Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке

Нами были отобраны сухие семена, облученные в течение двух и десяти часов. В качестве контроля использовали семена, не подвергавшиеся УФ облучению. Показано, что после УФ облучения в процессе набухания в семенах отмечается резкое возрастание содержание МДА, приводящее к компенсаторному накоплению низкомолекулярных АО. Так, поле двухчасового облучения в набухающих семенах резко повышается концентрация МДА с последующим снижением к 24 ч. Несколько иная динамика ПОЛ наблюдается в семенах, подвергнутых облучению в течение десяти часов. Интересно отметить, что длительное облучение семян приводит к интенсивной пероксидации липидов в период их набухания.

На основании наших результатов можно сделать вывод о том, что длительное и сильное стрессовое воздействие может привести к понижению всхожести или к полной потере жизнеспособности, тогда как кратковременное облучение активирует окислительные процессы на более ранних стадиях набухания, способствуя запуску программы прорастания семян.

3. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты и регуляторы активности пероксидазы

3.1. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты растительных пероксидаз

В работе показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, в стационарных условиях начальная скорость пероксидазного окисления подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Интересно, что пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты может сопровождаться активированием ПО при ее концентрации (22-220 мкМ) и ингибированием фермента при концентрации АК (264-352 мкМ). Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0).

Пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е1 и Е2). При связывании двух и более молекул АК наблюдается активирование фермента. Однако связывание нескольких (6-9) молекул АК ингибирует пероксидазу. Связывание одной молекулы АК с Е1 достаточно прочное, поскольку Кm1 составляет 6,1-11,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания быстро окисляемого субстрата ПО о-дианизидина, у которого Кm при рН 3,7-7,0 составляет 11-20 мкМ. Дополнительное связывание других молекул АК в 40-50 раз хуже. Причем Кm связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависит от рН. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК улучшается. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН.

Следует отметить, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в пероксидазных реакциях заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток аскорбиновой кислоты понижает каталитическую активность фермента. По-видимому, данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

В зависимости от концентрации фенольные соединения оказывают либо ингибирующее, либо стимулирующее действие на рост и длительность покоя. Нами изучено индивидуальное пероксидазное окисление гидрохинона - классического фенольного антиоксиданта в широком диапазоне рН и концентраций. Показано, что реакция пероксидазного окисления гидрохинона характеризуется высокими kсat, (1220-2225 с-1), что позволяет отнести этот субстрат к группе быстро окисляемых субстратов ПО, таких как ОДН, у которого kсat при рН 3,7-7,0 составляет 625-3540 с-1. Величина Кm для гидрохинона достаточно низкая и составляет 150-650 мкМ в зависимости от рН, что по величине соизмеримо с константой Михаэлиса для ферроцианида калия. Однако это в 10 раз хуже, чем Кm у ОДН. Кm и kсat, пероксидазного окисления гидрохинона мало зависят от рН. Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 2-3 молекул субстрата с фермент-субстратным комплексом ингибирует ПО. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что возможно, вызвано изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Индивидуальное окисление гидрохинона происходит без образования фермент-субстратного комплекса с полуокисленным субстратом. Данный механизм может наблюдаться в растениях для окисления различных регуляторов роста.

3.2. Совместное окисление антиоксидантов - регуляторный механизм с участием пероксидазы растений

При совместном окислении АК и ГХ, осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами ПО на два порядка лучше, чем гидрохинона.

Предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28-420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Однако, связавшись, гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражается в неконкурентном типе активирования. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект проявляется при рН 5,5-7,0. Оптимум активирования приходится на рН 6-7. Если в реакциях индивидуального окисления АК фермент ингибируется при рН 6-7 6-9 молекулами субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и ГХ ингибирование ПО возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Катализ для данного фермента определяется сродством его к субстрату (Chance, 1949), поэтому разные субстраты конкурируют между собой за фермент, и можно ожидать, что изменение каталитических характеристик приведет к накоплению или быстрому окислению биологически активных веществ. Поскольку глубина покоя зависит от концентрации ингибиторов роста и низкомолекулярных антиоксидантов, активность ПО оказывает непосредственное влияние на продолжительность этого физиологического состояния.

3.3. Антиоксиданты - регуляторы активности пероксидазы растений

Интерес к механизму действия ПО вызван еще и тем, что значительное накопление фенольных антиоксидантов в период покоя, а также под действием стрессовых факторов, приводит к активации окисления ИУК с участием ПО и к торможению роста. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола (Gazarian et al, 1996; Савицкий и др., 1998). Предложено, что ПО способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК (Савицкий и др., 1998).

Исследование влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволило установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты. В реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования. Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4-20,5 мкМ. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ. Известно, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: Arg 38, Phe 142 и 143 (Савицкий и др., 1998). При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связывающего участка вблизи Тгр 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений (Аммосова и др., 1997).

Таким образом, используя ИУК можно предположить, что участком связывания АК является дистальная область активного центра. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, когда в активном центре фермента связывается, по крайней мере, одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул аскорбиновой кислоты с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

Изучение реакций совместного пероксидазного окисления ОДН, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии ИУК позволило установить, что ауксин ингибирует ПО в реакции окисления ОДН по конкурентному типу. В реакциях окисления гидрохинона при кислых значениях рН проявлялся неконкурентный характер ингибирования, переходящий при рН>6,5 в смешанный тип. Присутствие ауксина не влияло на пероксидазное окисление ФК.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и ИУК связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению ОДН, тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если ИУК связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становится невозможным.

Физиологический механизм торможения прорастания зародыша связан с высоким содержанием ИУК и ингибиторов роста. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра ПО. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина служить оксидазным субстратом фермента. ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая фермент в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Ауксин может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ИУК, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность ПО, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых для активизации механизмов прорастания.

В экспериментах подробно был изучен механизм влияния низкомолекулярных регуляторов (салициловой кислоты, витамина К, кверцетин, стероидных глкозидов) на окисление антиоксидантов - субстратов пероксидазы. Сложность механизмов пероксидазного окисления субстратов позволяет предположить, что область активного центра фермента разделена на участки, в которых могут упорядоченно связываться и превращаться субстраты. Связывание в регуляторном участке оказывает влияние на протекание каталитического процесса. Последовательное связывание субстратов в этих участках создает условия для управления ферментативным процессом, основанном на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах, а его активность увеличивается при их прорастании. Понижение активности ПО служит критерием углубления покоя семян. Поэтому низкомолекулярные АО в высоких концентрациях понижая активность ПО, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Низкие концентрации субстратов ПО при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

4. Влияние анти- и прооксидантов на всхожесть и физиолого-биохимические процессы семян

4.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть и физиологические процессы семян пшеницы

Нами изучено влияние на всхожесть семян антиоксидантов различных по строению, являющихся субстратами гемсодержащей пероксидазы. Обладая разным механизмом действия, они в малых концентрациях активировали прорастание семян, а в больших - понижали их всхожесть. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Низкие концентрации строфантина, аскорбиновой кислоты, норадреналина, салицилата натрия, хлорпромазина и этанола повышали всхожесть семян пшеницы на 15-20%. Тогда как высокие концентрации исследуемых соединений наоборот понижали их всхожесть.

В зависимости от строения антиоксиданты могут регулировать протекание метаболических процессов, активировать или ингибировать различные ферменты, влиять на проницаемость мембран клеток. Нет сомнений в том, что наряду с участием в ингибировании действия свободных радикалов, антиоксиданты как соединения, относящиеся к различным классам химических веществ, могут по-разному оказывать существенное влияние на рост и развитие растений.

4.2. Действие аскорбиновой кислоты и гидрохинона на физиолого-биохимические процессы семян

Набухание семян в течение 24 ч в растворах АК и ГХ различных концентраций приводит к понижению их всхожести при одновременном уменьшении активности пероксидазы, которая коррелирует с возрастанием содержания в семенах пшеницы АК и ГХ. Установлена положительная корреляция между всхожестью семян и активностью ПО, которая находится в обратной зависимости от содержания АО в семенах пшеницы. Высокие экзогенные концентрации АК и ГХ могут ингибировать пероксидазу семян пшеницы, понижая их всхожесть.

Действие высоких концентраций АК и ГХ выражается в снижении всхожести семян пшеницы на 8-15%. Замачивание семян в 1 М растворе АК приводило к понижению активности пероксидазы в корнях и надземной части на 2-е сутки прорастания до 30 и 23%, на 3-и - 55 и 45%, на 4-е - 55 и 70%, а на 6-е - 62 и 87% соответственно. Набухание семян пшеницы в растворах 50 мМ гидрохинона снижало активность пероксидазы в корнях и надземной части проростков на 2-е сутки прорастания до 15 и 10%, на 3-и - 20 и 17%, на 4-е -27 и 19%, а на 6-е - 45 и 42% соответственно. Тогда как набухание семян пшеницы в растворах низких концентраций АК и ГХ практически не влияло на активность пероксидазы в семенах.

Пероксидаза, алкогольдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа играют важную роль в покое и прорастании семян пшеницы. В прорастающих семенах активность пероксидазы возрастает, а активность АДГ снижается. У непроросших семян активность АДГ повышается в 2,5-5,5 раза, при понижении активности пероксидазы в 2,8-3,5 раза по сравнению с прорастающими семенами. Высокая разница в величинах активности ферментов указывает на разную степень их участия в механизмах прорастания семян пшеницы. Показано, что независимо от концентрации используемых антиоксидантов активность АДГ и Г6ФДГ в семенах практически не изменялась после 24 ч замачивания их в растворах АК и ГХ.

Выполненные исследования по изучению эндогенного содержания АК в сухих и набухших семенах подтверждают участие аскорбиновой кислоты в регулировании покоя. Показано, что АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на высоком уровне, что в 1,5-1,8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этого антиоксиданта в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков пшеницы уровень АК понижается в 4 раза. Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Таким образом, понижение активности пероксидазы высокими концентрациями АО способствует углублению покоя семян, а активирование фермента - ускоренному их выходу из состояния покоя и быстрому прорастанию. Насыщая зерно регуляторами, можно добиваться повышения посевных качеств, а также сопротивляемости семян и растений к экзогенным неблагоприятным факторам. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести.

4.3. Влияние растительного гликозида на всхожесть и физиологические процессы семян

Замачивание и проращивание семян проводили в растворах строфантина 0,025 - 250 мкг/мл. Из опытов следует, что строфантин может избирательно влиять на всхожесть и рост вегетативной массы проростков. Высокие концентрации строфантина оказывают сильное угнетающее действие на всхожесть семян овса и караганы независимо от условий замачивания и проращивания. Тогда как эти же концентрации строфантина на семена ячменя Неван и пшеницы сортов Скороспелка и Якутянка 224 оказывают стимулирующее действие.

Малые дозы строфантина (2,5-0,025 мкг/мл) на семена всех видов оказывали преимущественно стимулирующее действие, повышая всхожесть на 15-30% и увеличивая вегетативную массу проростков. Причем следует отметить, что как ингибирующий, так и активирующий эффекты строфантина проявляются особенно сильно при предварительном замачивании семян в растворе. Для семян овса и караганы при замачивании и проращивании в растворе строфантина отмечается ингибирующий эффект, который аддитивно возрастает, если эти два действия производятся последовательно. Активация всхожести семян малыми дозами строфантина наблюдалась, в основном, если семена проращивались в растворе.

Таким образом, действие строфантина в отношении семян специфично и избирательно в зависимости от вида растения. Накопление СГ в семенах ячменя и пшеницы может активировать скорость протекания метаболических процессов, способствуя выходу их из состояния гипобиоза. Для семян овса и караганы такое повышение гликозидов наоборот приводит к снижению уровня метаболизма и углублению покоя.

4.4. Участие аскорбиновой кислоты и растительных гликозидов в формировании гипобиотического состояния семян

Установлено, что содержание СГ и АК в семенах различных растений сильно колеблется. Резкое понижение стероидных гликозидов в семенах зимой, когда наблюдается углубление состояние гипобиоза, при незначительном понижении аскорбиновой кислоты, может свидетельствовать о различной их роли. Аскорбиновая кислота является сырьевым соединением клеток, то есть расходуется во время протекания метаболических процессов, сильное понижение ее концентрации в семенах может привести к снижению окислительно-восстановительного потенциала гипобиотической системы, вследствие чего семенам будет трудно выйти из покоя весной и это способствует углублению вынужденного покоя. Гликозиды вместе с фитогормонами служат регуляторными веществами, влияющими на процессы деления и роста клеток. Понижение их концентрации будет способствовать углублению покоя. Действие гликозидов осуществляется через рецепторы клеток, поэтому при выходе из вынужденного покоя семенам достаточно малых концентраций этих соединений. Значительное понижение концентрации СГ в семенах зимой является необходимым условием поддержания покоя.

Проведенное изучение содержания аскорбиновой кислоты и гликозидов у различных видов растений позволило установить, что содержание аскорбиновой кислоты в различных частях растений распределяется равномерно. Гликозиды, в основном накапливаются в плодах, листьях, цветках и очень незначительно в корневой системе. Неравномерное распределение этих функционально активных соединений в различных органах растений вызвано их несколько различной биологической ролью. По-видимому, стероидные гликозиды преимущественно выполняют регуляторную роль, поэтому их накопление происходит в активно вегетируюших частях растения. Аскорбиновая кислота распределяется равномерно, выполняя функцию пластического материала.

Таким образом, возрастание содержания СГ всегда отмечается при активации ростовых процессов в семенах, а их понижение связано с углублением гипобиотического состояния. Высокое содержание АК в покоящихся семенах обусловлено их низкой метаболической активностью.

4.5. Влияние перекиси водорода на всхожесть и физиолого-биохимические процессы семян

Перекись водорода - один из регуляторов, применяемых для обеззараживания и стимуляции прорастания семян высших растений. Сам факт того, что основным местом продукции АФК в семенах являются митохондрии (Мерзляк, 1989), указывает на взаимосвязь свободно-радикальных процессов с процессами дыхания и прорастания семян.

Наибольший процент проросших семян отмечен при 24 ч замачивании в 1%-ном растворе перекиси водорода. Известно, что динамика проникновения воды и растворенных в ней веществ имеет колебательный характер, поэтому мы проследили зависимость всхожести семян от продолжительности замачивания их в 1%-ом растворе перекиси водорода. Наибольший процент проросших семян был отмечен при замачивании их в течение первых шести часов.

Таблица 10 Изменение антиоксидантно-прооксидантного статуса в зародышах при замачивании семян ячменя сорта Одесский 115 в перекиси водорода

Резкое возрастание количества супероксида в зародыше отмечено в первые 8 ч набухания в растворе перекиси водорода (табл. 10). Затем его содержание повышалось незначительно. Возможно, сдерживающим элементом оказывались низкомолекулярные антиоксиданты, концентрация которых возрастала по мере активации гидролитических ферментов. Динамика содержания супероксида в первые часы замачивания коррелирует с увеличением концентрации МДА и активацией антиоксидантных ферментов.

По-видимому, усиление генерации АФК и активации ПОЛ - один из механизмов активации метаболических процессов при выходе семян из покоя. Кроме того, АФК обладают способностью изменять проницаемость и физико-химические свойства мембран, что способствует более эффективному проникновению воды и вымыванию ингибиторов роста. Интересно отметить, что повышение продукции супероксида коррелирует с достижением необходимой влажности зародыша, когда активируются оксидазные окислительные процессы, выступающие дополнительным источником АФК.

Высокая активность СОД отмечена только после 12 ч набухания. Можно предположить, что низкая активность СОД в первые часы набухания, приводящая к активации окислительных процессов с участием АФК, объясняется недостаточной оводненностью зародыша. Повышение активности каталазы в первые часы набухания в растворе перекиси водорода приводило к дополнительному снабжению зародыша кислородом, образующимся в ходе реакции. Возрастание активности ПО обусловлено ее участием в процессах пероксидазного окисления ингибиторов роста. Возможно, участие перекиси и пероксидазы в совместном окислении ингибиторов и дыхательных коферментов - один из механизмов активации биохимических процессов при прорастании семян растений.

При изучении динамики активности основного фермента пентозофосфатного пути - Г6ФДГ, для которого необходим кофермент НАДФ+, оказалось, что замачивание семян в Н2О2 приводит к изменению периодичности возрастания его активности в зародыше со сдвигом экстремумов в более раннее время. Колебательное снижение активности Г6ФДГ после 8 ч набухания объясняется повышением аэрации зародыша и активацией митохондриальных ферментов.

В последние годы появились экспериментальные данные, указывающие на положительные функции АФК, в том числе сигнальную роль в контроле апоптоза (Бакиева и др., 2001), а также защитную в условиях биотического и абиотического стресса (Аверьянов, 1991). АФК являются мощным вторичным мессенджером регуляции дифференцировки пластид и аппарата Гольджи, клеточной дифференцировки, роста и развития растений (Шорнинг и др., 2000; Минибаева, 2004). Таким образом, активные формы кислорода, обладающие высокой энергетической способностью и свободно мигрирующие в клетке, принимают непосредственное участие в начальных этапах прорастания семян, находящихся в физиологическом покое. Активации окислительных процессов при набухании семян, приводящих к образованию активных кислородных метаболитов, дает возможность выявить механизм участия анти- и прооксидантной системы при прорастании семян растений.

5. Перспективы применения антиоксидантов в производстве солода

5.1. Антиоксиданты как показатель оценки качества зерна и биохимических процессов при производстве солода

Нами исследовано содержание низкомолекулярных антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов в зерновках ячменя, отвечающего требованиям ГОСТ 5060-86, и ячменя с низкой способностью прорастать (табл. 11).

Установлено, что семена непроросшие в течение всего периода солодоращения, имели низкую активность пероксидазы и высокое содержание низкомолекулярных АО. Небольшое снижение концентрации АО в непроросших семенах можно объяснить их частичным вымыванием и расходованием на окислительные процессы. Содержание МДА в прорастающих семенах значительно выше, чем в непроросшем ячмене. Следует отметить, что непроросшие семена проявляли положительную реакцию при исследовании их на жизнеспособность тетразолево-топографическим методом. В непроросших семенах дыхание крайне ослаблено, отмечались изменения в составе жирных кислот и функционально активных веществ мембран митохондриальной системы (Соболев, Жданова, 1982), за счет которых обеспечивается разобщение механизмов окислительного фосфорилирования, при сохранении активности окислительных процессов (Скулачев, 1996).

Снижение концентрации низкомолекулярных АО на начальных этапах набухания указывает на то, что АО используются семенами в качестве запасного пула, позволяющего сдерживать свободно-радикальные процессы на физиологическом уровне. Сравнивая значения ПОЛ и АО в прорастающих семенах ячменя видно, что при активации метаболизма и ростовых процессов повышается уровень продуктов перекисного окисления липидов и низкомолекулярных антиоксидантов. Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе антиоксидантов и повышением активности пероксидазы. Повышение концентрации низкомолекулярных АО на 2 и 4 сутки прорастания объясняется активацией гидролитических процессов, выступающих в качестве поставщиков пластичного материала и соединений-антиоксидантов.

Таблица 11 Состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в ячмене с различной всхожестью Одесский 115

В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в зерновках, обладающих высокой способностью к прорастанию, выявляется высокая активность ПО, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Низкая активность фермента свидетельствует о понижении жизнеспособности и всхожести семян.

Среди технологических методов оценки качества сырья и готовой продукции биохимические методы имеют приоритетное значение потому, что они позволяют выявить изменения до того, как происходят морфологические и даже функциональны нарушения. Таким образом, активность антиоксидантной системы может быть использована как дополнительный критерий оценки качества зерна.

5.2. Изменение активности антиоксидантной системы и процессов перекисного окисления липидов при производстве светлого пивоваренного солода

В производственных условиях проводили замачивание зерна в непрерывном потоке воды и воздуха. Следует отметить, что низкая температура замачивания (14 °С), а также снабжение кислородом, приводит к возрастанию окислительных процессов в клетке и образованию продуктов ПОЛ. Содержание МДА при набухании возрастает в первые 24 ч замачивания, а затем постепенно снижается. Пик повышения концентрации низкомолекулярных антиоксидантов в ячмене приходится на 36 часов набухания. Во-первых, это обусловлено растворением фенольных ингибиторов роста; во-вторых, активацией гидролитических процессов, в ходе которых образуются аминокислоты и углеводы, обладающие антиоксидантными свойствами.

Активность СОД постепенно повышается в течение всего времени набухания ячменя. Динамика активности ферментов, утилизирующих перекись водорода, - КАТ и ПО постепенно возрастает в течение всего периода замачивания. Возможно, возрастание активности этих ферментов обусловлено участием в окислении энергетических соединений и ингибиторов роста, накопление которых наблюдается во время покоя семян. Возрастание активности ГР и последующее постепенное ее снижение в процессе замачивания объясняется тем, что для катализа этому ферменту необходим кофермент НАДФН, содержание которого снижется при возрастании аэробных процессов.

Проращивание ячменя проводили в ящичной солодовне, используя для перемешивания ковшовый ворошитель. При солодоращении ячменя содержание МДА в зерновке резко возрастает на 5-е и 8-е сутки проращивания. С целью снижения потерь на дыхание и ростовые процессы солодоращение ведут при слабом освещении, пониженной температуре и высокой влажности. Из этого можно заключить, что замедленный рост и отсутствие освещения не способствует образованию низкомолекулярных АО с участием фотосинтетического аппарата проростка. Поэтому возрастание в зерновке концентрации низкомолекулярных АО на 2-3-е и в гусарах на 4-е сутки с постепенным снижением, объясняется накоплением низкомолекулярных соединений, образующихся в процессе биодеградации белков, полисахаридов и липидов (Тарчевский, 1992).

Динамика активности СОД в гусарах и зерновке постепенно повышается в первые 4 дня. Причем более высокие показатели активности ферментов отмечались в гусарах. Каталаза содержится в ячмене в незначительном количестве, но быстро накапливается при проращивании, причем скорость накопления явно зависит от длительности солодоращения. Активность КАТ возрастает меньше по сравнению с активностью пероксидазы, так как сродство фермента к малым концентрациям перекиси водорода ниже, чем у пероксидазы (Андреева, 1988). Постепенное снижение активности ГР в зерновке и гусарах можно объяснить преобладанием аэробных процессов над анаэробными, в процессе чего, снижается концентрация НАДФН в клетке.

Сушку проводили в производственных условиях по режиму ЛСХА. Показано, что на начальных этапах сушки наблюдается возрастание активности антиоксидантных ферментов с последующим ее снижением (табл. 12). Следует отметить, что ферменты обладают различной термоустойчивостью. Наибольшая активность при сушке сохраняется у ПО, в молекуле которой находятся два иона кальция, придающие ей стабильность (Угарова, Лебедева, 1996). Инактивация ГР начинается уже при 55 °С. Возможно, это обусловлено тем, что в активном центре данного фермента содержатся SH-группы, окисление которых приводит к инактивации (Smith, 1989). При сравнении динамики накопления низкомолекулярных АО и МДА обращает на себя внимание тот факт, что при подсушивании наблюдается снижение концентрации МДА на фоне возрастания концентрации антиоксидантов. Возможно, повышение концентрации антиоксидантов обусловлено активацией гидролитических ферментов, в результате чего образуются соединения, обладающие антиоксидантной активностью.

Таблица 12 Активность антиоксидантной системы и содержание продуктов перекисного окисления липидов при сушке солода

Свежий солод, поступающий из сушки, обычно не используется сразу в пивоваренном производстве, так как имеет влажность, недостаточную для эффективного дробления. При хранении солода происходят физические и химические изменения, облегчающие его последующую переработку. Кроме того, часть ферментов еще не восстановилась после тепловой обработки.

Нами установлено, что в первые четыре месяца хранения содержание антиоксидантов возрастает на 12-16 % по сравнению с исходным значением. Повышение концентрации АО при хранении солода обусловлено впитыванием влаги из окружающей среды и небольшой активацией гидролитических ферментов. Хранение солода в течение десяти месяцев не приводило к существенным изменениям концентрации. Достоверное понижение содержания антиоксидантов на 27-34 % наблюдалось после годичного хранения солода. Проведенные исследования указывают на то, что анти- и прооксидантное равновесие является биохимическим показателем технологического процесса производства пивоваренного солода.

5.3. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного производства и перспективы их использования

Наибольшее содержание антиоксидантов наблюдается в солодовых ростках (225,2 мкг/г) и хмелевой дробине (307,4 мкг/г). Высокое содержание антиоксидантов в ростках объясняется их сложным химическим составом, включающим в себя аминокислоты, фенольные соединения и витамины, которые входят в группу природных антиоксидантов. Следует также отметить, что при проращивании активируются синтетические процессы, приводящие к образованию разнообразных соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Результаты эксперимента указывают на то, что замачивание ячменя в течение первых 6-8 ч в экстрактах солодовых ростков приводит к повышению способности прорастать. Проведенные исследования показали, что замачивание зерна в экстрактах в первые 6-8 ч набухания повышают активность дегидрогеназ в 1.2, пероксидазу - 1.3 раза по сравнению с контролем. Наблюдаемое повышение всхожести и активности дыхательных ферментов объясняется тем, что биологически активные вещества солодовых ростов активируют метаболические процессы на начальных этапах набухания зерна, выступая в качестве природных стимуляторов роста. Таким образом, использование экстрактов из солодовых ростков позволит снизить производственные потери сухих веществ, а также сократить время проращивания пивоваренного ячменя.

ВЫВОДЫ

Гипобиотическое состояние семян в условиях естественного хранения сопровождается низкой активностью окислительных процессов и антиоксидантной системы. Длительное хранение семян зерновых культур приводит к снижению жизнеспособности, всхожести и активности оксидоредуктаз на фоне повышения продуктов перекисного окисления липидов. Естественное старение семян сопровождается снижением активности антиоксидантной системы.

Неблагоприятные условия хранения способствуют накоплению продуктов перекисного окисления липидов и активации антиоксидантной системы защиты. Снижение жизнеспособности и всхожести семян коррелирует с понижением активности антиоксидантной системы и накоплением продуктов перекисного окисления липидов.

Набухание и прорастание семян зерновых культур сопровождается активацией анаэробных дегидрогеназ и ферментов антиоксидантной системы на фоне накопления продуктов перекисного окисления липидов. Содержание низкомолекулярных антиоксидантов в непроросших семенах на протяжении всего срока прорастания сохранялось на достаточно высоком уровне на фоне низкой активности окислительных процессов. При этом пероксидаза необходима для сохранения жизнеспособности семян и инициирования процессов прорастания. Низкая активность фермента у непроросших семян, остающихся в покое, не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается возрастание активности фермента.

Окислительный стресс в процессе замачивания приводит к активации перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты в зародыше и щитке. Кратковременное воздействие стресс-фактора в процессе набухания приводит к повышению всхожести семян зерновых культур.

При прорастании контроль над уровнем ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, а в корнях эта функция возложена на ферменты антиоксидантной защиты. Одним из молекулярных механизмов реакции семян и проростков на действие факторов окружающей среды является изменение каталитических характеристик стрессового фермента - пероксидазы.

Аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом, пероксидазное окисление которой в концентрации 22-220 мкМ сопровождается активированием, а в концентрации 264-352 мкМ ингибированием фермента. Эффект активирования и ингибирования отмечался при всех изученных значениях рН (4,0-8,0). При связывании в активном центре двух и более молекул аскорбиновой кислоты активирует фермента, а связывание 6-9 молекул ингибирует пероксидазу. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН. Гидрохинон неконкурентно активирует пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, ускоряя ферментативную реакцию в 4-41 раз. В реакциях совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно двумя молекулами аскорбиновой кислоты. Данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

Гидрохинона является быстро окисляемым субстратом пероксидазы (kсat 1220-2225 с-1). Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4,5-5,5. Связывание 2-3 молекул гидрохинона с фермент-субстратным комплексом ингибирует пероксидазу. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что обусловлено изменениями в протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН. Данный механизм может наблюдаться в растениях при окислении различных регуляторов роста. Подробно изучен механизм и определены каталитические константы регуляции активности гемсодержащей пероксидазы растений биологически активными веществами. Предложен механизм участия пероксидазного катализа в покое и прорастании семян, а также в условиях окислительного стресса. Пероксидаза контролирует уровень перекиси и антиоксидантов в растениях; антиоксиданты в малых концентрациях способны повышать активность пероксидазы в реакциях совместного окисления, в высоких - снижать активность фермента, связываясь в активном центре.

Индолил-3-уксусая кислота регулирует пероксидазное окисление субстратов, имея специфический участок связывания в составе дистального домена активного центра фермента. ИУК способна изменять направленность реакции пероксидазы, превращая фермент в высокоспецифическую оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость которых возникает у растений в процессе развития. Углеводы в концентрациях 0,011-0,88 М снижают активность и термостабильность гемсодержащей пероксидазы растений.

Биологически активные вещества в малых концентрациях активировали прорастание семян на 15-20%, а в больших - понижали их всхожесть до 3-11%, при этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян зерновых культур к используемым соединениям. Высокие концентрации регуляторов и антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян зерновых культур.

Одним из физиолого-биохимических механизмов повышения всхожести при воздействии на семена физических и химических факторов является активация окислительных процессов на начальных этапах набухания зерновок с последующим повышением реактивности антиоксидантной системы.

Технологический режим замачивания и солодоращения ячменя влияет на протекание окислительных процессов и активность антиоксидантной системы. Антиоксидантный статус и интенсивность перекисного окисления липидов могут быть использованы как критерий оценки качества зерна и солода.

Отходы солодовенного и пивоваренного производства являются перспективным источником природных биологически активных веществ и могут быть использованы в качестве регуляторов биотехнологических процессов при солодоращении. Наибольшее содержание низкомолекулярных антиоксидантов наблюдалось в хмелевом экстракте и солодовых ростках, которые в перспективе можно использовать для снижения окислительных процессов при солодоращении пивоваренного ячменя.

Рекомендации производству

Низкомолекулярные антиоксиданты - эффективные регуляторы прорастания семян, использование которых позволяет повысить всхожесть, а также сопротивляемость семян и проростков к факторам внешней среды. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах БАВ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа замачивания.

Предложена принципиальная схема использования отходов солодовенного и пивоваренного производства как доступного источника биологически активных веществ, применение которых позволит регулировать солодоращение и окислительные процессы при производстве солода.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Верхотуров В.В. Перекисное окисление липидов и применение антиоксидантов для повышения устойчивости растений к температурному стрессу // Материалы Республиканской научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.70-71.

2. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота как медленно окисляемый субстрат пероксидазы // Биохимия. - 1997. - Т.62. - №12. - С. 1686-1690.

3. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Верхотуров В.В., Колесова Т.К. Роль пероксидазы и антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян // V-ой Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений". - М.: Изд-во ТСХА, 1999. - с. 89-90.

4. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы // Биохимия. - 1998. - Т.63. - № 6. - С. 63-68.

5. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В., Соколова О.В. Физиологические проявления действия окислительного стресса у проростков пшеницы // Сборник трудов “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.- с.109-111.

6. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 12.-С.107-112.

7. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние температуры, ультрафиолетового излучения и функционально активных веществ на всхожесть семян пшеницы // Известия ТСХА.-1999.-№ 3.-с.105-124.

8. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия перекисью водорода в присутствии пероксидазы // Биоорганическая химия. - 1999.-Т.25.-№ 1.-С.70-73.

9. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксидантной системы ячменя при анаэробном солодоращении // Доклады Российской академии с/х наук.-2004.-№ 6.-с.53-55.

10. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы // Биоорганическая химия.-1999.-Т.25.-№ 5.-С.377-382.

11. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы // Известия РАН. Сер. биол.-2001.-№ 2.-с.165-173.

12. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Всхожесть семян мягкой пшеницы под влиянием антиоксидантов // Сельскохозяйственная биология.-2001.-№ 3.-с.73-78.

13. Верхотуров В.В. Антиоксиданты как регуляторы роста растений // Республиканская научно-практическая конференция. - Якутск: Изд-во ЯГСХА. - 2001.-с.72-73.

14. Верхотуров В.В., Рогожин В.В. Особенности механизма действия пероксидазы // Сборник трудов химико-технологического факультета “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.114-117.

15. Верхотуров В.В., Соколова О.В., Пинигина Г.В., Рогожин В.В. Действие низкой температуры на состояние антиоксидантной системы проростков пшеницы // Сборник трудов химико-технологического факультета “Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона ”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.111-114.

16. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в растениях Сибири // Всероссийская научная конференция “Биологически активные добавки и здоровое питание”. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2001.-с.23.

17. Верхотуров В.В., Пинигина Г.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы в механизме прорастания семян пшеницы // Сборник научных трудов “Научное сопровождение образовательного процесса агровуза”, Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.42-43.

18. Рогожина Т.В., Верхотуров В.В. Влияние моно- и олигосахаридов на активность и стабильность пероксидазы // Сборник научных трудов “Научное сопровождение образовательного процесса агровуза”. - Якутск: Изд-во ЯГСХА, 2001.-с.47.

19. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидазный катализ многокомпонентных систем (монография).- Изд-во “Сахаиздат”, Якутск, 2003. - 166 с.

20. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Состояние антиоксидантной системы ячменя при замачивании и солодоращении // Хранение и переработка сельхозсырья.-2003.-№ 9.-с.26-30.

21. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение антиоксидантного статуса ячменя при производстве пивоваренного солода // Известия ВУЗов. Пищевая технология.-2004.-№ 5-6.-с.30-34.

22. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Активность некоторых оксидоредуктаз при хранении и солодоращении ячменя // Вестник Российской академии с/х наук.-2004.-№ 2.-с.82-84.

23. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Изменение активности оксидоредуктаз при производстве светлого пивоваренного солода // Всероссийская научно-техническая конференция “Молодые ученые - Сибири”. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ. 2003.-с.21.

24. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Характеристика пивоваренных сортов ячменя, выращенных в Восточной Сибири // Сборник трудов Межрегиональной конференции молодых ученых “Пищевые технологии”.- Казань: Изд-во КГТУ. 2004.-с.140-141.

25. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Окислительные процессы и антиоксидантная система при анаэробном солодоращении ячменя // Хранение и переработка сельхозсырья.-2004.-№ 8.-с.9-12.

26. Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Рогожина Т.В. Пероксидаза: строение и механизм действия (монография). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2004. - 200 с.

27. Верхотуров В.В., Топорищева В.К. Антиоксиданты как критерий оценки качества зерна и солода // Сборник трудов Международной научно-практической конференции “Прогрессивные технологии развития”. - Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2004. - с.176-177.

28. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Перекись водорода как регулятор прорастания ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции “Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации химических и пищевых производств”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006.-с.98-100.

29. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства // Сборник трудов 2-й Международной научно-практической конференции “Составляющие научно-технического прогресса”, Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2006.-с.212-215.

30. Верхотуров В.В. Прикладная энзимология (Учебное пособие). - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006. - 56 с.

31. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Антиоксидантная система и окислительные процессы при хранении и солодоращении пивоваренного ячменя // Сборник материалов научно-практической конференции “Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания”.- Иркутск: Изд-во ИрГТУ,.2006.-с.16-18.

32. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного и пивоваренного производства и перспективы их использования при получении солода // Экология и промышленность России. - 2006. -№ 10.- с. 15-17.

33. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние ультрафиолетового облучения на активность оксидоредуктаз ячменя // Зерновые хозяйство. - 2006.-№ 7.-с.22-24.

34. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Использование природных антиоксидантов для продления сроков хранения растительных масел // Сборник материалов научно-практической конференции “Региональные проблемы сельскохозяйственного производства”. - Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2001.-с.71-72.

35. Верхотуров В.В. Изменение антиоксидантного статуса и перекисное окисление липидов в зерновках ячменя при хранении // Сборник материалов V международной научно-практической конференции ученых Сибирского федерального округа “Современные тенденции развития АПК в России”. - Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 2007.-с.375-378.

36. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние искусственного старения на жизнеспособность семян ячменя // Зерновые хозяйство. - 2007. - № 1. - с.31-32.

37. Верхотуров В.В. Особенности протекания эколого-биохимических механизмов при хранении зерновых культур // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции “Пищевые технологии”. - Казань: Изд-во КГТУ, 2007.-с.45-48.

38. Верхотуров В.В., Франтенко В.К. Влияние перекиси водорода на анти- и прооксидантный статус семян ячменя при прорастании // Доклады Российской академии с/х наук.-2008.-№ 1.-с.11-13.

Размещено на Allbest.ru