На правах рукописи

Сивкова Татьяна Николаевна

Кариопатические и патоморфологические изменения под действием продуктов метаболизма паразитов и влияние на репродуктивную функцию домашних плотоядных

Специальность 03.00.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И.Скрябина (ВИГИС)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор БЕРЕЖКО Вера Кузьминична

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Новик Тамара Самуиловна

доктор биологических наук, профессор Новак Михаил Дмитриевич

доктор биологических наук, доцент Жданова Ольга Борисовна

Ведущая организация:

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита состоится 12 мая 2010г. в 11 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.011.01 при ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина" (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б.Черемушкинская ул., д.28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

Автореферат размещен на официальном сайте ВАК РФ.

Автореферат разослан "___"____________ 2010г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук В.К. Бережко

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время на территории крупных городов собаки и кошки составляют подавляющее большинство пациентов ветеринарных клиник. По данным Воличева А.Н. (2000), Пешкова Р.А. (2007) среди всех заболеваний плотоядных инвазионные болезни занимают четвертое-пятое место. Широкому распространению паразитарных заболеваний способствуют незначительное количество мест, приспособленных для выгула собак, некачественное кормление и содержание животных, отсутствие своевременной диагностики этих заболеваний, дегельминтизация без контроля со стороны ветеринарных специалистов, а также отсутствие обработки против простейших. Болезни репродуктивной системы мелких домашних животных составляют от 12 до 20% общего числа заболеваний (Федин А.А., 2005; Шафикова А.В., 2006). Этиологическими факторами при данных патологиях принято считать патогенную и условно-патогенную микрофлору (Емельянова Н.С., 2007, Кухарь И.В., 2007). В последние годы активно идет изучение патологии при гельминтозах и разработка способов ее коррекции. Известно, что паразит оказывает на организм хозяина не только механическое, трофическое, но и аллергическое и токсическое воздействие. Токсины гельминтов угнетают деятельность центральной нервной, сердечно - сосудистой и пищеварительной систем. Установлено отрицательное влияние некоторых гельминтов на функцию органов размножения хозяев (Карбышева Н.В. и др., 2000; Карбышева Н.В. и др., 2001; Гасанова Т.А., 2006; Соловьева А.В., 2007; Weigel M.M. et al., 1996). Данные исследования проводятся, главным образом, в гуманитарной медицине, тогда как сведений о влиянии гельминтов и их токсинов на репродуктивную функцию домашних животных в литературе имеется недостаточно. В связи с возрастающей популярностью племенного разведения собак и кошек, широким распространением у них паразитарных заболеваний, проблема изучения влияния воздействия гельминтов на размножение мелких домашних животных является весьма актуальной.

Несмотря на то, что в настоящее время на рынке товаров для животных широко представлены различные промышленные корма, большинство владельцев продолжает отдавать предпочтение натуральному кормлению, которое осуществляется продуктами животного (мясо, рыба) и растительного происхождения (крупы). Жители крупных городов приобретают продукты в основном в специализированных магазинах или на рынках, где продукция животного происхождения сертифицирована и проходит ветеринарно-санитарный контроль. Известно, что рыба, инвазированная личинками гельминтов, может стать причиной заражения человека и плотоядных животных. В речной рыбе содержатся метацеркарии трематод (Opisthorhis felineus, Clonorhis sinensis, Echinochasmus perfoliatus и др.) и плероцеркоиды широкого лентеца Dyphillobothrium latum. Большинство владельцев животных имеет представление об опасности этих заболеваний, поэтому избегает кормления собак и кошек сырой речной рыбой. Морскую рыбу часто скармливают в сыром виде. Анизакидоз, вызванный личинками нематод семейства Anisakidae (Skrjabin et Korokhin, 1945), является опасным для здоровья человека заболеванием (Горохов В.В. и др.,1998; Довгалев А.С. и др., 1999; Карманова И.В. и др., 2002). Возбудители анизакидоза человека - личиночные стадии развития гельминтов родов Anisakis, Contracaecum, Pseudoterranova, Hysterothylacium. За последние годы во всем мире было зарегистрировано несколько случаев этого заболевания в основном в тех странах, где придерживаются традиционной японской и китайской кухни, в которой рыба и другие гидробионты используются в сыром или полусыром виде. В замороженной рыбе и других гидробионтах допускается наличие нежизнеспособных личинок гельминтов (Поздняковский В.М. и др., 2005). Однако, товарная рыба, содержащая паразитов, вызывает негативную реакцию покупателей. Необходимо также помнить, что соматические белки гельминтов и продукты их метаболизма могут оказывать токсическое и аллергенное действие. Установлено, что инвазированная рыба имеет более интенсивную обсемененность микрофлорой по сравнению со здоровой, что отрицательно сказывается на сроках хранения (Софронова П.П., 1999; Гаевская А.В., 2004; Рамлочан П., 2006), и может стать причиной микробной интоксикации. В связи с этим изучение патогенного воздействия гельминтов и простейших на функцию размножения животных актуально. Имеется необходимость разработки экономически эффективных методов обеззараживания рыбной продукции при таких опасных заболеваниях как анизакидоз.

Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение кариопатических и патоморфологических изменений под действием гельминтов и их антигенов, личинок анизакид и некоторых простейших на органы размножения и патологии беременности, разработка профилактических мероприятий.

В задачи исследований входило:

· Изучение распространения паразитозов домашних плотоядных и установление взаимосвязи с заболеваниями половой сферы.

· Исследование патологии плаценты на фоне паразитарных заболеваний.

· Выявление степени пораженности товарной рыбы личинками анизакид.

· Приготовление соматических антигенов-экстрактов и метаболитов гельминтов, их биохимический и иммунохимический анализ.

· Установление клинической и морфологической патологии, вызванной продуктами метаболизма личинок анизакид.

· Изучение эмбриотоксического и кариопатического действия продуктов жизнедеятельности личинок анизакид в сравнении с кариопатическим действием белковых продуктов жизнедеятельности других гельминтов.

· Установление степени влияния белковых компонентов личинок анизакид на репродуктивную функцию самцов лабораторных мышей.

· Оценка влияния витаминов - антиоксидантов на кариопатические свойства личинок анизакид.

· Разработка методов обезвреживания экскреторно - секреторных и соматических продуктов метаболизма личинок анизакид.

Научная новизна. Впервые изучено распространение гельминтозов и протозоозов желудочно-кишечного тракта среди домашних плотоядных животных г. Перми, выявлены случаи заражения ослеруозом, капилляриозом, спироцеркозом, мезоцестоидозом, криптоспоридиозом, неоспорозом, бластоцистозом. Впервые проведен серологический мониторинг токсоплазмоза собак и кошек и лямблиоза собак в городской популяции г. Перми. Установлены патогистологические изменения в плаценте плотоядных на фоне инвазионной патологии. Впервые оценено влияние соматических и экскреторно-секреторных продуктов личинок анизакид, токсокар, гидатигеры и дифиллоботриума на митоз клеток красного костного мозга и деление клеток семенников лабораторных животных. Выявлено эмбриотоксическое действие продуктов метаболизма личинок анизакид на лабораторных животных. Проведена оценка влияния термической обработки на кариопатические и патогенные свойства личинок анизакид.

Практическая ценность и внедрение результатов исследований. Материалы исследований, выполненные автором самостоятельно, а также совместно с другими учеными и специалистами используются для чтения лекций и проведения лабораторных занятий со студентами факультета ветеринарной медицины по курсу "Паразитология и инвазионные болезни животных" в ФГОУ ВПО "Пермская ГСХА".

Разработаны:

1. Рекомендации "Гельминтологические исследования", ПГСХА, 2005;

2. Методическое пособие "Получение и характеристика антигенов гельминтов", ПГСХА, 2009;

3. Методическое пособие "Профилактика анизакидоза", ПГСХА, 2009;

4. Лабораторный регламент "На проведение кариопатической оценки продуктов метаболизма гельминтов in vivo", утвержден на секции "Инвазионные болезни животных" РАСХН 25 сентября 2009г;

5. Методические рекомендации "Способ определения поражения рыбной продукции личинками анизакид", утверждены на секции "Инвазионные болезни животных" РАСХН 25 сентября 2009г.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины мелких домашних животных", Екатеринбург, 2004; Международной научно-практической конференции "Вузовская наука - сельскому хозяйству", Барнаул, 2005; Научных конференциях "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями" (2007-2009гг.); Первой региональной научно-практической конференции "Организм как среда обитания", Оренбург, 15-17 мая 2007 г.; Научно-практической конференции "Современные проблемы биологии, экологии, физиологии и ветеринарии домашних животных", Тюмень, 2008; VI Международной научно-практической конференции "Паразитарные болезни человека, животных и растений", Витебск, ВГМА, 2008; Всероссийских научно-практических конференциях ФГОУ ВПО "Пермская ГСХА" (2005-2010гг.); Всероссийской научно-практической конференции "Инновационный потенциал аграрной науки - основа развития АПК", Пермь, 2008; Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Саратовского Госагроуниверситета "Вавиловские чтения", Саратов, 2008; Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию образования Волгоградской государственной сельскохозяйственной академии, "Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях", Волгоград, 2009; Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения П.Г.Петского, "Современные научные тенденции в животноводстве", Киров, 16-17 апреля 2009 года; Региональной конференции молодых ученых "Современные тенденции развития АПК в Северном Зауралье", Тюмень, 2009; Всероссийской научно-практической конференции "Современные достижения ветеринарной медицины сельскохозяйственному производству", Донской ГАУ, 2009; Международной научно-практической конференции "Высшее образование и аграрная наука - сельскому хозяйству", Казахстан, Семей, 2009; Международной научно-практической конференции, посвященной 35-лению образования факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета "Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных", 2009; секции "Инвазионные болезни животных" РАСХН 25 сентября 2009г.; научной конференции "Современный мир, природа и человек", Томск, 2009; научной конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии", Томск, 2009; Международной научно-практической конференции "Вавиловские чтения", Саратов, 2009.

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом многолетних (с 2002 по 2010 год) научных исследований автора. Исследования паразитофауны плотоядных, сбор патологического и гельминтного материала, приготовление антигенов-экстрактов и метаболитов и оценка их кариопатического и аллергенного действия, в том числе внутрибрюшинная иммунизация мышей, пероральное введение крысам личинок гельминтов, вскрытие лабораторных животных и приготовление мазков отпечатков красного костного мозга и семенников с последующим микроскопическим анализом выполнены диссертантом лично. Гистологические исследования были проведены в лаборатории гистопатологии Краевой детской клинической больницы Пермского Края при участии к.м.н. Патлусовой Е.С.

Работа выполнялась при консультативном руководстве доктора биологических наук, профессора В.К. Бережко.

Основные положения, выносимые на защиту.

· Анализ зараженности кошек и собак городской популяции Перми инвазионными болезнями.

· Влияние гельминтов и простейших на морфологию плаценты, патологию органов размножения плотоядных.

· Получение экстрактов и метаболитов гельминтов и оценка их антигенного, кариопатического и патоморфологического влияния на клетки и органы лабораторных животных, кариопротективное действие витаминов-антиоксидантов А и Е.

· Распространение личиночного анизакидоза товарной рыбы.

· Иммунохимический анализ антигена-экстракта из личинок анизакид.

· Влияние температурной обработки и СВЧ на антигенное и кариопатическое действие личинок анизакид.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 243 страницах компьютерного текста, включает 26 таблиц, 40 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Список использованной литературы включает 394 источника, в том числе 239 отечественных и 155 зарубежных авторов.

Обзор литературы

В главе представлен анализ работ по распространению гельминтов и простейших у плотоядных животных на территории Российской Федерации, влиянию инвазии на деление половых и соматических клеток организма хозяина и протективному действию витаминов - антиоксидантов, развитию патологии беременности на фоне паразитарных заболеваний. Представлены данные по распространению личиночного анизакидоза среди морской рыбы и способов ее обеззараживания, методов диагностики данной инвазии у человека и животных.

Собственные исследования

Материалы и методы

Исследования паразитофауны домашних плотоядных

Для определения экстенсивности инвазии кишечными паразитами проводили обследование домашних кошек и собак, которые поступали в ветеринарные клиники города. Кроме того, обследованию подвергали собак различных служебных пород (немецкая, кавказская, среднеазиатская и французская овчарки, ротвейлеры, лабрадоры, сенбернары, русские спаниели, американские кокер-спаниели и спрингер-спаниели) в возрасте от 1 месяца до 9 лет, принадлежавших питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, колониям общего режима и питомнику при Пермском колледже юстиции. Для выявления инвазированности безнадзорных животных обследовали кошек и собак из Пермского муниципального приюта.

Фекалии плотоядных собирали сразу после выделения в чистую сухую пластиковую промаркированную посуду. Исследование проводили комбинированным методом Г.А. Котельникова и В.М. Хренова (1984г.) с раствором аммиачной селитры плотностью 1,3 г/мл. Для диагностики криптоспоридиоза готовили тонкие мазки фекалий с последующим окрашиванием по методике Циля - Нильсена. Для выявления цист лямблий и других простейших, а также яиц трематод свежевыделенные фекалии собирали в контейнеры с консервантом Турдыева, тщательно перемешивали и исследовали методом формалин-эфирного осаждения (Новикова Т.В., 2005). Исследования на лямблиоз проводили трехкратно с интервалом 3-5 дней (Бандурина Т.Ю., Кнорринг Г.Ю., 2003; Коровина Н.А., 2004).

Для диагностики дирофиляриоза собирали пробы венозной крови в количестве 2-3-мл с добавлением гепарина; 1 мл гепаринизированной крови отстаивали с 9 мл дистиллированной воды в течение 5 мин, затем центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин и исследовали осадок на наличие личинок - микрофилярий (Ястреб В.Б., 2005).

Посмертно проводили компрессорную трихинеллоскопию поперечно-полосатых мышц для выявления инцистированных личинок. Таким образом, было исследовано 113 трупов собак и 143 - кошек как домашних, так и безнадзорных.

Для диагностики кровепаразитарных заболеваний (пироплазмоз) готовили тонкие мазки периферической крови собак, полученной из когтя, окрашивали их по методике Романовского-Гимзы, а затем микроскопировали под иммерсионным увеличением микроскопа. Всего таким способом было анализировано 180 проб.

Для обнаружения антител к возбудителю токсоплазмоза собирали сыворотку крови домашних и содержащихся в приюте собак и кошек и исследовали с помощью иммуноферментной тест - системы "ИФА - анти-Тох. g - Cate - Dog" (Казанская ГАВМ), предоставленной профессором Р.Х. Равиловым. Таким образом, было обследовано 218 животных.

Обнаружение антител к антигенам лямблий проводили у собак с помощью диагностического набора (Вектор-Бест). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови собаки, меченные пероксидазой хрена (Медгамал) в титре 1:4000.

Гистологические исследования

От абортировавших или оперированных по поводу овариогистеректомии кошек и собак собирали плоды, плаценты, матку и яичники. От экспериментальных белых мышей и лабораторных крыс собирали печень, селезенку, костный мозг, участки тонкого кишечника, семенники, матки, яичники, плаценты. Собранный материал промывали, фиксировали 10%-ным раствором нейтрального формалина с целью уплотнения. Далее производили вырезку кусочков и проводку их по спиртам возрастающей крепости с целью обезвоживания по общепринятой методике. После проводки кусочки заливали в парафин и изготавливали блоки 2х2см. С полученных блоков на микротоме-полуавтомате делали срезы толщиной 4-5 микрон. Их помещали на предметное стекло и окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная методика) и по ван Гизон с целью выявления степени развития склеропластических процессов в органах. Просмотр готовых препаратов производили с помощью микроскопа фирмы "Leica" и "Zeiss" при увеличении окуляра х10, с объективами х4; х40 и х100 с подробным описанием имеющейся морфологической картины в органах. Оценивали дисциркуляторные, дистрофические, склеропластические, воспалительные, гиперпластические, регенераторные процессы в органах.

В семенниках описывали состояние сперматогенного эпителия, наличие митозов и степень выраженности сперматогенеза. В плаценте животных оценивали четыре группы основных процессов: инволютивные, компенсаторные, дисциркуляторные и воспалительные. В костном мозге - степень развития каждого ростка гемопоэза с выявлением возможных нарушений морфогенеза клеток. В органах РЭС (печень, селезенка) производили оценку морфологии и локализации клеток макрофагально-гистиоцитарного ряда с целью выяснения их структурно-функциональной принадлежности (воспалительный или иммунокомпетентный генез). Для этого использовали иммуногистохимический метод с антителами S-100 и CD99. Иллюстративный раздел работы выполнен с использованием цифровой видеокамеры "Sony" на компьютере "Pentium-III" и Toshiba. Наиболее интересные и показательные фрагменты микропрепаратов фотографировали и сохраняли в памяти компьютера.

Получение материала из гельминтов, приготовление соматического экстракта и его биохимический анализ.

Для паразитологического исследования использовали свежемороженую рыбу, приобретенную в различных торговых точках города. После размораживания тушки рыбы вскрывали по общепринятой методике. Обнаруженных гельминтов извлекали, подсчитывали их количество (интенсивность - ИИ и экстенсивность инвазии - ЭИ). Выделенных личинок нематод фиксировали в жидкости Барбагалло для последующего определения и описания. Определение принадлежности выделенных личинок проводили с применением ключа, основанного на морфологических особенностях этих паразитов (Гаевская А.В., 2005). Часть гельминтов фиксировали в 10%-ном формалине и проводили гистологическое исследование по описанной выше методике. Жизнеспособность анизакисов устанавливали с помощью температурного теста в растворе искусственного желудочного сока.

Извлеченных из тушек рыбы личинок A.simplex 3-й стадии тщательно многократно промывали проточной водой, затем обрабатывали растворами антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и нистатин), стерильным физиологическим раствором и замораживали. После многократного замораживания и оттаивания личинок гомогенизировали, заливали стерильным забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и экстрагировали при температуре +4^°С в течение 18 часов. После этого раствор сливали и процедуру повторяли. Полученный антиген хранили в замороженном состоянии при температуре -10^°С.

Контроль на стерильность. Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу экстракта из личинок анизакид высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке. Для выявления грибковой контаминации антиген высевали на агар Сабуро в две чашки Петри. На микоплазменную контаминацию пробу антигена высевали на универсальной плотной среде для выделения микоплазм (ООО "Научно-производственная фирма Диагност-Мед") согласно инструкции в две чашки Петри. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при +37°С, посевы на полужидком агаре - 14 дней при +37°С, и на среде Сабуро - 15 дней при +23°С. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию экстракта считали нестерильной и в дальнейшей работе не использовали.

Определение содержания белка. Концентрацию белка в полученном экстракте определяли на биохимическом полуавтоматическом анализаторе StatFax 1904+ (AWARENESS technology inc) с использованием набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции, при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали фосфатно-солевой буферный раствор.

Для сравнения кариопатического и антигенного действия белкового экстракта из личинок анизакид с антигенами других гельминтов готовили соматические экстракты из Diphyllobothrium latum, Hydatigera taeniamorfis, Toxocara canis. Проводили их биохимический анализ на биохимическом анализаторе StatFax 1904+ с помощью набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции: аспартат-аминотрансфереза, аланин-аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, триглицериды.

Получение экскреторно-секреторного антигена T. canis

В качестве антигена также использовали метаболиты, полученные при культивировании яиц и личинок T.canis. Для этого выделенных от спонтанно зараженных животных гельминтов обрабатывали по описанной выше методике. Самок нематод вскрывали, извлекали матку с яйцами, которые культивировали в жидкой питательной среде 199 с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Perbio) при температуре +37°С в течение 7 дней. Метаболиты личинок собирали, очищали центрифугированием и замораживали при температуре -10°С для дальнейшего использования. Контроль на стерильность и определение содержания белка проводили с помощью методов, описанных ранее.

Изучение кариопатических свойств антигенов гельминтов

Для изучения кариопатического действия антигенов гельминтов проводили однократное внутрибрюшинное введение нелинейным белым мышам-самцам массой 18-20г 100 мкг белка-антигена. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1мл забуференного физиологического раствора. Количество животных в каждой группе составило 12. Убой мышей проводили через 4; 12; 24; 48 и 72 часа после введения материала.

Для выявления протективного действия на клетки красного костного мозга витаминов-антиоксидантов группе мышей в течение пяти дней перорально вводили масляный раствор "Аевит" в терапевтической дозе, затем также проводили внутрибрюшинное введение белкового экстракта в дозе 100 мкг.

Для определения эффективности термической обработки пробу антигена-экстракта A.simplex обрабатывали с помощью СВЧ-нагревания в бытовой микроволновой печи в течение 1 мин. Также применяли обработку белкового экстракта 15-минутным кипячением на водяной бане. Обработанные таким образом антигенные продукты использовали для введения мышам-самцам по описанной выше схеме. После этого по стандартной методике проводили гистологическое исследование печени, селезенки, красного костного мозга и семенников. Также из красного костного мозга грудины и семенников готовили мазки-отпечатки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду, а затем окрашивали азур-эозином по Романовскому. При микроскопировании подсчитывали количество делящихся клеток, учитывали форму, размеры и окраску ядер. Отмечали количество цитопатических и кариопатических нарушений в опытных и контрольных группах животных.

Оплодотворяющая способность мышей-самцов после внутрибрюшинного введения соматического антигена из личинок анизакид

Для выявления действия антигена-экстракта из личинок анизакид на функцию размножения проводили внутрибрюшинное введение самцам мышей массой 22-24г данного антигена как описано выше. К каждому самцу подсаживали по 4 взрослых интактных самки и оставляли на 3-4 дня. Контролем служили самки того же возраста, подсаженные к интактным самцам. С этого дня начинали отсчет сроков беременности. Кормление и содержание опытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента. Затем самцов отсаживали, а самок содержали до 20 дня беременности, после чего подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Извлекали матку с яичниками. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Выявляли предимплантационную и постимплантационную смертность плодов. Штангенциркулем определяли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств (отсутствие глаз, пальцев, расщепление неба и т.д.).

Морфологические изменения плаценты белых крыс при пероральном введении личинок анизакид, контроль эмбрионального развития

Для определения влияния экскреторно-секреторных и соматических продуктов личинок Anisakidae на эмбриональное развитие плодов использовали половозрелых нелинейных лабораторных крыс-самок (Rattus norvegicus) массой 120-150г. Отобранных беременных животных распределяли на несколько групп. Животным первой, второй и третьей групп перорально вводили личинок анизакид в растворе антибиотиков в дозе соответственно 10, 50 и 100 экз. на животное. Сроки введения составляли 1-2 день, 7-8 день и 13-14 дни беременности, которые являются критическими сроками эмбриогенеза крыс (соответственно образование зиготы, закрытие невропора и активного органогенеза). Животным четвертой группы выпаивали только антибиотики на 0,9%-ном стерильном растворе хлорида натрия в те же сроки. Самки пятой группы служили интактным контролем. Кормление и содержание подопытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента.

Самок подвергали эвтаназии на 20 сутки под воздействием эфира методом декапитации. При вскрытии извлекали матку с плодами и яичники. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Определяли предимплантационную и постимплантационную смертность. С помощью штангенциркуля измеряли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств.

Оценка действия личинок анизакид при пероральном введении самцам крыс на гематологические показатели и гистологическую картину

Патоморфологическое действие соматических продуктов личинок анизакид изучали на 60 самцах нелинейных лабораторных крыс, массой 120 - 150г. Подопытных животных распределяли на несколько групп по принципу аналогов. Животным опытных групп перорально инокулировали нежизнеспособных личинок анизакид в дозах 5; 10; 25; 50 и 100 штук на голову, соответственно. Шестая группа служила интактным контролем.

Для определения динамики изменения клеточного иммунного ответа на 3; 5 и 10 сутки проводили исследование периферической крови для подсчета лейкограммы. Кровь для анализа брали из когтя, готовили тонкие мазки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду и окрашивали по Романовскому.

Инвазированную рыбу делили на три группы в зависимости от индекса зараженности (интенсивности инвазии - ИИ). Рыбу, инвазированную менее чем 10 личинками (партия 1), 10-50 личинками (партия 2) и рыбу, инвазированную более 50 личинками (партия 3) измельчали на мясорубке до состояния однородного фарша. Опытным группам животных в течение 10 дней скармливали рыбный фарш, подогретый до комнатной температуры, животные контрольной группы находились на обычном рационе.

На десятые сутки крыс декапитировали под эфирным наркозом. Семенники, печень, селезенку, желудок и участок тонкого кишечника фиксировали 10%-ным нейтральным формалином для гистологического исследования. В эти же сроки отбирали кровь из сердца для проведения биохимического анализа по основным показателям: общий белок, глюкоза, мочевина, креатинин, альфа-амилаза, общий билирубин, АлАТ, АсАТ и щелочная фосфатаза.

Оценка действия термически обработанной рыбы на гематологические показатели и гистологическую картину при пероральном введении самцам крыс

Мясо инвазированной анизакидами путассу обрабатывали кипячением (варкой) при температуре 100^°С в течение 20 минут, другую партию рыбы обрабатывали в бытовой микроволновой СВЧ-печи в течении 10 минут. Полученные продукты скармливали крысам самцам 10 дней с проведением гематологического, биохимического анализа крови и гистологического исследования тонкого кишечника, печени, селезенки, семенников. Также готовили мазки-отпечатки красного костного мозга грудины и семенников по описанной выше методике для определения уровня кариопатических изменений в данных органах, вызванных термически обработанной рыбой.

Получение гипериммунных сывороток к антигенам анизакид

Гипериммунную сыворотку получали при введении трем кроликам соматического антигена, приготовленного из личинок A.simplex. Кроликов породы серый великан живой массой 3 кг внутримышечно иммунизировали возрастающими дозами соматического антигена с полным адъювантом Фрейнда (Диаэм, США) по методике Бережко В.К. и др. (2008) по схеме три цикла трехдневной иммунизации с трехдневными перерывами. Затем через 28 дней проводили реиммунизацию для повышения активности гипериммунных сывороток. Общая доза антигена по белку составила 10,0 мг. Кровь для исследования собирали из локтевой вены через семь дней после завершения иммунизации.

Реакция иммунодиффузии гипериммунных сывороток с антигенами анизакид и экстрактом из мышечной ткани рыбы

Реакцию иммунодиффузии (РИД) проводили в 1,2%-ном агаровом геле (Difco) на физиологическом растворе (Гусев А.И., Цветков В.С., 1961). Реакцию проводили в штампе "семерка", где в центральную лунку вносили экстракт из анизакид, а в периферийные - гипериммунные сыворотки в нативном состоянии, а также в разведениях 1/1; 1/2; 1/4 и 1/8.

Также проводили РИД с сыворотками крови гипериммунизированных кроликов и термически обработанными антигенами A.simplex.

Для выявления возможных соматических и экскреторно-секреторных антигенов личинок анизакид в мышечной ткани замороженной рыбы проводили РИД, где в качестве антигена использовали экстракт из рыбы.

Статистическая обработка результатов

Фактический материал, полученный при проведении исследований, обрабатывали методом вариационной статистики. Показатели считались достоверными при значениях p?0,05 (по t-критерию Стьюдента).

Результаты исследований

Анализ зараженности плотоядных гельминтами и простейшими

В настоящее время в г. Перми содержится несколько тысяч домашних собак и кошек, имеется и большое количество бездомных животных. Результаты паразитологического обследования представлены в таблицах 1 и 2.

В период нашей работы было обследовано 228 служебных собак. Из них 125 собак принадлежали питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, 85 собак - колониям общего режима и 18 собак - питомнику при Пермском колледже юстиции. Все собаки содержатся в обустроенных вольерах, кормление осуществляется два раза в день специально приготовленными или промышленными кормами Royal Canin, профилактическая дегельминтизация проводится согласно планам 2-3 раза в год отечественными препаратами. При клиническом осмотре у большинства собак не выявляли серьезных нарушений в состоянии здоровья.

Содержание животных, принадлежащих частным лицам, отличается значительным разнообразием. Большинство владельцев предпочитает использовать для кормления своих питомцев натуральные продукты. При этом мясо и рыбу зачастую скармливают в сыром виде.

Таблица 1 Виды гельминтов и простейших, выявленные у собак

Дегельминтизации домашних собак и кошек проводятся нерегулярно, в основном, перед вакцинацией, выставкой или перед транспортировкой за пределы Пермского края. С этой целью используются самые разнообразные препараты. Обработки против простейших производятся изредка, только в случае установления соответствующего диагноза при проведении копрологических исследований.

В муниципальном приюте находятся в основном беспородные животные, многие из которых ранее относились к безнадзорным. Собаки содержатся в групповых вольерах или клетках. Кормление проводится дважды в сутки натуральными продуктами. Дегельминтизации подвергают всех вновь поступивших животных. Препараты против простейших не назначают.

Таблица 2 Виды гельминтов и простейших, обнаруженные у кошек

На территории г. Перми собаки инвазированы гельминтами и простейшими на 31,66%, кошки - на 36,47%. Данный уровень экстенсивности инвазии сопоставим с аналогичным показателем, установленным в других городах Российской Федерации. Превалирующими инвазиями являются те, при которых цикл развития происходит без участия промежуточных хозяев, т.е. фекально-оральным путем. К ним относятся нематодозы (токсокароз, анкилостомоз и унцинариоз) и протозоозы (изоспорозы, бластоцистоз кошек, реже криптоспоридиозы). Основным источником инвазии служат безнадзорные животные, что подтверждается результатами обследования поголовья содержащихся в приюте кошек и собак.

На состав паразитофауны домашних плотоядных животных в значительной мере влияет тип кормления. Домашние животные по сравнению с другими группами наиболее инвазированы описторхами, саркоцистами, так как данные инвазии передаются при скармливании, термически необработанной рыбы и мяса, которые часто используют для кормления кошек и собак.

Что касается социально опасных гельминтозов, таких как трихинеллез, то степень инвазированности домашних плотоядных животных ничтожно мала. Так, ЭИ трихинеллезом у кошек по нашим данным составила 0,7%, у собак данную инвазию не выявили. Единственная зараженная Т.spiralis кошка была доставлена из сельской местности. Таким образом, в городской популяции плотоядных животных трихинеллезная инвазия отсутствует или имеет весьма незначительное распространение, тогда как в природе сохраняются очаги, в которые могут вовлекаться домашние кошки и собаки, имеющие возможность охотиться, в первую очередь на мелких грызунов.

Серологический анализ показал, что антитела к L.intestinalis имеются в сыворотке 15,0% служебных и 26,67% домашних собак, тогда как у собак из муниципального приюта был получен отрицательный результат. Обнаружение иммуноглобулинов класса IgG может являться следствием уже перенесенной инвазии. Такой высокий уровень серопозитивных собак при незначительной доле положительных результатов копрологического исследования нельзя объяснить только появлением ложноположительных реакций, так как в группе животных из приюта, наиболее инвазированных кишечными простейшими, положительные реакции вообще отсутствовали.

Распространение лямблиоза среди собак, по всей видимости, невелико и напрямую зависит от степени контакта с человеком. По нашему мнению, бездомные животные в городской популяции могут инвазироваться лямблиями лишь случайно и большой роли в распространении возбудителя не играют. Домашние собаки, напротив, находясь в непосредственной близости к человеку, могут становиться резервуаром L.intestinalis, выделяя возбудителя в виде цист. В целом же, собаки эпидемиологического значения в распространении лямблиоза человека, по всей видимости, не имеют.

Одним из наиболее распространенных протозойных заболеваний во всем мире является токсоплазмоз. Во время наших исследований серологический диагноз на токсоплазмоз подтверждали во всех группах обследованных животных. Наименьшая зараженность токсоплазмозом оказалась у служебных собак. Известно, что плотоядные могут заразиться T.gondii тремя путями: внутриутробно, перорально при проглатывании спорулированных ооцист возбудителя или при поедании мяса, зараженного тканевыми цистами. Так как кормление служебных собак осуществляется преимущественно готовыми сухими кормами, а содержание соответствует санитарно-гигиеническим нормам, риск заражения токсоплазмозом сводится к минимуму.

Наибольшее количество серопозитивных животных выявлено нами среди поголовья, содержащегося частными владельцами. Такой высокий показатель интенсивности инвазии, вероятно, связан с тем, что в рационе данных собак значительная доля приходится на сырое мясо, которое может быть инвазировано тканевыми цистами токсоплазм. Случай массового обнаружения ооцист токсоплазм при исследовании фекалий содержащихся в приюте кошек можно объяснить одновременным заражением большого количества молодых животных. Так как в приют попадают как домашние, так и безнадзорные кошки, заражение токсоплазмозом возможно через тканевые цисты, содержащиеся в мясе сельскохозяйственных животных. Также не следует исключать роли грызунов в инвазировании животных.

Оценка влияния инвазии на патологию органов размножения домашних плотоядных

Для изучения распространения патологий репродуктивной системы были исследованы образцы яичников, матки и плаценты, полученные от самок во время овариогистерэктомии по различным показаниям, а также с целью стерилизации у клинически здоровых животных. Образцы семенников получали во время кастрации клинически здоровых самцов, а также при вскрытии павших или подвергнутых эвтаназии животных.

Гистологический анализ препаратов яичников 36 кошек и 20 собак позволил установить наличие кистозно измененных фолликулов и фолликулярных кист в 65,0% случаев, причем, 40,0% из них принадлежали домашним и 60,0% - содержащимся в приюте животным. Возраст обследованных самок варьировал от 4,5 месяцев до 5 лет, преимущественно - 3-4 года. Наличие фолликулярных кист выявляли как на фоне гельминтозов: токсокароза, дифиллоботриоза, гидатигероза, так и протозоозов: изоспороза и токсоплазмоза.

Под действием паразитов были выявлены изменения и органов репродукции самцов. Во время проведения работы было исследовано 16 проб семенников собак из муниципального приюта и 26 - котов. При анализе ткани семенников животных с подтвержденным диагнозом токсокароза отмечали изменения в виде отека, избыточных склеропластических процессов в строме, зачастую изменения затрагивали зрелые сперматозоиды, которые были либо частично гомогенизированы, либо имели агглютинированные хвостовые части. В одном случае обнаруживали многополюсные митозы в клетках герминативного слоя. У самцов старше 6 - 7 летнего возраста была выявлена, кроме того, дистрофия эпителия семенных канальцев. В гистологических препаратах семенников содержащихся в приюте котов и кобелей агглютинацию сперматозоидов выявляли в 20, нарушения активности сперматогенеза - во всех случаях. В одном случае у кота после дегельминтизации с целью лечения токсокароза в семенных канальцах отмечали явления апоптоза на всех уровнях при отсутствии сперматогенеза, что может быть связано с влиянием как антгельминтика, так и метаболитов нематоды. У котов на фоне инвазии дипилидиозом и изоспорозом выраженных изменений в состоянии семенников не фиксировали, воспалительные, склеропластические и дистрофические изменения в тканях сперматогенного эпителия и канальцах отсутствовали. Гистологическое исследование 38 проб семенников домашних котов позволило выявить угнетение сперматогенеза в 25 случаях, из которых один был обнаружен у 10-летнего животного, страдающего сахарным диабетом. В остальных случаях животные были молодыми и клинически здоровыми. В трех случаях хвостовые части сперматозоидов были агглютинированы, в двух - были отмечены многополюсные и неравнополюсные анафазы митоза.

Патология последа при паразитарных инвазиях

В процессе нашей работы были исследованы 41 образец плаценты кошек и 22 - собак. Зависимость развития патологических процессов от паразитологического статуса животных представлена в диаграмме.

Рис. 1. Распространение патологий последа в зависимости от паразитологического статуса.

Гистологический анализ показал, что у кошек и сук (3 и 4, соответственно), клинически здоровых, свободных от паразитов, родоразрешившихся в срок либо самостоятельно, либо в результате кесарева сечения инволютивные процессы в плаценте соответствовали доношенной беременности. В базальной части выявляли мелкие пылевидные петрификаты. Воспалительные и некротические изменения отсутствовали.

В случае затяжных родов или кесарева сечения отмечали некоторые изменения в состоянии сосудов. Сосуды ворсин умеренного или слабого наполнения, материнские капилляры - расширены и полнокровны. В случае оперативного отделения плаценты от стенки матки также выявляли ретробазальные гематомы. Данные изменения характерны для острой фето-плацентарной недостаточности. Подобная патология может привести к кратковременной гипоксии плода. Признаки хронической патологии последа, вызванной интоксикацией или нарушением обмена веществ, у здоровых свободных от инвазии животных отсутствовали.

Напротив, патогистологические изменения различной выраженности отмечали в плаценте, полученной от сук и кошек, страдающих теми или иными инвазиями. При некоторых паразитарных болезнях изменения последа носили ярко выраженный характер.

От кошек с подтвержденным паразитологическим диагнозом на токсокароз было получено 8 последов, от собак - 4. На фоне токсокароза выявляли характерные изменения. В базальной части отмечали наличие отека, небольшие участки коликвационного и фибриноидного некроза, дистрофию децидуальных клеток. Петрификаты представляли собой пылевидные и очаговые образования. В мелких ворсинках плаценты сосуды слабого или умеренного кровенаполнения. Строма ворсинок рыхлая, с отеком и наличием одиночных элементов макрофагального ряда. Близ базальной пластинки определяли одиночные образования с плотной гомогенной, четко очерченной наружной границей и зернистой внутренней частью - петрифицированные личинки. В двух случаях отмечали признаки острой фетоплацентарной недостаточности при доношенной беременности без обнаружения мигрирующих личинок.

В случае гидатигероза кошек (6 проб) изменения в плаценте носили следующий характер. Инволютивные процессы соответствуют доношенной беременности. В базальной пластинке и строме ворсин определялись округлые мелкие петрификаты, участки фибриноидного некроза и дистрофия децидуальных клеток. Эпителий ворсин, а также состояние стенок кровеносных сосудов сохранены по структуре. В целом изменения соответствуют фето-плацентарной недостаточности, которая носит компенсированный или субкомпенсированный характер.

Исследованы также плаценты пяти содержащихся в муниципальном приюте кошек с подтвержденным диагнозом острого токсоплазмоза. В трех случаях (абортный материал) в базальной пластинке плаценты распространен фибриноидный некроз с наличием небольших округлых кальцинатов. Децидуальные клетки мономорфны. В прилежащем слое эндометрия железы кистозно расширены, выстланы однослойным эпителием, местами образующим истинные сосочки. Ворсинки крупные, извитые с рыхлой отечной стромой, наличием в ней значительного количества расширенных капилляров. Ворсинки покрыты двухслойным прерывистым эпителием, с признаками дистрофии. В крупных ворсинах и в базальной пластинке определяются псевдоцисты в виде округлых базофильных образований с четкой границей. Данные изменения характеризуют острый токсоплазмоз, последствием которого явилась замершая беременность.

В двух других случаях в последах выявляли недоношенную беременность с признаками преждевременного старения и диссоциированного нарушения созревания ворсин без обнаружения цист возбудителя. Фибриноидный некроз и образование петрификатов присутствовали во всех случаях.

При исследовании гистологических препаратов плацент больных изоспорозом кошек (4 пробы) плацентарная ткань содержит мелкие округлые петрификаты. Видимые изменения характерны для недоношенной беременности с признаками раннего старения, а также острого нарушения фето-плацентарного кровообращения.

При лямблиозе, который мы наблюдали у суки кавказской овчарки, содержащейся в частном питомнике, патология плаценты также носила признаки хронической фето-плацентарной недостаточности, на фоне которой впоследствии развивалась и острая, приводящая к гибели части новорожденных щенят. Выжившие щенки имели пониженный иммунитет и погибали в возрасте трех месяцев с признаками диареи и обезвоживания. Гистологический анализ тканей тонкого кишечника позволил выявить в просвете и слизистой оболочке колонии грибов рода Candida. На фоне кандидоза развивались признаки острого катарального энтерита, сопровождавшегося отеком тканей, десквамацией эпителия ворсинок, обильной плазмо-лимфоцитарной инфильтрацией с малым количеством нейтрофилов.

При исследовании плаценты кошек (3 пробы), в рационе которых присутствует значительная доля морской рыбы дешевых сортов, которая интенсивно инвазирована личинками анизакид, также отличались наличием патологических процессов. Инволютивные процессы соответствуют доношенной беременности. В базальной пластинке - отек, явления фибриноидного и коликвационного некроза. В децидуальных клетках отмечены дистрофические изменения, в слое децидуальной ткани - мелкоочаговые петрификаты. Встречались участки псевдоинфарктов. Ворсинки имели плохо выраженную структуру вследствие отека стромы, распространенного фибриноидного некроза и крупных петрификатов. Сосуды ворсинок расширены и полнокровны. Данные изменения характерны для острой плацентарной недостаточности на фоне хронической декомпенсированной. В одном случае помимо описанных выше изменений в базальной и хориальной пластинах выявляли также одиночные зрелые лимфоциты и группы клеток. Ядра децидуальных клеток находились в состоянии кариопикноза. Встречались также многоядерные децидуальные клетки, клетки с вакуолизированной цитоплазмой. Данные изменения можно было расценить как проявление внутриутробного инфицирования.

Таким образом, в группе кошек и собак с подтвержденным наличием той или иной инвазии количество хронической патологии последа в 3-7 раз превосходило аналогичный показатель в группе свободных от паразитов животных. Влияние инвазии на появление острой плацентарной недостаточности не установлено.

Анализ пораженности личинками анизакид товарной рыбы

В процессе нашей работы было исследовано 3134 экземпляров путассу (Micromesistius poutassou) с длиной тела 26-28 см и 153 экземпляра сельди (Clupea harengus) длиной тела 35-36 см. Данные размеры характерны для половозрелых особей. ЭИ при исследовании путассу оказалась на уровне 99,9%, тогда как сельдь оказалась менее инвазированной, ЭИ составила 56,0%. ИИ нематодами в товарной рыбе значительно варьировала. Наименьший показатель составил 2 личинки, в то время как максимальный достиг 158. В связи с этим, в разных партиях путассу ИИ колебалась от 14,5 до 47,4. Средний показатель ИИ оказался на уровне 27,6 личинки. Что касается сельди, то ИИ в этом случае не превышала 8-9 личинок в одной тушке. Все выделенные нами из свежемороженой рыбы личинки были нежизнеспособными, что соответствует санитарным нормам.

Морфологическое исследование позволило выявить у них наличие сверлильного зуба, крупного длинного желудочка, не имеющего выростов, расположение экскреторной поры на головном конце у основания губ. При определении видовой принадлежности паразитов они были отнесены к виду Anisakis simplex. Стоит отметить, что анизакиды обнаруживались, в основном, только в полости тела рыб и на поверхности внутренних органов, чаще всего на печени, молоках и серозных покровах кишечника. При анализе мышечной ткани наличие личинок установлено в 3 случаях (0,01%). Этот факт свидетельствует о быстрой заморозке рыбы непосредственно после вылова, при которой личинки не могут мигрировать из внутренних органов в мускулатуру.

Микроскопический анализ гистологических срезов из печени путассу, содержащей личинки паразита, показал наличие глубоких деструктивных изменений в тканях как рыбы, так и нематоды, вызванных кристаллизацией воды. Целостность тканей была нарушена. Вокруг личинок была сформирована тонкая соединительнотканная капсула, которая также имела разрывы. Таким образом, обнаруженные изменения свидетельствовали о гибели личинок гельминтов и о формировании слабого ксенопаразитарного барьера вокруг них. Вероятно, незначительная толщина соединительнотканной капсулы могла быть вызвана непродолжительным сроком паразитирования в организме рыбы.