Особенности проявления цитробактериоза, кандидамикоза у рыб и санитарная оценка рыбопродуктов

61

На правах рукописи

16.00.03. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Особенности проявления цитробактериоза, кандидамикоза у рыб и санитарная оценка рыбопродуктов

Ожередова Надежда Аркадьевна

Ставрополь ? 2008

Работа выполнена в ФГОУ ВПО

«Ставропольский государственный аграрный университет»

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Тимченко Людмила Дмитриевна

доктор ветеринарных наук, профессор Малышева Людмила Александровна

доктор ветеринарных наук, профессор Филиппов Николай Васильевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Ученый секретарь диссертационного совета Квочко А.Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышение жизненного уровня населения нашей страны, его обеспечение всеми необходимыми продуктами питания, а также безопасность продовольственного сырья и пищевой продукции является одной из важнейших задач на современном этапе. В решении этой проблемы существенное значение приобретает увеличение производства и потребления рыбы, которое к настоящему времени сократилось в 2 раза по сравнению с 1990 годом. Вместе с тем, ее производство всегда оказывалось в 2-3 раза дешевле в сравнении с мясом. В то же время по своей питательной ценности рыба мало уступает мясу сельскохозяйственных животных, а по степени усвояемости в организме человека значительно превосходит говядину. Вместе с тем, дальнейшему увеличению и сохранению запасов промысловых и прудовых рыб в последние годы в значительной степени препятствуют почти ежегодные вспышки новых, недостаточно изученных инфекционных заболеваний рыб, названных краснухоподобными (жаберными), ранее не регистрировавшихся в российских водоемах и обусловливающих массовую гибель рыб.

Вспыхнувшие в середине 50-х годов прошлого столетия указанные эпизоотии среди холодноводных в сравнительно короткое время довольно быстро охватили прудовые карповые хозяйства, расположенные в различных климатических зонах, начиная от северо-запада и центральной черноземной полосы до Северного Кавказа, от Волго-Каспийского региона до Западной Сибири. Однако, несмотря на проводимые исследования, природа этих заболеваний до сих пор остается невыясненной. Изучением этой патологии занимались ряд исследователей (А.Ф. Вылегжанин, 1964; Е.С. Цой, 1978; В.Д. Ящук, 1988; Валедская А.М., 1991; М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов,1995; В.И. Афанасьев, Л.И. Лаврентьева, Г.В. Афанасьев, Г.И. Сапожников, 1997; K.В. Бурлаченко, Л. И. Бычкова, 2003; Л.В. Ларцева, Я.М. Болдырева, 2004;С.Г Виноградова, Е.М. Харенко, 2005; О.В. Казимирченко, 2006; N. Tereza et al, 1980; D. Guston, B. Austin, 1990; Carunsagar, 1992). Однако роль С. freundii в патологии рыб до сих пор остается неясной.

В рыбохозяйственных водоемах, и в частности, в прудовых хозяйствах, отмечается заболевание рыб кандидамикозом (З.Г. Бахтиярова, 1987; С.В. Петрович и Н.В. Войнова, 1989; Ларцева Л.В., 2004). Вместе с тем, несмотря на отдельные исследования, специфика проявления указанного заболевания, механизм заражения рыб возбудителями этой болезни также до сих пор остаются недостаточно изученными.

На фоне вспыхнувших эпизоотий краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб в ряде регионов прикаспийской зоны и в частности, в Астраханской области и других зонах, среди населения, употреблявшего в пищу пораженные рыбные продукты, стали отмечаться вспышки пищевых заболеваний невыявленной этиологии. По данным ФАО, на долю эпидемий рыбного происхождения ежегодно приходится до 20-35% от общего количества вспышек пищевых заболеваний наблюдаемых в мире.

В связи с нередким выделением из организма рыб, пораженных краснухоподобными (жаберными) заболеваниями, цитробактерий и дрожжеподобных грибов рода Саndida, серьезной опасностью их отдельных представителей, таких как С. freundii и С. аlbicans для организма человека, были проведены специальные исследования по изучению степени контаминации указанными микроорганизмами рыбы и рыбных продуктов, а также степени их патогенности. Тем более, что в специальной научной литературе имеются указания об опасности С. freundii, выделяемых из других видов пищевых продуктов, для организма человека. О возможности цитробактерий, в том числе и С. freundii вызывать пищевые заболевания у людей сообщали В.П. Рагинская, 1973; А.А. Покровский, 1985; С.А. Шевелева, Н.Р. Ефимочкина, А.А. Иванов, Н.П. Турурушкина, Т.И. Фролочкина, 2004; а на способность гриба С. аlbicans обусловливать одноименное заболевание кандидамикозом у человека указывали П.Н. Кашкин, 1958; Н.П. Елинов, 1964; А.М. Ариевич, З.Г.Степанищева, 1965;Е.Н. Морозов, 1971; В.Н. Кулага, 1974; Р.Н. Реброва, 1979.

Ряд исследователей (Е.В. Себряков, 1985; Т.Т. Сутеева, 1987; Л.В. Ларцева, 2004) выявили высокую обсемененность грибами рода Candida отдельных видов пищевых продуктов животного происхождения и указывают на их эпидемиологическую опасность в возникновении кандидамикоза у детей при употреблении в пищу таких продуктов. Однако вопрос о распространения цитробактерий и дрожжеподобных грибов рода Саndida, обнаруживаемых в рыбе, пораженной кранухоподобными (жаберными) заболеваниями, до настоящего времени предметно не изучался.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение роли цитробактериоза и кандидамикоза в этиологии краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб, особенностей проявления этих заболеваний у рыб, санитарная оценка рыбопродуктов, контаминированых цитробактериями и грибами рода Candida.

При решении этой цели с учетом степени изученности проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпизоотический мониторинг в рыбохозяйственных водоёмах России и в Ставропольском крае по изучаемым заболеваниям рыб.

2. Изучить особенности клинического, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза рыб.

3. Изучить биологические свойства цитробактерий и грибов рода Candida, выделенных у карповых рыб.

4. Выяснить устойчивость С. freundii и гриба С. аlbicans к физико-химическим факторам и антибиотикам.

5. Разработать систему диагностических, лечебно-профилактических мероприятий при цитробактериозе и кандидамикозе карповых рыб.

6. Провести санитарную оценку рыбы и рыбных продуктов при цитробактериозе и кандидамикозе.

Научная новизна работы. Впервые нами были выяснены источники распространения цитробактерий в российских водоемах, особенности клиникого, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза рыб, изучена специфика биологических свойств возбудителей этих болезней, патогенность которых подтверждена экспериментально заражением подопытных рыб и белых мышей.

Выявлена восприимчивость подопытных рыб к возбудителям цитробактериоза при трех температурных режимах (+5^оС +7^оС, +15^оС +17^оС, +20^оС +25^оС), при семи способах заражения (водном, пероральном, жаберном, кожном, внутримышечном, интраперитониальном, контактном) и впервые была доказана возможность заражения этими микроорганизмами подопытных растительноядных рыб (пестрых толстолобиков). Аналогичные эксперименты по заражению подопытных рыб были проведены и с возбудителями кандидамикоза, которые показали положительные результаты, особенно при водном и пероральном способах их заражения.

Выяснены условия роста и размножения возбудителей цитробактериоза и кандидамикоза, их отношение к различным физическим (высокой и низкой температуре) и химическим факторам, разработаны методы диагностики, включающие дифференциацию изучаемых заболеваний.

Впервые дана полная санитарная характеристика рыбных продуктов, контаминированых цитробактериями и дрожжеподобными грибами рода Саndida.

Совокупность выполненных нами исследований является актуальной научной разработкой, направленной на сохранение запасов промысловых рыб, повышение их продуктивности и качества рыбной продукции.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате комплексных исследований нами получены теоретические и практические данные по цитробактериозу и кандидамикозу рыб, на основании которых можно устанавливать комплексный диагноз указанных заболеваний карповых рыб с учетом результатов анализа эпизоотической ситуации, особенностей клинических, патоморфологических проявлений заболеваний, биологических свойств возбудителей болезней и осуществлять проведение дифференциальной диагностики цитробактериоза и кандидамикоза рыб от сходных болезней, что позволит успешно проводить лечебно-профилактические мероприятия. Представленные сведения по санитарной оценке способствуют улучшению качества рыбопродуктов.

Основные аспекты практического использования результатов изложены в методических рекомендациях по диагностике, терапии и профилактике болезней рыб (цитробактериоза и кандидамикоза), утвержденных в РАСХН 1 июля 2008 г., одобренных секцией «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины (протокол № 3 от 27 сентября 2007 г.), а также в методических рекомендациях «Диагностика цитробактериоза рыб», «Диагностика кандидамикоза рыб», одобренных секцией животноводства и ветеринарии научно-технического совета МСХ Ставропольского края (протокол №2 от 10 марта 2006 г.).

Результаты исследований могут быть использованы в практической деятельности сотрудниками ветеринарных лабораторий, рыбоводами, фермерами, специалистами интересующимися вопросами инфекционной патологии, при составлении руководств, учебных и справочных пособий.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Одной из причин вспышек краснухоподобных (жаберных) заболеваний рыб в рыбохозяйственных водоемах России, в том числе Ставропольском крае являются возбудители цитробактериоза, кандидамикоза или их ассоциативное проявление.

- Особенности клинического, патоморфологического проявления цитробактериоза и кандидамикоза у рыб.

- Возбудители цитробактериоза и кандидамикоза - C. freundii, C. albicans, имеют характерные биологические свойства, при экспериментальном заражении вызывают заболеваемость и летальность особей.

- У рыб инфицированных цитробактериозом и кандидамикозом снижаются товароведческие показатели, а технологическая обработка тушек обеспечивает их обезвреживание.

Реализация результатов исследований. Результаты полученных исследований внедрены в рыбоводных хозяйствах Ставропольского края (ООО «Лотос», ЗАО «Голубая Нива», рыбколхоз «Зеркальные пруды», прудах с. Арзгир у индивидуального предпринимателя Геращенко А.Д.), а также в ГУ «Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория» и сельскохозяйственном кооперативе - рыболовецкая артель «Гулькевическая» Краснодарского края.

Кроме того, материалы диссертационной работы используются в учебном процессе по курсу микробиологии на кафедрах Ставропольского государственного аграрного университета, Московской ГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Донского государственного аграрного университета, Новосибирского государственного аграрного университета, Костромской государственной сельскохозяйственной академии, Карачаево-Черкесской государственной технологической академии, Калмыцкого государственного университета, Дагестанской государственной сельскохозяйственной академии, Кубанского государственного аграрного университета.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях Ставропольского государственного аграрного университета (1993, 1996, 2001, 2004, 2005, 2007), Алтайском (1995, 1996, 1998, 2000, 2002), Краснодарском (1996) и Башкирском (1999) государственных аграрных университетах, Российской академии сельскохозяйственных наук (1996), Бурятской сельскохозяйственной академии (1998), Калмыцком государственном университете (2003), Вятской сельскохозяйственной академии (2005).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 44 работах, опубликованных в тематических сборниках, материалах конференций, 3 рекомендациях. В центральных научных журналах опубликовано 7 статей, издана 1 монография.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 360 страницах, содержит 79 таблиц, 19 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и предложений. Список литературы включает 383 источника, в том числе 111 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнялась на кафедрах эпизоотологии и микробиологии, анатомии и гистологии, патологической анатомии и ветсанэкспертизы, в межфакультетской биохимической лаборатории Ставропольского государственного аграрного университета, в прудовых хозяйствах и естественных водоемах Ставропольского края, стационарно неблагополучных по изучаемым заболеваниям, а также в отдельных рыбохозяйственных водоемах других областей Северного Кавказа, при возникновении эпизоотии. В Ставропольском крае в процессе проводимых исследований использовали рыбу, выловленную из 6 прудовых хозяйств и 5 естественных водоемов. В каждом рыбохозяйственном водоеме Ставрополья взятие материала проводили в течение трех и более лет, в весенний, осенний, летний, а иногда и в зимний периоды года. Основными объектами исследований являлись различные виды карповых рыб (карп, карась, толстолобики). Исследованию подвергали преимущественно товарную рыбу в период ее массового вылова. Всего в процессе проведения исследований в рыбохозяйственных водоемах, стационарно неблагополучных по изучаемым заболеваниям было исследовано только в прудовых хозяйствах 22 084 экземпляров карповых рыб, в том числе 9 892 на наличие цитробактериоза и 12 192 - кандидамикоза, морфологическому исследованию - 244, бактериологическому - 171, микологическому - 334 экземпляра рыб. При экспериментальном заражении и наблюдении было использовано 353 экземпляра подопытных рыб (карпов и пестрых толстолобиков), 144 лабораторных животных (белых мышей). В процессе проведения морфологического, химического и аминокислотного состава тушек пораженных рыб, было проведено 252 анализа мяса, а при выяснении устойчивости цитробактерий и грибов рода Саndida к различным физико-химическим факторам, в том числе тепловой, холодильной обработке и посолу, было выполнено 32 эксперимента. Взятие материала для бактериологического, микологического и других методов исследования проводили от пораженных рыб в рыбоводных хозяйствах, стационарно неблагополучных по цитробактериозу и кандидамикозу. Отбор проб проводили на месте с первичным высевом материала на питательные среды и брали их только от тех живых пораженных рыб, которые имели специфические для заболеваний клинические и морфологические изменения или же доставляли их в живом виде в лабораторию в зависимости от складывающихся условий. При взятии проб соблюдали правила асептики. В питательные среды в процессе проведения микологического исследования добавляли растворы пенициллина и стрептомицина по 200-250 ЕД на 1 мл каждого препарата.

Бактериологическое исследование рыб на наличие С. freundii

При проведении бактериологического исследования, на наличие указанного вида микроорганизма, были использованы карповые рыбы, выращенные в 3 прудовых хозяйствах стационарно неблагополучных по цитробактериозу - Сергиевское (СПК «Александровское»), Донское (ООО «Волна»), Курсавское (СПК «Курсавский») и в 3 естественных водоемах (оз. Восточный Маныч, Отказненское и Чограйское водохранилища), имевшие специфические клинические и патоморфологические изменения для цитробактериоза. К этим признакам относились более рельефно выраженное кроваво-красное окрашивание поверхности тела рыб, геморрагическое поражение внутренних органов и наличие изъязвлений слизистой нисходящего отдела кишечника, а также проявление некроза жаберного аппарата. Выделение и идентификацию культур цитробактерий проводили в соответствии с методическими указаниями А.А. Покровского (1985) и других исследователей. Первичные высевы материала высевали на среды Симонса с цитратом натрия и инкубацией в термостате в течение 24-48 часов при температуре +25^оС +26^оС. После выделения чистой культуры проводили пересевы на среду Эндо, агар Плоскирева, висмут-сульфитный агар. Морфологию цитробактерий определяли в мазках окрашенных по Граму, а подвижность бактерий выявляли в висячей капле. Ферментативную активность определяли на углеводах (глюкозе, сахарозе, лактозе, маните, мальтозе, сорбите, ксилозе, рамнозе, инозите и арабинозе, выявляли отношение к Я-галактозидазе, мукату). Изучали гемолитические, протеолитические и толерантные свойства. Воспроизводили реакции на индол, сероводород и ставили реакцию Фогес-Проскауера. Проводили серологическую идентификацию с помощью специфических сывороток.

При определении патогенности изучаемых культур ставили биопробу на подопытных сеголетках и годовиках карпов при интраперитониальном введении суспензии высоковирулентных культур цитробактерий.

При изучении влияния на виды рыб температуры и способа заражения высоковирулентными культурами С. freundii, было использовано 154 экземпляра подопытных сеголетков карпов, содержащихся при 3 температурных экспозициях (+5^оС +7^оС, +15^оС +17^оС, +20^оС +25^оС). Помимо подопытных рыб при экспериментальном заражении цитробактериями интраперитониальным путем было использовано 72 белые мыши.

Отбор проб образцов мышечной ткани, внутренностей от пораженных и здоровых рыб осуществляли в соответствии с ГОСТ 24-896-81, а также ГОСТ 76-31-85. Отбор проб для микробиологических исследований проводили в соответствии с ГОСТ 26-669-85.

Гистологические исследования проводили по общепринятой методике, срезы окрашивали гематоксилин-эозином, а с целью наилучшей индикации С. freundii - по модифицированному способу Боголепова.

Микологическое исследование на наличие грибов рода Саndida

Материал для микологического исследования брали от рыб только в тех рыбоводных хозяйствах, которые являлись стационарно неблагополучными по кандидамикозу - Новомарьевском (СХП «Волна»), Благодатненском (колхоз «Зеркальные пруды»), Невинномысском (СХП «Невинномысский) и 2 естественных водоемах (Новомарьевский лиман и Сенгилеевском водохранилище). Пробы, подлежащие исследованию, отбирали лишь от тех рыб, которые имели ясно выраженные клинические признаки и морфологические изменения, свойственные для изучаемого заболевания. К таким признакам относили темное окрашивание передней части тела, образование белых пятен на голове, глазном яблоке, изъязвление кожи в области головы, а иногда боков, брюшная водянка и некроз жаберных лепестков и концевых участков отдельных плавников. Исследование пораженных рыб на наличие дрожжеподобных грибов, проводили в соответствии с рекомендациями, приводимыми в руководствах П.Н.Кашкина (1956), Н.П.Елинова (1964), Р.Н.Ребровой (1978) и другими исследователями. Первичные посевы материала проводили на среды Сабуро, которые выдерживали в термостате до 2-3 суток и более при температуре +25^оС +26^оС. Затем изучали тип выросших колоний и после отбора 2-3 наиболее типичных колоний, присущих грибам рода Саndida и просмотра мазков, окрашенных 1%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором основного фуксина, проводили дальнейшее выделение чистых культур кандид на средах Сабуро, сусло-бульоне и сусло-агаре. Также осуществляли изучение ферментативных свойств на 5 углеводах (глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе и галактозе). Изучали характер роста кандид на средах Пагано-Левина-Трейо, агаре Литмана, Никерсона. Гемолитическую активность выявляли при росте грибов Саndida на кровяном агаре. Выявление хламидоспор и псевдомицелия проводили путем посева грибов в толщу кукурузного агара с использованием двух температурных экспозиций (+25^оС, +37^оС), а типа филаментации - на картофельном агаре.

При экспериментальном заражении использовали 199 сеголетков карпов, с введением высоковирулентных культур грибов С. аlbicans и C. guilliermondii, c cодержанием рыбы при температурных экспозициях +20^оС +25^оС. При определении патогенности выделенных культур грибов их вводили 72 белым мышам интраперитониальным способом. Наблюдения за подопытными рыбами и белыми мышами проводили в течение 1 месяца.

Изучение и идентификацию грибов рода Саndida проводили в соответствии с наставлением Департамента ветеринарии МСХ РФ от 14.07.03 г., № 13-5-02/СВ-27.

Гистологическе исследования проводили по общепринятой методике, срезы окрашивали гематоксилин-эозином, а с целью выявления грибов - по методу Шиффа.

Качественная и санитарная оценка рыбных продуктов, обсемененных C. freundii и C. albicans.

При изучении товароведческих и качественных показателей тушек рыб при указанных заболеваниях разделяли на 2 группы: доброкачественную и злокачественную рыбную продукцию. К доброкачественной рыбной продукции относили рыбу, имеющую на поверхности тела отдельные очаги геморрагического поражения или единичные изъязвления, а к злокачественной - при наличии брюшной водянки или множественных язв на поверхности тела, а также при наличии снижения консистенции (дряблости) мышечной ткани, при диффузном поражении жабр. Во всех группах рыб, в каждой из которых находилось по 3-4 тушки, определялась живая масса, морфологический состав съедобных и несъедобных частей. Морфологический состав определяли путем взвешивания каждого экземпляра рыбы, после чего проводили разделение каждой тушки на съедобную и несъедобные части, а мышечную ткань, снятую с одной или двух половинок тушек, использовали для определения химического и аминокислотного состава. Химический состав рыбных продуктов (содержание воды, белка, жира и золы) определяли по общепринятым методикам: белок - по способу Кьельдаля, жир - по Сокслету, золу и влагу - методом высушивания, калорийность расчетным способом. Аминокислотный состав изучали методом хроматографии с помощью аминоанализатора «Хитачи». Идентификацию аминокислот проводили путем сравнивания характеристики удерживания аминокислот исследуемой пробы и достоверных аминокислот стандартной смеси.

Устойчивость C. freundii, патогенных форм дрожжеподобных грибов рода Саndida (C. albicans, С. guilliermondii) определяли при различных способах технологической обработки рыбных продуктов: тепловой и холодильной обработке, посоле и мариновании. Это осуществляли путем введения суспензий указанных бактерий и грибов в толщу кусков рыбы в количестве 1-1,5 млрд микробных тел на мл с последующим воздействием избранных физических и химических факторов с рекомендуемыми режимами их применения. При тепловой обработке рыбных продуктов использовались температуры +60^оС, +70^оС, +85^оС, +100^оС, в зависимости от их технологического назначения. При охлаждении тушек рыб применялись температуры, близкие к 0^оС -1^оС, замораживании -25^оС -30^оС. При посоле - обработка ее при различных способах посола: слабом - 3-7%-ном содержании поваренной соли, среднем - 10-12%-ной концентрации и 16-17%-ном содержании соли.

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали с применением методов вариационной статистики по Стьюденту (А.Т. Усович, П. Лебедев), а аминокислотный состав обсчитывали с применением двустороннего критерия Стьюдента в программе Primer of Biostatics 4.03 для Windows-95, на IBM-совместимом компьютере. Достоверным считали различия по критерию Стьюдента при р<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ

3.1 Цитробактериоз. Анализ эпизоотической ситуации в рыбохозяйственных водоемах

В истекшем столетии в водоемах нашей страны были отмечены две крупные вспышки эпизоотий среди рыб, принявшие массовый характер. Первая вспышка эпизоотий нового заболевания в отличие от краснухи отличалась тем, что она протекала в летнее и в осеннее время года, а также сопровождалась не только проявлением геморрагического поражения кожных покровов, но и некротическим поражением жабр, чего ранее у карповых рыб не отмечалось. Возникшее неизвестное инфекционное заболевание сопровождалось массовой гибелью рыб, достигавшей 50-60% и более. Ввиду специфики эпизоотического и клинического проявления заболевание было названо краснухоподобным (жаберным). Вспыхнувшее заболевание одновременно было отмечено в середине 50-ых годов прошлого столетия в дельте реки Волги, в регионах северо-запада, центральной, южной зонах и даже в Западной Сибири. Особенно крупная вспышка эпизоотии была отмечена в дельте реки Волги, впервые возникшая летом 1956 года и охватившая северо-западную часть Каспия. В результате вспышки эпизоотии в дельте реки Волги с 1956 по 1960 годы погибло или было преждевременно выловлено, по П.Д. Неловкину (1963), более 4 млн экземпляров промысловых волжских рыб, преимущественно волжского сазана. Источником вспышки указанной эпизоотии, как и в других регионах, явились белые амуры, вселенные в водоем в 1954-1955 годах, по Е.Н. Казанчееву (1974). В последующие годы вспышки новых инфекционных заболеваний были отмечены во многих российских прудовых хозяйствах и естественных водоемах. Развитие эпизоотии указанных болезней уже происходило через 1-3 года после вселения растительноядных рыб. По данным ветеринарной службы в период с 1956 по 1963 годы в России количество неблагополучных пунктов по краснухоподобной (жаберной) болезни составляло 12, 1964 году - 131, 1965 году - 128, 1966 году - 150, 1968 году - 120, 1969 году - 102, 1973 году - 178, 1993 году - 91 и 2006 году - более чем в 20 областях. В указанные годы краснухоподобное (жаберное) заболевание приобрело тенденцию распространения из традиционно неблагополучных южных и северо-западных регионов в уральские и западносибирские.

Возникшие новые заболевания рыб в первую очередь поражали отечественные виды рыб (карпов, карасей и других), а по мере увеличения вирулентности возбудителей стали заболевать и погибать растительноядные рыбы. Передача возбудителей болезни из одного водоема в другой преимущественно происходила с рыбопосадочным материалом.

Впервые на наличие цитробактерий в организме пораженных рыб обратили внимание научные сотрудники Астраханского рыбвтуза, выделившие эту бактерию из организма больных промысловых рыб в дельте реки Волги. Патогенность выделенной С. freundii была также подтверждена при экспериментальном заражении подопытных рыб (карпов и сазанов). В 1965 году заболевание рыб цитробактериозом было установлено в процессе их бактериологического исследования в Краснодарском и Ставропольском краях.

С целью подтверждения наличия указанного заболевания нами проводилось бактериологическое исследование и изучение степени распространения цитробактериоза у рыб в стационарно неблагополучных рыбоводных хозяйствах Ставрополья (3 прудовых и 3 естественных водоемах), в период с 1986 по 2006 годы. При изучении степени распространения цитробактериоза было осмотрено 13 690 экземпляров преимущественно двухлетков товарных карповых рыб, имевших специфические признаки заболевания (геморрагическое поражение кожных покровов и воспалительные процессы в жабрах, в основном некротического характера). В результате проведенного исследования, симптомы, специфические для заболевания, были выявлены в 3226 случаях (23,6%), в том числе из 9892 экземпляров прудовых рыб - 270 случаях (25,0%) и у 3798 экземпляров из естественных водоемов - 756 случаев (19,9%).

Достаточно высокую степень поражения прудовых рыб цитробактериозом можно объяснить высокой плотностью посадки рыб, а неблагополучие естественных водоемов - отсутствием проведения лечебно-профилактических мероприятий.

Это заболевание при исследовании 7156 экземпляров карпов было выявлено в 2021 случаях (28,2+0,31%), 3354 сазанов - в 699 случаях (20,8+0,60%), 2234 пестрых толстолобиков - 340 (15,2+0,01%), 647 серебряных карасей - 96 (14,8+0,44%) и у 299 белых толстолобиков - 70 (23,4+2,09%). Во всех случаях результаты были достоверными, р<0,001.

В связи с сезоном года, болезнь в Сергиевском прудовом хозяйстве (СПК «Александровское») наблюдалось во все периоды года, в том числе оно выявлялось весной в 10,7% (годовиков), летом (двухлетков) - 21,2%, осенью (двухлетков) - 24,8% и зимой (сеголетков) - 3,6%.

3.2 Клинико-морфологические проявления цитробактериоза

Заболевание рыб цитробактериозом протекает в виде острого и хронического течения. Острое течение болезни в условиях северокавказского региона у карповых рыб отмечается преимущественно в весенне-летнее время года и особенно тяжелый характер приобретает у карпов, сазанов и белых толстолобиков. При исследовании 1017 экземпляров двухлетков карпов острое течение болезни было выявлено в 162 случаях (15,9%), 579 сазанов - 126 случаях (21,8%), 2234 пестрых толстолобиков - 117 (5,2%), 299 белых толстолобиков - 27 (9,0%).

У пораженных рыб в различных участках поверхности тела возникало резко выраженное кроваво-красное окрашивание, сочетавшееся с мелкими кровоизлияниями не только по бокам, но и в области груди, брюшка, плавников и возле ротовой полости. В подчешуйчатых кармашках, кроме отдельных кровоизлияний, скапливался и транссудат, обусловливающий ерошение чешуи. У некоторых рыб развивалась брюшная водянка, экзофтальмия и гидремия мышечной ткани. Отмечалось наличие пояска гиперемии кровеносных сосудов вдоль боковой линии.

Хроническое течение болезни сопровождалось изъязвлением в кожном покрове.

Таблица 1

Патоморфологические изменения во внутренних органах и тканях рыб, пораженных цитробактериозом

Как видно из данных таблицы 1, при остром течении болезни было исследовано 112 экземпляров рыб, а при хроническом - 30.

В процессе изучения патоморфологических признаков, обнаруженных во внутренних органах и тканях рыб, пораженных цитробактериозом, помимо кожного покрова и жаберного аппарата, изменения выявляли в кишечнике, печени, почках, селезенке, а также в мышечной ткани (табл.1.)

При остром течении болезни патоморфологические изменения отмечались во всех слоях кожи (эпидермисе, дерме и гиподерме), проявлявшиеся в диапедезных кровоизлияниях, очаговой инфильтрации лимфоидными элементами и в развитии отдельных очагов некроза. Бокаловидные клетки, находящиеся в эпидермисе и продуцирующие слизь, находились в состоянии гипертрофии. В собственной коже и подкожной клетчатке проявлялись диапедезные кровоизлияния, а в гомогенном экссудате определялось наличие эритроцитов, лейкоцитов и нейтрофильных элементов. В подкожной клетчатке выявлялись очаги лимфоидной инфильтрации, а в отдельных случаях некротического поражения, распространявшихся на дерму. Жабры в первоначальный период воспаления покрывались слизью, продуцируемой бокаловидными клетками, находящимися в состоянии гипертрофии. Клетки респираторного эпителия подвергались десквамации, слущиванию и обнаруживались в гомогенном экссудате. Межуточная ткань у карпов и сазанов была инфильтрована лимфоидными, нейтрофильными элементами и эозинофильными гранулоцитами. Жаберные лепестки подвергались слипчивому воспалению. При развитии геморрагического поражения наблюдалась гиперемия кровеносных сосудов по ходу жаберных лепестков, а в гомогенном экссудате обнаруживалось наличие эритроцитов и лимфоидных элементов, а также цитробактерий, в клетках которых просматривалось желтовато-зеленоватое окрашивание. В последующем регистрировали очаги некроза, по ходу жаберных лепестков и в области их апикальных концов. В очагах некроза выявлялась гомогенная зернистая масса, состоявшая из некротизированных эпителиальных клеток, коллагеновых волокон и хондриоцитов. Жаберная ткань при этом принимала пестрое окрашивание, одни участки которой были красными, другие оказывались анемичными, а третьи - серыми. В кишечнике на фоне выраженной гиперемии и точечных кровоизлияний в слизистой оболочке восходящего отдела выявлялось слущивание покровного эпителия в просвет кишечной трубки и некроз в апикальной части ворсинок. Слизистая и подслизистая оболочка были разрыхлены и отечны, а иногда инфильтрованы лимфоидными элементами. Мышечные волокна представлялись набухшими и в отдельных местах гиперемированными. Печень у рыб не разделяется на дольки, а состоит из секреторных трубочек. В ней находили застойную гиперемию, нарушение белочной структуры, признаки дистрофии с проявлением глинистой окраски ее паренхимы рыхлой консистенции, нередко проявлялись очаги зернистого перерождения ее клеток и наличие в строме лимфоидной инфильтрации. В почках определялась гиперплазия, наличие кровоизлияний, размягчение и темное окрашивание ее пульпы, кровенаполненность и наличие отдельных клеток цитробактерий зеленоватого цвета. Просветы в извитых канальцах суживались, эпителий нередко находился в состоянии дистрофии и слущивания. Селезенка у рыб не разделяется на красную и белую пульпу, не имеет трабекул. В отдельных случаях в ней находили гиперемию застойного характера, инфильтрацию незрелыми лимфоидными элементами. В мышечных волокнах, прилегающих к области боковой линии, выявляли ценкеровский некроз и фрагментацию.

При хроническом течении болезни, выявляемом у карпов, в пределах 8,9%, сазанов - 11,2%, пестрых толстолобиков - 10,0% и белых толстолобиков - 14,4%. Основным патоморфологическим симптомом являются язвы, находящиеся в различных местах кожного покрова рыб, а также воспалительные процессы различного характера, обнаруживаемые в жаберном аппарате, отчасти в кишечнике и внутренних органах. При гистологическом исследовании в коже, прилегающей к местам еще неполностью заживших изъязвлений, проявлялось разрушение эпидермиса, дермы и гиподермы, а также образование серозного экссудата с находящимися в нем нейтрофильными лейкоцитами и дегенеративными клеточными элементами. В период заживления язв и эрозий экссудативные процессы заканчивались и развивались процессы организации, состоящие из массы регенерируемых фибробластов и коллагеновых волокон, находящихся между мышечными волокнами. Развивалась интенсивная пролиферация клеток эпителия. В конечной стадии заживления обширных язв регистрировали развитие рубцовой ткани. Жаберная ткань находилась в состоянии регенерации и в ряде мест лепестки покрывались регенерируемым слоем респираторного эпителия, а в отдельных местах выявлялись соединительнотканные элементы. В нисходящем отделе кишечника у карпов и сазанов иногда определялись изъязвления слизистой и воспалительные процессы дифтеритического характера, выявляемые окраской по Вейгерту. Эпителий крипт в нисходящем отделе находился в состоянии слизистой дистрофии и некроза. В паренхиме печени еще выявлялись отдельные очажки с зернистым перерождением печеночных клеток.

3.3 Биологические свойства С. freundii

Бактериологическое исследование рыб на наличие С. freundii проводили в период с 1986 по 2006 годы. Материал, необходимый для исследования брали от больных рыб только в тех рыбоводных хозяйствах, которые являлись стационарно неблагополучными по цитробактериозу в течение многих лет и лишь от тех экземпляров, которые имели ясно выраженные патологические изменения в коже, жабрах, кишечнике и внутренних органах.

Всего бактериологическому исследованию был подвергнут 171 экземпляр пораженных рыб, в результате чего было выделено 142 культуры С. freundii от такого же количества рыб, что составило 83,0%. Из 96 исследуемых карпов С. freundii была выделена в 80 случаях (83,3%), из 25 сазанов - 24 (96,0%), из 6 серебряных карасей - 3 (50,0%), 24 пестрых толстолобиков - 17 (70,8%) и из 20 белых толстолобиков - 18 (90,0%).

В связи с течением болезни степень поражения рыб также была неодинаковой. При остром течении - из 129 исследуемых рыб С. freundii была изолирована в 103 случаях (79,8%), а при хроническом - 26 (20,2%). Изучение степени контаминации пораженных тушек карпов с острым течением болезни показало, что ее основным биотопом являлись кишечник (90,9%), печень (81,8%), жабры (72,7%) и пораженные мышцы (63,6%).

При изучении специфики морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств С. freundii было установлено, что по морфологии, выделенная цитробактерия, в односуточной культуре представляет собой палочку величиной в 0,5х1,0 мкм и 0,6х1,2 мкм. По методу Грама С. freundii окрашивались отрицательно. При изучении подвижности цитробактерий было установлено, что все изучаемые культуры оказались наиболее подвижными при температуре +22^оС +24^оС, спор и капсул не образовывали. Проявляли оптимальный рост на средах Симонса с цитратом натрия. Росшие на среде Эндо колонии разделялись на 2 основные группы: лактозоотрицательные, не ферментировавшие или очень слабо ферментировавшие лактозу и лактозоположительные, расщеплявшие молочный сахар. Первая группа С. freundii росла на этой среде в виде округлых прозрачных или слаборозового цвета колоний, а вторая - красных, в отличие от Е. соli, без металлического блеска. На агаре Плоскирева лактозоотрицательные культуры С. freundii образовывали слегка розоватые (в тон среды) колонии, а лактозоположительные колонии принимали более интенсивную розово-красную окраску с темным центром. На висмут-сульфит агаре цитробактерии росли в виде колоний коричневого или черного цвета с весьма неприятным запахом, на среде Хью-Лейфсона росли в виде темно-синих колоний. При изучении характера роста С. freundii на агаре Симонса было установлено, что по истечении 1-2 суточного роста при температуре инкубации +24^оС +26^оС преимущественно обнаруживались гладкие и очень редко шероховатые колонии. Консистенция их хотя и представлялась сметанообразной, но была менее влажной. Края колоний чаще всего оказывались ровными, лишь иногда - волнистыми; врастания их в толщу среды не наблюдалось. Все изучаемые культуры С. freundii проявляли оптимальный рост на средах с малонатом натрия, утилизировали цитрат натрия в среде Симонса, показывали положительную реакцию на в-галактозидазу, ферментировали глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, непостоянно ферментировали сахарозу и лактозу, не сбраживали инозит. Иногда проявляли положительную реакцию на сероводород и всегда отрицательную на индол. Представлялись положительными в реакции с метилротом, отрицательными в реакции Фогас-Проскауера, восстанавливали нитриты в нитраты. В процессе изучения культурально-биохимических свойств цитробактерий выяснялись и их факторы патогенности, к которым относили протеолитическую, гемолитическую активность и галотолерантность. Патогенные культуры цитробактерий обладали протеолитической активностью. Все 142 выделенные культуры этих бактерий при выращивании на кровяном агаре, уже через 3-5 суток вызывали гемолиз эритроцитов, то есть они обладали гемолитической активностью. В зависимости от температурных условий выделенные культуры С. freundii проявляли визуальный рост при +15^оС +17^оС, а также при более высокой температуре +25^оС +26^оС. При изучении фактора галотолерантности к хлориду натрия было установлено, что все изучаемые культуры сохранялись на плотных и жидких питательных средах (РПА, РПБ), с содержанием в них 3-5%, 7% и иногда 10% соли. При серологической идентификации все изучаемые культуры принадлежали к С. freundii.

При экспериментальном заражении 154 подопытных сеголетков или годовиков рыб суспензиями высоковирулентных культур С. freundii в дозе 10³ - 10⁴ микробных тел на мл погибло 44 экземпляров рыб (28,6%), заболело 55 (35,7%) и не заболело 55 (35,7%). В зависимости от вида рыб чаще всего заболевали сазаны (72,5%), затем карпы (67,5%) и реже всего пестрые толстолобики (47,0%). В зависимости от способа заражения подопытные рыбы чаще всего заболевали или погибали при интраперитониальном введении суспензий культур (100%), затем пероральном (82,1%) и жаберном (60,0%). Подопытные рыбы заболевали при трех температурных экспозициях (+5^оС+7^оС;+15^оС+17^оС; +25^оС+26^оС). При экспериментальном заражении суспензиями цитробактерий подопытных карпов, сазанов и пестрых толстолобиков, было также установлено, что обнаруживаемые у них патоморфологические изменения оказывались еще более выраженными, в сравнении с естественно инфицированными рыбами, а в зависимости от метода заражения они проявлялись по-разному.

У подопытных карпов, сазанов, зараженных через кожу, контактным и внутримышечным способами, обнаруживаемые патоморфологические изменения преимущественно развивались в кожных покровах. Они состояли в геморрагическом поражении кожных покровов, расположенных в области боков, грудных и брюшных плавников, а также образовании изъязвлений и проявлений некроза в области межлучевых перепонок и концевых участков плавников. Наличие кровоизлияний также отмечалось и в более глубоких слоях кожи, дерме и гиподерме. В других участках пораженной кожи отмечали инфильтрацию эпидермиса нейтрофильными элементами и эозинофильными гранулоцитами, а также пролиферацию эпителиальных клеток. При образовании изъязвлений в краевых участках отмечали некроз клеток всех слоев кожи и фрагментацию мышечных волокон. В отдельных местах появлялось наличие серозного экссудата и дистрофия слизевых клеток. Выявлялись очаги инфильтрации межуточной ткани лимфоидными элементами.

При жаберном способе заражения основные патологические изменения сосредотачивались в жаберном аппарате. В первый период инокуляции на поверхности жабр находили достаточное количество слизи, в особенности на первой дужке, продуцируемой бокаловидными клетками. Проявление патологических изменений обильно начиналось с апикальных концов жаберных лепестков, которые затем распространялись на лепестки других дужек. В первоначальный период воспаления лепестки представлялись уплотненными и отечными. В пространствах между лепесточками в этот период обнаруживалось большое количество слущенных эпителиальных клеток и воспалительного экссудата, что приводило к слиянию лепестков. Жаберные капилляры представлялись расширенными, а их эндотелий набухшим. В последующем этапе воспалительного процесса, вследствие нарушения проницаемости стенок капилляров, отмечалось наличие эритроцитов, лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов в бледно окрашенном гомогенном экссудате. Межуточная ткань была инфильтрована лимфоцитами. В момент развития некроза отмечалось резко выраженное отторжение респираторного эпителия. В строме лепестков выявлялись зеленовато-желтого цвета цитробактерии, обнаруживались воспалительные процессы, некроз, происходило отторжение жаберных лепестков. Мышечная ткань жаберных дужек представлялась набухшей и находилась в стадии резко выраженного воспалительного процесса.

При пероральном и водном способах заражения у подопытных рыб, также отмечались достаточно выраженные патологические изменения, в особенности в кишечнике. В слизистой восходящего отдела находили наличие кровоизлияний и очагов некроза, а в мышечной оболочке набухание мышечных волокон. В слизистой нисходящего отдела также выявлялись отдельные кровоизлияния и изъязвления.

При интраперитониальном заражении у подопытных рыб обнаруживалось геморрагическое воспаление кишечника в обоих отделах, а также и во внутренних органах.

У инфицируемых рыб находили и другие патологические изменения во внутренних органах, что зависело от способов инокуляции суспензиями культур цитробактерий. При пероральном и водном способах заражения печень иногда представлялась увеличенной, приобретала слегка глинистую очаговую окраску. У отдельных больных рыб отмечали наличие кровоизлияний в ее паренхиме. Почки представлялись увеличенными, имели темноватую окраску, а иногда в их пульпе встречались и отдельные кровоизлияния. Селезенка помимо увеличения имела темноватую окраску и была пропитана массой точечных кровоизлияний, что особенно интенсивно у рыб проявлялось при интраперитониальном способе заражения.

При экспериментальном заражении 72 белых мышей суспензиями культур С. freundii интраперитониальным путем, в дозе 500 млн клеток на мл в 38 случаях (52,8%) была отмечена их гибель, в 18 (25,0%) - заболевание, а в 16 случаях (22,2%) мыши не заболели. При жизни у подопытных белых мышей наблюдались признаки возбуждения и симптомы гастроэнтерита, а после их гибели наличие гнойников в печени, признаки геморрагического и некротического поражения в кишечнике и внутренних органах, обусловленные проявлением токсикоза.

3.4 Устойчивость С. freundii к физико-химическим факторам и лечебным препаратам

При изучении устойчивости С. freundii к физико-химическим факторам и лечебным препаратам установлено, что под воздействием ультрафиолетового облучения культуры инактивировались в течение 35 минут с начала опыта. Под влиянием высокой температуры двухсуточные культуры цитробактерий, эмульгированные в физиологическом растворе, содержащем 1 млрд. микробных тел в 1 мл при температуре +70^оС теряли свою жизнеспособность по истечении 5 минут, +80^оС - 1-2 минут и +100^оС - в течение 30 секунд. При низкой температуре (-25^оС) они сохраняли свою жизнеспособность по истечении 12 и 24 часов. При воздействии 3%-ного раствора формальдегида цитробактерии инактивировались по истечении 1 часа, 1%-ного раствора хлористого йода - 1 часа, 10%-ного раствора свежегашеной извести и раствора 1:1000 марганцевокислого калия не погибали в течение 2-3 часов.

При испытании устойчивости 60 культур С. freundii к лечебным препаратам, было установлено, что под влиянием фуразолидона высокочувствительными и среднечувствительными оказались 49 культур (81,7%), хлортетрациклина - 16 культур (26,7%), террамицина - 7 культур (11,7%). Бактериостатическая активность С. freundii к фуразолидону составляла 0,1-0,28 мкг/мл, а к хлортетрациклину - 0,2-0,78 мкг/мл. Бактерицидная активность указанных препаратов соответственно равнялась 0,2-0,76 и 5,36-10,2 мкг/мл.

В связи с высокой бактерицидностью фуразолидона по отношению к С. freundii совместно с ихтиопатологической службой Ставропольрыбпрома осуществлялось применение этого препарата для лечения рыб, пораженных цитробактериозом. В задачи нашей работы входило бактериологическое исследование карповых рыб в неблагополучных рыбоводных хозяйствах края и выяснение степени чувствительности выделяемой цитробактерии к фуразолидону.

При этом на 1 тонну гранулированного корма совместно с ветеринарной службой Ставропольрыбпрома при остром течении болезни в состав корма вводили 600 г указанного препарата, а при хроническом течении - 300 г. Проводили его скармливание до конца вегетационного периода. При этом проводили три курса лечения, каждый из которых состоял из 15 дней с промежутками между пятидневками 2 дня, а между курсами в 10-12 суток. В результате проведенных мероприятий в рыбоводных хозяйствах края была ликвидирована гибель рыб, а степень заболеваемости их снизилась до 2-3%. Рыбопродуктивность в течение 20 лет в период с 1968 по 1988 годы увеличилась в три раза, с 6,8 ц/га до 18,6 ц/га. У карпов увеличилась и масса тела, которая приближалась к кондиционной (450 г).

Помимо проведения специфических лечебно-профилактических мероприятий в условиях прудовых хозяйств Ставрополья создавался оптимальный гидрохимичесикий режим с поддержанием реакций среды в воде в пределах 8,0-8,5. При этом в воду прудов вносят 2,5 ц/га свежегашеной извести, проводят дезинфекцию хлорной известью (5 ц/га), а ложе прудов при летовании обрабатывают 3%-ным раствором формалина с помощью параформалиновых камер. Не допускают вселение в водоем рыб без соблюдения правил карантина.

3.5 Качественная и санитарная оценка рыбы и рыбных продуктов при цитробактериозе

Рыба является ценным пищевым продуктом. Под влиянием различных заболеваний, в том числе и цитробактериоза, в результате развития различных патоморфологических процессов (геморрагического и язвенного поражения кожи, брюшной водянки), могут снижаться ее товарные качества.

В зависимости от степени поражения такую рыбу разделяли на 2 группы: доброкачественную - при наличии на ее теле единичных красных пятен или язв и злокачественную - при выявлении множественных красных пятен, ерошения и отслоения чешуи, большого количества язв или брюшной водянки. При определении морфологического состава было взято по 4 экземпляра сазанов и белых толстолобиков в каждую из 3 исследуемых групп (табл.2).

Таблица 2

Морфологический состав тушек рыб, пораженных цитробактериозом, n =4

* - степень достоверности р<0,001

При анализе данных таблицы 2 видно, что при этом определялась масса тушек, содержание несъедобных и съедобных частей. При доброкачественной форме масса тушек у 2-х летков товарных сазанов снижалась на 80 г (20,0%), а при злокачественной - 110 г (22,9%). У белых толстолобиков аналогичные показатели соответственно сокращались на 36 г (8,2%) и 80 г (18,1%), в сравнении с теми же видами здоровых рыб.