06*	0,80±0,06*	1,13±0,04*
печень	10,11±0,44	8,48±0,28*	7,12±0,31*	8,64±0,21*
легкие	2,08±0,09	1,60±0,06*	1,64±0,08*	1,13±0,04*
селезенка	0,6±0,05	0,61±0,03*	0,58±0,06*	0,73±0,04
почки	2,04±0,07	1,61±0,04*	1,63±0,04*	1,86±0,08

?- p?0,05 при t_крит.=2, 18

Как следует из представленных в таблице 7 данных, двухнедельное введение Азитронита привело к статистически значимому снижению относительной массы всех внутренних органов у крыс, получавших препарат в дозах 930 и 465 мг/кг. Значения относительной массы сердца, печени и легких в дозе 186 мг/кг претерпели достоверные изменения и составили, соответственно 1,13±0,04; 8,64±0,21 и 1,13±0,04 против контрольных значений 1,26±0,05; 10,11±0,44 и 2,08±0,09. Следует отметить, что изменения не были дозозависимы: самое низкое значение массового коэффициента сердца (0,80±0,06) отмечали в средней группе, получавшей 465 мг/кг, в то время как в максимальной и в минимальной группе этот показатель был практически одинаковым: 1,08±0,06 и 1,13±0,04 соответственно. Аналогичная картина наблюдалась в случае с печенью: 7,12±0,31 в средней дозе и 8,48±0,28 и 8,64±0,21 в максимальной и минимальной дозах. В случае с легкими наибольшее различие по сравнению с контрольной группой наблюдалось в группе, получавшей минимальную дозу: 1,13 против 2,08 в контрольной группе.

Гематологическое исследование крови

Данные, полученные при анализе наиболее значимых показателей периферической крови контрольной и опытных групп крыс, обобщены в таблице 8.

Таблица № 8

Влияние Азитронита на гематологические показатели крови крыс при внутримышечном введении в течение 14 суток в трех дозах (n=10, p?0,5)

Показатель	Контроль (вода для инъекций)	Дозы препарата, мг/кг
		930	465	186
Гематокрит, %	46,87±0,75	43,12±0,77*	48,08±0,8	45,47±0,87
Гемоглобин, г/л	160,33±3,13	144,67±3,04*	159,50±3,58	155,00±2,34
Эритроциты, 1012/л	8,25±0,19	7,57±0,16*	8,88±0,19	8,23±0,11
Лейкоциты, 109/л	12,10±1,41	10,40±1,41	12,47±1,95	11,88±1,30
Тромбоциты, 109/л	967,17±65,23	1149,83±44,35	1098,00±1973	1098,83±31,79
Показатель анизоцитоза эритроцитов, %	17,25±0,41	18,2±0,24	17,55±0,25	17,17±0,48
Средняя концентрация Hb в эритроците, %	34,22±0,20	33,53±0,28	33,18±0,36	33,82±0,40
Средний объем эритроцитов, f/л	56,85±0,69	56,98±0,49	55,10±0,59	55,23±0,77
Содержание Hb в эритроците, пг	18,45±0,12	17,12±0,27	17,97±0,18	18,85±0,18
Палочкоядерные нейтрофилы ABS, 109/л	0,17±0,09	1,29±0,79	0,18±0,08	0,15±0,06
Сегментоядерные нейтрофилы, 109/л	3,66±0,56	3,31±0,79	2,69±0,94	3,13±0,71
Эозинофилы ABS, 109/л	0,09±0,02	0,04±0,02	0,16±0,14	0,09±0,05
Базофилы ABS, 109/л	0	0	0	0
Моноциты ABS, 109/л	0,64±0,35	0,44±0,10	0,45±0,15	0,75±0,35
Лимфоциты ABS, 109/л	7,61±0,67	5,45±0,66	7,91±1,82	6,76±1,09
Лейкограмма
Палочкоядерные нейтрофилы, %	1,40±0,02	1,71±0,04	1,03±0,06	1,26±0,03
Сегментоядерные нейтрофилы, %	30,67±4,26	40,50±2,81	35,00±5,34	35,67±4,98
Эозинофилы, %	0	0,33±0,21	1,33±0,95	0,67±0,33
Моноциты, %	5,33±2,68	4,50±1,09	4,00±1,39	5,67±2,33
Лимфоциты, %	62,67±2,43	52,83±1,10	59,50±5,70	56,83±6,10

?- p?0,05 при t_крит.=2,18

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что длительное введение Азитронита в дозе 930 мг/кг заментно отразилось на таких гематологических показателях крови крыс, как гематокрит, гемоглобин, содержание эритроцитов, которые составляли соответственно: 43,12 ±0,77; 144,67±3,04 и 7,57±0,16 против контрольных значений 46,87±0,75; 160,33±3,13 ; 8,25±0,19. Эти значения статистически значимо отличались от показателей контрольной группы, однако находились в пределах физиологической нормы для данного вида животных. Остальные показатели, в том числе лейкограмма, достоверно не отличались от контрольной группы.

Изменение вышеперечисленных показателей свидетельствуют о токсическом влиянии препарата на организм крыс в дозе 930 мг/кг массы животного.

Биохимическое исследование крови

В таблице 9 приведены результаты определения биохимических показателей сыворотки крови крыс после многократного внутримышечного введения Азитронита в трех разных дозах.

Таблица № 9

Влияние Азитронита на биохимические показатели крови (n=10, p?0,5)

Показатель	Контроль (физ. раствор)	Дозы, мг/кг
		930	465	186
Общий белок, г/л	69,00±0,82	69,83±1,87	69,67±2,17	69,17±1,30
Креатинин, мкмоль/л	38,17±4,94	46,67±2,81	47,83±2,34	40,83±2,30
Мочевина, ммоль/л	6,33±0,51	6,78±,49	7,15±0,42	6,38±0,26
Глюкоза, ммоль/л	5,05±0,31	5,05±0,17	5,28±0,28	5,65±0,28
Билирубин общий, мкмоль/л	9,72±1,15	11,13±1,06	11,60±0,67	10,92±0,89
Билирубин прямой, мкмоль/л	1,37±0,34	1,75±0,36	2,80±0,55	2,13±0,35
Аланин- аминотранс- фераза (АЛТ), Ед/л	63,67±3,80	62,33±4,77	58,00±3,45	55,00±2,84
Аспартат- аминотранс- фераза (АСТ), Ед/л	167,83±12,04	250,83±16,39*	225,67± 14,06*	206,67± 14,62
Щелочная фосфатаза, Ед/л	206,67±9,30	231,00±15,95	192,17± 12,53	217,67± 16,89
Альфа-Амилаза, общая, Ед/л	678,50±73,54	505,50±29,24	503,83± 31,82	475,00± 76,19
ЛДГ, Ед/л	1830,33±101,31	2494,33±231,80*	2323,67± 192,81	2489,17± 165,53

?- p?0,05 при t_крит.=2,10

Как следует из приведенных данных таблицы, при введении препарата в дозах 930 и 465 мг/кг, имело место статистически достоверное изменение уровня аспартатаминотрансферазы соответственно 250,83±16,39 и 225,67±14,06 Ед/л против данных контроля 167,83±12,04 Ед/л.

В верхней дозе наблюдается повышение уровня лактатдегидрогеназы до 2494,33±231,80 Ед/л против контрольных значений 1830,33±101,31 Ед/л.

Остальные биохимические показатели не претерпели статистически значимых изменений и находились в пределах физиологической нормы для данного вида биомодели.

В то же время следует отметить дозозависимую тенденцию к повышению уровня креатинина, общего и прямого билирубина. Снижение концентрации альфа-амилазы не было дозозависимым; в группе животных, которым вводили минимальную дозу, уровень фермента был самым низким: 475 против 678,5 Ед/л в контроле.

2.2.2 Морфологические исследования

При макроскопическом исследовании 30 образцов печени, легких, почек, сердца, селезенки и мышечной ткани из места инъекции после введения Азитронита крысам в трех дозах отмечено следующее.

Печень. Во всех испытанных дозах отмечена нормальная ткань печени, которая имеет молочно-шоколадный цвет, более темные участки ткани соответствуют центральным зонам долек, кровеносные сосуды не видны.

Легкие. Во всех образцах легкие имели вид пористой, губчатой структуры бело-розового цвета.

Почки. Во всех образцах было отмечен характерный темно-красный цвет, плотного на ощупь строения.

Сердце. Сердце крыс имеет темно-красный цвет и форму неправильного конуса. Хорошо видны протоки артериальных и венозных сосудов.

Селезенка. имеет блестящую поверхность темно-красного цвета с сероватым оттенком. Наружная поверхность селезенки гладкая и выпуклая.

Мышца бедра. В зависимости от дозы препарата отмечены изменения (186 мг/кг - умеренные; 465 мг/кг - выраженные; 930 мг/кг - ярко выраженные) в виде кровоизлияний во всех слоях мышечной ткани, выраженный отек и вздутие, абсцесс.

При микроскопическом исследовании печени, легких, почек, сердца, селезенки и мышечной ткани от крыс, отмечено следующее.

Печень (рисунок 1). На гистологических препаратах печени от крыс, получавших Азитронит в дозе 930 мг/кг, обнаружено незначительное полнокровие синусоидов (межбалочных капилляров). Четко выступают балки и синусоиды. Междольчатая соединительная ткань выражена умеренно, дольки отличить можно, в них четко выступают центральные вены, встречается двуядерные гепатоциты с небольшими вакуолями. В дозах 465 и 186 мг/кг на уровне светового микроскопа отклонений от нормы не обнаружено. Отмечено: гепатоциты овальной (полигональной) формы, размер их 3-4 диаметра эритроцита, содержат центрально расположенное ядро, круглой или слегка овальной формы, с грубыми нитями хроматина и ядрышками. Ядра окружены оксидоильной цитоплазмой, с незначительной зернистостью. Встречаются двуядерные гепатоциты. В междольковой соединительной ткани видны желчные протоки (не везде четко). Эндотелий капилляров (синусоидов) слегка вытянутой формы, встречаются плазматические клетки, хроматин в ядрах расположен наподобие спиц в колесе.

Окрашивание гематоксилин-эозином, увеличение 40х10.

Печень от контрольной Печень от крысы, при введении

крысы Азитронита в дозе 930 мг/кг

Рисунок 1 Микроскопическое строение печени

Селезенка. На уровне светового микроскопа на всех образцах отчетливо видны белая (лимфатические фолликулы) и красная пульпа. Трабекул не обнаружено. Артерии в белой пульпе просматриваются отчетливо, вокруг них лимфоидные клетки, доминирующими являются малые лимфоциты, в красной пульпе доминирующими являются лимфоциты среднего калибра. Отмечается умеренная гиперплазия белой пульпы за счет средних лимфоцитов, в ядрах которых видны богато окрашенные глыбки хроматина. Строение клеточного состава селезенки всех исследуемых образцов без патологии (рисунок 2).

Окрашивание гематоксилин-эозином, увеличение 40х10

Селезенка от контрольной Селезенка от крысы, при введении

крысы Азитронита в дозе 930 мг/кг

Рисунок 2 Микроскопическое строение селезенки

Сердце. На уровне светового микроскопа на всех препаратах сердечная мышца имеет вид симпласта, состоящего из одетых сарколеммой анастомозирующих друг с другом мышечных волокон, между которыми расположена рыхлая соединительная ткань, богатая сосудами. Волокна окрашиваются оксифильно в красно-розовый цвет, ядра (в отличие от поперчено-полосатой мышцы) лежат не под сарколеммой, а в центре мышечных волокон. Клетки сердечной мышцы представлены кардиомиоцитами. Патология в сердечной мышце у крыс, получавших Азитронит в трех дозах, на всех препаратах отсутствует (рисунок 3).



Окрашивание гематоксилин-эозином

увеличение 10х10 увеличение 40х10

Сердце от контрольной крысы Сердце от крысы,

при введении Азитронита в дозе 930 мг/кг

Рисунок 3 Микроскопическое строение сердечной мышцы

Легкие (рисунок 4). На препаратах отчетливо видны бронхи, перебронхиальная соединительная ткань и альвеолы. Альвеолы выстланы плоским эпителием (пневмоциты I порядка) с уменьшением количества более круглых (округленных клеток - пневмоциты II порядка). Они поддерживаются нитями соединительной ткани и состоят из нежных ретикулярных, коллагеновых и эластичных волокон, с наличием фибробластов, между альвеолами многочисленные капилляры, отмечено большое количество макрофагов. Около бронхов расположены небольшие участки лимфоидной ткани и слизистые структуры. Они предохраняют эпителий от разрушения. Респираторные эпителиальные клетки слабобазофильные, цилиндрического или кубического типа, содержат овальные ядра с зернистым хроматином, расположенным в базальной части клеток, в небольшом количестве слизь присутствует в большинстве бронхов. На гистопрепаратах легких от крыс, получавших верхнюю дозу, т.е. 930 мг/кг, выявлены участки альвеолярной эмфиземы. Отмечено расширение просвета альвеол, разрыв межальвеолярных перегородок и в местах разрыва их видны колбовидные вздутия. Альвеолярные капилляры сдавлены, обескровлены, местами отмечено незначительное разрастание соединительной ткани. Вокруг бронхов отмечены скопления лимфоидной ткани. Отдельные участки легких показывают картину застойной гиперемии и отека. В таких участках отмечено выпотевание транссудата в просвет альвеол и в бронхи.

Окрашивание гематоксилин-эозином, увеличение 40х10

Легкие от контрольной Легкие от крысы, при введении

крысы Азитронита в дозе 930 мг/кг

Рисунок 4 Микроскопическое строение легких

Почки. На гистологических срезах почек от крыс, получавших азитронит во всех исследуемых дозах отклонений от нормы не обнаружено. Почки в норме состоят их паренхимы - основой ее являются мочевые (или извитые) канальцы - это корковый слой. В корковым слое (на ряду с извитыми канальцами) расположены сосудистые клубочки (мальпигиевые тельца). Почечные клубочки окружены (боуменовой) капсулой. Канальцы выстланы эпителием кубического типа. Между канальцами хорошо просматриваются кровеносные сосуды, эндотелий в них хорошо виден (рисунок 5).



Окрашивание гематоксилин-эозином, увеличение 40х10.

Почки от контрольной Почки от крысы, при введении

крысы Азитронита в дозе 930 мг/кг

Рисунок 5 Микроскопическое строение почки

Мышцы бедра. На гистопрепаратах контрольной группы на уровне светового микроскопа отчетливо просматривается поперечная исчерченность. Особенностью этих мышц является то, что они состоят не из клеток, а из крупных симбластов, напоминающих по форме цилиндры, концы которых заострены. В мышечном волокне различают сарколемму и саркоплазму. Ядра мышечных волокон оттеснены к периферии (ближе к сарколемме) и часто расположены цепочкой (одно за другим). Саркоплазма окружает ядро, количество ее варьирует в зависимости от активности мышечного волокна.

На срезах мышечной ткани от крыс, получавших препарат в трех дозах, видны жировая ткань, мышечные пучки (волокна) в продольном и поперечном срезах. Дерма и подкожная клетчатка представлены жировыми клетками и коллагеновыми волокнами. Изменения представляют повышенный интерес, мышечные волокна разъединены серозно-лейкоцитарным инфильтратом. Соединительно-тканные пучки и мышечные волокна разделены серозной жидкостью. Процесс напоминает разлитое гнойное воспаление (флегмону). Пролиферат (клеточный) состоит из макрофагов и лимфоцитов, и большого количества нейтрофильных лейкоцитов. На лицо изменение ядер в виде карпопикноза и карполизиса (рисунок 6).

Окрашивание гематоксилин-эозином, увеличение 40х10.

Скелетная мышца от контрольной крысы

Рисунок 6 Микроскопическое строение скелетной мышцы (бедро)

465 мг/кг 930 мг/кг

Рисунок 7 Скелетные мышцы от крыс, при введении Азитронита в дозах 465 и 930 мг/кг

Изменения мышечной ткани отмечены во всех дозах, но степень ее повреждения зависит от дозы препарата, при 186 мг/кг они незначительные, в дозе 465 выражены сильнее, а в дозе 930 мг/кг изменения в виде гнойного воспаления, отмечено разрушение клеток ткани (рисунок 7).

2.2.3 Определение раздражающего действия и аллергизирующих свойств препарата «Азитронит»

Определение раздражающего действия препарата Азитронит представлены в таблице 10.

Таблица № 10

Результаты изучения раздражающего действия препарата на кожу кроликов

Номер кролика	Масса кролика, кг	Количество нанесенного препарата, мл	Результат
1	2,93	2,93	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
2	2,85	2,85	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
3	2,78	2,78	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
4	2,83	2,83	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
5	2,79	2,79	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
6	2,75	2,75	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
7	2,88	2,88	0 - отсутствие эритемы я после 20 аппликаций
8	2,87	2,87	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
9	2,90	2,90	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций
10	2,81	2,81	0 - отсутствие эритемы после 20 аппликаций

В результате проведенного эксперимента установлено, что при визуальной оценки кожи и изменения толщины ее складки препарат не оказывал местного раздражающего действия на кожу кроликов после 20 ежедневных аппликаций.

Результаты исследования раздражающего действия на конъюнктиву глаза кроликов показали, что через 1 и 5 суток воспалительных явлений в опытном глазу отсутствовали, отличий между опытным и контрольным глазом, в который закапывали стерильный изотонический раствор хлорида натрия, не наблюдали. Таким образом, можно заключить, что Азитронит не обладает раздражающим действием на кожу и слизистую оболочку глаз.

Определение аллергезирующих свойств препарата

Результаты определения аллергизирующих свойств препарата Азитронит представлены в таблице 11.

Таблица № 11

Оценка аллергического действия Азитронита в реакции гиперчувствительности замедленного типа на белых мышах

Контрольная группа	Опытная группа
Номер мыши, контрольной группы	Разница размеров лап, мм, через ч	Номер мыши опытной группы	Разница размеров лап, мм, через ч
	6	22	24	22	6	22	24
1	0	0	0	11	0	0	0
2	0	0	0	12	0	0	0
3	0	0	0	13	0	0	0
4	0	0	0	14	0	0	0
5	0	0	0	15	0	0	0
6	0	0	0	16	0	0	0
7	0	0	0	17	0	0	0
8	0	0	0	18	0	0	0
9	0	0	0	19	0	0	0
10	0	0	0	20	0	0	0

Проведенный эксперимент показал отсутствие изменения размера лап у мышей опытной и контрольной группы.

Оценивая результаты конъюнктивальной пробы (табл. 12) можно констатировать, что через 0,25; 24 и 48 ч после внесения препарата в глаз морских свинок опытной группы реакция оценивалась как нулевая как в опытной группе, так и контроле.

Таким образом, по результатам проведённых экспериментов можно заключить, что Азитронит не обладает аллергизирующим действием.

Таблица № 12

Результаты конъюнктивальной пробы на морских свинках

№ животного	Реакция через, ч
	Контроль	Опыт
	0,25	24	48	0,25	24	48
1	0*	0*	0*	0*	0*	0*
2	0*	0*	0*	0*	0*	0*
3	0*	0*	0*	0*	0*	0*
4	0*	0*	0*	0*	0*	0*
5	0*	0*	0*	0*	0*	0*
6	0*	0*	0*	0*	0*	0*
7	0*	0*	0*	0*	0*	0*
8	0*	0*	0*	0*	0*	0*
9	0*	0*	0*	0*	0*	0*
10	0*	0*	0*	0*	0*	0*

Примечание* - 0- отсутствие изменений

2.2.4 Исследование токсичности повышенных доз препарата на телятах

В результате проведенных экспериментов нами установлено, что при многократном введении препарата в дозах 1,0 мл и 3,0 мл на 20 кг массы животного не было отмечено видимого неблагоприятного влияния на клиническое состояние телят. На протяжении всего эксперимента животные были активны, хорошо принимали корм, равномерно прибавляли в весе. Видимых клинических отклонений у телят не отмечали.