Молекулярні механізми взаємодії біомолекул з наноструктурами, лігандами та малими дозами мікрохвильового та радіаційного випромінювання

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н.КАРАЗІНА

УДК 577.32:535.34:541.65/.654

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ВЗАЄМОДІЇ БІОМОЛЕКУЛ З НАНОСТРУКТУРАМИ, ЛІГАНДАМИ ТА МАЛИМИ ДОЗАМИ МІКРОХВИЛЬОВОГО ТА РАДІАЦІЙНОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

ДОВБЕШКО Галина Іванівна

Харків 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізики НАН України.

Офіційні опоненти:

- член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, заступник директора з питань науки, завідувач відділу молекулярної та квантової біофізики (м. Київ);

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Косевич Марина Вадимівна, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної біофізики (м. Харків);

- доктор фізико-математичних наук, професор, Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків).

Захист відбудеться " 27_"_, березня 2009 року о _15.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий "_25_"_лютого__2009 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки внаслідок активного розвитку біонанотехнологій велика увага приділяється дослідженню молекулярних механізмів взаємодії біологічних макромолекул з низкою зовнішніх та внутрішніх чинників. Зокрема, структура та конформаційні стани біологічних молекул змінюються при взаємодії з лігандами (малими молекулами, що взаємодіють з дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК) та білками шляхом утворення валентних або невалентних зв'язків), наночастинками та електромагнітними полями. Механізми дії протипухлинних препаратів на ДНК та мембрани в модифікованих протипухлинними препаратами клітинах та трансформація пухлинних тканин у резистентні, на які не діють протипухлинні ліки, на сьогодні не з'ясовані, попри те, що вони є важливими у медицині. Вплив мікрохвильових полів (мобільні телефони, мікрохвильові пічки тощо) на людину і досі є предметом наукових дискусій.

Іншими важливими чинниками, що діють на структуру біологічних макромолекул, є різного типу наноструктури. Можливість використання наноструктур для керування оптичними властивостями біомолекул при їхній взаємодії з металічними, вуглецевими, оксидними наноструктурами привертає неабияку уваги дослідників через те, що, змінюючи розмір, геометрію та природу наноструктур можна впливати на властивості (зокрема оптичні) біологічних молекул, розміщених поблизу цих наноструктур або приєднаних до них. Зокрема, вуглецеві наноструктури, до яких відносяться різного роду фулерени, нанотрубки, наноалмази вже достатньо широко досліджуються матеріалознавцями, біофізиками, медиками і хіміками як матеріали майбутнього при створенні систем доставки ліків нового покоління, сенсорів різного типу біохімічних реакцій, речовин, взаємодій, для моніторингу довкілля, тощо.

При дослідженні структури та ідентифікації молекул в експериментах з клітинами, вірусами, нуклеїновими кислотами (НК), білками, ліпідами виникають певні обмеження на застосування традиційних методик, що вимагає специфічних підходів і методів визначення біологічних молекул та їхніх конформаційних станів. Це в основному пов'язано з недостатньою кількістю досліджуваної речовини, з якою змушені працювати біологи, біофізики та біохіміки. Тому для ідентифікації малої кількості біологічних молекул та структурних змін у них запропоновано використовувати властивості наноструктур і на цій основі створити новий науковий підхід та метод, що дозволять досягти підсилення наноструктурованою металічною і неметалічною поверхнею оптичних сигналів від адсорбованих на цих поверхнях молекул. Розробка фізичних принципів та чутливих методів на основі застосування наноструктур дає можливість збільшити ймовірність інфрачервоних (ІЧ) переходів, підсилити слабку люмінесценцію, досягти гігантських сигналів у комбінаційному розсіянні світла, завдяки чому зареєструвати ряд спектральних проявів структурних особливостей біомолекул та вивчити молекулярні механізми їхньої взаємодії з наноструктурами, лігандами, мікрохвильовим та іонізуючим випромінюванням, що має фундаментальне значення для розуміння молекулярної природи живого.

У зв'язку з цим постають нагальні питання, актуальні для біофізики: як взаємодіють біологічні молекули з металічними та неметалічними наноструктурами; чи змінюються при цьому конформаційні стани основних біологічних полімерів; які методи краще використовувати для дослідження та адсорбції біологічних молекул на металічні та вуглецеві наноструктури; як досягти високої ефективності оптичних процесів в біологічних молекулах, приєднаних до наноструктур; якими методами можна ефективно характеризувати біологічні молекули на наноструктурах; як краще приєднувати біологічні молекули до наноструктур; як і які характеристики металічних та неметалічних наноструктур впливають на структуру та властивість біологічних молекул. Розв'язанню саме цих задач присвячена дана робота. Крім цього, в роботі приділяється значна увага вивченню молекулярних механізмів взаємодії біологічних молекул з лігандами, впливу малих доз іонізуючого випромінювання на конформаційні стани ДНК та малих доз мікрохвильового випромінювання на модельні біологічні молекули, що дало можливість випробувати та відпрацювати запропоновані нові спектральні методики та прояснити деякі біофізичні аспекти онкогенезу, а саме - молекулярні механізми взаємодії клітин з ліками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до планів наукової діяльності відділу фізики біологічних систем Інституту фізики НАН України в межах тем: “Дослідження фізичних властивостей і механізмів функціонування біологічних молекул та утворених ними структур” (1.4.1.В/27, 1995-1998 рр.); “Експериментальне та теоретичне дослідження фізичних механізмів функціонування біологічних макромолекул та їх комплексів в нерівноважних умовах та під дією зовнішніх чинників” (№ Держреєстрації 0199U000657, 1999-2001 рр.); “Дослідження структурних особливостей та нелінійної динаміки біологічних макромолекул та утворених ними структур” (№ Держреєстрації 0102U000596, 2002-2004 рр.); “Дослідження фізичних принципів структурної організації та динамічної поведінки біологічних макромолекул” (№ Держреєстрації 0105U001136, 2005-2007 рр.); “Дослідження фізичних властивостей і структурної динаміки біомакромолекул та нанокомплексів на їх основі” (№ Держреєстрації 0108U000253, 2008-2012 рр.).

Робота отримала підтримку: Державного фонду фундаментальних досліджень за проектом “Теоретичне та експериментальне вивчення діелектричних властивостей біологічних систем у міліметровому та субміліметровому електромагнітному полі” (№2/3 303, 1994-1996 рр.); Міністерства вищої освіти Польщі за сумісним польсько-українським проектом “Study of microwave radiation upon biological molecules” (1999-2000 рр.); сенсорної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій” за проектом “Детектування малих кількостей біологічних молекул та їх конформацій на основі ефекту підсилення оптичних сигналів” (№ Держреєстрації 0103U007306, 2003-2006 рр.); цільової комплексної програми “Фізичні та астрофізичні дослідження фундаментальних проблем будови і властивостей матерії на мікроскопічному та макроскопічному рівнях” за проектом “Електронні та іонні процеси в біологічних об”єктах та органічних напівпровідниках” (№ Держреєстрації 0102U007063, 2002-2006 рр.); програми “Наноструктурні системи, наноматеріали, нанотехнології” об'єднаного проекту “Застосування наноматеріалів в біології та медицині”, Розділ 2 “Вивчення властивостей та створення наноматеріалів на основі комплексів біомолекул з вуглецевими нанотрубками” (№ Держреєстрації 0107U008449, 2007-2009 рр.); цільової програми НАН України ВЦ-138 “Нанофізика квантоворозмірних та низьковимірних структур, у тому числі на поверхні твердого тіла, в металоорганічних, полімерних та рідкокристалічних системах, молекулярна наноелектроніка” (№ Держреєстрації 0107U002165, 2007-2011 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є встановлення молекулярних механізмів взаємодії біомолекул з металічними та вуглецевими наноструктурами, лігандами (протипухлинними препаратами, барвниками), низькоінтенсивним іонізуючим та неіонізуючим випромінюванням в експериментах in vitro та in vivo.

Для досягнення поставленої мети розв'язувалися наступні задачі:

- розробка нового методу Фур'є-ІЧ спектроскопії для реєстрації малої кількості біологічних молекул та визначення їхнього конформаційного стану;

- створення наноструктурованих металічних підкладинок для отримання максимального підсилення ІЧ сигналів біологічних молекул;

- розробка методики для ідентифікації пухлин та вірусів, визначення дії лігандів на ДНК, тестування резистентності та чутливості пухлин на основі спектроскопії SEIRA (surface enhanced infrared absorption - підсилення ІЧ-поглинання поверхнею) та методу головних компонент;

- виявлення молекулярних особливостей структурних пошкоджень НК, що виникають як результат взаємодії іонізуючого випромінювання та лігандів (протипухлинних препаратів, барвників) з ДНК ( ліпідами);

- створення фізичної моделі взаємодії лігандів з біомолекулою;

- дослідження молекулярних механізмів впливу слабкого електромагнітного випромінювання на оптичні властивості біологічних молекул та розрахунки діелектричної проникності модельних кристалів в середній і далекій ІЧ та міліметровій областях спектру;

- визначення впливу міжмолекулярної взаємодії на конформаційні стани ДНК та білків в комплексі з вуглецевими та металічними наноструктурами;

- квантово-хімічні розрахунки геометрії та енергії стабілізації комплексів фрагмент ДНК-нанотрубка.

Об'єкт дослідження - структура та коливальні моди біомолекул (амінокислот, ДНК, білків, ліпідів), які збурені адсорбцією на наноструктури та дією електромагнітних полів і лігандів.

Предмет дослідження - молекулярні механізми взаємодії біологічних молекул з електромагнітними полями, наночастинками різної природи та лігандами. нанотрубка інфрачервоний спектроскопія молекула

Для розв'язання поставлених задач використано сучасні чутливі експериментальні і розрахункові методи: для вивчення конформаційного стану молекул, молекулярної та кристалічної структури використанно методи Фур'є- спектроскопії - ІЧ -поглинання, відбивання і підсилене металевою поверхнею ІЧ-поглинання, поляризаційне ІЧ-відбивання, комбінаційне розсіяння світла. Для визначення дипольних моментів молекул у плівці Ленгмюра-Блоджет використано техніку Ленгмюра-Блоджет. Для визначення змін показника заломлення при упаковці шару молекул, адсорбованих на металічній поверхні в мікрохвильовому полі використано поверхневий плазмонний резонанс. Для розрахунку діелектричної проникності монокристалів амінокислот задіяна дисперсійна модель невзаємодіючих осциляторів. Для розрахунку енергії коливальних переходів і зміщень атомів при утворенні водневого зв'язку, а також енергії зв'язку фрагментів ДНК з нанотрубками використано напівемпіричні та неемпіричні квантово-хімічні методи AM1, MNDO, PM3, DFT, ab initio. Для характеристики ДНК і РНК використано ультрафіолетову (УФ) спектроскопію та гель-електрофорез. Для візуалізації дії мікрохвильового поля на біологічні молекули проведено експерименти на голографічному інтерферометрі. Для обробки спектрів, а саме - визначення правомірних відмінностей застосовано алгоритм нейронних мереж та метод головних компонент. Набір запропонованих методів прийнятно описує структуру, конформаційні стани та міжмолекулярні взаємодії біологічних молекул і властивості наноструктур.

Наукова новизна отриманих результатів. При виконанні дисертаційної роботи вперше було отримано експериментальні та розрахункові результати, які можна сформулювати у вигляді наступних положень:

1. Вперше розроблено та застосовано методику SEIRA для детектування малих кількостей біологічних молекул та моношарів, доведено можливість її застосування для характеризації типу біологічних молекул та їхніх конформаційних станів.

2. Проведено систематичне дослідження впливу низки факторів (типу та топології поверхні, способів осадження, структури молекул) на підсилення ІЧ-поглинання молекул, адсорбованих на поверхню металу, що дало можливість вперше отримати незбурені підсилені (у 3-15 разів) ІЧ-спектри біологічних молекул на шорстких поверхнях металу.

3. Зареєстровано значне підсилення ІЧ-поглинання (порядку 100) для близьких до мономолекулярних тонких шарів бичачого сироваткового альбуміну (БСА).

4. Розроблено алгоритм визначення конформаційного стану ДНК на основі спектроскопії SEIRA і методу головних компонент та вперше його застосовано до ДНК, екстрагованих з вірусів та пухлин.

5. Розроблено методичний підхід щодо визначення пошкоджень в ДНК та РНК на основі ІЧ- фур'є спектроскопії та методу нейронних мереж.

6. Вперше досліджено та сформульовано спектроскопічні ознаки пухлинної РНК та ДНК, що є відображенням структурних змін в цих молекулах в результаті їхньої взаємодії з численними зовнішніми та внутрішніми чинниками.

7. Вперше зареєстровано суттєві відмінності в структурі ДНК та фосфоліпідів з тканин чутливих та резистентних штамів пухлин, досліджених до та після дії протипухлинних препаратів цис-платини та доксорубіцину в експериментах in vivo.

8. Запропоновано модель взаємодії лігандів з клітиною, яка включає: а) взаємодію ліганда з мішенню; б) модифікацію мішені; в) модифікацію ліганда при проходженні через мембрану та при взаємодіях у клітині.

9. Виявлено, що в результаті дії на ДНК слабких доз (1-57 сГр) радіаційного опромінення виникають початкові пошкодження її структури, які призводять до її локального розупорядкування.

10. Встановлено ефект дії низькоінтенсивного мікрохвильового випромінювання на діелектричні характеристики амінокислот (a-гліцину, b-аланіну), білків, плазми крові.

11. Встановлено особливості взаємодії ДНК та її фрагментів з нанотрубками, наночастинками золота, визначено конформаційні стани ДНК при взаємодії з наноструктурами, а також їхні місця зв'язування та енергетичні параметри. Вперше застосування спектроскопії SEIRA дало можливість охарактеризувати конформації комплексу ДНК-наноструктура.

12. Вперше визначено конформаційний характер змін в молекулах альбуміну при їхній взаємодії з одностінними вуглецевими нанотрубками (ВНТ) та наночастинками золота.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати можна застосовувати в медицині, молекулярній біології, фармакології при використанні протипухлинних препаратів і вивченні їхніх молекулярних механізмів дії, що адаптовано до реальних умов у клітині in vivo.

Розроблена методика визначення конформаційних станів біополімерів за допомогою наноструктурованої металічної поверхні, яка може ефективно застосовуватись в біохімії.

На основі результатів спектроскопічних досліджень НК з пухлинних тканин і алгоритму нейронних мереж та (або) методу головних компонент можуть бути створені діагностичні методики для визначення злоякісних пухлин, вірусів, резистентності тканин.

Запропонована в роботі методика створення біологічних наноструктур на золотій шорсткій поверхні може бути використана для чутливого детектування та подальшого моделювання станів біомолекул в живій клітині.

Отримані дані по визначенню впливу різних по природі протипухлинних препаратів на ДНК і ліпіди із чутливих і резистентних штамів та впливу барвників на ДНК в експериментах in vivo дають можливість прояснити окремі аспекти молекулярних механізмів резистентності та відмінності у взаємодії в експериментах in vivo та in vitro.

Запропоновано модель взаємодії лігандів з біологічними молекулами, що може надати поштовх для збільшення ефективності при тестуванні нових ліків.

Низка експериментів на різних моделях демонструє поляризаційний характер дії малих доз мікрохвиль на біологічні молекули та підтверджує факт дії і зміни в структурі біомолекул, що може бути використано для керуванням властивостями біомолекул або кристалів на їхній основі.

Розроблено наноструктуровані золоті поверхні, що ефективно використовуються у відділі фізики біологічних систем ІФ НАН України на протязі останніх 10 років як ефективні, дешеві підкладинки для вимірювання спектрів речовин в ІЧ діапазоні.

Особистий внесок здобувача полягає в ініціюванні, постановці, розв'язанні серії задач з моделювання та проведення експериментів in vitro та in vivo, при вивченні структурних перебудов в біологічних молекулах, що адсорбовані на наноструктури, під дією слабоінтенсивних електромагнітних полів, при порушенні метаболізму в клітині та при дії протипухлинних препаратів. Автору належить вибір методів досліджень, участь в проведенні експериментів, обговоренні результатів та написанні статей. Результати в роботах [1-5, 7, 9, 11] отримано самостійно, в роботах [6, 8, 10, 12-35] під науковим керівництвом здобувача. В опублікованих разом зі співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1-5, 7, 9, 11] - самостійно отримані всі експериментальні результати, проведений їх аналіз та інтерпретація, участь в обговоренні, написання наукових статей;

- у роботах [12, 13, 15, 23, 35] - постановка задачі, вибір експериментальних методів, участь в обговоренні та інтерпретації результатів, формулюванні висновків;

- у роботах [6, 8, 10, 27] - участь в постановці задачі, аналізі літературних джерел, у проведенні вимірювань, в обробці експериментальних даних та обговоренні отриманих результатів, написання статей;

- у роботах [14, 16, 18-22, 24, 26, 28, 30-34] - постановка задачі, розробка плану біофізичного експерименту, аналіз літературних джерел, підбір методів обробки результатів, участь у проведенні експериментів, аналіз та обговорення отриманих результатів, узагальнення результатів, формулювання основоположних висновків та написання статей;

- у роботах [17, 25, 29] - участь у формулюванні задач дослідження та висновків, участь у проведенні експериментів, обговоренні та інтерпретації результатів, написання статей.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної праці були представлені та доповідалися на: Мiжн. конф. з оптичноi спектроскопiї (1988 Айзенах, Німеччина); VII, VIII, IX, X, XI, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII школах-семінарах зі спектроскопїї молекул та кристалів (1987 Полтава, 1989 Тернопіль, 1991 Cуми, 1993 Чернігів, 1995 Харків, 1997 Суми, 1999 Одеса, 2001 Чернігів, 2003 Севастополь, 2005, 2007 Берегове; Україна); Мiжн. конф. з металевих йонiв в бiологiчних системах (1994 Флоренцiя, Італія), Мiжн. конф. з водневого зв'язку (1995 Вiльнюс, Литва); Мiжн. конф. з водневого зв'язку (1996 Meнджиздрує, Польща); ХІ Міжн. спектроскопічному колоквіумі (1999 Анкара, Турція); Конференції біофізичного товариства, присвяченій пам'яті О.Сєрікова (1999 Київ, Україна); Specialized International Colloque Ampere “Molecular Dynamics and Phase Transition” (1999 Vilnius, Lithuania); XIII, XIV, XY Conference “Horizons in Hydrogen Bond Research” (1999 Wroclaw, Poland, 2000 Vilnius, Lithuania; 2001 Torino, Italy); International Conference on DNA conformation, Modification and Recognition in Biomedicine (2000 Brno, Czech Republic); “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (2000 Київ, Україна); Conference “Chemistry and Physics of Mulitfunctional Materials” (2001 Acquafredda di Maratea (near Naples), Italy); ХIХ, XXV та XXVI Європейських конгресах з молекулярної спектроскопії (1989 Дрезден, Німеччина; 2000 Коімбра, Португалія; 2002 Lille, France); Мiжн. конф. з електромагнiтної сумiсностi (1992 Вроцлав, Польща); конференція з нелінійної оптики рідких і фоторефрактивних кристалів (1997, 2000, 2002 Алушта, Крим); Міжн. конф. з фiзики та хiмiї багатофункцiональних матерiалiв (2001 Маратеа, Італія); 1 and 2 EURESCO Conference, «Molecules of Biological Interest in the Gas Phase», (2000 des Houches,. France, 2002 Wildbad Kreuth, Germany); Першій російсько-українсько-польській конференції з молекулярних взаємодій (2001 Гданськ, Польща); Осінній школі NATO “Горизонти молекулярної структури та технології фулеренів, нанотрубок, наносиліконів, мультифункціональних наносистем та біополімерів (ДНК, протеїни)” (2001 Київ, Україна); Frontiers in Molecular-Scale Science and Technology of Nanocarbon, Nanosilicon and Biopolymer Integrated Nanosystems. NATO Advanced Research Workshop Summer School (2003 Ilmenau, Germany); ІІІ-му та IV-му з'їздах Українського біофізичного товариства, (2002 Львів; 2006 Донецьк, Україна ); 4, 5, 8 International Young Scientists Conference “Problems of optics and high technology material science (SPO)” (2003, 2004, 2007 Київ, Україна); 9-й Міжн. конференції “Фізика і технологія тонких плівок” 2003 Івано-Франківськ, Україна); II, ІІІ, IV Межд. симпозиуме “Фуллерены и фуллереноподобные структуры в кондесированных состояниях” (2002, 2004, 2006 Минск, Белоруссия); Second international symposium “Shedding new light on disease. Optical diagnostics for the new millenium” (2002 Reims, France); Faraday Discussion (2003 Nottingham University, England); Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (2004 Харків, Україна); Міжн. науково-технічній конференції “Сенсорна електроніка і мікросистемні технології” (СЕМСТ-1, СЕМСТ-2), (2004, 2006 Одеса, Україна); 5, 9, 11-th European conference “Spectroscopy of Biological molecules” (ECSBM) (1993 Лутраки, Греція; 2001 Praque, Chech Republic; 2005 Aschaffenburg, Germany); VII-th, VIII-th IX-th International Conference on Molecular Spectroscopy (2003, 2005, 2007 Wroclaw, Poland); II-th, III-th Internation conferences on Hydrogen bonding and Molecular Interactions (2004 Moscow, Klyaz'ma, Russia; 2006 Kyiv, Ukraine); 3-ей, 4-ой Межд. конференции “Углерод: фудаментальные проблемы науки, материаловедение, технология” (2004, 2005 Москва, Россия), The 5-th porous semiconductors - science and technology, (2006 Sitges, Barcelona, Spain); VII Межд. семинаре “Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии” (2006 Минск, Белоруссия; XIV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (2008 Челябинск, Россия).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані в 84 роботах, у тому числі - в 35 статтях у наукових зарубіжних та вітчизняних фахових журналах та в 49 тезах доповідей на міжнародних і національних наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, шести розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 419 стор., вона містить 138 рисунків, з них 37 на окремих сторінках, 28 таблиць, з них 8 на окремих сторінках. Перелік використаних літературних джерел - 465 найменувань на 51 сторінці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету та перелічено задачі, що необхідно розв'язати для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих дисертантом результатів, наведено загальну структуру дисертації.

У розділі 1 проведено огляд літератури. Представлено структури тих молекул, що вивчаються. Зроблено огляд механізмів дії іонізуючого випромінювання на структуру ДНК та її складових, проаналізовано типи можливих структурних пошкоджень. Зазначено, що реакція організму на опромінення має системний характер і включає в себе як наслідки прямого влучання іонізуючого випромінювання в мішені, якими є молекули НК, так і взаємодії з продуктами радіолізу компонент клітини. Особлива увага звертається на дію слабких доз іонізуючого опромінення та відзначається їхня можлива роль у процесах канцерогенезу. Проаналізовано роботи, в яких йдеться про те, що структура ДНК в пухлинній клітині може відрізнятися від ДНК здорової клітини. Згідно з мутаційною теорією канцерогенезу геном пухлинної клітини характеризується наявністю мутацій. Серед можливих причин їх утворення є помилки в процесі реплікації та дія зовнішніх чинників (вільні радикали, канцерогени, іонізуюче опромінення та інші). Проаналізовано роботи, в тому числі виконані методом ІЧ-спектроскопії, з вивчення структури ДНК з пухлинних тканин та впливу протипухлинних препаратів на основні структурні складові ДНК.

Охарактеризовано нормальні коливальні моди ДНК, білків, кристалів амінокислот, ВНТ. Зроблено огляд робіт, присвячених дослідженню структури ВНТ та їхнього застосуванню в біонанотехнологіях. Описано сучасні напрямки розвитку біонанотехнологій, роль у цьому мікрохвильового випромінювання та вплив мікрохвиль на біологічні системи.

На основі проведеного аналізу літературних даних зроблено висновки про необхідність подальшого детального вивчення молекулярних механізмів дії зовнішніх та внутрішніх чинників на біологічні молекули. Зокрема, потребують вивчення особливості міжмолекулярної взаємодії протипухлинних препаратів зі структурними складовими клітини - ДНК і мембранами та структурні перебудови біологічних молекул, включаючи Н-зв'язки, при взаємодії з різними лігандами та під дією малих доз мікрохвильового та іонізуючого випромінювання.

У розділі 2 детально описано застосовані експериментальні та числові методи і наведено характеристику об'єктів досліджень. Основними використаними в роботі експериментальними методами були методи коливальної спектроскопії, а саме, ІЧ- поглинання, ІЧ-відбивання і підсилене металічною поверхнею ІЧ-поглинання, поляризоване ІЧ -відбивання, комбінаційне розсіяння світла за допомогою Фур'є-ІЧ-спектрометрів IFS-48, IFS-66, RFS 100/S (Bruker, Німеччина). Описана техніка Ленгмюра-Блоджет, поверхневий плазмонний резонанс, голографічна інтерферометрія для створення та дослідження зразків з біологічними молекулами в мікрохвильовому полі. Охарактеризовано методи розрахунку та обробки спектральної інформації з акцентами на напівемпіричних та неемпіричних методах розрахунку, а саме AM1, MNDO, PM3, DFT, а також алгоритмі нейронних мереж та методі головних компонент. Запропоновані методи є чутливими та адекватними для вирішення поставлених задач. Разом з тим для дослідження молекулярних механізмів дії різних чинників на біологічні молекули виникає необхідність розробки нової надчутливої методики реєстрації коливальних спектрів молекул на основі підсилення сигналів молекул на наноструктурованій металічній поверхні.

У розділі 3 дано обґрунтування, розробка та детальний опис запропонованої нами методики реєстрації коливальних спектрів молекул на основі ефекту підсилення шорсткою металічною поверхнею ІЧ-поглинання (методики SEIRA). Теоретична інтерпретація ефекту підсилення представлена в літературі в загальному вигляді і включає принаймні два можливих механізми: локальне підсилення електромагнітного поля внаслідок взаємодії світла з локальними (поверхневими) плазмонними коливаннями, що виникають на неоднорідностях (кривизні) металевої поверхні, та специфічне зростання дипольних моментів переходів молекул, які адсорбовані на поверхню металу (Рис.1).

Ефективний переріз процесу взаємодії світла з молекулою, адсорбованою на металічну поверхню, визначається формулою:

(r,) ~ ⁽⁰⁾ g(r,щ)² h(r)², (1)

де ⁽⁰⁾ - переріз для вільної молекули за відсутності металу (E = E₀);

g(r,щ) - коефіцієнт підсилення електричного поля; h(r) - коефіцієнт підсилення дипольного моменту адсорбованої молекули.

Теоретичне вивчення ефекту підсилення В.Кособукіним (1983) виявило, що величина підсилення електричного поля при резонансі характеризується конкуренцією процесів збудження і розпаду поверхневих електромагнітних хвиль (ПЕХ), які є бозе-збудженнями, що переходять при великих числах заповнення в класичні моди. Тому рівень накачування ПЕХ (в заданому зовнішньому полі E0) лімітується тільки процесами їх розпаду. При описі ПЕХ, параметр 1/ описує повну швидкість їхнього розпаду:

Виділяють такі канали розпаду ПЕХ:

а) дисипативний (час релаксації _d), пов'язаний з переходами енергії ПЕХ у тепло;

б) поверхневий (розсіювання ПЕХ в інші ПЕХ за час _s);

в) випромінювальний (розпад на фотони за час _r ).

У зв'язку з цим важливо зауважити, що ефективність підсилення електричного поля локальними плазмонами і поверхневими електромагнітними хвилями може бути пов'язана з різним впливом шорсткостей на локальні і делокалізовані плазмонні коливання. Справді, на шорсткій поверхні з характерним розміром шорсткостей меншим за довжину хвилі світла зростає ймовірність збудження локальних плазмонних коливань, але при цьому різко зменшується час життя поверхневих електромагнітних хвиль і підсилення ними електричного поля визначається процесами їхнього радіаційного розпаду та розсіяння на шорсткостях. Співвідношення між цими процесами визначає можливість досягти максимальне підсилення. Підсилення електромагнітного поля залежить від форми та розміру неоднорідностей поверхні металічної плівки, а також оптичних властивостей металу і оточуючого середовища та визначається, в основному, функцією діелектричної проникності металу. Розрахунковий коефіцієнт підсилення електромагнітного поля в ефекті SEIRA обчислюється як відношення дійсної та уявної частини діелектричної проникності металу на відповідній частоті: g_роз=|еґ(щ)|/еґґ(щ)?. З точністю до мультиплікативної константи це відповідає реальній ситуації. Використовуючи експериментальні значення оптичних констант, нами було розраховано коефіцієнти підсилення електричного поля для таких металів: Ag, Au, Cu, Mo, Pt, Ni та Ir. Експериментальний коефіцієнт підсилення ІЧ-поглинання в ефекті SEIRA знаходився як відношення інтегральної інтенсивності смуги поглинання відповідної молекулярної групи на металічній поверхні до інтенсивності смуги поглинання цієї молекулярної групи такої самої кількості речовини на нейтральній підкладці (СаF₂, BaF₂, LiF) - .

Експерименти проводили в геометрії на пропускання та відбивання. При цьому зразки молекул - НК, білків, амінокислот, нуклеотидних основ, фулеренів, нанотрубок тощо - наносилися на скляні пластини з шаром напиленого золота товщиною 200-500 Е. Шорсткість поверхні становила близько 20 Е та визначалась за допомогою атомно-силового мікрскопу (AFM, Nanoscope IIIa, Digital Instrument, Santa Barbara, CA) із застосуванням серійного вістря з нітриду кремнію в режимі періодичного контакту. Дослідження показали, що величина підсилення є оптимальною, коли шорсткість поверхні знаходиться в межах 20-50 Е, а товщина шару напиленого золота порядку 200 Е (Рис.2).

Результати свідчать про те, що внаслідок використання методу SEIRA для дослідження ІЧ-поглинання нуклеїнових кислот (НК) не спостерігається деформації контуру смуг поглинання, порівняно зі спектром на нейтральній підкладинці CaF2 (Рис.3), що доводить правомірність використання методики для реєстрації конформацій ДНК. Деякі частотні зсуви присутні, але для більшості смуг вони незначні (1-2 см^-1). Отримані в експерименті коефіцієнти підсилення інтегральної інтенсивності смуг поглинання, які відповідають коливанням різних молекулярних груп складних молекул - ДНК та білків, - склали від 3 до 5 в залежності від товщини шару напиленого золота, а для простих - таких як, гліцин, гуанін тощо - від 3 до 15 (Рис.4).

У розділі 4 розглядаються особливості структурної організації НК, екстрагованих з пухлинних тканин. Проаналізовано молекулярні механізми взаємодії протипухлинних препаратів - доксорубіцину та цис-платини з ДНК. Основну увагу приділено дослідженню структури ДНК та фосфоліпідів, екстрагованих з чутливих та резистентних до протипухлинних препаратів клітин. Експерименти зроблені в умовах in vitro та in vivo.

Представлено результати аналізу спектрів поглинання РНК з пухлинних тканин на різних стадіях злоякісності пухлини. Загальна фракція РНК виділялась з тканин пухлин головного мозку щурів лінії Вістар (штам 101,8 гліобластоми) та з пухлинних тканин головного мозку людей. Контрольною була РНК, виділена з тканин головного мозку здорових тварин. Виявлено спектроскопічні прояви структурних особливостей РНК (Рис.5) з пухлинних тканин різного ступеня злоякісності та визначено їхній характер. Суттєві зміни спостерігаються у випадку РНК з тканин, що знаходились безпосередньо біля пухлини і були видалені в процесі операції. Поява маркерних смуг поглинання С3'-ендо/анти та С2'-ендо/анти конформацій цукрів разом з ослабленням їхніх коливань, збільшення кількості розділених смуг поглинання в усьому досліджуваному частотному інтервалі (Рис. 5 б) вказують на розупорядкування в структурі РНК.

Характерною рисою спектрів РНК з пухлинних тканин і з тканин, взятих безпосередньо біля пухлини, є значне зростання інтенсивності валентних СН-коливань (Таблиця 1). Для оцінки внеску СН-коливань розраховано відношення сумарної інтегральної інтенсивності валентних СН-коливань до інтегральної інтенсивності всієї смуги ОН, NH і CH-коливань (максимум на 3400 см-1). Як видно з Таблиці 1, для зразків пухлинної РНК це значення для більшості зразків значно перевищує контроль, тоді як для РНК біля пухлини вклад СН-коливань може бути різним. Значення для зразків 5 та 6 мало відрізняються від контролю і належать до астроцитоми, не малігнантної пухлини. Підвищена інтенсивність СН-коливань у НК з пухлинних тканин різного типу відмічалась і в інших роботах. Це узгоджується з припущенням зробленим Д.Говоруном (2007) про можливу зміну в конформаціях цукрових залишків завдяки перебудовам в СН групах. Отож, даний параметр може бути використаний як один з маркерів пухлинного процесу.

Таблиця 1

Відношення інтегральної інтенсивності валентних коливань СН₂ та СН₃ до інтегральної інтенсивності широкої смуги з максимумом на 3400 см^-1. Цифрами пронумеровано різні зразки РНК, похибка складала 0,55%

Спектральні параметри смуг фосфатів значно відрізняються у випадку РНК з пухлини порівняно з контролем (Рис. 5а). В пухлинній РНК спостерігається зменшення інтегральної інтенсивності смуги антисиметричних коливань молекулярних груп РО2- до 2,22 для астроцитоми та 5,47 для гліобластоми, порівняно з 6,77 у контролі. Це може бути пов'язано з ослабленням зв'язків та появою потенційних місць розривів. З іншого боку, у випадку більшого ступеня злоякісності пухлини спостерігався перерозподіл інтегральних інтенсивностей та зсув основних компонент, які у контролі знаходяться на частотах близько 1243 та 1223 см^-1. Крім того, в пухлинних РНК зростає інтегральна інтенсивність високочастотного плеча в області 1275 - 1300 см^-1. У гліобластомі це значення складає 0,154, що в 1,9 рази перевищує контроль (0,080). Для РНК з тканин астроцитоми маємо 0,086.

Було розраховано кількість молекул води на нуклеотид для РНК, виділеної з мозку контрольної тварини, та мозку тварин з гліобластомою, до та на 4-ий день після операції. Ці величини склали відповідно: контроль - 10,8; пухлина - 6,4; біля пухлини - 12,4. Така тенденція до зменшення кількості молекул води на нуклеотид у РНК з пухлини та деяких форм ДНК з резистентних клітин спостерігається в різних експериментах та на різних моделях. Після операції або лікування, як правило, кількість молекул води прямує до тієї, що спостерігається в РНК або ДНК з нормальної тканини. В описаному випадку ця кількість збільшувалась.

Відомо, що хіміотерапія залишається одним з основних методів боротьби з раковими захворюваннями. Вважається, що препарати діють на всі складові клітини, але основною мішенню при протипухлинній терапії є ДНК, тому проблема взаємодії протипухлинних препаратів з ДНК є особливо актуальною. Дія багатьох ліків спрямована на утворення пошкоджень в структурі ДНК, вплив на її біологічну активність. За характером взаємодії з ДНК ці препарати можна поділити на чотири групи:

- даунорубіцин, доксорубіцин утворюють з ДНК нековалентні комплекси;

- дістаміцин А - зв'язування в жолобі;

- цис-платина, мітоміцин С зв'язуються з ДНК ковалентно;

- дуокарміцин/СС-1065, блеоміцин/пеплеоміцин, енедін призводять до викривлень, чи розривів у цукрофосфатному остові.

ДНК можна розглядати як макромолекулярний рецептор для препаратів. Можна виділити наступні місця зв'язування (Рис.6):

- атом N2 аміногрупи гуаніну в мінорній борозенці є частково доступним для дії препаратів. Специфічне зв'язування багатьох препаратів з ДНК включає розпізнавання гуаніну через водневе зв'язування атому N2 екзоциклічної аміногрупи.

Цей сайт алкілюється багатьма препаратами.

- атом N3 гуаніну і аденіну в мінорній борозенці;

- атом N7 гуаніну і аденіну в мажорній борозенці є найбільш активним сайтом, з яким взаємодіють багато іонів металів і алкілуючих агентів;

- C4'- C5'- C1'- атоми дезоксирибози цукрофосфатного остова для подвійної спіралі ДНК у В-конформації.

В залежності від умов в клітині, модифікації самих препаратів клітиною та модифікації ДНК в онкопроцесі можуть переважати ті чи інші взаємодії, а відомі місця зв'язування можуть змінюватись. На основі попередніх наших та Д.Малінса (1996) даних зі структури ДНК з пухлинних тканин ми припускаємо, що структура ДНК з резистентних та чутливих пухлин може відрізнятись. Зв'язування препарату з модифікованою ДНК неодмінно буде призводити до змін у просторовій структурі молекули, індукуючи нові зміни в ДНК. Тому, у випадку чутливих та резистентних клітин, схема взаємодії протипухлинних препаратів з ДНК тепер може мати інший вигляд, ніж це представлено на Рис.6, а доступні звичайні місці зв'язування зайнятими. Це треба враховувати при розробці алгоритму тестування чутливості протипухлинних препаратів.

Нами було досліджено структуру ДНК, яка виділена з тканин чутливого і резистентного до доксорубіцину і цис-платини штамів карциноми Герена, привитих щурам лінії Вістар, а також ДНК з цих пухлин через 1 годину після введення одноразової максимальної дози цих препаратів. В спектрах ДНК, виділеної після дії протипухлинного препарату, ми не фіксували смуги від цього препарату, а лише смуги ДНК, оскільки вихідна кількість протипухлинного препарату на 3 - 4 порядки менша, ніж ДНК.

Виявлено суттєві відмінності в структурі ДНК з тканин чутливих та резистентних штамів пухлин (Рис. 7). Структуру ДНК з резистентних пухлин можна охарактеризувати більшим рівнем впорядкування, вона є більш жорсткою і за спектральними ознаками є близькою до канонічної спіральної структури і менше змінюється під дією зовнішніх чинників.

Структура ДНК з чутливих штамів пухлин є більш гнучкою, характеризується вищим рівнем розупорядкування та наявністю неканонічних конформаційних станів.

У випадку застосування цис-платини до чутливої пухлини ми не спостерігаємо суттєвих зміни. Всі відмінності в області поглинання цукрів, основ та водневих зв'язків незначні, проте можна відмітити деяку тенденцію до стабілізації структури внаслідок лікування, що проявляється у вигляді зменшення відношення інтенсивностей смуг С-О (1070 см^-1/ 1053 см^-1). У наших дослідженнях ІЧ-спектрів поглинання фосфоліпідів з плазматичних мембран чутливих і резистентних штамів карциноми Герена встановлено, що цис-платина може утворювати комплекси з фосфоліпідами і не потрапляти в клітину. Таким чином, можна припустити, що препарат або не доходив до ДНК, або доходив модифікованим і в незначній кількості.

Зміни, які ми спостерігаємо після застосування цис-платини до резистентних штамів сильніше проявляються в області поглинання симетричного і антисиметричного коливань молекулярних груп РО2-. Зменшення інтегральної інтенсивності смуги антисиметричного коливання фосфатів (Рис. 8) та його низькочастотний зсув (до лікування - 1242 см^-1 та після лікування - 1239 см^-1) може бути пов'язане з ковалентним зв'язуванням цис-платини з компонентами ДНК.

Проте, крім описаних у літературі зв'язків з N7-положенням гуаніну, важливу роль можуть відігравати водневі зв'язки N-H з фосфатними групами. У ДНК з резистентних штамів після застосування цис-платини подавленим виявляється також симетричне коливання РО2-. Його інтегральна інтенсивність до лікування складає 1,24 (v=1095 см^-1) і 0,82 (v=1094 см^-1) після. Разом з тим виявлений явний перерозподіл інтенсивностей С-О компонент. Як видно з Рис. 8, після застосування цис-платини інтенсивнішим стає низькочастотне плече смуги симетричного РО2-.

Компонентний аналіз цієї смуги показав збільшення внеску компоненти 1070 см^-1, яку пов'язуємо з появою неканонічних конформаційних станів ДНК або дестабілізацією структури. Аналогічний результат отриманий нами і для випадку застосування доксорубіцину до резистентних штамів карциноми Герена. Змінюється також співвідношення інтенсивностей між антисиметричним і симетричним коливаннями РО2-- групи. У контрольній ДНК та в ДНК з чутливої пухлини за інтенсивністю переважає симетричне коливання, тоді як у резистентній після застосування цис-платини інтенсивнішим стає антисиметричне коливання, що взагалі не характерно для спіральної конформації ДНК та в експериментах із застосуванням доксорубіцину не спостерігалось.

Застосування доксорубіцину до резистентної пухлини призводить до порушення цілісності її структури, до появи розупорядкування, змін у водневому зв'язуванні. ДНК з чутливої пухлини є більш гнучкою і після лікування вона різко змінюється в напрямку до ДНК з нормальної тканини. Аналіз області поглинання фосфатів показав зростання інтегральної інтенсивності смуги фосфату антисиметричного як для ДНК з чутливого, так і з резистентного штаму, причому у випадку чутливої пухлини інтенсивність смуги зростає в 1,5 рази, у резистентної - в 1,2 рази. Збільшення інтенсивності смуги, імовірно, пов'язано з інтеркаляцією доксорубіцину і утворенням водневих зв'язків РО2- молекулярної групи з препаратом, а саме С14-ОН групою доксорубіцину.

Рис.8. Фур'є-ІЧ-спектри ДНК з чутливих (а) і резистентних (б) до цис-платини пухлинних тканин до (криві 2) і після (криві 3) застосування цис-платини, криві 1 - контроль (ДНК з нормальної тканини). Цифрами в лівому кутку позначено кількість молекул води на нуклеотид, навпроти максимуму смуги вказано значення середнього квадратичного відхилення (RMS) при розкладі кожної смуги.

Застосування доксорубіцину індукує суттєві зміни в області поглинання цукрів (Рис. 9, а). Для ДНК з чутливого штаму карциноми Герена, зокрема спостерігається зменшення в 2 рази внеску С2'-ендо конформації цукрів на 830 см^-1 (В-форма), а також збільшується інтенсивність смуги 963 см^-1 дезоксирибози. Таким чином, структура ДНК в області цукрів стає більш подібною до канонічної спіральної форми. У резистентній пухлині застосування препарату проявляється у вигляді збільшення кількості розділених смуг поглинання, а також присутності маркерів різних конформаційних станів ДНК, як це було у випадку чутливої пухлини до лікування. Це свідчить про те, що застосування доксорубіцину призводить до розупорядкування в структурі ДНК з резистентної пухлини, що корелює з висновками, зробленими вище.

В той же час застосування цис-платини (Рис. 9, б) до чутливого і резистентного штаму не призводить в області поглинання цукрів до перебудови спектрів. Подібно до того, як це було у випадку доксорубіцину, спостерігається присутність маркерних смуг поглинання різних конформаційних станів цукрофосфатного остову, як С3Ч-ендо, А-форма (856, 782 см^-1), так і С2'-ендо, В-форма (832 см^-1). Крім того, у зразках ДНК з пухлинних тканин бачимо смугу поблизу 820-823 см^-1 для різних зразків, поява якої є характерною для лівоспіральної Z-конформації.

Рис. 9. SEIRA-спектри ДНК з резистентних (2,3) і чутливих (4,5) до доксорубіцину (а) та цис-платини (б) пухлинних тканин до (2,4) і після (3,5) застосування відповідного препарату, 1-контроль; N, S відноситься до цукових залишків в С₃Ч-ендо/анти (А-форма ДНК) С₂Ч-ендо/анти (В-форма), відповідно, та Bk(Z) остов в Z-формі.

Суттєві зміни спостерігаються в області 2300-3800 см^-1 і проявляються у перерозподілі внеску водневопов'язаних молекулярних груп О-Н, N-H та, імовірно, пов'язані з утворенням водневих зв'язків між інтеркальованим доксорубіцином і компонентами ДНК (як було показано в області поглинання фосфатних груп).

Рис. 10. Сумарна інтегральна інтенсивність О-Н та N-H валентних коливань спектрах ДНК з резистентних (2,3) та чутливих (4,5) пухлинних тканин до (2,4) та після (3,5) застосування доксорубіцину, 1-контроль.

Застосування доксорубіцину до чутливої пухлини призводить до зміни співвідношення між вкладами NH і ОН молекулярних груп на користь останніх (Рис.10, стовпчик 5), що наближає структуру ДНК до контрольної (у контролі вклади N-H та О-Н співвідносяться як 1:2), тоді як без лікування ми спостерігали зсув максимуму всієї широкої смуги в область NH. На противагу цьому, в резистентній пухлині лікування призводить до значного зростання внеску коливань NH порівняно з вихідним станом, майже до рівня чутливої пухлини без введення препарату (Рис. 10, стовпчик 3). Значний внесок дають коливання сильно водневопов'язаних NH груп (максимум близько 2600 см-1). Щодо внеску валентних коливань СН, то інтенсивність їх зменшується.

Відомо, що однією з важливих характеристик молекули ДНК є кількість молекул води, що адсорбується на її поверхні. Це є одним з найістотніших факторів, що визначає належність до певного конформаційного сімейства ДНК. У залежності від структурних особливостей (наявності певного роду пошкоджень, модифікацій складових, розривів) кількість молекул зв'язаної води в розрахунку на нуклеотид повинна змінюватись. На основі даних ІЧ-спектроскопії для всіх зразків пухлинних і нормальних ДНК та РНК була розрахована кількість молекул води на нуклеотид. Так, в контрольному зразку ми отримали 10,1 молекул води, в зразку ДНК з чутливих до доксорубіцину тканин - 19,7, після лікування - 8,5. Для ДНК з резистентних тканин ці значення склали 12,3 - до лікування і 13,4 після лікування доксорубіцином. Для ДНК з чутливих до цис-платини тканин ми отримали до лікування 19,3, після лікування 8,4. Для ДНК з резистентних тканин - 8,2 до лікування і 12,8 після. Таким чином, бачимо, що дія як одного, так і іншого препарату на структуру ДНК має подібні риси. А саме, в ДНК з чутливих до дії препаратів пухлинних тканин маємо майже вдвічі більшу кількість молекул води, ніж в контролі, а в ДНК з резистентних тканин - вдвічі меншу кількість молекул води на нуклеотид, ніж в ДНК з чутливих пухлинних тканин. Після лікування ДНК з чутливої тканини зменшує кількість молекул води на нуклеотид, наближаючись до контрольної, а резистентна або не змінює цей параметр, або незначно зростає. Навіть за цим параметром видно, що ДНК з чутливих тканин суттєво відрізняється за своєю структурою від ДНК з резистентних тканин та сприйнятливістю до дії протипухлинних препаратів.

У цьому розділі також представлено результати дослідження особливостей структури ДНК, виділеної з тканин придатків сім'яників щурів лінії Вістар, що перебували під впливом хронічного зовнішнього комбінованого (, в, г,) іонізуючого опромінення (40-60 мкP/год) і внутрішнього опромінення в умовах зони відчуження Чорнобильської АЕС впродовж 4 і 12 місяців. Тварини отримували корм і питну воду, забруднену радіонуклідами Sr90, Сs134 і Сs137. Загальні поглинуті дози радіації склали: для 12-місячних щурів - 5,7 та 57 сГр, для 4-місячних - 0,7, 2 і 25 сГр. Для 4-місячних зразків спостерігаються лише слабкі зміни в ІЧ-спектрах поглинання, що свідчать про початкові перебудови у вторинній структурі ДНК, тоді як для 12-місячних зразків зміни мають більш яскравий характер. Виявлено, що в результаті дії на ДНК слабких доз (0,7-57 сГр) радіаційного опромінення виникають пошкодження її просторової структури. Вони полягають у перебудові сітки водневих зв'язків з можливою зміною типів спарювання основ. Можлива модифікація основ та цукрових залишків, а також розриви проявляються у вигляді зростання інтенсивності валентних коливань С-Н. Низькочастотні зсуви та зменшення інтенсивностей смуг, зокрема РО2- близько 1239 см^-1, вказують на ослаблення зв'язків та появу потенційних місць розривів. Такі структурні пошкодження можуть призводити до локальних змін конформації молекули ДНК - розупорядкування просторової структури. Висновки корелюють з даними, отриманими з аналізу кривих плавлення ДНК з біологічно-активними нуклеозидами О.Кругловою (1999) та результатами обробки Фур'є-ІЧ-спектрів ДНК методом нейронних мереж.