Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке

Размещено на http://www.allbest.ru/

Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке

03.00.12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Верхотуров Василий Владимирович

Москва 2008 г.

Работа выполнена в Якутской государственной сельскохозяйственной академии и Иркутском государственном техническом университете

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.В. Рогожин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Н.Н. Новиков

доктор биологических наук, профессор С.Ф. Измайлов

доктор технических наук, профессор Г.П. Карпиленко

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится "16" декабря 2008 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 по защите диссертаций на соискание степени доктора биологических наук при ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева"

Автореферат разослан "___" __________ 2008 г.

Автореферат размещен на сайте ВАК www.vak.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета С.Л. Белопухов

зерновка злаковый оксидоредуктаз

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность семян находиться в состоянии покоя является важным приспособительным механизмом, позволяющим человеку в определенных условиях длительно хранить семена сельскохозяйственных растений (Николаева, 1999). В то же время наличие покоя у семян весьма затрудняет культивирование многих пищевых, кормовых, технических и других полезных растений, а также осложняет работы в ботанических садах по созданию коллекций растений и интродукции перспективных для хозяйства видов и т.д. Свежеубранные зерновые культуры почти всегда прорастают плохо, поскольку в них велик процент зародышей, неспособных к прорастанию. Наибольшую энергию прорастания зерновки получают в процессе дозревания, которое в зависимости от свойств сорта, условий роста и хранения может длиться многие недели (Трисвятский, 1985). Вся цепь процессов, происходящих в семенах при дозревании, прорастании и превращении их в новое растение постоянно находится в поле зрения физиологов растений (Хавкин, 1982; Николаева, 2001).

Прорастание семян сопровождается активацией генома и различных физиолого-биохимических процессов (Зауралов, Лукаткин, 1997; Обручева и др., 1999). Энергетическое жизнеобеспечение клеток зародыша, выходящего из покоя, поддерживается достаточно сложным комплексом митохондриальных окислительно-восстановительных реакций (Робертси, 1982; Обручева, 2001). С повышением метаболических процессов в клетках прорастающих семян наблюдается образование активных форм кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы в составе низко- и высокомолекулярных соединений (Кения, Лукаш, 1993). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Мерзляк, 1989).

Активные формы кислорода выполняют в клетках важные сигнальные функции не только при стрессе, но и в обычных условиях произрастания растений (Аверьянов, 1999; Тарчевский, 2000). Стрессовые воздействия (низкая температура, ультрафиолет, химические соединения и др.), применяемые для прерывания покоя и повышения всхожести семян, могут быть инициаторами окислительных процессов, таких как перекисное окисление липидов. В тоже время публикации, отражающие роль анти- и прооксидантного баланса при прорастании семян встречаются крайне редко. Наконец, остается открытым вопрос о взаимной регуляции анти- и прооксидантной системы, а также перспективы использования данного механизма в сельскохозяйственной практике и перерабатывающей промышленности.

Субстратами пероксидазы могут быть фитогормоны, цитохром с, НАДФН, триозы, аскорбат, флавоноиды и др. (Садвакасова, Кунаева, 1987; Рогожин, Верхотуров, 2004). Поскольку активность пероксидазы и метаболизм гормональных и негормональных соединений тесно взаимосвязаны, то повышение активности фермента должно отражаться в изменении метаболизма его субстратов. Динамика роста научной литературы, посвященной активным формам кислорода, антиоксидантной системы, окислительным реакциям и их участием, говорит о стремительно растущем к ним интересе физиологов и биохимиков.

Цель работы состояла в изучении роли анти- и прооксидантной системы при хранении, прорастании и переработке зерновых культур, установлении закономерностей проявления ее активности на действие физических и химических факторов, а также исследовании перспективы применения антиоксидантов в сельском хозяйстве и солодовенном производстве. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Исследовать окислительные процессы и антиоксидантный статус зерновок злаковых культур при различных условиях хранения.

Определить активность и каталитические свойства некоторых оксидоредуктаз при хранении и прорастании зерновок пшеницы.

Проследить за изменением активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при набухании и прорастании зерновок.

Изучить влияние химических и физических факторов на окислительные процессы и антиоксидантный статус семян и проростков.

Предложить механизм окисления низкомолекулярных антиоксидантов с участием пероксидазы и исследовать влияние регуляторов на каталитические свойства фермента.

Исследовать влияние экзогенных анти- и прооксидантов на прорастание и всхожесть зерновок пшеницы.

Исследовать влияние технологического режима проращивания ячменя на антиоксидантный статус и качество светлого пивоваренного солода.

Определить содержание низкомолекулярных антиоксидантов в отходах солодовенного производства и предложить перспективы их использования при солодоращении ячменя.

Защищаемые положения.

Длительное хранение семян, а также их хранение при неблагоприятных условиях, способствует накоплению продуктов ПОЛ и снижению активности антиоксидантной системы. Поэтому показатели состояния про- и антиоксидантной системы могут быть использованы как критерий оценки жизнеспособности семян в условиях хранения и переработки. Низкая активность окислительных процессов и высокое содержание низкомолекулярных антиоксидантов в зерновках является одним из биохимических механизмов, обеспечивающих жизнеспособность семян при длительном хранения.

Перекисное окисление липидов является показателем активации кислородных метаболитов, участвует в запуске программы прорастания семян и активации антиоксидантной системы.

Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы растений в условиях in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и высокомолекулярного антиоксидантного фермента - пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян растений.

Низкомолекулярные экзогенные анти- и прооксиданты являются эффективными регуляторами прорастания зерновок злаковых культур. Участие низкомолекулярных антиоксидантов в механизме покоя семян обусловлено ингибированием фермента антиоксидантной защиты - пероксидазы, что подтверждается в экспериментах in vitro и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян, а активация пероксидазы - ускоренному их выходу из состояния гипобиоза и быстрому прорастанию.

Научная новизна. Показано участие компонентов антиоксидантной системы в регуляции биохимических процессов при хранении и прорастании семян растений. Установлено, что стресс-факторы (температура, ультрафиолет, химические соединения), способствуют стимуляции прорастания семян, через активацию перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы. Результаты проведенных исследований дают возможность рассматривать ПОЛ как один из пусковых механизмов активации программы прорастания семян. Знания механизмов активации биохимических процессов прорастания семян позволяют разработать новые методы, повышающие всхожесть семян и устойчивость растений к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Впервые изучены механизмы индивидуального и совместного пероксидазного окисления низкомолекулярных антиоксидантов. Определены каталитические константы реакций и предложены механизмы взаимной регуляции пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов, реализуемые в биологической системе. Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы проявляются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Фермент, не проявляющий избирательность по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Впервые в производственных условиях исследована активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в зерновках ячменя при производстве светлого пивоваренного солода. Предложено использовать показатели активности антиоксидантной системы для оценки протекания окислительных процессов при производстве пивоваренного солода.

Практическая значимость работы. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики НИР кафедры пищевой технологии ИрГТУ "Техническая биохимия, биотехнология и химия биологически активных веществ" (госбюджетная тема №378). Исследования были поддержаны грантом Министерства образования и науки РФ “Биохимия процессов, протекающих при хранении и переработке растительного сырья” (код ГРНТИ 62.09.37).

Показатель состояния анти- и прооксидантной системы может быть использован как дополнительный критерий оценки качества при хранении и солодоращении зернового сырья. Замачивание семян в растворах низкомолекулярных антиоксидантов, приводит к повышению всхожести и устойчивости проростка к неблагоприятным факторам среды. Полученные данные позволят предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах регуляторов, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для увеличения всхожести и сопротивляемости семян к неблагоприятным факторам.

Результаты, посвященные изучению влияния низкомолекулярных антиоксидантов на солодоращение пивоваренного ячменя, могут быть использованы при разработке технологии применения этих регуляторов в солодовенном производстве. Исследования, посвященные определению содержания низкомолекулярных антиоксидантов в отходах пивоваренного и солодовенного производства, могут быть полезны для разработки технологии использования отходов в регуляции биотехнологических процессов при солодоращении зернового сырья.

Материалы используются для проведения занятий по курсам “Физиология и биохимия растений”, “Биохимия”, “Прикладная энзимология”, и "Биотехнология переработки растительного сырья" для студентов технологического и сельскохозяйственного профиля, обучающихся в ИрГТУ и ЯГСХА.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на научно-практической конференции "Физиология, биохимия и экология растений" (Якутск, 1997, 1998); на V-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); на ежегодных семинарах СИФИБР СО РАН (Иркутск, 1999, 2000); на республиканской научно-практической конференции "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза" (Якутск, 2001); на научно-практических конференциях "Региональные проблемы сельскохозяйственного производства" (Якутск, 2001), "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона" (Иркутск, 2001), "Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации пищевых производств" (Иркутск, 2004), “Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания” (Иркутск, 2006, 2007); на Всероссийской научной конференции “Биологически активные добавки и здоровое питание” (Улан-Удэ, 2001); на V съезде общества физиологов растений “Физиология растений - основа фитобиотехнологии” (Пенза, 2003 г); на Международной научно-практической конференции “Прогрессивные технологии развития” (Тамбов, 2004); Всероссийской конференции “Пищевые технологии” (Казань, 2004), на VIII Международной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); на Всероссийской научно-технической конференции “Молодые ученые - Сибири” (Улан-Удэ, 2003); на 2-й Международной научно-практической конференции “Составляющие научно-технического прогресса” (Тамбов, 2006); на смотре-конкурсе НИР работа на тему "Ресурсосберегающие технологии в производстве пива" удостоена дипломом (Иркутск, 2006); на V-ой Международной научно-практической конференции “Современные тенденции развития АПК в России” (Красноярск, 2007).

Достоверность и обоснованность научных положений и выводов обеспечены проведенным объемом лабораторных исследований; профессионализмом проведения измерений на современном оборудовании; подтверждены сходимостью расчетных и экспериментально полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано более 40 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, а также 2 монографии (в соавторстве) и 1 учебное пособие.

Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 360 страницах машинописного текста, включает 44 таблиц, 73 рисунков, а также список цитируемой литературы из 452 наименований. Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы и приложения.

Личное участие автора. Личный вклад соискателя заключается в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке, интерпретации и публикации полученных результатов.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту проф. В.В. Рогожину за профессиональное и доброжелательное руководство; с.н.с. Т.Т. Курилюк, к.б.н., Т.В. Рогожиной, В.Ю. Гребенщикову, Г.В. Пинигиной, В.К. Франтенко, О.В. Соколовой - за помощь и ценные советы, высказанные в процессе обсуждения диссертационной работы. Автор искренне благодарит сотрудников ОАО "БПК", ЯГСХА, ИрГТУ, ИГСХА и СИФИБР СО РАН за всестороннюю помощь и поддержку, оказанные при подготовке диссертации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили семена пшеницы сорта Омская 12, Скороспелка, Приленская 19, Якутянка 224 (Республика Саха-Якутия), ячмень сорта Гонар (Кировская и Белгородская обл.), Сигнал, Соболек, Кедр (Алтайский край), Ача, Одесский 100, Одесский 115, Неван, Зазерский 85 (Иркутская обл.), Дворан (Тамбовская и Оренбургская обл.), а также семена дикорастущих растений (Республика Саха-Якутия). Технологические свойства ячменя исследовали по общепринятым методикам: отбор проб - ГОСТ 13586.3-83, запах и цвет - ГОСТ 10967-75, влажность - ГОСТ 13586.5-85, примеси и крупность - ГОСТ 13586.2-81, жизнеспособность - ГОСТ 12039-82, способность прорастать - ГОСТ 10968-88, вредители - ГОСТ 13586.4-83, белок - ГОСТ 10846-74, натура - ГОСТ 10840-64, стекловидность - ГОСТ 10987-76, пленчатость - ГОСТ 10843-76, масса 1000 зерен - ГОСТ 10842-89, экстрактивность - ГОСТ 12136-77 и др. Технологические свойства светлого солода исследовали, используя классические методы по ГОСТ 5060-86 (Мальцев, 1972; Косминский, 2000). Исследования проводили на базе ЯГСХА, ИрГТУ, ИрГСХА и АО "Байкальская пивоваренная компания".

Количество супероксида определяли спектрофотометрически при 480 нм по окислению адреналина в адренохром (Misra, Fridovich, 1972). Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при л = 532 нм (Владимиров, Арчаков, 1972; Рогожин, 1999). Активность глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли при 340 нм по начальной скорости изменению абсорбции НАДФH (Smith et al., 1989; Рогожин, 1996); алкогольдегидрогеназы регистрировали по скорости окисления этанола и образования НАДН при л= 340 нм е = 6,22 мМ-1см-1 (Рогожин, 1999); полифенолоксидазы проводили по окислению пирокатехина (Ермаков, 1987); пероксидазы по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода при л = 460 нм е = 30 мМ-1см-1 (Лебедева и др., 1977); каталазы по уменьшению поглощения л = 240 нм, е = 42,3 М-1 см-1 (Цагарели, Пруидзе, 1990); супероксиддисмутазы по ингибированию окисления адреналина супероксид-радикалом при 347 нм (Сирота, 1999).

Определяли активность амилолитических (Плешков, 1976) и протеолитических ферментов (Ермаков, 1987). Содержание антиоксидантов определяли по реакции с о-фенентролином (Ермаков, 1987; Рогожин, 1996); аскорбиновой кислоты по восстановлению К3[Fe(CN)6] при л = 700 нм (Ермаков, Максимов, 1978); стероидных гликозидов по реакции с пикриловой кислотой (Ермаков, 1987). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с учетом критериев Стьюдента и Фишера по методике, описанной в руководстве (Лакин, 1990). Разницу считали достоверной при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Антиоксидантная система и окислительные процессы при хранении семян растений

1.1. Влияние влажностно-температурного стресса на перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему зерновок ячменя

Самосогревание - порочный процесс повышения температуры зерновой массы, приводящий к утрате семенных, продовольственных, кормовых и технических достоинств зерна (Трисвятский, 1985). Проследили за изменениями антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов в семенах ячменя, подвергнутых действию повышенных температур и влажности. Показано, что уже после трех часов экспозиции наблюдалось снижение всхожести (на 5-8%) и повышение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (на 18-20%). Свободные радикалы, образующиеся в результате стрессового воздействия, способны повреждать фитогормоны, белки, нуклеиновые кислоты и другие соединения (Барабой, 1981; Мерзляк, 1989; Зенков, Меньшикова, 1993), поэтому продолжительное влажностно-температурное воздействие приводит к существенному накоплению продуктов ПОЛ и полной потере всхожести семян.

Компенсаторная активация АО системы проявлялась в своеобразной динамике и зависела от продолжительности воздействия неблагоприятных факторов. В первые 12 ч экспозиции активируются антиоксидантные ферменты, что указывает на образование АФК в семенах, подвергнутых влажностно-температурному воздействию. Активность СОД повышалась в течение восьми часов набухания с последующим падением. Максимальная активность КАТ наблюдалась после 12 ч набухания семян. Активность пероксидазы максимально возрастала к 12 ч набухания. В ходе исследований установлено, что в результате действия стрессирующих факторов, отмечается снижение активности антиоксидантной системы, коррелирующей с понижением всхожести зерновок. При этом наблюдается увеличение активности кислых и щелочных протеаз у исследуемых сортов на 6,3 % и 4,7 %, соответственно. Повышение активности протеолитических ферментов зерна под воздействием стресса может быть следствием нарушения целостности мембран и выхода протеаз в цитоплазму клетки.

Таким образом, самосогревание вызывает в клетке усиление свободно-радикальных процессов и смещение равновесия в сторону активации ПОЛ. Активация ПОЛ представляет собой один из первых неспецифических звеньев в общей стресс-реакции организма и может инициировать включение других механизмов защиты. Длительное воздействие стресс-фактора приводит к снижению активности антиоксидантной системы и падению всхожести семян на фоне возрастания окислительных процессов. Поэтому состояние антиоксидантно-прооксидантного равновесия можно рассматривать как показатель жизнеспособности семян и устойчивости их к условиям окружающей среды.

1.2. Влияние условий хранения на активность антиоксидантной системы и физиолого-биохимические процессы зерна

Показано, что у семян, заложенных на хранение в естественных условиях с низкой влажностью (до 14 %), сохранялись достаточно высокие показатели качества на фоне небольших колебаний значений активности окислительных и антиоксидантных процессов. У зерновок, заложенных на хранение с высокой влажностью (18-20 %) в 1,3-1,8 раза снижаются посевные качества. Повышенная влажность зерновой массы и температурный стресс способствуют активации окислительных процессов, приводящих к накоплению продуктов ПОЛ. Продолжительное хранение приводит к резкому снижению активности супероксиддисмутазы и каталазы, а также повышению концентрации продуктов ПОЛ. Пероксидаза сохраняет свою активность на протяжении всего времени хранения.

Следует отметить, что зерновки с влажностью 24 % почти полностью утратили посевные качества (энергия прорастания - 8%, всхожесть - 12-16 %).

Интересно, что повышение активности антиоксидантной системы и интенсивности ПОЛ коррелировало с повышением всхожести и энергии прорастания семян после двухмесячного хранения. Резкое падение всхожести наблюдалось на фоне понижения активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов (табл. 1).

На основании полученных данных можно заключить, что одним из физиолого-биохимических механизмов, определяющих жизнеспособность и сохранность зерна, является активность окислительных и антиоксидантных процессов.

Высокая температура и повышенная влажность зерна способствуют активации свободно-радикальных процессов и ПОЛ, приводящих к понижению жизнеспособности и качества семян.

Таблица 1 Изменение активности антиоксидантных ферментов при хранении ячменя сорта Ача в естественных условиях

Примечание: супероксиддисмутаза (СОД), ед.акт; каталаза (КАТ), мМ/мин г; пероксидаза (ПО), мкМ/мин г; глутатионредуктаза (ГР), мкМ/мин г.

В следующей серии экспериментов изучили влияние температурных условий на физиолого-биохимические показатели семян. Зерновки, хранившиеся при 4-5 и 19-22 °С в течение трех лет, успешно прорастали и формировали морфологически нормальные проростки. Концентрация продуктов ПОЛ несколько повышалась в течение шести месяцев низкотемпературного хранения, что указывает на участие окислительных процессов в послеуборочном дозревании семян. Динамика содержания низкомолекулярных антиоксидантов имела колебательный характер.

Семена, подвергнутые ускоренному старению при 37 °С, формировали меньшее количество сильных проростков, которые были гетерогенны по морфологическим показателям. Посевные качества, содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантной системы ускоренно состарившихся семян определяли с интервалом в две недели в течение шести месяцев. В течение четырех месяцев хранения при 37 °С наблюдается повышение концентрации продуктов ПОЛ. Длительное пребывание в условиях искусственного старения приводит к снижению концентрации МДА и низкомолекулярных антиоксидантов. Таким образом, под действием температурного стресса в клетках зародыша происходят необратимые физиолого-биохимические изменения, приводящие к нарушению роста и развития проростка.

В течение четырех месяцев ускоренного старения активность протеолитических ферментов колебательно повышалась во всех исследуемых сортах. Причем возрастание активности протеаз коррелировало со снижением содержания белка и всхожести. После шести месяцев хранения снижается активность протеолитических ферментов в сортах Дворан и Гонар. В остальных исследуемых сортах ячменя активность протеаз снижается незначительно.

Причиной этих изменений могут быть катаболические процессы, протекающие в семенах при старении, в результате чего происходит нарушение гомеостаза клеток и выход протеаз в свободное состояние. Активность амилолитических ферментов при хранении ячменя характеризовалась повышением в период полуторамесячного ускоренного старения. Снижение активности после двух месяцев хранения при повышенной температуре обусловлено инактивацией ферментов в условиях нарастающего стресса и действием протеолитических ферментов. Полученные данные указывают на существенную взаимосвязь между состоянием антиоксидантной системы и жизнеспособностью семян.

1.3. Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы при длительном хранении зерна в естественных условиях

Установлено, что ПО и ПФО - ферменты, играющие важную роль в метаболизме и способные выполнять роль оксидаз терминального окисления, несколько снижаются в процессе хранения (табл. 2). АДГ - фермент, катализирующий обратимое окисление этанола в ацетоальдегид. Равновесие реакции в физиологических значениях рН смещено в сторону образования этанола, который участвует в различных физиолого-биохимических процессах устойчивости семян к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Накопление этанола в клетках зародыша способствует поддержанию жизнеспособности и длительному сохранению всхожести семян.

Таблица 2 Изменение физиолого-биохимических показателей при хранении ячменя в естественных условиях Гонар

Снижение активности Г6ФДГ указывает на нарушение функционирования основного метаболического пути, участвующего в поддержании жизнеспособности семян при хранении (Робертси, Смит, 1982). Таким образом, понижение жизнеспособности семян коррелировало с уменьшением активности АДГ и Г6ФДГ, а снижение активности ПО и ПФО - с понижением всхожести. Из таблицы 3 видно, что длительное хранение ячменя в естественных условиях склада приводит к снижению всхожести и активности антиоксидантной системы защиты зерна. Содержание продуктов ПОЛ повышалось в течение 3 лет хранения ячменя в естественных условиях. Понижение концентрации продуктов ПОЛ и низкомолекулярных АО коррелировало с резкой потерей жизнеспособности (до 52 %) и всхожести (до 46 %) семян.

Таблица 3 Изменение активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при хранении ячменя сорта Кедр

Таким образом, универсальной причиной старения служит образование активных кислородных метаболитов и свободно-радикальное окисление липидов мембран, белков, нуклеиновых кислот. Результатом метаболических изменений при естественном старении семян является утрата ими жизнеспособности. В качестве основных звеньев, ответственных за сохранение жизнеспособности семян, могут выступать окислительные и антиоксидантные процессы.

2. Влияние внешних факторов на антиоксидантную систему и окислительные процессы при прорастании семян растений

2.1. Активность оксидоредуктаз при набухании и прорастании семян

таблицы 4 видно, что в первые 12-24 ч набухания, активируются как дегидрогеназы, так и оксидазы. Возможно, это объясняется тем, что выход из состояния покоя, сопровождается активацией биосинтетических процессов, для осуществления которых необходима активация дыхания.

Таблица 4 Активность оксидоредуктаз при набухании пивоваренного ячменя Гонар (Кировская область)

Известно, что именно работа ПФП существенно важна для выхода семян из состояния покоя (Робертси, Смит, 1982). Ограничивающим скорость звеньев ПФП является реокисление НАДФН. Наиболее вероятным механизмом ускоренного окисления НАДФН можно предложить совместное окисление кофермента с другими субстратами (Лебедева, Угарова, 1996).

Снижение на более поздних стадиях замачивания (36-48 ч) активности дегидрогеназ и увеличение на их фоне активности пероксидазы и полифенолоксидазы объясняется преобладанием в семенах аэробных процессов.

Нами изучена активность окислительных ферментов в зародыше, щитке и эндосперме в течение 24 ч набухания ячменя. Выход из покоя семян обусловлен интенсивностью биосинтетических процессов, прежде всего, в зародыше и щитке, поэтому наибольшая активность изучаемых нами дегидрогеназ и оксидаз, наблюдается именно в них.

Активность оксидазных ферментов - пероксидазы и полифенолоксидазы возрастала в течение всего времени проращивания (табл. 5). Повышение активности пероксидазы свидетельствует о том, что фермент может участвовать в пусковых механизмов прорастания семян, инициируя реакции свободно-радикального окисления, которые через активацию ПОЛ могут способствовать возрастанию дыхательной процессов митохондрий (Рогожин, 2000). Следует отметить, что активность окислительных ферментов в корнях гораздо выше, чем в зерновке.

Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя, с кратковременным подъемом активности в корнях на 4 сутки. Снижение активности АДГ при прорастании объясняется ингибированием фермента молекулами АТФ, концентрация которых повышается за счет активации аэробного биологического окисления (Рогожин, 2000). Активность Г6ФДГ резко возрастала в корнях на 3 сутки, а затем постепенно снижалась.

Таблица 5 Активность оксидоредуктаз при проращивании ячменя Гонар

Таким образом, при запуске процессов прорастания необходима активация как анаэробных, так и аэробных процессов. Путем правильного регулирования условий проращивания можно в определенных пределах управлять процессами переключения дегидрогеназных реакций на оксидазные.

2.2. Окислительные процессы и активность антиоксидантной системы при набухании и прорастании семян

В течение всего времени набухания, постепенно повышается содержание в ячмене МДА и низкомолекулярных АО (табл. 6). Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в прорастающих зерновках объясняется активацией гидролитических реакций, обеспечивающих зародыш пластичным материалом и энергией. Активность каталазы и пероксидазы постепенно возрастает в течение всего периода замачивания, что объясняется участием их в окислении энергетических соединений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян. Пик активности СОД приходит на 12 ч замачивания с последующим колебательным падением. Снижение активности глутатионредуктазы можно объяснить тем, что для катализа этому ферменту необходим кофермент НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов. Нами изучена активность антиоксидантных ферментов, содержание низкомолекулярных АО и МДА в зародыше, щитке и эндосперме в течение первых 24 ч набухания ячменя. Активность СОД, КАТ и ПО в процессе набухания колебательно возрастает. Причем высокая активность ферментов и содержание АО наблюдается в зародыше и щитке. Пик наибольшей активности приходится на 12-16 ч замачивания. Следует отметить, что активность глутатионредуктазы резко возрастает в первые 8 ч, а затем постепенно идет на снижение.

Таблица 6 Окислительные процессы и антиоксидантный статус ячменя сорта Сигнал (Алтайский край) при замачивании

Физико-химические свойства мембран могут оказывать существенное влияние на протекание метаболических процессов (Владимиров, Арчаков, 1972; Мерзляк, 1989). Хотя поглощение воды и служит сигналом к организации митохондрий, самого по себе поглощения воды для активации окислительных процессов недостаточно. В сухих семенах отсутствует окислительное фосфорилирование, но существуют митохондрии, для активации работы которых необходимы физико-химические изменения в мембранах (Khan, 1982). Возможно, что абсолютная необходимость АФК и антиоксидантной системы для жизнедеятельности семян объясняются образованием при их реакциях электронно-возбужденных состояний - триггеров всех последующих биоэнергетических процессов. Колебательный режим таких реакций может обусловливать ритмичное протекание биохимических процессов более высокого уровня. Резкое повышение содержание МДА в зародыше и щитке можно объяснить возрастанием окислительных процессов и дыхания в зерне при достижении необходимой влажности. По-видимому, процессы ПОЛ запускают у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности.

Повышение концентрации низкомолекулярных АО на 12 ч набухания объясняется выходом из депо низкомолекулярных растворимых соединений, а также гидролизом белков и полисахаридов, продукты которых обладают антиоксидантными свойствами (Тарчевский, 2001). Из результатов видно, что проращивание сопровождается постепенным возрастанием ПОЛ в зерне и корнях (табл. 7). Концентрация низкомолекулярных АО постепенно снижается в зерне в течение всего времени проращивания. Динамика активности СОД в корнях и зерне постепенно повышается в течение четырех суток ращения. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в корнях. Каталаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накапливается при проращивании, причем скорость накопления явно зависит от длительности проращивания. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению с активностью ПО, так как сродство фермента к малым концентрациям Н2О2 ниже, чем у пероксидазы (Саундерс, 1988). Указанные ферменты принадлежат к дыхательному комплексу растений, поэтому повышение их активности в прорастающем ячмене обусловлено также возрастанием дыхания.

Таблица 7 Состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в процессе прорастания ячменя сорта Сигнал

Увеличение активности ПО может быть вызвано накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих его синтез. Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут ингибировать фермент (Рогожин, 2004), способствуя, таким образом, увеличению концентрации Н2О2 в клетках. Возможно, этим и объясняется падение активности фермента на 3 и 6-е сутки проращивания. Постепенное снижение активности ГР в зерне и корнях можно объяснить преобладанием аэробных процессов над анаэробными, в результате чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Таким образом, контроль над уровнем ПОЛ во время набухания и прорастания семян ячменя осуществляется с помощью низко- и высокомолекулярных антиоксидантов. Понижение свободно-радикальных процессов в семенах возможно за счет образования большого количества антиоксидантов, концентрация которых при этом возрастает в несколько раз, особенно в зародыше семян ячменя. Выявленные закономерности являются проявлением адаптационных компенсаторных механизмов, использование которых позволяет регулировать физиолого-биохимические процессы в семенах при прорастании.

2.3. Влияние температуры на активность антиоксидантной системы и окислительные процессы

2.3.1 Активность, каталитические свойства пероксидазы и содержание антиоксидантов при прорастании семян пшеницы

Изучена динамика активности ПО и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 ч набухания при 5 єС (I группа) и 23 єС (II группа). Процесс набухания семян сопровождается колебательным возрастанием активности фермента. Обращает на себя внимание тот факт, что резкое повышение активности фермента в семенах, подвергнутых температурному стрессу, наблюдается на 8, 18 и 24 ч набухания. Пероксидаза - стрессовый фермент растений, который участвует в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Поэтому своеобразные колебательные всплески активности фермента обусловлены проявлением компенсаторных механизмов в условиях низкой положительной температуры.

Для выяснения локализации и участия компонентов антиоксидантной системы в процессах прорастания определено содержание продуктов ПОЛ, низкомолекулярных АО и активность ПО в различных органах семян (табл. 8). Видно, что активность ПО и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1,5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и оболочке в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

Субстратами ПО могут быть фитогормоны и фенольные ингибиторы роста, поэтому фермент имеет большое значение в регуляции состава биологически активных веществ в клетках растений. Окисление БАВ ферментом способствует активации ростовых процессов в условиях стресса.

В покоящихся семенах дыхание крайне ослаблено, отмечаются изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы (Николаева, 1999; Робертси, Смит, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996). При активизации дыхания, поступивший кислород ускоряет пусковые механизмы процессов ПОЛ, поэтому наибольшее содержание продуктов ПОЛ отмечается в активно метаболизирущих органах - зародыше и щитке.

Таблица 8 Активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в органах семян пшеницы сорта Омская 12 после 24 ч замачивания зерен при разных температурах

По-видимому, повышение всхожести при низкотемпературном замачивании семян обусловлено тем, что ведущим звеном этой системы являются процессы ПОЛ, запускающие у покоящихся организмов основные процессы жизнедеятельности. Таким образом, набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в концентрации АО и повышением активности ПО.

Изучение влияния температуры на кинетические и структурные свойства ферментов позволит понять молекулярную природу приспособления организма к меняющимся факторам окружающей среды.

Показано, что различия в величинах Кm по о-дианизидину пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни), а также Vm проростков пшеницы семян I (5 єС) и II групп (23 єС) незначительны. Основные изменения наблюдаются у Кm по аскорбиновой кислоте пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Кm зерен I группы выше в 1,5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Vm по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1,5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Km no AK пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, чем у ПО надземной части проростков этой же группы.

Пероксидаза обладает широкой субстратной специфичностью, поэтому катализ определяется сродством его к субстрату. Разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Таким образом, результаты исследования показали, что изменение не только активности, но и каталитических свойств ПО в семенах является одним из механизмов регуляции процесса прорастания. Наблюдаемое in vivo взаимное влияние между антиоксидантами и пероксидазой обусловлено тем, что низкомолекулярные антиоксиданты являются субстратами пероксидазы.

2.3.2. Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от окислительного стресса

Поскольку ПО и АО входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 сутки роста проростков пшеницы. Показано, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО понижается на 4-5 сутки в 1,4-1,5 раза, при повышении активности пероксидазы в 1,8 раза. В этот период контроль над уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1,5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1,5 раза, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижаются в 2,4 и 1,2 раза соответственно.

Таким образом, контроль за уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно принадлежит низкомолекулярным антиоксидантам, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. В корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ.

Активность ПО в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 5 єС и 23 єС, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы. Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы. Зависимости активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имели вид "качелей" с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков. Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. В корнях семян II группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксидазы и только на 7-ой день отмечался ее рост. Зависимость активности ПО у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день и понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность ПО в корнях семян I группы была 1,5-2,5 раза выше, чем у корней семян II группы. Мотивацией к повышению активности пероксидазы является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей, вызванных воздействием низких температур.

Таким образом, антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции. Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, кроме этого могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя общий контроль за деятельностью системы антиоксидантной защиты.

2.4. Биохимические процессы и антиоксидантный статус при различных режимах аэрации

При производстве пивоваренного солода все большей популярностью пользуется анаэробное солодоращение, которое имеет ряд преимуществ: снижается расход питательных веществ на дыхание и рост, сокращается время солодоращения при достаточном накоплении ферментов, резко активируется пуллуланаза, улучшаются технологические свойства солода и др. (Карпенко и др., 2000).

Изменение активности оксидоредуктаз при солодоращении ячменя представлены в таблице 10. Активность оксидазных ферментов возрастала в течение всего времени проращивания. Следует отметить, что активность окислительных ферментов в солодовых гусарах гораздо выше, чем в зерне. Наибольший пик ПОЛ наблюдается на 6-7 сутки солодоращения.

Известно, что из-за нарушения метаболических систем, сахара в анаэробных условиях не могут полноценно использоваться в качестве энергетических соединений (Чиркова, 2002). Возрастание концентрации низкомолекулярных АО в конце солодоращения обусловлено образованием в процессе гидролиза восстанавливающих углеводов, обладающих антиоксидантными свойствами.

Активность ПФО незначительно возрастает в условиях начинающейся гипоксии. В изменении активности пероксидазы наблюдается резкий скачок после первых суток пребывания в гипоксии. Длительное нахождение солода в анаэробных условиях приводит к снижению активности как антиоксидантных ферментов, так и активности терминальных оксидаз на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидов.

Таблица 9 Изменение антиоксидантного статуса и интенсивности перекисного окисления липидов при аэробном (Аэр) и анаэробном (Ана) солодоращении ячменя сорта Дворан

Активность АДГ колебательно снижалась в течение всего времени прорастания ячменя в аэробных условиях, с кратковременным подъемом активности в солодовых ростках на 4 сутки. Активность Г6ФДГ резко возрастала в гусарах на 3 сутки, а затем постепенно снижалась. Активность дегидрогеназ в течение первых двух суток нахождения в условиях гипоксии постепенно возрастала. Равновесие алкогольдегидрогеназной активности в первые двое суток анаэробиоза сдвинуто в сторону образования этанола, который может служить в условиях стресса энергетическим субстратом для клеток, регулировать интенсивность ПОЛ и проницаемость клеточных мембран. Известно, что для поддержания высокой скорости гликолиза необходимо непрерывное реокисление восстанавливающихся в ходе гликолтического процесса коферментов. В условиях гипоксии, когда электрон-транспортная сеть митохондрий отключена, окисление НАДН может происходить в конечных реакциях спиртового брожения. Следовательно, сдвиг равновесия реакции в сторону образования эндогенного этанола является одним из механизмов реактивности системы на стресс.

Своеобразная динамика падения активности оксидаз и дегидрогеназ указывает на разобщение метаболических процессов при длительной гипоксии из-за накопления продуктов анаэробного окисления веществ и перекисного окисления липидов.

При гипоксии повышается значение низкомолекулярных АО, чья избыточность и относительная свобода миграции в клеточной и тканевой среде выступает на передний план (Мерзляк, 1989). Показано, что в первые сутки анаэробного солодоращения снижение концентрации низкомолекулярных АО сопровождалось накоплением продуктов ПОЛ. Максимальное содержание АО наблюдается на 6-7 сутки солодоращения. Продолжительное анаэробное солодоращение приводит к разобщению окислительных процессов, снижению антиоксидантной активности и накоплению продуктов ПОЛ.

2.5. Влияние ультрафиолетового облучения на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы

В последние годы предприняты многочисленные попытки, позволяющие выяснить метаболическую основу покоя семян и выхода из него, в связи с этим был предложен ряд теорий, из которых все большее признание получают те, в которых рассматриваются окислительные процессы, такие, как гликолиз, ЦТК, ПФП. Правда, остается неясным вопрос о природе активации этих процессов, а также о механизмах их блокировки при покое семян (Робертси, Смит, 1982).

Нами показано, что всхожесть семян ячменя зависит не только от продолжительности УФ облучения, но и от степени набухания семян. Кратковременное облучение ячменя в первые часы набухания приводит к повышению всхожести семян. УФ облучение после 12 ч набухания семян не способствует достоверному повышению всхожести. Обращает на себя внимание тот факт, что длительное облучение после 24 ч замачивания приводит к резкому снижению всхожести семян.

Для объяснения биохимического механизма активации прорастания семян ячменя была изучена активность оксидоредуктаз в различных частях, принимающих непосредственное участие в биохимических процессах активации метаболизма. Установлено, что малые дозы облучения могут изменять периодичность возрастания активности ферментов со сдвигом экстремумов на более раннее время. Кратковременное облучение семян в течение 15 мин после двухчасового набухания приводит к резкому повышению активности оксидоредуктаз в зародыше и щитке.

Именно работа анаэробного биохимического окисления важна для выхода семян из состояния покоя. Поэтому активация Г6ФДГ и АДГ в набухающих семенах после кратковременного облучения указывает на то, что УФ провоцирует запуск окислительных процессов на более ранних этапах набухания, способствуя выходу семян из состояния покоя. Высокая активность ПО указывает на возможность участия фермента в окислении коферментов, способствуя, таким образом, протеканию ферментативного процесса с участием дегидрогеназ (Лебедева, Угарова, 1997). Следует отметить, что воздействие УФ на более поздних этапах набухания, когда влажность уже достигла необходимого уровня, в результате чего активировались различные классы ферментов, приводит к снижению всхожести из-за инактивации ферментов семян с последующим их протеолизом (Арчаков, Мохосоев, 1989).