Молекулярні механізми взаємодії біомолекул з наноструктурами, лігандами та малими дозами мікрохвильового та радіаційного випромінювання

Представлено результати дослідження впливу сильних доз г-опромінення на структуру ДНК з паростків пшениці, опромінених в лабораторних умовах джерелом високоенергетичного випромінювання на основі ізотопу Со60. Загальні поглинуті дози склали: 2, 20 і 200 Гр. Сильні одноразові дози (2-200 Гр) опромінення призводять до значних ушкоджень структури ДНК, таких як розриви цукрово-фосфатного остову, про що свідчить ослаблення та низькочастотний зсув смуги РО2- близько 1240 см^-1, виділення в окрему смугу коливання молекулярної групи С-О близько 1146 см^-1, а також зростання інтенсивності валентних коливань СН в області 2850-2950 см^-1, зокрема компоненти СН2. Збільшення інтенсивності поглинання в області 1069 см^-1 та присутність в області поглинання цукрів маркерних смуг А, В, Z конформацій ДНК свідчить про розупорядкування в структурі та зміну конформації компонент ДНК.

На основі даних ІЧ-спектроскопії було розраховано кількість молекул води, що зв'язані з ДНК. Узагальнення даних результатів представлено на Рис. 12 та в Таблиці 2. У ДНК з 4-місячних зразків кількість молекул води на нуклеотид більша, ніж ДНК з 12-місячних, але всі ці значення менші, ніж у контрольному зразку. З отриманих результатів можна зробити висновок про те, що місця, які в контрольній ДНК були зайняті молекулами води, після опромінення зайняті іншими активними групами.

Відомо, що молекули води зв'язуються як основами, так і з цукрофосфатним остовом, тому зменшення кількості зв'язаної води може означати зміну конформаційної структури ДНК. Тенденція, яка спостерігається для великих доз, прямо протилежна тій, що ми бачили для малих доз. Кількість молекул води на нуклеотид збільшується з дозою. Останнє, мабуть, є свідченням того, що кількість розривів в ДНК при цьому значно зростає.

Таблиця 2

Кількість молекул води на нуклеотид для опромінених і контрольних зразків ДНК

За результатами роботи показано можливість відрізняти ДНК з пошкодженнями структури та після взаємодії з лігандами за допомогою Фур'є-ІЧ спектроскопії. Сформульовано спектроскопічні ознаки НК з пухлинних тканин.

Для аналізу конформацій НК з вірусів, резистентних та чутливих пухлин у цьому розділі було використано метод головних компонент. Для цього вибирались змінні, які характеризують конформаційний стан молекули, чотири з них наведені у Таблиці 3. Вдало вибрані параметри спектру, які добре відрізняють одну конформацію від іншої, та їх адекватне представлення або вибір відповідних головних компонент дають змогу побудувати карти ознак, що є корисними в ідентифікації зразків.

Таблиця 3

Набір з чотирьох спектроскопічних параметрів (змінних), які входять в головні компоненти для конформаційного аналізу ДНК

Головні компоненти не є математичною абстракцією, їм можна надати конкретний фізичний зміст, розглянувши величину внесків параметрів спектру до першої та другої компонент (Рис. 13). Побудова та аналіз відповідних карт ознак дали змогу побачити, що ДНК з пухлин розташована в іншій області простору, ніж ДНК з нормальних тканин. даному розділі наведено результати експериментів по взаємодії двох типів флуоренових барвників ДНК з нормальних та пухлинних клітин в експериментах in vitro та in vivo. В цих експериментах показано різний характер взаємодії ДНК з лігандами. Зв'язування in vitro відбувається зі зміною геометрії одного з барвників при взаємодії з ДНК з нормальних тканин, в той час, як взаємодія з ДНК з пухлинних тканин показує наявність численних місць зв'язування без радикальної зміни ліганда. На основі порівняння даних експериментів in vitro та in vivo запропоновано фізичну модель дії лігандів на клітину. Ця модель включає зміну структури основних мішеней клітини після дії ліганда, модифікацію ліганда в результаті такої взаємодії та запам'ятовування клітиною нав'язаних подій.

У розділі 5 розглядаються особливості структури біологічних молекул в мікрохвильовому діапазоні частот або близькому до нього (2- 400 см^-1) та під дією мікрохвильового поля в діапазоні 2 - 75 ГГц потужністю 2 - 100 мВт/см². Наведено ряд експериментів, що надають можливість:

1) розрахувати діелектричні властивості монокристалів на основі амінокислот і показати суттєвий внесок коливань в діелектричну проникність в-аланіну (більше 50%) в області частот нижче 400 см^-1;

2) зареєструвати чисельні коливальні стани монокристалів амінокислот - -гліцину, в-аланіну, L-гістидину та DL-триптофану в низькочастотній області (10 - 400 см^-1);

3) виявити дію електромагнітного поля на коефіцієнт відбивання поляризованого ІЧ світла простих біологічних молекул на моделі монокристалів амінокислот -гліцину, в-аланіну, і гліцин-вмісткого монокристалу - тригліцинсульфату. На основі цих експериментів розрахувати коефіцієнти тензора діелектричної проникності і нелінійну поляризовність кристалів.

4) дослідити дію поля з виділеними частотами з області 37 - 60 ГГц потужністю до 10 мВт/см² на показник заломлення альбуміну на моделі моношару білка при його адсорбції на металеву поверхню за допомогою плазмонного резонансу, зміна показника заломлення складає для білка 8,3х10^-3.

5) візуалізувати дію мікрохвильового поля на розчин плазми крові, з яким проводились голографічні експерименти; поле призводить до зміни показника заломлення ( = 0,63 мкм) для плазми крові на 2,52 х10^-4.

6) показати дію поля на формування моношарів фосфоліпідів та арахідонової кислоти, отриманих за допомогою методу Ленгмюра-Блоджет та поляризаційні властивості молекул. Так, в мікрохвильовому полі в смузі частот 54-78 ГГц, потужності 3 - 5 мВт/см2 утворення моношару арахідонової кислоти та ліпідів за методом Ленгмюра-Блоджет відбувається з іншими структурними та діелектричними параметрами ніж без поля, а саме: зменшуються площа, яка займається молекулою (для арахідонової кислоти вона зменшується з 18 до 15 А²), та її дипольний момент (приблизно на 10-15 %).

У ряді експериментів дослідження проведено в реальному масштабі часу. Показано, що у випадку біфуркованого Н-зв'язку не виникає двоямного потенціалу, за допомогою якого можна було б з'ясувати виникнення тунельних переходів в міліметровій області спектру, або появу нових смуг поглинання в низькочастотній області коливального спектру. Незважаючи на біфуркований характер Н-зв'язку, найважливішу роль в ньому відіграє водневий зв'язок в одному з напрямків. Можна припустити, що в біологічних нерівноважних системах при дії зовнішніх чинників або біохімічних реакцій в біфуркованому Н-зв'язку може відбуватися переключення водневого зв'язку зі зміною головного напрямку. Але навіть в рівноважних умовах перебудови коливальних мод можуть мати місце. Теоретичний опис спектральної поведінки ІЧ спектрів агрегатів або кластерів біологічних молекул під впливом слабкого мікрохвильового поля був запропонований О.Сєріковим (1995). На основі квантового формалізму, поєднаного з класичним підходом, ним було показано, що збудження коливальних станів колективної природи під впливом мікрохвильового випромінювання нетеплової густини потужності можуть бути причиною перебудов в ІЧ спектрах ланцюжків або кластерів молекул, в тому числі біологічної природи. Особливу увагу в роботі звернуто на те, що саме молекули, які містять групи NH3+ та CO2- можуть утворювати агрегати та бути мішенню для перебудов у спектрах при мікрохвильовому збудженні.

У розділі 6 приведено результати дослідження взаємодії вуглецевих та металічних наноструктур з молекулами ДНК. Виявлено, що шорстка поверхня золота не впливає на конформацію ДНК на противагу колоїдному золоту, яке змінює структуру молекул ДНК, що спричиняє виникнення фрагментів молекули з вмістом А- та Z- форми (Рис.14 ).

Характеризація одностінних ВНТ проведена за допомогою електронної мікроскопії та комбінаційного розсіяння світла (Рис. 15).

Спектр комбінаційного розсіяння, а саме, коливальні моди G (поблизу 1600 см^-1), D (1200-1300 см^-1) та низькочастотна дихальна мода в області 40-400 см^-1, обертон в області 2500-2650 см^-1 є своєрідним "паспортом" одностінної нанотрубки. Положення, півширина та співвідношення інтенсивностей мод G та D дають можливість віднести графітовий матеріал до відповідної форми вуглецю - нанотрубок, графіту або сажі.

Наявність у спектрі та положення низькочастотної дихальної моди вказує на те, яка це нанотрубка: одно-, дво- або багатостінна та дає змогу визначити діаметр нанотрубки. Нанотрубки, з якими ми працювали, мали діаметр в діапазоні 0,8-1,6 нм. Взаємодія ДНК з нанотрубками була вивчена за допомогою спектрів, отриманих методом SEIRA (Рис.16) у порівнянні зі спектрами комплексів ДНК-ультрадисперсний графіт (Рис. 17).

ДНК була попередньо нагріта до температури 100 ⁰С, потім разом з нанотрубками оброблена ультразвуком та центрифугована, в результаті чого утворювались колоїдні розчини, що стабільні на протязі більше 3-х місяців. Зразки ДНК-ультрадисперсний графіт готувались аналогічно. В спектрах комплексу ДНК-нанотрубка спостерігалось зростання поглинання в області високочастотного плеча поблизу 1699 см^-1 (Рис.16, вихідна ДНК) та його зміщення у високочастотну область - (1700, 1703, 1703, 1702, 1703, 1703, 1700 см^-1) в порівнянні з вихідною ДНК, що може бути інтерпретовано як зростання спарювання основ та появу А та В форм. Коливання фосфату симетричного змістилося з 1090 см^-1 (маркер А-форми) у контрольній ДНК (нижня крива, Рис.16) до 1100, 1095, 1095, 1096 см^-1 (3-я, 4-а, 5-а, 6-а низу Рис. 16) і не належать ні до А, ні до В-форми; 1091, 1092 см^-1 (6-а, 7-а крива - А-форма) в ДНК-ВНТ комплексі. Коливання фосфату асиметричного (1220-1240 см^-1) змістилося з 1234 см^-1 (маркер А-форми) в контрольній ДНК до 1226, 1227, 1229, 1228, 1229, 1229, 1226 см^-1 (В-форма) (Рис.16) в ВНТ-ДНК комплексі. Внесок в смугу "фосфат асиметричний" дає в основному група PO2-. Фосфат симетричний має більш складний склад і туди дають внесок поряд с групою PO2- ще і групи дезоксирибози ( С-О, С-С).

Таким чином, в спектрі комплексу ДНК-ВНТ спостерігались такі особливості: а) в області коливань OH-, NH-, CH- (2950-3200 см^-1) спостерігалось збільшення півширини смуги до 527 см^-1 в порівнянні з 478 см^-1 в контролі, що вказує на формування сильних водневих зв'язків, тому що уширення смуги йде з боку низьких частот; б) в області коливань залишків азотистих основ зросла інтенсивність поглинання на частотах, які відносяться до молекулярних груп С=О (1712, 1700, 1685 см^-1) і C=N (1608 см^-1), що свідчить на користь спіральної структури ДНК і водневого зв'язування азотистих основ, які раніше було розірвано температурною обробкою, а збільшення інтегрального поглинання в області 1600-1700 см^-1 свідчить про те, що основи стали більш вільні, ніж в В і А формі; в) значно зросла інтегральна інтенсивність смуг в області 600-900 см^-1, які відповідають коливанням залишків дезоксирибози, з'явилась смуга на 923 см^-1, що можна пояснити появою фрагментів ДНК в Z-формі; г) збільшення інтенсивності смуги 830 см^-1 вказує на збільшення внеску В-форми ДНК; д) спостерігався зсув частотного положення асиметричного коливання фосфатної групи РО2-: з 1234 см^-1 (А-форма) в контролі до 1226 см^-1 (В-форма).

При взаємодії ДНК з ультрадисперсним графітом (Рис.17) вищенаведені зміни не спостерігались або були виражені слабше і спектральні криві майже співпадають. Наші експериментальні дані показали, що при взаємодії ДНК з нанотрубками відбувається зміна структури ДНК, а саме, поряд з ДНК в А-формі, з'являються маркерні смуги В і Z форми, що говорить про наявність фрагментів ДНК або складових в цих формах або про глобальну перебудову її структури.

Як саме відбувається відновлення спіральної структури ДНК відповісти складно. Можна припустити, що утворюються нові зв'язки в структурі молекули ДНК і потім знов утворена конформація накручується навколо нанотрубки з новим кроком, формуючи новий стабільний комплекс за рахунок нековалентної взаємодії основ з нанотрубкою. Дійсно, наші дані показують утворення нових водневих зв'язків в комплексі ДНК-нанотрубка, відновлення спіральної структури ДНК і збільшення інтенсивності переходів основних маркерних смуг, що свідчить про перебудову внутрішньомолекулярних водневих зв'язків. Напевно, реальна ситуація така, що ДНК взаємодіє з ВНТ по деяким схемам одночасно, тобто відбувається як накручування ДНК, так і глобальна зміна її структури.

Нами було зроблено розрахунки взаємодії структурних блоків ДНК - тиміну та аденіну та їхніх протонованих форм з фрагментами ВНТ методом ab initio (з функціоналом B3LYP у стандартному базисі 6-31**). Із отриманих розрахованих даних можна зробити висновок, що кільця тиміну (аденіну) і поверхня нанотрубки утворюють численні комплекси з енергією, що знаходиться у діапазоні 3,2-12,1 ккал/моль. Протоновані форми основ утворюють також нековалентні комплекси з фрагментами нанотрубки з енергією взаємодії в тих самих межах, але вищу за відповідні непроторовані форми в 1,5 - 2 рази. В основі взаємодії лежить р-стекінг, що може слугувати підтвердженням механізму накручування ДНК на нанотрубку. Але в цьому випадку конформація ДНК, швидше за все, не відповідає відомим канонічним формам, а повинна отримати нову, раніше невідому форму. При наявності дефектів в нанотрубках можливе ковалентне зв'язування фрагмента ДНК з ВНТ, а також формування інших структур, наприклад, стопочних. Взаємодія ДНК з нанотрубками залежить від структури ДНК, а саме від первинної і вторинної, тому її різні форми можуть використовуватись для відбору і характеристики нанотрубок за діаметром та властивостями.

Отже, при взаємодії ДНК з нанотрубками відбувається зв'язування макромолекул на поверхні нанотрубки за участю взаємодії Ван-дер-Ваальса, в якій стекінгу відводиться основна роль і які формують достатньо стабільні комплекси, змінюючи водневі зв'язки всередині біологічної молекули і перебудовуючи її структуру.

У цьому ж розділі наведено результати дослідження взаємодії вуглецевих і металічних наноструктур з білками та в форми - БСА та рибонуклеазою А, відповідно. За площею під смугами, які відповідають сумарним внескам коливань a-спіралі (1650 - 1655 см^-1), поворотів (1665-1680 см^-1), в-форми (1620-1624, 1640-1645, 1680-1690 см^-1), невпорядкованої структури (1658-1667 см^-1), коливань бічних ланцюгів амінокислот (1600-1610, 1680-1720 см^-1) ми визначали їх внесок у смугу аміду І. Розрахунки показали, що домінуючою конформацією в усіх випадках є -спіраль для БСА, що підтверджується даними рентгеноструктурного аналізу та ЯМР для молекул БСА та в-форма для рибонуклеази. Аналіз спектрів поглинання плівки БСА товщиною близькою до моношару на золотій поверхні вказує на деякі відмінності конформаційного складу об'ємного зразка або товстої плівки. Це пов'язано із значним впливом металічної поверхні, у тонкій плівці близькій до моношару краще виділяються коливання бічних амінокислотних ланцюгів. За допомогою SEIRA методу також досліджено зв'язування білків з ВНТ. Виявлено, що під час взаємодії молекул БСА та рибонуклеази з ВНТ відбуваються конформаційні зміни в структурі білка, які характеризуються зменшенням вмісту a-спіралі для БСА та в-форми для рибонуклеази, води і збільшенням вмісту бічних ланцюгів і поворотів.

Таким чином, нековалентна взаємодія ДНК та білків з вуглецевими одностінними нанотрубками та колоїдними частинками золота призводить до зміни конформаційного стану біологічних молекул. Так, конформаційний стан ДНК, адсорбованої на нанотрубці, можна визначити як неканонічний, а білки частково перерозподіляють вторинну структуру, змінюючи вміст -спіралей, в-структур, поворотів та невпорядкованої форми.

ВИСНОВКИ

У роботі отримано нові результати щодо молекулярних механізмів взаємодії ДНК та альбуміну з колоїдними частинками та шорсткою поверхнею золота, а також ДНК, аденіну, тиміну, альбуміну з вуглецевими нанотрубками. З використанням нових підходів на основі методу SEIRA поглиблено розуміння молекулярних механізмів впливу малих доз іонізуючого і мікрохвильового випромінювання на модельні біологічні системи та резистентності до дії ліків. За підсумками роботи сформульовано низку основних наукових висновків:

1. На основі ефекту SEIRA розроблено методику детектування малих кількостей біологічних молекул та їхніх моношарів. На прикладі молекул БСА та ДНК показано, що шорстка поверхня плівки золота не впливає на конформацію біомакромолекул. Водночас, частинки колоїдного золота індукують конформаційні перетворення окремих фрагментів ДНК в А- та Z-форми.

2. Вперше проведено систематичне дослідження впливу низки факторів, а саме - типу металу та топології поверхні, способів осадження, структури молекул - на підсилення інтенсивності ІЧ-поглинання біологічних молекул (гуаніну, гліцину, БСА, ДНК), адсорбованих на наноструктуровану поверхню металу. Визначено умови виготовлення металічних поверхонь і способи осадження молекул, які гарантують максимальне підсилення сигналу в ІЧ спектрах. Максимальне підсилення демонструють плівки золота товщиною 200-300 Е з середньою висотою шорсткості 20-50 Е та діаметром 200-900 Е. Зареєстровано підсилення у 10 разів для багатошарових плівок різних біомолекул і підсилення у 100 разів для моношарів БСА.

3. Розроблено алгоритм визначення конформаційного стану ДНК на основі методу SEIRA та методу головних компонент. Запропонована методика ідентифікації структурних пошкоджень в НК на основі фур'є- ІЧ спектроскопії та нейронних мереж.

4. Встановлено, що молекулярний механізм дії малих доз (1-57 сГр) радіаційного опромінення на тварини, що перебували в Чорнобильській зоні на протязі від 4 до 12 місяців, полягає в ушкодженні первинної та вторинної структури ДНК. На це вказують перебудова сітки водневих зв'язків та можлива зміна типу спарювання основ, спричинених модифікацією основ та цукрових залишків і, як наслідок, розупорядкування структури.

5. Виявлено суттєві відмінності в просторовій організації макромолекули ДНК з тканин чутливих та резистентних штамів пухлин, зумовлені впливом протипухлинних препаратів цис-платини та доксорубіцину. Структуру ДНК з резистентних пухлин можна охарактеризувати більшим рівнем впорядкованості, вона є жорсткішою, за спектральними ознаками ближча до канонічної спіральної структури і менше змінюється під дією зовнішніх чинників. Структура ДНК з чутливих штамів пухлин є більш гнучкою, характеризується вищим рівнем розупорядкування та наявністю неканонічних конформаційних станів.

6. Показано, що дія протипухлинних препаратів на чутливий штам пухлинних тканин викликає сильніші зміни спектральних параметрів ДНК, порівняно з резистентним. В той же час, застосування цис-платини до пухлинних тканин викликає менш яскраві зміни в ІЧ-спектрах ДНК порівняно з дією доксорубіцину: це може бути пов'язано з частковою затримкою цис-платини плазматичними мембранами пухлинних клітин. Лікування чутливих пухлин доксорубіцином призводить до стабілізації структури ДНК, що проявляється як в зменшенні кількості розділених смуг поглинання, так і в перерозподілі їхніх інтенсивностей. У ДНК з резистентних пухлин після дії препаратів, навпаки, спостерігається зростання розупорядкування.

7. Визначено спектроскопічні параметри, якими можна охарактеризувати НК з пухлинних тканин поява більшої кількості розділених смуг поглинання, порівняно зі спектром контролю; поява неканонічних форм цукрових залишків, зростанням вкладу поглинання в області 1070 см^-1, зміна параметрів смуг фосфатів, в тому числі, суттєве в 1,3 - 2 рази зменшення, порівняно з контролем інтегральної інтенсивності антисиметричних коливань РО2-; перерозподіл внесків ОН та NH водневозв'язаних молекулярних груп; зростання інтегральної інтенсивності валентних коливань груп СН; в РНК виділення в окрему компоненту коливань С-О молекулярної групи в області 1150 см^-1. Всі ці ознаки свідчать про розупорядкування в структурі ДНК з пухлин порівняно з контролем.

8. На базі проведених експериментів в умовах in vivo запропонована модель взаємодії лігандів з клітиною, яка враховує не тільки вплив ліганда на мішень, а й зворотній вплив мішені на ліганд і включає: взаємодію ліганда з мембраною, ДНК, білками; модифікацію мембрани, ДНК та інших фрагментів клітини в результаті такої взаємодії; модифікацію ліганда при проходженні через мембрану та при взаємодіях у клітині.

9. Експериментально та теоретично показано, що під впливом окремих частот мікрохвильового поля в діапазоні 37-78 ГГц і потужністю до 100 мВт/cм² змінюється показник заломлення альбуміну та плазми крові; коефіцієнт відбивання поляризованого ІЧ світла, коефіцієнти тензора діелектричної проникності і нелінійна поляризовність кристалів амінокислот -гліцину, в-аланіну, і гліцин-вмісного монокристалу - тригліцинсульфату. Виходячи зі зміни поляризовності і дипольних моментів як окремих молекулярних груп, так і молекул у цілому, запропоновано поляризаційну модель дії мікрохвильового поля на біологічні молекули.

10. На основі створеної технології отримання прозорих розчинів вугле-цевих одностінних нанотрубок, розділених за допомогою ДНК, отримано їх комплекси з нанотрубками. Показано, що в таких комплексах ДНК знаходиться в неканонічному конформаційному стані та визначено місця зв'язування нанотрубок з ДНК. Розраховано енергії зв'язування основ ДНК-тиміну та аденіну - з нанотрубками. Показано, що Ван-дер-Ваальсові взаємодії лежать в основі утворення стабільних комплексів ДНК-нанотрубка з енергіями 3,2-12,1 кКал/моль. Ця система є перспективною для доставки ліків до пухлин.

11. Показано, що міжмолекулярна взаємодія вуглецевих нанотрубок з альбуміном призводить до змін в конформаційному складі білка: збільшується кількість невпорядкованої фази та поворотів, зменшується вміст основної фази та води, при цьому альбумін залишається у вихідній основній формі, а саме, в -спіралі.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Belokur Ye.L. Modelling and calculation of infrared spectra of complex biological molecules / Belokur Ye.L., Dovbeshko G.I., Litvinov G.S. // J. Mol. Structure. 1992. Vol. 267. P. 61-66. 2. Bизyaлизaция дeйcтвия миллиметрового излучения на плазму крови / Бережинский Л.И., Гpидина Н.Я., Довбешко Г.И., Лисица М.П., Литвинов Г.С. // Биофизика.1993.Vol.38, №2. С. 378-384.

3. Перестройки в поляризованных колебательных спектрах глицинсодержащих кристаллов под действием миллиметрового излучения / Бережинский Л.И., Довбешко Г.И., Литвинов Г. С., Обуховский В.В., Яновская Н.Б. // Оптика и спектроскопия.1993.Vol.75, №3. P. 628 - 636.

4. Dovbeshko G.I. Low-frequency vibrational spectra of some amino acids/ Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I.// J.Mol.Structure.1998.Vol.450, P. 121-128.

5. Vibrational spectra of crystalline b-Ala / Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I., Lisitsa M.P., Litvinov G.S. // Spectrochimica Acta A. 1998. Vol.54. P. 349-358.

6. Исследование структурных повреждений в молекулах ДНК из гамма-облучённых крыс / Круглова Е.Б., Довбешко Г.И., Крутько Н.А., Пащук Е.П., Карпенко Н.А., Алесина М.Ю., Красницкая А.А. // Вісник Харківського Університету. Біофізичний Вісник. 1999. Т. 450, № 4. С. 92 - 95.

7. Довбешко Г.І. Особливості інфрачервоних спектрів нуклеїнових кислот з пухлинних тканин / Довбешко Г.І., Гридіна Н.Я. // Вісник Харківського Університету. Біофізичний Вісник. 1999. Т. 450, №4. С. 85 - 87.

8. FTIR spectroscopy studies of nucleic acid damage / Dovbeshko G.I., Gridina N.Ya., Kruglova E.B., Paschuk O.P. // Talanta. 2000. Vol. 53. P. 233 - 246.

9. Electron and vibrational spectra of b-ala single crystal: new data from ESCA, Raman and FTIR spectroscopy / Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I., Talik E., Woznjak R., Zawada K., Bukovska I. // Functional materials. 2000. Vol.7, № 4. P. 722-725.

10. FTIR spectroscopy studies of DNA from low-dose irradiated tissue / Dovbeshko G.I., Kruglova E.B., Repnytska O.P., Alesina M., Karpenko N.Ya., Mysnyk A., Novoselets M. // Biophysical Bulletin. Visnyk Kharkivskogo universytetu.2000.Vol. 497, № 2(7). P. 65-73.

11. Berezhinsky L.I. Microwave-induced optical non-lineary of amino acid crystals / Berezhinsky L.I., Dovbeshko G.I., Obukhovsky V.V. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 2001. Vol.4, №4. P. 331-336.

12. О диелектрической проницаемости b-аланина в миллиметровом диапазоне / Макеев Ю.Г., Моторненко А.П., Ермак Г.П., Довбешко Г.И. // Вісник Харківського національного університету. Біофізичний бюлетень. 2001. Vol. №528, № 2(9). С. 100-102.

13. Surface plasmon resonance of adsorbed molecules of proteins under microwave fields / Berezhinsky L.I., Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Shirshov Yu.M., Melnichuk A., // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 2001. Vol.4, N4. P. 333 - 336.

14. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids on gold substrate / Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Ya., Repnytska O.P., Shirshov Y.M., Tryndiak V.P., Todor I.M. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 2001. Vol.4, №3. P. 202-206.

15. The possible role of biffurcated hydrogen bonds in formation of low- frequency spectra of amino acids / Berezhynskiy L.Y., Dovbeshko G.I., Sekirin I.V., Repnytska O.P. // Ukrainian Physical Journal. 2001.V46, №5-6. P. 541 -545.

16. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids from tumour cells: an FTIR reflectance study / Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Ya., Repnytska O.P., Shirshov Y.M., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. // Biospectroscopy, USA. 2002. Vol.67. P. 470-486.

17. FTIR reflectance and UV-VIS study of two-water-colloidal solution of C60 fullerene / Andrievsky G.V., Bordyuh A., Dovbeshko G.I., Klochkov V.K. // Chemical Physics Letters. 2002. Vol. 364. P. 8-17.

18. The SEIRA spectroscopy data of nucleic acids and phospholipids from sensitive- and drug-resistant rat tumours / Chekhun V. F., Solyanik G. I., Kulik G.I., Tryndiak V.P., Todor I.N., Dovbeshko G.I., Repnytska O.P. // Journal of Experimental Clinical Cancer Research. 2002. Vol.21, №4. P. 599-607.

19. Interaction of nucleic acids and lipids from tumour cells with anticancer drugs: an SEIRA spectroscopy data / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndyak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I., Chehun V.F. // Frontiers of Multifunctional Nanosystems, Eds.: E.Buzaneva, P.Scharff., Amsterdam: Kluwer Academic Piblishers. 2002. P. 265-280.

20. Structure transition in lipids and nucleic acids of tumour cells under anti-cancer drugs application / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M. // Proceedings of SPIE. 2003. Vol. 5257. P. 320-328.

21. DNA interaction with single-walled carbon nanotubes: a SEIRA study / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Obraztsova E.D., Shtogun Y.V. // Chemical Physics Letters. 2003. Vol. 372. P. 432 - 437.

22. Study of DNA interaction with carbon nanotubes / Dovbeshko G.I., Repnytska O. P., Obraztsova E. D., Shtogun Y.V., Andreev E.O. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 2003. V.6, №1. P. 105-108.

23. Dovbeshko G.I. Role of low-frequency modes in the formation of dielectric function of b-alanine molecular crystal / Dovbeshko G.I., Grydyakina O.V., Romanyuk V.R. // Ukrainian Journal of Physical Optics. 2003. Vol.4, N1. P. 27-37.

24. Structural organisation of nucleic acids from tumour cells / Repnytska O.P., Dovbeshko G.I., Tryndiak V.P., Todor I.M. and Kosenkov D.V. // Faraday Discuss. 2004. Vol. 126. P. 61 - 76.

25. Vibrational spectroscopy and principal component analysis for conformational study of virus nucleic acids / Dovbeshko G.I., Repnytska O., Pererva T., Miruta A., Kosenkov D. // Proceedings of SPIE. 2004. Vol. 5507. P. 309-316.

26. Biological molecule conformations probed and enhanced by metal and carbon nanostructures: SEIRA, AFM and SPR data / Dovbeshko G., Chegel V.I., Paschuk O.P., Shirshov Yu.M, Nazarova A., Kosenkov D., Fesenko O. // Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems; eds.: E. Buzaneva, P. Scharff. Kluwer Academic Publishers, 2004. P. 447-466.

27. Спектроскопічні дослідження взаємодії ДНК з флуореновими барвниками / Пржонська В., Бондар М.В., Довбешко Г.І., Репницька О.П., Триндяк В.П., Тодор І.М., Белфілд К.Д. // Укр. фіз. журнал. 2004. T.49, № 7. C. 636 - 647.

28. Gold and Colloidal Gold Surface Influence on DNA Conformational Changes / Dovbeshko G.I., Gnatyuk O.P., Chegel V.I., Shirshov Y.M., Kosenkov D.V., Andreev E.A., Tajmir-Riahi H.A., Litvin P. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics & Optoelectronics. 2004. Vol.7, №3. P. 318 - 325.

29. Synthesis of carbon nanotubes from chlorine-containing precursor and their properties / Brichka S.Ya., Prikhod'ko G.P., Sementsov Yu.I., Brichka A.V., Paschuk O.P., Dovbeshko G.I. // Carbon. 2004. Vol.42. P. 2581-2587.

30. The enhancement of optical processes near rough surface of metals / Dovbeshko G.I., Fesenko O.M., Shirshov Yu.M., Chegel V.I. // Semiconductor, Quantum Electronics and Optoelectronics. 2004. Vol. 7, №4. P. 411-424.

31. Vibrational spectra of carbonaceous materials: a SEIRA spectroscopy versus FTIR and Raman / Dovbeshko G.I., Gnatyuk O.P., Nazarova A.A., Sementsov Yu.I., Obraztsova E.D. // Fullerenes, Nanotubes and carbon nanostructures. 2005. Vol.13, № 1. P. 393-400.

32. Effect of nanostructured gold surface on the SEIRA spectra of nucleic acid, Albumin, a-Glycine and Guanine / Dovbeshko G., Fesenko O., Chegel V., Shirshov Yu., Kosenkov D., Nazarova A. // Asian Chemistry Letter. 2006. Vol. 10, № 1 - 2. P. 33 - 44.

33. Реактивність одностіних вуглецевих нанотрубок при взаємодії з біологічними макромолекулами - ДНК і білками. / Довбешко Г.І., Образцова О.Д., Фесенко О.М., Яковкін К.І. // Sensor Electronics and Microsystem Technologies. 2006. Vol. 1. P. 36 - 46.

34. Dovbeshko G. Effect of nanostructured metal surface on SEIRA spectra of albumin and nucleic acids / Dovbeshko G., Fesenko O., Nazarova A. // Journal of Physical Studies. 2006. Vol. 10, №2. P. 127 - 134.

35. Shtogun Ya.V. Adsorption of Adenine and Thymine and Their Radicals on Single-Wall Carbon Nanotubes / Shtogun Ya.V., Woods L. M., Dovbeshko G.I.// J. Phys. Chem. C.2007.Vol. 111.P. 18174-18181.

АНОТАЦІЯ

Довбешко Г.І. "Молекулярні механізми взаємодії біомолекул з наноструктурами, лігандами та малими дозами мікрохвильового та радіаційного випромінювання". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2009.

Дисертацію присвячено дослідженню молекулярних механізмів взаємодії біомолекул з металічними та вуглецевими наноструктурами, протипухлинними препаратами та малими дозами іонізуючого та мікрохвильового випромінювання. Запропоновано та застосовано нову методику підсиленого інфрачервоного поглинання молекул поблизу наноструктурованих металічних поверхонь (SEIRA) для детектування малих кількостей біомолекул та визначення конформаційних станів ДНК та білків. Застосування розроблених нами наноструктурованих золотих поверхонь допомогло виявити особливості структурної організації нуклеїнових кислот, екстрагованих з пухлин різного ступеня злоякісності, а також резистентних та чутливих штамів до та після дії протипухлинних препаратів in vivo та in vitro.

Виявлено, що молекулярний механізм дії малих доз (1-57 сГр) радіаційного опромінення на тварини полягає в ушкодженні первинної та вторинної структури ДНК. Дослідження дії слабких доз (1-100 мВт/см²) мікрохвильового випромінювання в діапазоні 37-78 ГГц на оптичні та поляризаційні властивості модельних біологічних структур вказує на поляризаційний механізм дії мікрохвиль.

Визначено конформаційні стани, можливі місця зв'язування та енергетичні характеристики ДНК та білків, адсорбованих на вуглецевих одностінних нанотрубках та металічних наноструктурах.

Ключові слова: Фур'є-ІЧ спектроскопія, SEIRA-спектроскопія, плазмони, РНК, ДНК, альбумін, іонізуюче випромінювання, мікрохвильові поля, канцерогенез, структурні пошкодження, протипухлинні препарати, металічні та вуглецеві наноструктури.

АННОТАЦИЯ

Довбешко Г.И. "Молекулярные механизмы взаимодействия биомолекул с наноструктурами, лигандами, малыми дозами микроволнового и радиационного излучения".- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени доктора физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2009.

Диссертационная работа посвящена исследованию молекулярных механизмов взаимодействия биологических молекул с металлическими и углеродными наноструктурами, противоопухолевыми препаратами и малыми дозами ионизирующего и микроволнового излучения в экспериментах in vivo и in vitro. Предложена и применена новая методика усиленного инфракрасного (ИК) поглощения молекул вблизи наноструктурированных металлических поверхностей (SEIRA) для детектирования малых количеств биологических молекул, а также определения конформационных состояний ДНК и белков. Проведено исследование влияния ряда факторов (типа и топологии поверхности, способов осаждения, структуры молекул) на усиление ИК поглощения биомолекул (гуанина, глицина, белка, ДНК), адсорбированных на наноструктурированную поверхность металла. Определены условия изготовления металлических поверхностей и способы осаждения молекул для получения максимального усиления сигнала в ИК-спектрах. Максимальное усиление было обнаружено для пленок золота толщиной 200-300 Е с средней высотой шероховатостей 20-50 Е и диаметром 200-900 Е. Доказана высокая чувствительность этой методики и правомочность её использования для спектроскопических исследований биологических объектов. На базе этих исследований разработаны золотые наноструктурированные подложки, которые хорошо усиливают ИК-поглощения молекулярных групп биологических молекул и эффективно используются в практике ИК-спектроскопии. Благодаря разработанной методике удается достичь усиление в 3-15 раз для многослойных пленок разных молекул и значительное усиление (порядка 100 раз) для монослоев бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Применение наноструктурированных золотых поверхностей дало возможность зарегистрировать спектроскопические проявления особенностей в структурной организации нуклеиновых кислот, экстрагированных из опухолей разной степени злокачественности, а также резистентных и чувствительных штаммов до и после действия противоопухолевых препаратов. Основываясь на спектральных особенностях, сформулированы признаки структурных повреждений нуклеиновых кислот из опухолевых тканей. Они заключаются в появлении большего числа разрешенных полос поглощения; в смещении и перераспределении вкладов интегральных компонент полосы антисимметричного и симметричного колебания РО2- в области 1000-1300 см^-1; появлении маркерных полос поглощения, которые относятся к С3Ч-ендо, С2Ч-ендо и неканоническим для ДНК конформациям сахаров, перераспределении вкладов ОН и NH водородосвязанных молекулярных групп; возрастании интегральной интенсивности валентных колебаний групп СН. Все эти признаки указывают на разупорядочение структуры РНК и ДНК из опухолевых клеток. В экспериментах in vivo показано, что ДНК из чувствительных тканей имеет все эти особенности, в то же время ДНК из резистентных тканей близка по структуре к канонической форме. Действие противоопухолевых препаратов изменяет структуру ДНК из чувствительных тканей, но слабо влияет на структуру ДНК из резистентных тканей. Изучение ИК спектров показало, что под действием противоопухолевых препаратов - цис-платины и доксорубицина, структура фосфолипидов из разных штаммов опухолевых тканей в экспериментах in vivo и in vivo модифицируется действием цис-платины и слабо подвержена действию доксорубицина.

Показано in vivo, что в случае воздействия слабых доз ионизирующего облучения (1-57 сГр) возникают повреждения вторичной структуры, которые заключаются в перераспределении сетки водородных связей, разупорядочении в структуре, ослаблении связей и появлении потенциальных мест разрывов. Влияние сильных доз облучения (2-200 Гр) приводит к разрывам в сахарофосфатном остове и к возможным изменениям конформаций отдельных областей ДНК.

Исследовано действие слабых доз (1-100мВт/см²) микроволнового излучения на коэффициент отражения, показатель преломления, дипольный момент в модельных биологических структурах - кристаллах аминокислот, растворе плазмы крови, монослоях альбумина, фосфолипидов. На примере в-аланина показано, что диэлектрическая проницаемость кристаллов с водородными связями формируется существенными вкладами колебаний в низкочастотном диапазоне спектра, а именно ниже 400 см^-1.

Исследованы структурные и конформационные изменения в ДНК, её составляющих и в белках, которые адсорбированы на одностенные углеродные нанотрубки (УНТ) и металлические наноструктуры. Анализ данных позволил сделать выводы о характере нековалентных взаимодействий в системе УНТ-биомолекула и показал, что при взаимодействии ДНК с нанотрубками происходит их связывание на поверхности нанотрубки с образованием достаточно стабильных комплексов при участии Ван-дер-Ваальсового взаимодействия, в котором p-стэкингу отводится основная роль и которое изменяет водородные связи внутри биологической молекулы, перестраивая ее структуру. Нанотрубка навязывает перестройки в структуре БСА и рибонуклеазы А, уменьшая вклад основной фазы - в БСА это -спираль, а в рибонуклеазе - в-слой, увеличивает число поворотов, не основных фаз и боковых цепей. Адсорбция альбумина на нанотрубку предположительно происходит на обычные места связывания этого белка за счет гидрофобного взаимодействия и р-стэкинга.

Ключевые слова: фурье-ИК спектроскопия, SEIRA-спектроскопия, плазмоны, РНК, ДНК, альбумин, ионизирующее излучение, микроволны, канцерогенез, структурные повреждения, противоопухолевые препараты, металлические и углеродные наноструктуры.

SUMMARY

Dovbeshko G.I. Molecular mechanisms of interaction of biological molecules with nanostructures, ligands and low doses of ionizing and microwave irradiation. Manuscript.

A thesis for scientific degree of Doctor of Sciences in Physics and Mathematics by speciality 03.00.02 - Biophysics. - V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2009.

Molecular mechanisms of biological molecule interaction with metal and carbon nanostructures, anti-cancer drugs, as well as with low doses of ionizing and microwave irradiation are studied. A new method based on surface enhanced infrared absorption (SEIRA) of molecules near nanostructured metal surfaces is proposed and used for a detection of small amounts of biological molecules and identification of conformation state for DNA and protein molecules. Application of SEIRA technique with nanostructured gold surfaces developed by us, revealed characteristic features of structural organization of nucleic acids extracted from cancer cells of different malignancy grade, as well as that of sensitive and resistant strains of cells before and after an anti-cancer drug application in vivo and in vitro.

A molecular mechanism of an effect of low doses of ionizing irradiation (1-57 cGy) on model animals is revealed to induce damages in primary and secondary DNA structures. An effect of low doses (1-100 mW/cm2) of microwave irradiation in the range of 37-78 GHz on optical and polarization properties for model biological systems indicates to polarization mechanism of microwave influence.

Structural and conformation changes in DNA, its building blocks and proteins adsorbed on single-walled carbon nanotubes and gold nanostructures, possible sites of interaction, energetic parameters are studied.

Keу words: Fourie transform IR spectroscopy, SEIRA spectroscopy, plasmons, RNA, DNA, albumin, ionizing radiation, microwaves, carcinogenesis, structural damage, anti-cancer drugs, metal and carbon nanostructures.

Размещено на Allbest.ru