Кариопатические и патоморфологические изменения под действием продуктов метаболизма паразитов и влияние на репродуктивную функцию домашних плотоядных

Сравнительная характеристика соматических экстрактов и метаболитов гельминтов

Сравнительная характеристика соматических экстрактов Anisakis simplex, Toxocara canis, Hydatigera taeniaformis и Diphyllobothrium latum, а также метаболитов T.canis представлена в таблице 3.

По результатам наших исследований можно предположить, что наибольшей ферментативной активностью обладает соматический экстракт H.taeniaformis. Некоторое количество тканевых ферментов присутствует также в составе T.canis. Наименьшая ферментативная активность выявлена в экстракте личинок анизакид. Возможно, это связано с тем, что данные личинки подвергались длительному замораживанию, которое привело к частичному разрушению белковых молекул, в том числе и ферментов.

Таблица 3. Характеристика соматических экстрактов и метаболитов некоторых гельминтов

Микроморфологические изменения во внутренних органах мышей после введения соматических экстрактов из:

а) Anisakis simplex. Общее состояние контрольных и опытных животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода исследований. В результате проведенного эксперимента установлены следующие закономерности.

При изучении морфологических изменений семенников сперматогенез был выражен неравномерно в разных канальцах. Сперматогенный эпителий сохранял четкую стратификацию слоев, однако клетки зачастую находились в состоянии дистрофии или были десквамированы. В строме отмечали умеренный отек и полнокровие сосудов. Через 48 часов после введения экстракта из анизакид количество зрелых сперматозоидов в семенных канальцах подопытных животных постепенно снижалось и оставалось низким. В семенниках мышей после витаминизации и последующего введения антигена, а также после его термической обработки (как кипячение, так и СВЧ) сперматогенез был не нарушен, однако был выражен неравномерно.

В печени отмечали дисциркуляторные и дистрофические изменения. Через 12 часов в дольках появлялись мелкие скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 48 часам. Данные морфологические изменения свидетельствуют об активации иммунной системы, а именно ее Т-клеточного звена на уровне центрального органа, принимающего участие в детоксикации, поскольку соматические продукты анизакид являются активно действующими антигенами.

При применении витаминов А и Е дистрофические изменения и нарушения циркуляции крови также присутствовали. Начиная с 24 часов, в синусоидах и портальных трактах выявляли одиночные зрелые лимфоциты, которые впоследствии к 48 часам превращались в скопления. Аналогичные изменения наблюдали и в печени мышей, которым вводили термически обработанные антигены.

Изменения в селезенке, как в основном органе иммуногенеза, были также характерными. В динамике хорошо просматриваются процессы, характерные для становления иммунного ответа. Уже через 4 часа после введения антигенного препарата начинает определяться четкая, но слабовыраженная макрофагальная реакция в периартериальных зонах фолликулов, которую можно расценить как первое звено иммунного ответа. Степень выраженности данного морфологического признака усиливается к 48 часу и сохраняется к 72 часам. Данные изменения свидетельствуют о возникновении довольно быстрого и адекватного иммунного ответа на внутрибрюшинное введение антигена.

Изменяется степень выраженности фагоцитарной активности макрофагов, которая усиливается в зависимости от сроков эксперимента и достигает максимума к 48 часу. Об этом можно судить по наличию в субкапсулярной и перифолликулярной зонах селезенки возрастающего количества элементов макрофагального и гистиоцитарного ряда с постепенным увеличением их ядерности (показатель незавершенности фагоцитоза и митотической активности клеток). Если через 4; 12 и 24 часа после начала эксперимента преобладали клетки с двумя ядрами, то через 48 и 72 часа - клетки с 6-8 ядрами.

Слабую макрофагальную реакцию и активизацию клеток гистиоцитарного ряда отмечали также в селезенке витаминизированных мышей, а также животных, получивших термически обработанный антиген.

Гемопоэз на уровне красного костного мозга протекал с преобладанием красного ростка. К 48 часам происходила активация миелоидного ростка с увеличением числа бластных и переходных форм клеток. Однако к 72 часу клеточный состав костного мозга в отношении миелоидного ростка нормализовался. Витаминизация и высокотемпературная обработка на активизацию миелоидных клеток влияния не оказывала.

б) Toxocara canis

В печени уже через 4 часа после введения экстракта из T.canis регистрировали расширение и полнокровие венозных сосудов и синусоидов, особенно в центральных отделах долек. Впоследствии подобные дисциркуляторные изменения приобрели более выраженный характер и достигли максимального уровня спустя 48-72 часа. Начиная с 12 часов после начала опыта, отмечали белковую дистрофию гепатоцитов, которая просматривалась более отчетливо в периферических отделах долек. Кроме того, в разных отделах долек и в портальных трактах обнаруживали скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 24-48 часам, затем отмечали тенденцию к уменьшению их размеров и количества клеток в них.

В селезенке изменения происходили на уровне красной пульпы. Уже через 4 часа было выражено полнокровие артерий фолликулов. В субкапсулярном слое и в перифолликулярной зоне определяли наличие одиночных многоядерных гистиоцитов, их групп (через 24-48 часов). Таким образом, в печени и селезенке происходили характерные изменения, свидетельствующие о формировании адекватного иммунного ответа.

В красном костном мозге грудины отмечали активацию миелоидного и лимфоидного ростков. Тромбоцитарный росток оставался интактным на протяжении всего опыта. При гистологическом исследовании ткани семенников при относительном сохранении стратификации слоев сперматогенного эпителия отмечали угнетение сперматогенеза в отдельных канальцах, в основном, расположенных по периферии органа. В строме и наружной оболочке был выражен умеренный отек.

в) Hydatigera taeniaformis. При исследовании гистологических препаратов семенников отмечали сохранение слоев сперматогенного эпителия с наличием незначительных очагов десквамации клеток эпителия. После введения соматического экстракта гидатигеры гидропическая дистрофия клеток усилилась вплоть до образования вакуолизации цитоплазмы. Сперматогенез частично ослаблен, неравномерно выражен в разных канальцах. Через сутки после начала эксперимента в строме семенников отмечали явления отека, полнокровия, плазматического пропитывания очагового характера. Затем к концу периода наблюдений интенсивность отека несколько снизилась, однако по-прежнему сохранялось полнокровие сосудов. В печени также отмечали дисциркуляторные и дистрофические изменения. Уже через 4 часа после введения антигена в дольках появлялись мелкие скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 12 часам, а затем наблюдали только одиночные зрелые лимфоциты или мелкие группы их. К 72 часу в печени отмечали активизацию клеток РЭС. Следовательно, антигенные продукты H.taeniaformis быстро всасываются в кровь при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам и вызывают активизацию иммунной системы. Селезенка после введения экстракта гидатигеры реагировала довольно интенсивно. На фоне полнокровия органа отмечали пролиферацию гистиоцитов в различных отделах красной пульпы, а также активацию Т- и В-лимфоцитов, максимальное увеличение количества которых было выявлено уже через 12 часов и сохранялось на протяжении всего опыта. При исследовании гистологических препаратов красного костного мозга отмечали преобладание миелоидного и лимфоидного ростков. Тромбоцитарный росток оставался интактным на протяжении всего периода наблюдений. Следовательно, при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам соматического экстракта стробилы H.taeniaformis, происходит сравнительно быстрая антигенная активация основных органов детоксикационной и иммунной системы (печени и селезенки), достигающая максимального развития уже через сутки после иммунизации. Кроме того, соматические продукты данной цестоды вызывают циркуляторные нарушения в семенниках подопытных мышей и приводят к снижению сперматогенеза.

г) Diphyllobothrium latum

Под влиянием антигенов широкого лентеца клиническое состояние экспериментальных животных соответствовало норме. Патологоанатомические изменения при этом обнаруживали во всех исследованных органах. Так, в семенниках клетки находились в состоянии дистрофии и частичной десквамации. В разных группах канальцев сперматогенез был выражен умеренно, чрез 12 часов после начала эксперимента отмечали некоторое ослабление сперматогенеза. Стратификация слоев органа сохранена. Селезенка также имела признаки патологии. Красная пульпа умеренно полнокровна, фолликулы небольшие, клеточные, однако через 12 часов фолликулы становились крупными, с наличием макрофагальной реакции в периартериальной зоне. Субкапсулярно и перифолликулярно на уровне красной пульпы обнаруживали мелкие группы многоядерных элементов гистиоцитарного ряда, количество и размеры которых увеличивалось к 12 часу эксперимента.

В печени при относительном сохранении дольковой структуры синусоиды были сдавлены, малокровны. Центральные и портальные вены через 12 часов после введения антигена были или пустые или слабого кровенаполнения. Гепатоциты находились в состоянии гидропической дистрофии. В синусоидах и портальных трактах выявляли одиночные зрелые лимфоциты. Что касается красного костного мозга, то после введения антигена у мышей отмечали некоторое увеличение клеток миелоидного и лимфоидного ряда при отсутствии реакции со стороны эритроцитарного и тромбоцитарного ростков кроветворения.

Микроморфологические изменения во внутренних органах мышей после введения экскреторно-секреторного антигена Toxocara canis

Все животные во время всего периода эксперимента находились в хорошем состоянии. Под влиянием экскреторно-секреторных продуктов Т.canis происходили изменения как в структуре семенников, так и печени и селезенки лабораторных мышей.

В семенниках отмечали отек капсулы и межканальцевой стромы при сохранении строения сперматогенного эпителия. Сперматогонии и сперматобласты находились в состоянии дистрофии. Сперматогенез неравномерно выражен в разных канальцах, интенсивность его несколько снижена. Через 12 часов в семенных канальцах находятся сперматозоиды с бледно окрашенными ядрами, а вокруг самих канальцев отмечаются крупные скопления клеток воспалительного ряда (макрофаги, плазмоциты, эозинофилы, нейтрофилы). Впоследствии через 48-72 часа отмечали активизацию сперматогенеза при сохранении дистрофических процессов, однако семявыносящие протоки оставались преимущественно пустыми. Следовательно, при относительной активизации сперматогенеза он заканчивался образованием неполноценных половых продуктов.

В селезенке отмечали полнокровие красной пульпы, наличие крупных клеточных фолликулов. В красной пульпе субкапсулярно и вокруг фолликулов располагались группы моно- и полинуклеарных гистиоцитов, которые впоследствии стали преобладать. Через 12 часов после введения метаболитов T.canis отмечали оживление Т-клеточного иммунного звена. Через двое суток после введения антигена в красной пульпе появились клетки - мононуклеары с крупными гиперхромными ядрами. Максимальные изменения отмечали через 12-24 часа, затем их интенсивность снижалась, однако активацию Т-клеток наблюдали на протяжении всего периода эксперимента.

В красном костном мозге выявляли преобладание миелоидного ростка, значительное количество мегакариоцитов. В печени также были выявлены как дисциркуляторные, так и дистрофические изменения. Через 24 часа появившиеся первоначально мелкие группы зрелых лимфоцитов трансформировались в крупные, вплоть до появления очаговых лимфоидноклеточных инфильтратов. К концу периода наблюдений лимфоциты выявляли в печени единично, либо в составе небольших скоплений, что свидетельствует о стремительном развитии иммунного ответа, вызванного однократным введением продуктов метаболизма личинок Т.canis, и быстрым его угасанием. Кариопатическое действие на клетки красного костного мозга и семенников лабораторных животных соматических экстрактов и экскреторно-секреторных антигенов из: а) Anisakis simplex. Результаты исследования приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4. Частота кариопатических последствий в костном мозге мышей после введения антигена-экстракта личинок анизакид в сравнении с контролем

Примечание: % - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р ? 0,01

Таблица 5. Частота кариопатических последствий в семенниках мышей после введения антигена-экстракта личинок анизакид в сравнении с контролем

Примечание: % - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р ? 0,01

Максимальное количество митозов отмечали через 48 часов после введения подопытным животным соматического экстракта из личинок анизакид, митотический индекс составил 1,71 (контроль - 0,12). К 72 часам этот показатель снижался. Уже через 4 часа после начала эксперимента отмечали появление патологических митозов. Начиная с 4 и до 48 часов, около 30% делящихся клеток находились в состоянии многополюсного митоза. Известно, что многополюсные митозы возникают довольно легко под воздействием самых разных химических и физических факторов, особенно характерно их появление в опухолевых клетках (Алов И.А., 1972).

Наиболее часто наблюдали такую патологию митоза как образование хромосомных мостов и отставание фрагментов хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы, анэуплоидию. Особенностью кариопатического действия биопрепарата личинок анизакид является образование гигантских многоядерных клеток в красном костном мозге (многоядерных мегакариоцитов).

Также мы определяли соотношение фаз митоза в разных группах. В контрольной группе мышей митотические клетки находились в состоянии анафазы. Через 4 часа после внутрибрюшинного введения антигена анафазы составили 75,0% от общего числа митозов, и 25,0% клеток находились в профазе. Через 12 часов это соотношение не менялось, однако появились первые признаки К-митоза.

В семенниках животных после введения соматического экстракта из личинок анизакид увеличение делящихся клеток также отмечали, начиная с 4 часов, при этом количество патологий находилось на уровне 2%. Через 12 часов произошло значительное увеличение количества профаз, что свидетельствует об увеличении мейотического индекса клеток. К наиболее распространенным патологиям деления относились преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также 3-х и 4-х-полюсные анафазы.

Результаты эксперимента по определению протективного действия витаминов А и Е показали, что митотический индекс в костном мозге мышей не превышал 0,5% в течение всего периода наблюдений, но оказался выше контрольных показателей. Количество патологических митозов оказалось несколько ниже, отставания хромосом в анафазе не наблюдали. Показатели числа многополюсных и неравнополюсных митозов в период с 24 до 48 часов были снижены по сравнению с аналогичными данными, полученными в предыдущем опыте, однако через 72 часа было отмечено повышение уровней обоих процессов. Соотношение профаза-анафаза во время всего периода наблюдений смещалось в сторону последних (83,3%). Количество многоядерных клеток не отличалось от данного показателя у животных, не получавших витамины.

При введении подопытным мышам антигена анизакид, подвергнутого кипячению и СВЧ-обработке, количество патологических фигур митоза увеличивалось в 2,5 раза по сравнению с контролем, а число многоядерных клеток - в 10 раз соответственно. Количество патологий митоза при термической обработке антигена снижалось в первом случае до уровней контрольной группы, тогда как при СВЧ-обработке оно превышало этот уровень в 2,5 раза.

При микроскопии мазков-отпечатков, сделанных с семенников опытных и контрольных животных, отмечали активное деление клеток, патологические мейозы, как на стадии метафазы, так и на стадии анафазы. При этом количество делящихся клеток во всех группах животных находилось на уровне контроля, в то время как патологии мейоза встречались в первой группе подопытных животных, которым вводили антиген после заморозки, в 20 раз чаще через 24 часа после введения и в 59 раз - через 48 часов. Обработка кипячением и микроволнами снижала кариопатическое действие антигена, однако частота патологий деления клеток превышала контрольный уровень почти в 10 раз. Нарушение фигур деления клеток наиболее часто выражалось преждевременным расхождением отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсными анафазами с образованием хромосомных мостов, а также трех- и четырех-полюсными анафазами. Подобные патологии деления приводят к формированию анэуплоидных дочерних клеток, многоядерности, а также появлению ядрышек.

Количество многоядерных клеток под воздействием антигена-экстракта увеличивалось незначительно - в 1,5 раза, а при высокотемпературной обработке антигена оно не превышало показателей контроля. Появлялись гигантские клетки с количеством ядер от 2 до 9, каждое из которых, в свою очередь, находилось в состоянии деления.

Пероральное введение нематод приводило к резкому увеличению количества делящихся клеток в красном костном мозге. При этом значительное количество митозов было многополюсным.

В семенниках показатель деления сперматоцитов незначительно повышался. Среди патологических фигур деления наиболее часто отмечали преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, а также наличие многоядерных клеток. Количество патологий деления в третьей группе превысило контрольный показатель более чем в девять раз.

При исследовании морфологии клеток периферической крови экспериментальных крыс в группе животных, ежедневная доза кормления которых составила 100 личинок, были выявлены кариопатические нарушения. Около 1,5-2,5% лейкоцитов имели патологии ядра, проявляющиеся в формировании "ракеток" (лишняя Х-хромосома), бобовидные или лопастные ядра лимфоцитов, лимфоциты с эозинофильной зернистостью цитоплазмы.

При скармливании крысам мышечной ткани инвазированной рыбы также происходили кариопатические изменения. В красном костном мозге количество митозов превысило показатели контроля в 4 раза, а в 3 группе животных (более 50 личинок) - в 5 раз. Патологии деления отмечали во всех опытных группах. Как и при внутрибрюшинном введении антигена анизакид, при пероральном введении как самих личинок, так и инвазированной рыбы в красном костном мозге грызунов выявляли гигантские многоядерные клетки.

В семенниках сперматогенез был несколько снижен, при этом статистически значимое увеличение количества патологий выявлено в 3 группе, которая выражалась в появлении К-митоза и преждевременном расхождении отдельных хромосом в метафазе. Чем интенсивнее была инвазирована рыба, тем сильнее проявлялись кариопатические изменения сперматоцитов, частота которых в четыре раза превысила контрольный уровень в группе животных, получавших рыбу, содержащую более 50 личинок анизакид.

Полученные при проведении предыдущих экспериментов результаты привели к необходимости выяснить, является ли инвазированная анизакидами рыба после проведения кулинарной обработки мутагеном для клеток красного костного мозга и сперматоцитов лабораторных животных. С этой целью проводили скармливание крысам рыбы, обработанной варкой и СВЧ-лучами.

Проведенное исследование клеток красного костного мозга показало увеличение активности деления в обоих случаях, особенно при использовании вареной рыбы. В этой же группе животных было выявлено значительное увеличение количества патологий деления, которые, в основном, проявлялись в виде многополюсного митоза, реже отмечали отставание отдельных хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы с мостом, К-митоз и формирование ядрышек. Также в обеих группах лабораторных животных отмечалось увеличение количества многоядерных мегакариоцитов.

При скармливании рыбы, подвергнутой термической обработке, в семенниках крыс отмечали некоторое усиление сперматогенеза, которое происходило, в основном, за счет ана- и телофаз. При этом рыба, обработанная в микроволновой печи, практически не оказывала антимитотического действия, тогда как вареная вызывала увеличение количества патологий деления клеток почти в пять раз. В то же время оба продукта стимулировали формирование многоядерных клеток, количество которых превзошло контрольный уровень в три раза.

а) соматический экстракт из Toxocara canis

При внутрибрюшинном введении соматических продуктов T.canis костный мозг реагировал значительным увеличением митотического индкеса, которое отмечалось через 4 и 72 часа, тогда как к 12 часам количество делящихся клеток резко снизилось. В остальные периоды наблюдений митотический индекс не отличался от контрольных показателей. Следовательно, действие антигенов данного гельминта было незначительным и сопровождалось патологией деления небольшого количества клеток в виде многополюсных митозов и отставания отдельных хромосом в анафазе.

Изменения сперматогенеза проявились более выражено резким увеличением количества патологических фигур деления, которые даже спустя 72 часа превысили контрольный уровень в три раза. Среди патологических фигур были отмечены преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также трех- и четырех - полюсные анафазы, которые, однако, не привели к увеличению количества многоядерных клеток, оставшись незавершенными. Незавершенный процесс деления привел к снижению количества делящихся клеток в целом, которое проявилось через 48 часов и оставалось ниже контрольного уровня до конца эксперимента. Следовательно, соматический экстракт из токсокар оказывает более выраженное патогенное действие на сперматоциты, чем на клетки красного костного мозга.

б) метаболиты личинок Toxocara canis

Костный мозг начинал реагировать на внутрибрюшинное введение метаболитов токсокары уже через четыре часа, при этом митотическая активность повысилась в два раза по сравнению с контролем. К 12 часам активность деления клеток упала ниже показателей контрольной группы, однако через сутки она резко повысилась (в 3 раза по сравнению с контролем), а затем постепенно стала снижаться. Патологические фигуры митоза были выявлены через 4 и 24 часа, при этом их количество достигало 10% от общего числа делящихся клеток.

В семенниках активизацию деления клеток выявляли, начиная с 12 часов и до конца периода эксперимента, при этом мейотическая активность повышалась незначительно (не более 2%). В то же время патологии деления клеток отмечали на протяжении всего периода наблюдений. Количество неправильных фигур деления начинало возрастать через 4 часа после введения экскреторно-секреторных антигенов, достигало максимального показателя (в четыре раза выше по сравнению с контролем) через сутки, а к третьим суткам - приближалось к контрольному уровню.

Наиболее часто среди нарушений деления клеток, как красного костного мозга, так и семенников, отмечали многогрупповые анафазы, при которых расхождение хромосом происходит к трем и более полюсам, а также преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе. Выявленные патологии приводят к неравномерному распределению хромосом в дочерних клетках, анэуплоидии или многоядерности.

В ходе нашего эксперимента было установлено, что воздействие продуктов гельминта на костный мозг лабораторных животных происходит в два этапа. Первый этап характеризуется повышением митотической активности и количества патологий деления уже в первые 4 часа после однократного внутрибрюшинного введения биоматериала. Повреждение митотического аппарата под действием токсокар происходит на уровне клеточных центров, количество которых может увеличиваться, в результате чего митоз приобретает многополюсный характер, а также на состоянии кинетохорных микротрубочек, что проявляется в виде отставания отдельных хромосом в анафазе. Происходящие изменения приводят к снижению общего количества делящихся клеток, которое отмечается уже спустя 12 часов.

Полученные нами белковые экстракты и метаболиты являются по своему составу сложными системами, отдельные компоненты которых при введении лабораторным мышам всасываются с разной скоростью. При этом экскреторно-секреторные продукты, по-видимому, вступают во взаимодействие с ядерными структурами несколько быстрее, нежели соматические, вызывая изменения в клетках в более ранние сроки. Под воздействием метаболитов наблюдается интенсивная стимуляция деления клеток красного костного мозга без возникновения патологий, что свидетельствует о развитии адекватного иммунного ответа у экспериментальных животных.

В то же время соматический экстракт токсокар более активно вызывает патологию сперматоцитов. При делении половых клеток митотические яды или токсоиды T.canis также оказывают повреждающее действие на микротрубочки и увеличение количества клеточных центров. Под влиянием данных продуктов значительно снижается активность сперматогенеза у мышей опытных групп в результате образования анэуплоидных клеток. При однократном внутрибрюшинном введении указанные выше изменения сохраняются на протяжении не менее трех суток.

в) Hydatigera taeniaformis

Костный мозг мышей, которым внутрибрюшинно вводили соматический антиген из гидатигеры, начинал реагировать увеличением количества митозов уже через 4 часа. К 12 часам количество делящихся клеток превышало контрольный показатель уже в 4,5 раза, затем с 24 до 48 часов отмечался некоторый спад митотической активности, однако через 3 суток она снова повышалась до 0,9%, что превысило показания контроля более чем в 4,5 раза. Патологии митоза выявляли во всех опытных группах животных. При этом максимум патологических фигур деления клеток приходился на 72 часа. Наиболее часто встречали многополюсный митоз, реже - образование хромосомных мостов в анафазе и неравнополюсные анафазы. Соотношение фаз деления смещалось в сторону профаза - метафаза. Многоядерные клетки в красном костном мозге мышей отмечали через 12 и 48 часов.

Семенники мышей после введения антигена гидатигеры также реагировали. Во все периоды наблюдений, исключая 24 и 48 часов, индекс активности деления клеток находился ниже уровня показателей контроля. Количество патологий клеточного деления достигло максимума к 24 часам (почти в 6 раз выше контроля). Большинство патологических фигур приходилось на преждевременное расхождение хромосом в метафазе, отставание отдельных хромосом в метафазе, многогрупповые анафазы (по три центра деления) и неравнополюсные анафазы. Количество многоядерных клеток в семенниках опытных животных незначительно превышало показатели контрольной группы, достоверное увеличение многоядерных клеток отмечали только на вторые сутки проведения опыта.

г) Diphyllobothrium latum

В костном мозге мышей, которым вводили соматический антиген широкого лентеца, интенсивность митотического деления начала возрастать с 4 часов, в два раза превысив контрольный показатель. Максимальное количество митозов зафиксировали спустя сутки после введения антигена, а затем их количество постепенно снижалось, приближаясь в конце эксперимента к показателю контроля. Следовательно, активные антигенные компоненты дифиллоботриума с большой скоростью всасываются при внутрибрюшинном введении и вызывают сравнительно быстро развивающуюся патологию в красном костном мозге лабораторных мышей. При введении мышам антигена-экстракта из D.latum также увеличивалось количество патологических митозов в клетках лимфоидного и миелоидного ряда. Подавляющее количество патологий деления пришлось на многополюсный митоз и лишь в нескольких случаях отмечали неравномерное расхождение хромосом, а также образование хромосомных мостов во время анафазы. Указанные патологии были отмечены во все периоды наблюдений с максимальным уровнем через 24 часа.

Изменения в состоянии сперматоцитов протекали несколько быстрее. Под воздействием антигенов D.latum уже через 4 часа деление клеток активизировалось, но впоследствии, за исключением суточного интервала, этот показатель был несколько ниже контрольного уровня. В соотношении фаз отмечали сдвиг в сторону ана- и телофаз. Количество патологий деления резко повысилось с максимальным значением (в три раза выше контрольного показателя) - через 12 часов и последующим постепенным снижением, однако оставалось достаточно высоким на протяжение всего эксперимента. Наиболее часто регистрируемыми формами патологий являлись отставание, а также преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, отставание хромосом в анафазе. Значительно реже по сравнению с ними отмечались неравнополюсные и многогрупповые анафазы. Следовательно, соматические компоненты широкого лентеца влияют в первую очередь на состояние центриолярных и кинетохорных микротрубочек сперматоцитов.

При сравнении действия биопрепаратов обеих цестод на процесс деления соматических и половых клеток лабораторных мышей отмечали некоторое различие между ними. Экстракт H.taeniaformis оказывал менее выраженное, но более продолжительное действие на клетки красного костного мозга грызунов по сравнению с D.latum. В первом случае значительный подъем митотической активности клеток отмечали лишь спустя 12 часов. Этот процесс продолжался на протяжении трех суток сначала за счет увеличения количества профаз и метафаз, затем - анафаз и телофаз. Во втором случае высокий уровень митотической активности был выражен уже в первые часы эксперимента, но к 72 часам она начала ослабевать. При этом соотношение фаз сдвигалось в сторону про- и метафаз. Уровень патологических митозов при введении продуктов H.taeniaformis также оставался высоким с 12 до 72 часа эксперимента, тогда как иммунизация экстрактом D.latum вызывала пик митотических нарушений через 12 и 24 часа, а к концу периода наблюдений этот показатель пошел на спад. На фоне введения экстракта H.taeniaformis отмечали образование хромосомных мостов, что является следствием хромосомных аберраций, и неравномерное расхождение хромосом в анафазе, а также значительное количество многополюсных митозов (до четверти от количества делящихся клеток). При введении мышам препарата, приготовленным из стробилы широкого лентеца, подавляющее количество патологий митоза приходилось на формирование многополюсных митозов. Воздействие на семенники лабораторных животных под влиянием продуктов цестод также отличалось. Экстракт гидатигеры сначала подавлял, а спустя сутки после введения - незначительно стимулировал процесс деления сперматоцитов (за счет ана- и тело - фаз), при этом значительное количество патологий было выявлено с 12 до 72 часов. Биопрепарат дифиллоботриума весьма незначительно снижал активность деления клеток семенников, но вызывал резкое увеличение количества патологий уже через 4-12 часов, количество которых к концу эксперимента начало постепенно снижаться, но все же оставалось на высоком уровне. Преобладающими формами патологий деления половых клеток в обоих случаях являлись преждевременное расхождение хромосом в метафазе, образование неравнополюсных анафаз. В то же время продукты H.taeniaformis вызывали развитие многогрупповых анафаз, при этом количество центров деления равнялось 3 или 6, что свидетельствует о явлении полиплоидии. Под влиянием экстракта D.latum количество многогрупповых анафаз было незначительным, но зато отмечали отставание отдельных хромосом в метафазе. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что экстракты цестод способны вызывать разнообразные патологии деления как соматических, так и половых клеток организма хозяина. При однократном внутрибрюшинном введении лабораторным мышам продукты стробилы широкого лентеца всасываются быстро, вызывая уже в первые часы реакцию организма, которая сопровождается также формированием патологий митоза. Данный биопрепарат воздействует в основном, на клеточные центры клеток миелоидного и лимфоидного ростка, вызывая формирование многополюсных митозов. В сперматоцитах лабораторных грызунов, напротив, действие широкого лентеца повреждает аппарат микротрубочек, вызывая отставание или преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, формирование неравнополюсных анафаз, что приводит, в свою очередь, к образованию анэуплоидных сперматозоидов. Экстракт из стробилы H.taeniaformis, является многокомпонентным продуктом, который при внутрибрюшинном введении всасываются в кровь с разной скоростью, но медленнее продуктов D.latum. Воздействие экстракта гидатигеры менее выражено в отношении клеточных центров, но некоторое влияние оказывается на кинетохорные микротрубочки, что приводит к нарушению процесса расхождения хромосом в анафазе. Деление сперматоцитов под действием продуктов H.taeniaformis также нарушается, при этом помимо повреждения микротрубочек наблюдается явление полиплоидии (увеличение количества хромосом в 1,5 или 3 раза). Таким образом, наши исследования позволяют заключить, что гельминты, а также продукты их жизнедеятельности способны вызывать нарушения деления соматических и половых клеток хозяина при разных способах введения. Следовательно, наличие гельминтозной инвазии, а также кормление инвазированными пищевыми продуктами, даже прошедшими термическую обработку, нежелательно для племенных животных, беременных самок перед вязкой и вакцинацией. Так как во время проведения дегельминтизации происходит разрушение гельминтов, продукты их распада могут всасываться в кровь и вызывать кариопатологические изменения в различных клетках, то, на наш взгляд, наилучшим способом предотвращения этих последствий может служить проведение грамотной профилактики. Влияние антигенных продуктов паразитов на патологию размножения самцов - мышей. Так как проведенные исследования позволили установить, что соматические и экскреторно-секреторные продукты А.simplex обладают мутагенным действием в отношении сперматоцитов лабораторных животных и угнетают сперматогенез, было решено провести исследование оплодотворяющей способности грызунов после введения им этих антигенов и влияния их на потомство. Состояние опытных и контрольных животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода эксперимента. После отсадки самцов самки мышей оставались интактными в течение 20 дней, после чего их эутаназировали эфиром и извлекали матку с плодами. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 8. Гистологические исследования позволили выявить, что в опытных группах мышей и плоды и плаценты по своему строению являлись незрелыми, гипотрофичными, тогда как в контрольной группе регистрировали доношенную беременность с нормальным развитием плодов.

Таблица 8. Патологии эмбрионального развития плодов мышей после иммунизации самцов антигенами анизакид

Примечание: * - Р ? 0,05, статистически достоверная разница по сравнению с контролем

В результате оплодотворения яйцеклеток интактных самок сперматозоидами, имеющими кариопатические изменения, формируются нежизнеспособные эмбрионы, что является следствием патологии кариотипа. Изменения в организме выживших эмбрионов приводят частично к их гибели уже после имплантации, а также к замедлению, как эмбриогенеза самого плода, так и формирования плаценты. Таким образом, наши исследования подтверждают тот факт, что продукты жизнедеятельности гельминтов вызывают патологии сперматогенеза, что отрицательно сказывается на последующем эмбриогенезе.

Аллергенное действие замороженных личинок анизакид и инвазированной рыбы на лабораторных животных

Во время проведения эксперимента общее состояние опытных животных оставалось удовлетворительным. Известно, что одним из важнейших клинических признаков аллергии является эозинофилия периферической крови. Количество эозинофилов крови крыс перед началом проведения опыта колебалось в пределах 0-2%, что соответствует физиологической норме. В крови крыс, которые ежедневно получали 100 личинок A.simplex, уже на третий день количество эозинофилов поднималось до 3-5%, на пятый - достигало уровня 7%, однако к десятому дню этот показатель не превышал 2-3%.

Во второй группе животных (доза личинок - 50 экз. на голову) изменения в картине крови были менее выраженными. На третий и пятый день опыта количество эозинофилов не превышало 3-4%, а к десятому дню этот показатель снизился до нормальных пределов. Что касается контроля, то у этих животных уровень эозинофилов оставался в пределах нормы на всем протяжении опыта. Остальные клинические показатели крови не отличались от нормы и контрольного уровня.

Биохимическое исследование крови крыс показало статистически значимое повышение уровней общего белка, а также АлАТ и АсАТ в крови животных второй и третьей групп. Кроме того в данных пробах крови выявляли незначительное увеличение креатинина и щелочной фосфатазы. Что касается остальных биохимических показателей, то они оставались без изменений по сравнению с контролем. Показатели крови крыс контрольной группы оставались в пределах физиологической нормы.

Таким образом, при продолжительном скармливании лабораторным крысам нежизнеспособных личинок анизакид происходят изменения в морфологическом и биохимическом составе периферической крови, что подтверждает их кариопатическое и аллергическое действие. Сдвиг биохимических показателей крови свидетельствует о нарушении тканевого обмена и развитии патологических процессов в печени лабораторных животных, что подтвердилось в результате дальнейшего гистологического исследования, которое позволило выявить наличие изменений и в состоянии печени и, особенно, тонкого кишечника подопытных животных.

Исследования показали, что патологические изменения в состоянии тонкого кишечника экспериментальных животных происходили уже при скармливании 5 личинок. В слизистой оболочке кишечника наблюдали небольшой отек стромы, полнокровие сосудов, отдельные лимфоциты или их небольшие группы, в подслизистом слое также отмечали наличие незначительного отека.

С увеличением дозы введенных личинок до 10 и 25 к указанным выше изменениям присоединялись увеличение количества бокаловидных клеток и гиперсекреция слизи. В строме слизистой оболочки выявляли группы зрелых лимфоцитов с примесью макрофагов и эозинофилов, которые с увеличением дозы скармливаемых личинок также становились крупнее. При дозе в 50 личинок кишечные ворсинки становились более рыхлыми, извитыми, в строме - отек и наличие крупных групп лимфоцитов и плазматических клеток с примесью макрофагов и эозинофилов. Также незначительный отек отмечали в подслизистом слое.

Наиболее выраженные изменения происходили в кишечнике крыс, получавших ежедневную дозу в 100 личинок анизакид. Слизистая оболочка отечна, эпителий верхушек ворсинок десквамирован. В строме - диффузные скопления зрелых лимфоцитов и плазмоцитов, а также довольно большого количества эозинофилов. В подслизистом слое выражен отек, полнокровие сосудов, явления плазморрагии. Данные изменения соответствуют катаральному энтериту с аллергическим компонентом .

При гистологическом исследовании соответствующих органов контрольных животных подобных изменений не отмечали. Таким образом, нежизнеспособные личинки рода Anisakis и продукты их жизнедеятельности, сохраняющиеся в свежемороженой рыбе, вызывают в кишечнике лабораторных животных развитие катарального аллергического энтерита.

При попадании в тонкий кишечник соматические и экскреторно-секреторные продукты нежизнеспособных личинок частично подвергаются перевариванию до отдельных аминокислот, однако при развитии энтерита и десквамации эпителиальных клеток процесс переваривания становится невозможен, в связи с чем данные продукты нематод всасываются в кровь и разносятся по организму. Одним из основных органов, отвечающих за процессы детоксикации, является печень, которая первая реагирует на воздействие паразитов. Уже при дозе в 5 личинок в печени регистрировали в разных отделах долек и перипортально одиночные зрелые лимфоциты. При сохранении дольковой структуры обнаруживали умеренно выраженную белковую дистрофию гепатоцитов. Синусоиды бедны кровью, вены расширены, неравномерного наполнения.

Увеличение дозы личинок постепенно привело к выраженной белковой дистрофии гепатоцитов, формированию сначала мелких, затем более крупных скоплений лимфоцитов. Также отмечались изменения со стороны сосудистого русла в виде расширения вен. Характерной особенностью воздействия продуктов личинок анизакид явилось и то, что гепатоциты имели 1-2 ядрышка и крупные ядра с глыбчатым распределением хроматина. При дозе в 100 личинок наблюдали гиалиново-капельную или гидропическую дистрофию гепатоцитов. Также выявляли гигантские многоядерные клетки. Дифференциальная окраска виментином, который специфически окрашивает гепатоциты, и S-100, окрашивающим гистиоцитарные элементы, позволила определить их как многоядерные гистиоциты.

В селезенке отмечали полнокровие красной пульпы, крупные клеточные фолликулы. Субкапсулярно и перифолликулярно обнаруживали скопления многоядерных гистиоцитов, которые с увеличением дозы введенных личинок постепенно увеличивались. Таким образом, соматические и метаболические продукты личинок Anisakis simplex, являясь сильными антигенами, вызывают пролиферацию клеток ретикуло-эндотелиальной системы в печени и селезенке лабораторных животных.

При исследовании тканей семенников отмечали относительное сохранение структуры органа, незначительный отек и полнокровие сосудов стромы. Сперматогенез был выражен слабо в разных канальцах, хвостовые отделы сперматозоидов часто были в состоянии агглютинации. Уже при дозе 5-10 личинок наблюдали частичную дистрофию и десквамацию сперматогенного эпителия. При дозе в 50 личинок эпителий семявыносящих протоков имел признаки атрофии, сами протоки - кистозно расширены.

У крыс, получавших мясо рыбы в разной степени инвазированной личинками анизакид выраженных изменений в клеточном и биохимическом составе крови не наблюдали. Однако по истечении срока эксперимента в различных органах данных животных отмечали характерные гистопатологические изменения. При скармливании рыбного фарша патологические изменения тканей тонкого кишечника также присутствовали, причем степень выраженности патогистологических изменений соответствовала степени инвазированности рыбы личинками анизакид. Если при скармливании фарша, приготовленного из путассу, содержащей менее 10 личинок, обнаруживали лишь отек слизистой оболочки и подслизистого слоя с наличием в апикальных отделах ворсинок одиночных зрелых лимфоцитов или их мелких групп, то зараженность рыбы 10-50 личинками вызывала уже и увеличение количества бокаловидных клеток и формирование в строме слизистой оболочки и подслизистого слоя полиморфных клеточных инфильтратов с примесью значительной доли эозинофилов. Наиболее высокая зараженность рыбы (более 50 личинок) вызывала изменения, соответствующие катаральному энтериту с десквамацией эпителия апикальной части ворсинок, формированием диффузных инфильтратов из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов. В строме стенки желудка также были обнаружены одиночные зрелые лимфоциты - клетки иммунной системы.

Печень как основной орган детоксикации пищеварительной системы также реагировала появлением в разных отделах долек и портальных трактах при слабой степени инвазии рыбы - единичных лимфоцитов, при увеличении интенсивности инвазии - мелких групп лимфоцитов и макрофагов. Также присутствовали признаки дисциркуляторных изменений в виде переполнения кровью и расширения венозных сосудов. При дозе до 50 экз. в гепатоцитах выявляли гидропическую, более 50 - гиалиново-капельную и вакуольную дистрофию и наличие мелких жировых вакуолей.

В красной пульпе селезенки выявляли полнокровие, под капсулой и вокруг фолликулов располагались отдельные гистиоциты с крупными ядрами. В центральных отделах долек была заметна макрофагальная реакция. При ИИ рыбы более 50 личинок в селезенке крыс отмечали густые скопления зрелых лимфоцитов.

Некоторые изменения происходили и в семенниках животных. При сохранении сперматогенеза отмечались его неравномерность в различных канальцах, десквамацию клеток в просветы, дистрофические изменения. Сперматозоиды зачастую имели слабоокрашенные ядра. С увеличением степени зараженности рыбы сперматогенез был угнетен, отдельные канальцы оказывались полностью запустевшими.

Таким образом, всасывающиеся из кишечника белковые продукты личинок Anisakis оказывают токсическое действие, проявляющееся пролиферативными изменениями в органах ретикуло-эндотелиальной системы, а также угнетением сперматогенеза. Интенсивность данных изменений напрямую зависит от интенсивности поражения рыбы личинками.

Морфологические изменения в органах крыс после скармливания обработанной в микроволновой печи, а также вареной инвазированной рыбы также присутствовали, однако были менее выраженными, нежели в группе животных, получавших свежемороженую рыбу. Так в семенниках сперматогенез оставался относительно сохраненным, с незначительными признаками дистрофии. В печени обнаруживали некоторые дисциркуляторные изменения, наличие одиночных зрелых лимфоцитов. Более выраженные изменения наблюдали в селезенке в виде полнокровия красной пульпы, активации Т и В-зависимых зон и клеток гистиоцитарного ряда. В стенке кишечника на фоне отека и инфильтрации клетками лимфоплазмоцитарного ряда установили увеличение количества эпителиоцитов в состоянии митоза, которое свидетельствует о процессах активного восстановления органа. В кишечной стенке присутствовали также и эозинофилы, но несколько в меньшем количестве по сравнению с использованием свежемороженой рыбы. Следовательно, кулинарная термическая обработка не исключает развития иммунологических и аллергических реакций при скармливании животным инвазированной личинками анизакид рыбы.

Эмбриотоксическое действие личинок агнизакид при экспериментальном пероральном введении лабораторным животным

Во время проведения эксперимента общее состояние опытных животных оставалось удовлетворительным. Количество эозинофилов крови крыс перед началом проведения опыта колебалось в пределах 0-2%, что соответствует физиологической норме. Через три дня после инокуляции личинок изменений в клеточном составе крови не отмечали. Через пять дней количество эозинофилов увеличилось до 3-4%, однако к 10 дню вернулось к исходной точке. Что касается крыс первой группы, а также контроля, то у них уровень эозинофилов не превышал нормы на всем протяжении опыта.

При инокуляции самкам крыс нежизнеспособных личинок во всех использованных дозах в 1-2 дни беременности отмечали 100%-ную эмбриональную смертность. При гистологическом исследовании в яичниках животных обнаруживали желтые тела, иногда кистозно измененные, в матке - отек тканей и образование кист дна измененных маточных желез. Количество желтых тел было значительно меньше (3-4) по сравнению с контролем (8-9).

Пероральное введение личинок анизакид на 7-8 и 13-14 сутки беременности вызывало изменения в состоянии половых желез, а также плодов и плацент. При однократном введении личинок в сроки 13-14 дней в яичниках отмечали множественное образование кист. В плаценте отмечали более интенсивные изменения: цитоплазма децидуальных клеток имела ярко выраженную эозинофильную зернистость, полиморфные, местами уродливой формы, гиперхромные ядра иногда с наличием 1-2 ядрышек, отмечались острые нарушения фето-плацентарного кровообращения.

Кроме этого, отмечали значительное уменьшение размеров плода и плаценты, напрямую зависящее от дозы введенных личинок анизакид, на фоне высокого показателя постимплантационной смертности. При исследовании органов плодов отмечали нарушения микроциркуляции крови в органах.

Иммунохимический анализ соматического экстракта A.simplex

Соматические экстракты гельминтов разных видов не однородны по антигенному составу и являются многокомпонентными системами. Установлено, что разные виды гельминтов могут иметь общие антигенные компоненты, которые затрудняют специфическую диагностику. Для определения антигенного состава различных продуктов гельминтов и выявления наличия в них идентичных компонентов используется реакция иммунодиффузии (РИД).

В результате проведения РИД мы установили, что полученные нами экстракты личинок анизакид (АГ1 и АГ2) являются антигенами, способными вызывать преципитацию с гипериммунными сыворотками кроликов. Все три пробы сыворотки иммунизированных животных оказались достаточно активными как в нативном состоянии, так и в разведении 1/1. Тем не менее, сыворотка крови одного животного реагировала с гомологичными антигенами в разведении 1/8, что свидетельствует об индивидуальном активном иммунном ответе данной особи.