Наблюдения на одиночных нервных и мышечных волокнах

РЕФЕРАТ ПО ФИЗИКЕ

НАБЛЮДЕНИЯ НА ОДИНОЧНЫХ НЕРВНЫХ И МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКНАХ

МОСКВА, 2009

Изолированное нервное или мышечное волокно, например волокно портняжной мышцы лягушки или гигантский аксон кальмара, помещают в подходящий солевой раствор а нервное волокно кальмара или иного морского беспозвоночного -- в обычную морскую воду). Как и раньше, применяют две пары электродов -- одну для раздражения и другую для регистрации ответа. Электроды представляют собой покрытые хлоридом серебра серебряные проволочки, соединенные с различными пипетками. В каждой паре одна пипетка сделана из очень тонкой капиллярной трубочки, у которой диаметр кончика настолько мал, что его можно ввести внутрь волокна, а другая пипетка -- из трубки обычных размеров, образующей жидкостный контакт с окружающим волокно раствором. Одна пара электродов соединена с импульсным стимулятором, который используется для раздражения клетки током. Другая пара отводит потенциалы от клетки к катодному повторителю, усилителю напряжения и осциллоскопу для регистрации разностей потенциалов. Эти пипетки наполнены концентрированным раствором КС1, что создает два важных преимущества. Прежде всего, концентрированный солевой раствор служит для того, чтобы по возможности уменьшить электродное сопротивление очень тонкой микропипетки, хотя его редко удается сделать значительно меньше 10--20 Мом. Как уже говорилось, высокое сопротивление электродов может вести к существенному искажению регистрируемого сигнала, особенно тогда, когда входная лампа усилителя создает емкостный шунт. При использовании электродов с сопротивлением 10--20 Мом важно иметь катодный повторитель, который нейтрализует ток между сеткой и катодом, что позволяет передавать сигнал с минимальным искажением или ослаблением.

Второе преимущество использования концентрированного раствора КС1 состоит в том, что это позволяет избежать возникновения диффузионных потенциалов, обусловленных неодинаковой подвижностью различных ионов на границах разных электролитов.

При соприкосновении двух растворов, содержащих разные соли или одну и ту же соль в разных концентрациях, растворенные вещества диффундируют через границу между жидкостями. Диффузия представляет собой процесс беспорядочного теплового движения, при котором частицы -- молекулы или ионы -- обычно перемещаются независимо друг от друга. Если положительно заряженный ион какой-то соли обладает большей подвижностью, то он проявляет тенденцию передвигаться вниз по градиенту концентрации быстрее, чем его отрицательно заряженный партнер, но существенного разделения ионов при этом произойти не может, так как сразу же после начала диффузии между ними возникнет большая электростатическая сила притяжения. Таким образом, устанавливается временное равновесие между тепловым движением, под влиянием которого ионы, обладающие неодинаковой подвижностью, стремятся разделиться, и электродвижущей силой, противодействующей разделению противоположно заряженных ионов. Диффузионные потенциалы, как правило, значительно меньше, чем электродные потенциалы, возникающие на границе металл/жидкость или на границе между хлорированным серебряным электродом или каломельным электродом и раствором. Поэтому всегда желательно устраивать жидкостный контакт с нервом или мышцей с помощью пипетки и помещать металлические контакты дальше по цепи, причем так, чтобы они находились в постоянной среде.

Даже и в этом случае потенциал жидкостного соединения может вносить серьезные ошибки, когда в ходе эксперимента кончик регистрирующей пипетки вводят из наружного раствора в цитоплазму клетки, имеющую совсем иной ионный состав. Это создает весьма серьезную проблему, в связи с чем возникали большие споры относительно интерпретации измерений клеточных потенциалов.

Применение концентрированного раствора КС1 для устранения диффузионных потенциалов прочно вошло в практику; оно основано на том, что подвижность ионов калия и хлора почти одинакова. Если их концентрация намного выше концентраций веществ, растворенных в смежной среде, то быстрая диффузия ионов К⁺ и С1" будет гасить любую разность потенциалов, которую могли бы создать эти вещества. Однако при использовании очень тонких пипеток возникают некоторые трудности, так как кончики их легко засоряются заряженными частицами, что приводит к непостоянству получаемых результатов. Ввиду этого необходимо тщательно подбирать пипетки и систематически проверять результаты измерений потенциала, проводя их с помощью различных пипеток.

После этого методического отступления вернемся к нашему эксперименту. Все электроды находятся у нас в солевой ванне. Вероятно, будет отмечаться небольшая разность потенциалов между двумя отводящими электродами, обусловленная асимметрией системы, но если эта разность постоянна, ее можно игнорировать. Теперь мы подводим тонкий отводящий электрод к одному из поверхностно расположенных волокон. В момент прокола его оболочки на экране осциллоскопа видно внезапное отклонение. Когда кончик микропипетки входит в цитоплазму, он" оказывается в среде с более низким электрическим потенциалом, от --60 до --90 в по отношению к наружной жидкости. Обычно эта разность потенциалов остается на постоянном уровне все время, пока микроэлектрод находится внутри волокна, если только это волокно или связанные с ним нейроны не подвергаются раздражению. Так называемый потенциал покоя, о существовании которого известно уже более ста лет, хотя раньше его измеряли с меньшей точностью и менее прямыми методами. Та же разность потенциалов обнаруживается во всех других точках, где бы мы ни ввели электрод в покоящуюся клетку. Если не считать некоторых интересных исключений, разности потенциалов никогда не отмечались внутри цитоплазмы: в покоящейся клетке они имеются только между цитоплазмой и наружной поверхностью клеточной мембраны.

Продолжая наш эксперимент, мы используем вторую пару электродов и пропускаем кратковременный ток с помощью тонкой пипетки, соединенной с катодом генератора импульсов. Мы приближаем микропипетку к тому же волокну и в конце концов вводим ее внутрь цитоплазмы на небольшом расстоянии от введенного ранее отводящего электрода. До тех пор пока раздражающий электрод находится в наружном растворе, осциллоскоп не показывает никаких отклонений, кроме мгновенного «артефакта», улавливаемого паразитными емкостями в начале и в конце импульса. Но когда этот электрод проникает в цитоплазму, импульс тока начинает проходить через обладающую высоким сопротивлением поверхность волокна и при этом вызывает большое снижение потенциала, которое отмечается на экране осциллоскопа. Этот сигнал во временной развертке имеет характерную округленную форму, что отличает его от мгновенного подъема и спада «прямоугольного» раздражающего тока. Такое подпороговое изменение потенциала, регистрируемое поблизости от раздражающего электрода и не распространяющееся дальше, уже давно известно под названием электротонического потенциала.

Описанные выше наблюдения показывают, что поверхность волокна содержит слой, в котором имеется большой градиент потенциала, и что электрическое сопротивление этого слоя достаточно высоко, чтобы при прохождении через него слабого тока возникала большая разность потенциалов. Если увеличивать расстояние по длине волокна между раздражающим и отводящим микроэлектродами, то окажется, что получаемый последним сигнал быстро затухает, уменьшаясь вдвое.

Раздражающий и отводящий микроэлектроды вводят в аксон рядом н затем воздействуют прямоугольными толчками тока, вызывающими «электротонические» потенциалы и -- в случае, если сила тока достаточна и он протекает через мембрану аксона изнутри наружу,-- потенциалы действия на каждом участке длиной 1--2 мм. Такого рода измерения проводили для определения «кабельных констант» волокна и особенно поперечного сопротивления утечки его поверхностной мембраны и продольного сопротивления цитоплазмы. Тот факт, что электрический импульс в волокне начинается и кончается более плавно, чем импульс раздражающего тока, показывает, что мембрана характеризуется определенным временем «зарядки». Она обладает свойствами «конденсатора с утечкой», напряжение которого отстает от изменений проходящего через него тока с постоянной времени, зависящей от емкости и сопротивления мембраны. Чем дальше от места возникновения сигнала мы его регистрируем, тем слабее он становится. Измеряя это ослабление, можно определить величину мембранной емкости.

Локальные изменения мембранного потенциала, вызываемые толчком тока. На схеме А показаны направление токов и положение раздражающего и регистрирующего электродов, введенных близко друг к другу в одиночный аксон. Б -- электрическая схема, соответствующая распределенным сопротивлению и емкости аксоплазмы и мембраны аксона. В -- прямоугольный толчок тока и вызываемое им изменение мембранного потенциала, записанные на разных расстояниях от раздражающего электрода.

Описанные явления наблюдаются тогда, когда импульсы тока направлены через мембрану волокна внутрь и повышают трансмембранную разность потенциалов по сравнению с уровнем покоя, т. е. гиперполяризуют мембрану. Если удвоить силу тока, электрический сигнал также увеличится вдвое, но его форма во времени и характер затухания по длине волокна не изменятся. Если изменить направление раздражающего тока на обратное и производить раздражение очень слабым током, то снова получится тот же локальный феномен, но с обратным знаком. Однако с увеличением силы тока электрический сигнал изменяет свой характер и начинает приближаться к точке, электрической неустойчивости, называемой порогом.

В этой точке мембранный потенциал обычно составляет 50 мв с отрицательным полюсом внутри. Если снять приложенный ток, потенциал не возвратится тотчас же к своему устойчивому уровню покоя. Произойдет одно из двух: либо через некоторый небольшой, но непостоянный промежуток времени деполяризация уменьшится и исчезнет, либо потенциал будет автоматически стремительно возрастать и произойдет гораздо большее его изменение -- возникнет потенциал действия, или спайк. Этот процесс уже н« контролируется первоначально приложенным импульсом тока; это кратковременное самоусиливающееся изменение потенциала, которое превышает его пороговое смещение в 4--10 раз и переходит за нулевую линию¹. В наивысшей точке он достигает уровня 40--50 т с положительным полюсом, внутри, а затем быстро возвращается к уровню покоя. Если этот потенциал действия возник, то он распространяется по всей длине волокна с постоянной скоростью и без ослабления. Затем наступает короткий рефрактерный период -- «период молчания» длительностью в одну или несколько миллисекунд, во время которого волокно не способно проводить второй сигнал. После этого система готова к повторному возбуждению и в ней может возникнуть следующий распространяющийся импульс.

Если регистрировать электрическую реакцию нервного волокна на достаточном расстоянии от точки раздражения, подпороговая реакция не отмечается вовсе. Но при силе раздражения выше пороговой к отводящему электроду придет распространяющийся потенциал действия «в полном виде», причем его амплитуда и форма не будут зависеть от вызвавшего его раздражения. Это явление было названо реакцией типа «все или ничего»; так говорят о потенциале, распространяющемся по отдельному волокну, который можно зарегистрировать на любом расстоянии от места его первоначального возникновения. Реакция такого типа указывает на то, что мы имеем дело с процессом, который, будучи инициирован пусковым механизмом, в дальнейшем сам себя поддерживает.

Методика только что описанных экспериментов могла бы вызвать следующие сомнения: 1) возможно, что изолированная ткань, изучаемая в искусственной среде, дает аномальные реакции, и 2) введение в клетку микроэлектродов может серьезно расстроить систему, которую мы хотим исследовать.

Действительно, изолированные нервные и мышечные ткани, даже принадлежащие холоднокровным животным, не находятся в идеальном стационарном состоянии. На протяжении многих часов функция их постепенно ухудшается. Скорость этой деградации зависит от таких разнообразных факторов, как мастерство экспериментатора, достаточное или недостаточное снабжение ткани кислородом, толщина препарата, температура и состав раствора, в котором он находится, и т. п.

Раздражение и регистрация производились с помощью внутриклеточных микроэлектродов, находившихся на большом расстоянии друг от Друга. После введения регистрирующего электрода производили восемь очень коротких электрических толчков различной полярности и силы. Если ток имеет надлежащее направление н его сила превышает критический пороговый уровень, возникает потенциал действия стандартной величины.

Однако при надлежащих условиях ткань можно поддерживать в состоянии, достаточно стационарном для наших экспериментов. Например, если изолированную портняжную мышцу лягушки держать при низкой температуре в растворе Рингера, то она может в течение нескольких дней давать ответы постоянной величины на электрическое раздражение и содержание в ней калия остается почти нормальным. Гигантские аксоны кальмара можно выделять и сохранять в морской воде при комнатной температуре несколько часов, и за это время они способны провести несколько сот тысяч импульсов почти такой же амплитуды, как и в предварительных опытах in situ. Это особенно поразительно, если учесть, что такие аксоны фактически представляют собой лишь фрагменты одиночных клеток; они отделены от центрального тела клетки и ядра, а также от своих периферических разветвлений и соединений с мышцами. Эти волокна после их выделения не только остаются в достаточно нормальном функциональном состоянии, но их большая толщина позволяет производить на них различные внутриклеточные «хирургические» операции, вводить в них канюли и пипетки, имплантировать капиллярные электроды для раздражения и для регистрации ответов и перфузировать их внутренность искусственными растворами. Удивительные результаты такого рода получили Бейкер, Ходжкин и Шоу; они показали, что можно механически выдавить большую часть аксоплазмы, заменив ее подходящим раствором солей калия, и после этого аксон все же сохраняет способность генерировать обычные серии потенциалов действия в течение 3--4 час.

Часто ставился вопрос о том, не теряет ли экспериментатор важных познавательных возможностей, ограничивая себя при изучении какого-либо физиологического механизма наблюдениями на изолированных тканях, клетках или частях клеток. На этот вопрос нет общего ответа; ясно, что при таком подходе исследователь исключает ряд существенных факторов -- например, взаимодействия между аксоном и клеточным ядром или между аксоном и соединенными с ним нервными и эффекторными клетками и, конечно, все гормональные влияния, исходящие от удаленных тканей. Такие факторы, несомненно, имеют огромное значение для длительных процессов роста, регенерации и поддержания изучаемых клеток в нормальном состоянии. Но столь же очевидно и то, что если нас интересует просто механизм возникновения нервного импульса и его передачи к мышечным волокнам и от них, то сохранение связей с другими частями организма не обязательно, и в большинстве случаев оно создавало бы для экспериментатора непреодолимые трудности. Изолированный аксон сравнивали иногда с системой, снабженной аккумулятором, который может питать ее током в течение многих часов, но постепенно теряет эту способность при отсутствии устройства для подзарядки. Даже это не совсем верно, так как нервное волокно сохраняет способность «подзаряжать свои аккумуляторы»; используя энергию, освобождающуюся в процессе метаболизма, оно может активно выводить во внешнюю среду натрий против электрического и концентрационного градиентов. Поэтому если искать грубую аналогию, то лучше сравнивать изолированный аксон с системой, содержащей как батарею аккумуляторов, так и устройство для их непрерывной подзарядки; если эта система медленно деградирует, то по иной причине -- вероятно, отчасти потому, что в ней не восполняются запасы «топлива», а отчасти из-за недостаточного восстановления ее постепенно разрушающейся белковой структуры.

Второе возражение -- относительно возможных повреждений мембраны, вызываемых внутриклеточными электродами, -- можно снять с помощью сравнительно простых контрольных экспериментов. При условии что кончик пипетки очень тонок, клетка имеет крупные размеры и окружающая ткань не создает механических помех, введение электрода внутрь клетки не вызывает никаких повреждений. Пипетки с диаметром кончика 0,5 мк, наполненные концентрированным раствором КО, можно вводить в мышечные волокна поперечником 100 мк и держать там в течение многих минут, не вызывая снижения потенциала покоя более чем на 1--2% и не оставляя даже микроскопических следов местного повреждения. Но при попытках применять более толстые пипетки возникают все более серьезные местные повреждения, как только электрод проходит через клеточную мембрану или задевает за ее поверхность. Преимущества прямой регистрации потенциалов с обеих сторон мембраны поистине огромны. Разработка метода внутриклеточной регистрации вместе с использованием гигантских аксонов и меченых ионов фактически создала основу для поразительных успехов.