Основні транскрипційні фактори, які беруть участь у функціонуванні стовбурових клітин. Особливості їх активації та експресії в р-клітинах підшлункової залози (частина 2)

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України»

Основні транскрипційні фактори, які беруть участь у функціонуванні стовбурових клітин. Особливості їх активації та експресії в р-клітинах підшлункової залози (частина 2)

М.Д. Тронько, В.М. Пушкарьов,

О.І. Ковзун, Л.К. Соколова,

В.В. Пушкарьов

Резюме

Трансплантація клітин є найбільш перспективним і фізіологічним підходом до лікування дисфункції ендокринних залоз. Отримані дані свідчать про ефективність застосування стовбурових клітин (stem cells, SC) для лікування низки ендокринних захворювань і, у першу чергу, цукрового діабету (ЦД) 1-го типу. SC це клітини з клоногенним потенціалом, які можуть самостійно відновлюватися та диференціюватися в різні типи клітин. Вони відповідають за регенерацію та розвиток органів і тканин. SC надають багато можливостей для регенеративної медицини та слугують перспективною модельною системою для вивчення ранніх стадій розвитку ембріона людини. З'ясовано багато молекулярних механізмів, що лежать в основі самовідновлення та диференціації SC. Основні сигнальні шляхи, залучені в SC, є JAK/STAT, Notch, MAPK/ERK, PI3K/Akt, NF-kB, Wnt, Hedgehog (Hh), TGF-P та Hippo, які реалізують свою дію через численні, специфічні для кожного шляху транскрипційні фактори. Аналіз їх статусу та послідовності активації, пригнічення і взаємодії надзвичайно важливий в контексті функціонування SC.

Прорив у генерації плюрипотентних клітин із соматичних було досягнуто внаслідок надекспресії специфічних факторів транскрипції. І ембріональні SC (embryonic stem cells, ESC), і індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (induced pluripotent stem cells, iPSC) відрізняються здатністю розмножуватися в недиференційованому стані та диференціюватися в будь-який тип клітин в організмі людини, що відображає їх величезний терапевтичний потенціал.

Розробка протоколів для диференціації плюрипотентних клітин до в-клітин, що виробляють інсулін, вимагає чіткого розуміння участі та перехресної взаємодії цілої низки сигнальних систем клітини та залежних від них транскрипційних

Огляди факторів. У протоколах розвитку P-клітин із плюрипотентних клітин було встановлено шість стадій із використанням специфічних індукуючих факторів. Для оцінки прогресу та ефективності процесу диференціації використовуються специфічні маркери.

Ключові слова: стовбурові клітини, сигнальні шляхи, транскрипційні фактори.

Abstract

Main transcription factors involved in the functioning of stem cells. Characteristics of their activation and expression in the pancreatic p-cells (part 2)

M.D. Tronko, V.M. Pushkarev, O.I. Kovzun, L.K. Sokolova, V.V. Pushkarev, State Institution «V.P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine»

Cell transplantation is the most promising and physiological approach to the treatment of endocrine gland dysfunction. The obtained data indicate the effectiveness of the use of stem cells (SCs) for the treatment of a number of endocrine diseases and, first of all, type 1 diabetes. SCs are cells with clonogenic potential that can self-repair and differentiate into various cell types. They are responsible for the regeneration and development of organs and tissues. SCs offer many opportunities for regenerative medicine and serve as a promising model system for studying the early stages of human embryonic development. Numerous molecular mechanisms underlying SC self-repair and differentiation have been elucidated.

The main signaling pathways involved in SCs are JAK/STAT, Notch, MAPK/ERK, PI3K/Akt, NFkB, Wnt, Hedgehog, TGF-p, and Hippo, which exert their effects through numerous, specific for each pathway transcription factors. Analysis of their status and sequence of activation, suppression and interaction is extremely important in the context of SC functioning. A breakthrough in the generation of pluripotent cells from somatic cells was achieved due to the overexpression of specific transcription factors. Both embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells are distinguished by their ability to proliferate in an undifferentiated state and differentiate into any cell type in the human body, which reflects their enormous therapeutic potential. The development of protocols for differentiating pluripotent cells to insulin-producing p-cells requires a clear understanding of the involvement and cross interaction of a number of cell signaling systems and their transcription factors dependent on them. In the protocols for the development of p-cells from pluripotent cells, six stages were established using specific inducing factors. To assess the progress and effectiveness of differentiation, specific markers are used.

Keywords: stem cells, signaling pathways, transcription factors.

Трансплантація клітин є найбільш перспективним і фізіологічним підходом до лікування дисфункції ендокринних залоз. Отримані дані свідчать про ефективність застосування стовбурових клітин (stem cells, SC) для лікування низки ендокринних захворювань і, у першу чергу, ЦД 1-го типу. Основні сигнальні шляхи, залучені в SC реалізують свою дію через численні специфічні для кожного шляху транскрипційні фактори. Аналіз їх статусу та послідовності активації, пригнічення і взаємодії надзвичайно важливий для розуміння функціонування SC.

Фактор транскрипції с-Myc належить до сімейства регуляторів та протоонкогенів, що кодують основні фактори транскрипції. Головним чином він регулює ріст клітин, проліферацію, диференціювання, клітинний цикл, метаболізм, виживання та апоптоз, а також пухлиноутворення [1-3] (рис. 1). Більш того, він контролює долю пухлинних клітин, індукуючи стовбуровість, блокуючи старіння та диференціювання клітин, а також організовуючи зміни в мікросередовищі пухлини [4, 5].

Myc зазвичай експресується в p-клітинах на дуже низькому рівні та може бути індукований глюкозою мітогеном p-клітин [6]. Ці спостереження поставили два запитання: чи є Myc ключовим регулятором смерті p-клітин при хронічній гіперглікемії та чи здатний Myc стимулювати терапевтичну проліферацію p-клітин? Для відповіді на ці запитання генерували трансгенних мишей із конститутивною або індуцибельною гіперекспресією Myc у p-клітинах. Трансгенні миші, що експресують дуже високі рівні Myc у p-клітинах (у 20-50-кратному діапазоні), демонструють посилення проліферації та апоптозу p-клітин, знижену регуляцію експресії генів інсуліну та розвиток ЦД.

Таким чином, Myc, ймовірно, сприяє токсичності глюкози, коли його експресія в p-клітинах підтримується на дуже високих рівнях. Ці дослідження засвідчили, що підвищена регуляція Myc негативна подія для p-клітин, яка може призвести до руйнування клітин та ЦД, і відкидає ідею використання експресії Myc для збільшення маси p-клітин при ЦД. Дослідження, проведені в останнє десятиліття, показали, що «м'яка» індукція експресії Myc у p-клітин гризунів та людини посилює реплікацію p-клітин без індукції загибелі клітин або втрати секреції інсуліну, а це свідчить що належний рівень Myc може мати терапевтичний потенціал для регенерації p-клітин [7, 8].

c-Myc був спочатку виявлений наприкінці 1970-х років після того, як дослідники виявили гомологію між онкогеном, що передається вірусом мієлоцитоматозу птахів, та людським геном, що надекспресований при різних видах раку. Пізніше відкриття тісно гомологічних генів у людей призвело до додавання n-Myc і l-Myc до цієї родини регуляторних генів та протоонкогенів, які кодують фактори транскрипції [9].

Більшість дослідників була зосереджена на здатності Myc стимулювати ріст і проліферацію клітин шляхом стимуляції прогресування клітинного циклу [10]. Відповідно, Myc посилює експресію циклінів, циклін-залежних кіназ (cyclin-dependent kinases, CDK) та факторів транскрипції E2F, зменшуючи при цьому експресію інгібіторів клітинного циклу [11, 12]. Тому Myc є важливим прогностичним фактором у багатьох типах агресивних видів раку [8, 13, 14]. Проте з роками стало ясно, що цей білок контролює кілька різних функцій всередині клітини (рис. 1). Так, Myc послаблює диференціацію численних типів клітин під час розвитку, таким чином зберігаючи стовбуровість цих клітин. Більш того, хоча Myc і пов'язаний із поділом клітин, його експресія, за умов обмеження факторів росту, сприяє апоптозу [15]. Також Myc впливає на клітинний метаболізм. Експресія Myc стимулює шляхи гліколізу та глутамінолізу, які сприяють проліферації клітин, збільшуючи синтез АТФ, нуклеотидів та жирних кислот, які слугують будівельними матеріалами для поділу клітин [16, 17]. Myc індукує біогенез мітохондрій і посилює мітохондріальну функцію шляхом активації коактиваторів гамма-рецептора, що активується проліфератором пероксисом 1-альфа (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PGC-1), факторів транскрипції мітохондрій, мітохондріальних рецепторів та протеїнкіназ. Він бере участь у стимуляції загального синтезу білка, необхідного для мітозу, шляхом активації РНК-полімераз I, II, III та генів, які беруть участь у біосинтезі рибосом, формуванні структури рибосом та синтезі тРНК і рРНК [3]. У цілому, Myc здійснює багато біологічних дій, необхідних для експансії, виживання та нормального функціонування клітини. Отже, зміни в експресії, послідовності або структурі Myc можуть призвести до зміни поведінки клітин, що призводить до патологій, починаючи від легкої дисфункції до загибелі клітини або утворення пухлини.

Внаслідок такої кількості різних функцій всередині клітини, структура білка Myc дуже складна. Встановлені кілька доменів, які необхідні для його активності [2, 9] (рис. 1). У N-кінцевій області Myc містить транскрипційний домен активації (trans-activating domain, TAD), який разом із боксами Myc, MBI та MBII, необхідний для транскрипційної та трансформаційної активності Myc. Крім того, Myc містить область MBIII, яка відповідає за репресійну активність транскрипції цього фактора. Центральна область містить сигнал ядерної локалізації (nuclear localization signal, NLS) і бокс MBIV, необхідний як для транскрипційної активності Myc, так і для апоптотичного сигналінгу. С-кінцева область Myc складається з базового домену, який забезпечує зв'язування Myc із ДНК, і домену лейцинової застібки, необхідного для зв'язування Myc зі своїм облігатним гетеродимерним партнером, Max. Після того, як утворюється комплекс Myc-Max, Myc зв'язується з послідовностями енхансер-боксу (enhancer box, Е-бокс) (CAC(G/A)TG), і відбувається стимуляція транскрипції на промотор-проксимальному E-боксі [9]. Оскільки E-бокс містить лише 6 bp, це відбувається в геномі з високою випадковою частотою. Відповідно, існує багато тисяч сайтів зв'язування для Myc, а оскільки існує безліч інших факторів транскрипції, які розпізнають E-бокси, існує постійна конкуренція з Myc за зв'язування з ДНК. У p-клітинах одним із таких факторів транскрипції, регуляція якого підвищується у відповідь на глюкозу і який може зв'язуватися з деякими E-бокс-елементами, є зв'язуючий білок елементів відповіді вуглеводів (carbohydrate response element binding protein, ChREBP) [18]. У відповідь на посилений метаболізм глюкози ChREBP зв'язується з елементами відповіді вуглеводів (carbohydrate response elements, ChoRE), які складаються з 2 Е-боксів (або послідовностей, дуже схожих на Е-бокси), розділених 5 bp. Таким чином, можна передбачити, що в контексті подвійних Е-боксів, розділених 5 bp, можуть виникнути обставини, коли Myc та ChREBP конкурують за зв'язування з тим самим сайтом, і лише один фактор транскрипції залишається прив'язаним до конкретного регуляторного локусу. Однак у p-клітинах і Myc, і ChREBP одночасно рекрутуються на глюкозо-респонсивні гени-мішені [19]. Це пояснюється тим, що Myc може взаємодіяти з такими компонентами механізму транскрипції, як домен-асоційований білок трансформації /транскрипції.

Transcription domain-associated protein, TRAAP та позитивний фактор елонгації транскрипції b (positive transcription elongation factor b, p-TEFb), які регулюють ініціацію транскрипції та елонгації відповідно, і без обов'язкового зв'язування з ДНК [20].

Насправді в клітинах раку надекспресія Myc діє як підсилювач практично всіх генів, які активні в цій клітині на момент його надекспресії, і Myc зберігає трансформаційну активність навіть після видалення свого ДНКзв'язуючого домену. У більш фізіологічному контексті, у p-клітинах кількість Myc збільшується приблизно в 1,5-3 рази після підвищення рівня глюкози [6, 7]. Використовуючи декілька праймерів для промотора та сайту початку транскрипції (transcription start site, TSS) прототипу глюкозо-респонсивного гена, Pklr, показано, що ChREBP специфічно рекрутується до ChoRE, близько 200 bp вище TSS. Водночас Myc рекрутується в той же регіон геному, починаючи вище від ChoRE і поширюючись майже на 1000 bp вниз від TSS [19]. Важливо, що в цій області ДНК немає консенсусного Е-боксу, а це свідчить про те, що в цьому випадку Myc не взаємодіє з ДНК безпосередньо. Крім того, активність Myc необхідна для рекрутування ChREBP до ДНК, так що нокдаун Myc із застосування siRNA або хімічного інгібітора блокує здатність ChREBP зв'язуватися з його спорідненим респонсивним елементом [19]. Таким чином, Myc та ChREBP кооперуються в опосередкуванні експресії гена, що реагує в p-клітинах на глюкозу.

Рис. 1. Організація і сигнальний шлях білка Myc [1]

Fig. 1. Myc protein organization [1]

Примітки. Зверху схематичне зображення білка Myc людини з його основними доменами (МВІ та ін.) і взаємодіючими партнерами: зображені основні функціонально охарактеризовані транскрипційно-зв'язувальні партнери Myc, а також основні лігази E3 (SKP2, Fbw7), які беруть участь в обороті Myc (деталі в тексті). Внизу сигнальний шлях Myc: наведено частковий список сигналів навколишнього середовища, які призводять до змін в експресії Myc; показано кілька рівнів, на яких регулюється ген Myc, мРНК і білок Myc; перелічені ефекти Myc, пов'язані з транскрипційною та нетранскрипційною активністю (деталі в тексті). MBI (MBII, MBIII і MBIV) Myc бокс, PEST послідовність білків, багата на пролін, глутамінову кислоту, серин та треонін, NLS сигнал ядерної локалізації, BHLH мотив базова спіраль-петля-спіраль, LZ-лейцинова застібка, TRRAP білок, асоційований із доменом трансформації/транскрипції, GCN5 гістонова ацетилтрансфераза KAT2A, TIP60/48 Tatінтерактивний білок, 60 кДа/48 кДа, SKP2 білок, асоційований з кіназою S-фази 2, MAX myc-асоційований фактор X, MIZ-1 білок із доменом цинкового пальця, що взаємодіє з Myc, TGF-ft трансформуючий фактор росту-ft, CSF1 колонієстимулюючий фактор-!, Wnt сайт інтеграції, пов'язаний із wingless, LIF фактор інгібування лейкемії, PDGF тромбоцитарний фактор росту, SHH білок sonic hedgehog, IL-2 інтерлейкін-2, EGF епідермальний фактор росту.

Notes. Above schematic representation of the human Myc protein with its main domains (MBI, etc.) and interacting partners: depicted are the main functionally characterized transcriptional binding partners of Myc, as well as the main E3 ligases (SKP2, Fbw7) involved in Myc turnover (details in text). Below Myc signaling pathway: the diagram shows a partial list of environmental signals that lead to changes in Myc expression; several levels at which the Myc gene, mRNA, and Myc protein are regulated are shown; the effects of Myc related to transcriptional and non-transcriptional activity are listed (details in text). MBI (MBII, MBIII і MBIV) Myc Box, PEST peptide sequence rich in proline (P), glutamic acid (E), serine (S), and threonine (T), NLS nuclear localization signal, BHLH basic helix-loop-helix motif, LZ leucine zipper, TRRAP transformation/transcription domain-associated protein, GCN5 general control nonderepressible 5 protein, TIP60/48 Tat-interactive protein, 60 kD/48 kD, SKP2 S-phase kinase-associated protein 2, MAX myc-associated factor X, MIZ-1 «Myc-interacting zinc finger» protein, TGF-ft transforming growth factor-ft, CSF1 colony stimulating factor 1, Wnt wingless-related integration site, LIF leukemia inhibitory factor, PDGF platelet-derived growth factor, SHH Sonic hedgehog protein, IL-2 interleukin-2, EGF еpidermal growth factor.

Оскільки зміни в експресії Myc можуть призвести до важливих функціональних наслідків для клітини, рівні Myc жорстко контролюються розвиненою регуляторною мережею. На рівні транскрипції експресія Myc контролюється чотирма різними промоторами та понад 30 факторами транскрипції з багатьох регуляторних шляхів. На рівні трансляції 5' регіон мРНК Myc, що не транслюється, високо структурований і містить ділянку внутрішній сайт зв'язування рибосоми (internal ribosomal entry site, IRES), що дозволяє регулювати трансляцію Myc під час процесів розвитку та у відповідь на генотоксичний стрес [21]. На рівні білка стабільність Myc контролюється кількома убіквітиновими лігазами, що визначає надзвичайно короткий період напівжиття приблизно 20-30 хвилин [22]. Щобільше, посттранскрипційні модифікації, такі як фосфорилювання, убіквітинування та ацетилювання, регулюють стабільність і функцію Myc, а транскрипційна активність Myc під час різних стресів негативно контролюється коротким варіантом Myc «Myc-nick». Важливо, що хоча Myc не димеризується з іншими білками, що містять мотиви базова спіраль петля спіраль лейцинова застібка (basic helix-loop-helix zipper, bHLHZ), відмінними від Max, останній димеризується з іншими білками bHLHZ, такими як сімейство білків Mxd та Mga [7].

Множинні взаємодії Max та білків bHLHZ утворюють розширену мережу, за допомогою якої Myc опосередковує широку транскрипційну відповідь на мітогенні, метаболічні сигнали та зупинку росту. Myc також кооперується з прилеглою lncRNA транслокація варіанта плазмацитоми 1 (plasmacytoma variant translocation 1, PVT1), яка стабілізує білок Myc і потенціює його активність [23]. З іншого боку, було показано, що PVT1 також може діяти як супресор пухлини [24], а отже, PVT1 може або стимулювати, або інгібувати активність Myc залежно від клітинного контексту. Таким чином, регуляторні механізми на багатьох рівнях контролюють експресію Myc через його високу значущість для життя клітини [2, 3, 9, 11, 15, 16, 21, 22].

Промотор Myc пов'язує численні фактори транскрипції, які діють як перемикачі великої кількості шляхів передачі сигналу, інтегруючи клітинні сигнали й опосередковуючи транскрипційну відповідь, яка стимулює ріст і проліферацію клітин, впливає на диференціацію, виживання та плюрипотентність. Шляхи передачі сигналу можуть бути ініційовані гормонами, факторами росту, змінами в обміні речовин або будь-якими змінами в навколишньому середовищі [25]. Індукція Myc потім стимулює експресію інших факторів транскрипції, які потім можуть зв'язуватися з промотором Myc, прискорюючи чи пригнічуючи його активність. Таким чином, промотор Myc поєднаний, регулює та регулюється багатьма мережами зворотного зв'язку. Контроль транскрипції гена Myc і його подальша регуляція на рівні мРНК і білка за допомогою сигналів навколишнього середовища є важливим клітинним датчиком, який надає клітині інформацію, необхідну для виконання критичних функціональних рішень, таких як клітинний ріст, поділ, або загибель клітин. Через їх важливу роль у патофізіології, зусилля дослідників були зосереджені на з'ясуванні регуляції Myc під час клітинного стресу. Щодо ЦД, оскільки постійна гіперглікемія призводить до початкового компенсаторного зростання р-клітин із подальшою функціональною декомпенсацією та загибеллю, регуляція Myc у цих процесах повинна бути ретельно вивчена [7].

FOXA2. Білки Forkhead боксу (Forkhead box, FOX) складаються з великої родини факторів транскрипції, члени якої проявляють функціональне різноманіття і беруть участь у клітинних процесах, починаючи від розвитку до імунітету та обміну речовин [26]. Понад 170 представників сімейства FOX були ідентифіковані з різних видів та класифіковані в 19 підродин (від FOXA до FOXS). FOXA, також відомий як ядерний фактор 3 гепатоцитів (the hepatocyte nuclear factor 3, HNF3), спочатку був відкритий як ключовий регулятор транскрипції в печінці та багатьох тканинах, що походять з ентодерми. Члени підродини FOXA можуть ремоделювати нуклеосоми та, як фактори-піонери, сприяти зв'язуванню з ДНК інших факторів транскрипції [27]. У ссавців підродина FOXA складається з FOXA1 (HNF3a), FOXA2 (HNF3P) та FOXA3 (HNF3y). FOXA2 є головним регулятором експресії генів у печінці, бере участь у транскрипції специфічних для печінки генів та пов'язаних із ними фізіологічних процесах. Отримані дані свідчать про те, що FOXA2 може впливати на проліферацію та інвазивність ракових клітин підшлункової залози (ПШЗ) та діяти як супресор пухлини при раку ПШЗ [28].

Білки сімейства FOX містять відносно консервативний домен, що зв'язує ДНК (DNAbinding domain, DBD), відомий як wingedhelix або forkhead домен. DBD з FOX зазвичай складається з трьох частин: трьох a-спіралей на N-кінці, триланцюгового мотива р-sheet та двох менш консервативних крилатих петель на C-кінці (крила 1 і 2). Основна область розпізнавання ДНК розташована на третій спіралі (Helix 3, Н3), яка зв'язує ДНК, вставляючись у головну канавку ДНК. Послідовність амінокислот H3 демонструє високу гомологію серед усіх членів сімейства FOX. Більшість паралогічних білків FOX зв'язуються з канонічним респонсивним елементом ДНК 5'-RYAAAYA-3' (R = A або G, Y = C або T) [29]. Розбіжність послідовностей у ділянках крила сприяє відмінностям у зв'язуванні ДНК. Області крила містять основні амінокислоти, які розпізнають структури ДНК у флангових регіонах сайту зв'язування FOX, як це показано і для інших сімейств факторів транскрипції [30]. Щодо forkhead білків, нещодавній аналіз даних HT-SELEX продемонстрував, що специфічність зв'язування може покращуватися для моделей, які збільшують нуклеотидну послідовність з особливостями форми ДНК [31].

У мікроерей експериментах щодо зв'язування білків, показано, що forkhead білки мають здатність специфічно зв'язуватись із різними мотивами ДНК.

Повнорозмірний білок FOXA2 людини містить два домени активації транскрипції та forkhead домен. Його DBD характеризується високою гомологією послідовності (95%) з FOXA1 та FOXA3 22. Повногеномний аналіз сайтів, що зв'язують FOXA2 в тканинах печінки людини та миші показав, що FOXA2 зв'язується з консенсусною послідовністю (5'-GTAAACA-3') сімейства FOX [32]. Було визначено ко-кристалічну структуру FOXA2-DBD, зв'язану з 16-bp ДНК, що містить консенсусний сайт (5'-GTAAACA-3') [27].

SOX17. Y-бокс області, що визначає стать 17 (sexdetermining region Y-box 17, SOX17) є фактором транскрипції, що керує специфікою та розвитком примітивної ентодерми, примітивних статевих клітин, дефінітивної ентодерми і згодом бере участь у функціонуванні серцево-судинної системи та органів, що походять з ентодерми. SOX17 належить до підродини SOXF поряд із SOX7 та SOX18. SOX17 не може замінити SOX2 при перепрограмуванні плюрипотентності, але одна міссенс-мутація може перетворити SOX17 у фактор, що індукує плюрипотентність значно перевершуючи ефекти SOX2 [33]. Тому міссенс-мутації можуть змінити дію SOX17 щодо споріднених елементів ДНК, що, своєю чергою, змінює виконання програми експресії генів разом з активацією стану перепрограмування клітин.

SOX17 був спочатку клонований із бібліотек кДНК тканини сім'яників миші та припускали, що він виконує специфічну для певних стадій функцію в сперматогенезі. Ключову роль

SOX17 у розвитку ентодерми було виявлено в Xenopus та в Даніо, під час досліджень делецій генів мишей та його надекспресії в ембріональних стовбурових клітинах. Подальші дослідження встановили, що SOX17 є важливим фактором у серцево-судинній системі, підтримці фетальних гемопоетичних стовбурових клітин (haemopoetic stem cells, HSC) [32] та визначенні артеріальної ідентичності [34]. У ембріонах ссавців SOX17 керує розвитком примітивної ентодерми одним із найперших рішень долі клітин в ембріональному розвитку. У мишей SOX17 спільно експресується з октамер-зв'язуючим транскрипційним фактором 4 (octamer-binding transcription factor 4, OCT4) на 32-клітинній стадії передімплантаційного ембріона й обмежується шаром примітивної ентодерми на стадії пізньої бластоцисти [35]. OCT4 виконує подвійну функцію як активатор розвитку примітивної ентодерми та репресор трофектодермального напрямку. З використанням моделі in vitro, було показано, що ДНК-залежні гетеродимери SOX17/OCT4 спрямовують програми транскрипції, які призводять до специфікації примітивних ентодерм у передімплантаційному розвитку ссавців. Партнерські перемикання OCT4 з SOX2 (епібласт) на SOX17 (екстраембріональна примітивна ентодерма) дозволяють гетеродимерам SOX2/OCT4 vs SOX17/OCT4 зв'язувати альтернативні набори генів-мішеней. SOX17 також може безпосередньо взаємодіяти з OCT4, для визначення зародкової лінії в людей, але не мишей [36]. SOX17 містить консервативний домен високомобільної групи (high mobility group box, HMG-box), що складається з трьох альфаспіралей і подовжених кінцевих хвостів, які приймають L-подібну структуру. HMG-box зв'язує приблизно гептамерну CATTGTC-подібну послідовність розпізнавання, через малу канавку ДНК, використовуючи ультраконсервативний набір амінокислот, що виходять зі спіралей 1 і 2, а також N і С-кінці [37]. Спіраль 3 і С-кінець діють як платформи взаємодії з такими партнерами, як OCT4. Зв'язування з ДНК призводить до серйозної деформації кривини ДНК. З огляду на цей своєрідний спосіб зв'язування, припускають, що SOX-фактори можуть регулювати архітектуру хроматину та петель енхансерів. Також вважають, що HMG-box слугують для підтримки зв'язування ДНК у контексті гістонових октамерів [34].

Крім незалежної укладки HMG-box, деякі фактори SOX містять додаткові функціональні домени, які опосередковують конститутивну або ДНК-залежну димеризацію, трансактивацію та репресію [38]. У випадку SOX 17, ділянки поза HMG-боксами слабо консервативні та складаються з областей малої складності з високою схильністю до внутрішньої дезорганізації, що ускладнює їх вивчення. Домен трансактивації, який є частково консервативним у групі SOXF, був картований на С-кінці SOX17. Немає структурної інформації щодо доменів або мотивів послідовностей поза HMG-box будь-яких білків SOX [34].

Отримані дані, що свідчать про антагонізм сигналінгу SOX17 та сайт в інтеграції, пов'язаним з wingless (wingless-related integration site, WNT) у кількох типах тканин. Було виявлено, що білок Xenopus SOX17 зв'язується з областю ARM р-катеніну і його ектопічне утворення порушує дорсовентральний патерн ембріонів жаб. Взаємодія опосередковується коротким еволюційно консервативним, EFDQYL-подібним пептидом, у межах С-кінцевого домену трансактивації SOX17 [39]. Вважають, що р-катенін діє як кофактор SOX17, що нагадує транскрипційний фактор сімейства Т клітинний фактор/лімфоїдний енхансерний фактор (T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF). Цілком можливо, що SOX17 конкурує з TCF і перенаправляє р-катенін на інші гени-мішені. Цей перерозподіл р-катеніну антагонізує з канонічним сигналінгом WNT і може інактивувати гени, зв'язані з факторами TCF/ LEF. Така модель додатково підтверджується існуванням ділянок зв'язування TCF та SOX17 у домені ARM р-катеніну, які перекриваються. Механізм, за допомогою якого р-катенін діє як «викрадений» ко-активатор SOX17, також міг би пояснити посилену активність перепрограмування плюрипотенції змінених факторів SOX17 (eSOX17), таких як SOX17EK, SOX17FNV [40] та SOX2-C17. Мішенями транскрипційного фактора eSOX17 є гени плюрипотентності, які потенційно можуть залучати р-катенін до ектопічних сайтів і прив'язують його до енхансерів плюрипотентності, що призводить до більш ефективної трансактивації та більш ефективного перепрограмування. Видалення або мутація в мотиві, що забезпечує взаємодію р-катеніну з SOX17EK порушує його активність як високоефективного індуктора плюрипотентності.

Аналогічно, у клітинах-сателітах миші показано, фактори SOXF (SOX7, SOX17 та SOX18), які антагонізують передачу сигналів WNT, сприяють самовідновленню та переходу в стан спокою [41]. Видалення мотиву взаємодії р-катеніну в SOX17 руйнує цю активність. Також було виявлено, що р-катенін стимулює трансактивацію генів-репортерів SOX, тоді як SOX17 репресує репортери р-катеніну/TCF відповідно до моделі, де SOX17 та TCF/LEF конкурують за р-катенін та спрямовують його на різні енхансери [40]. Нарешті, виявлено, що міссенс-мутація p.Y259N на С-кінці SOX17, пов'язана з посиленням функції, є рекурентним генетичним драйвером вроджених аномалій нирок та сечовивідних шляхів. Відомо, що ця мутація спричиняє невідповідне накопичення білка SOX17 та подальше підвищення його ефективності, що інгібує сигналінг WNT, як потенційний механізм захворювання.

Отже, SOX17 антагонізує з канонічним сигналінгом WNT у кількох типах клітин і тканин, безпосередньо взаємодіючи з р-катеніном на рівні білка, що призводить до перемикання транскрипційних програм [34].

NKX6.1. Розуміння біологічних процесів, що лежать в основі механізмів та шляхів регулювання розвитку р-клітин ПШЗ, необхідне для з'ясування патології ЦД, яка характеризується поступовим зменшенням маси р-клітин, що виробляють інсулін. Плюрипотентні стовбурові клітини (pluripotent stem cells, PSC) потенційно можуть забезпечити необмежений запас функціональних р-клітин для клітинної терапії та моделювання хвороб ЦД. Білок NK6 гомеобокс 1 (NK6 homeobox 1, NKX6.1) є фактором транскрипції, який відіграє найважливішу роль у функціонуванні та проліферації р-клітин ПШЗ.

У острівцях ПШЗ людини експресія NKX6.1 є ексклюзивною для р-клітин і не виявляється в інших клітинах острівців. Показано, що активація NKX6.1 у мультипотентних клітинах попередниках ПШЗ, отриманих із PSC (multipotent progenitor cells, MPC), що експресують гомеобокс ПШЗ та дванадцятипалої кишки 1 (pancreatic and duodenal homeobox 1,

PDX1) (PDX1+/NKX6.1+), гарантує їх майбутнє перетворення на моногормональні р-клітини.

Тоді як подальша диференціація MPC, у яких відсутня експресія NKX6.1 (PDX1+/NKX6.1-), призводить до генерації нефункціональних полігормональних р-клітин [41] (рис. 2). Важливість NKX6.1, як вирішального регулятора для специфікації MPC у функціональні р-клітини, заслуговує на подальше дослідження пов'язаних із ним механізмів та вивчення можливості посилення експресії NKX6.1 як засобу для збільшення функції та маси р-клітин. PDX1 (рапегеаїїе and duodenal homeobox 1) та NKX6.1 є двома основними факторами транскрипції, які інтенсивно експресуються як у MPC ПШЗ, так і у функціональних р-клітинах. MPC, отримані з hPSC (hPSC-MPC), спільно експресують PDX1 та NKX6.1 (PDX1+/NKX6.1+), дозрівають у функціональні р-клітини при трансплантації їх в імунодефіцитних мишей і успішно знижують високий рівень глюкози в крові.

З іншого боку, MPC, у яких відсутня експресія NKX6.1, перетворюються на полігормональні клітини та не функціонують належним чином in vivo. Це вказує на те, що експресія NKX6.1 відіграє вирішальну роль у керуванні розвитком MPC у р-клітини [42]. Більш того, специфікація MPC у не-р ендокринну лінію може потребувати пригнічення NKX6.1.

Таким чином, NKX6.1 відіграє незамінну роль у специфікації MPC у зрілі функціональні р-клітини. Крім того, він відіграє важливу роль у підтримці функції дорослих р-клітин ПШЗ. Усі дорослі клітини ПШЗ походять від тих самих MPC, які експресують групу факторів транскрипції, включаючи PDX1, SOX9, FOXA2, NKX6.1, HNF6 та транскрипційний фактор ПШЗ 1 субодиниця альфа (pancreas transcription factor 1 subunit alpha, PTF1A) [41]. Організована експресія ключових факторів транскрипції є обов'язковою для розвитку функціональної ПШЗ ссавців. PDX1, NKX6.1, NKX2.2, білок парного боксу 6 (paired box gene 6, PAX6), нейрогенін 3 (neurogenin 3, NEUROG3), білокенхансер гену інсуліну 1 (insulin gene enhancer protein 1, ISL1) та нейронна диференціація 1 (neuronal differentiation 1, NEUROD1) є одними з основних факторів транскрипції, що контролюють хронологічний розвиток окремих типів ендокринних клітин, що включають острівці Лангерганса. PDX1 та NKX6.1, два фактора транскрипції, експресовані на стадії MPC, визначають генерацію функціональних р-клітин ПШЗ [43].

Рис. 2. Схема, що демонструє функцію NKX6.1 у p-клітинах ПШЗ [41]

Fig. 2. Schematic showing the function of NKX6.1 in pancreatic (3-cells [41]

Примітки: Sur1 рецептор сульфонілсечовини 1, Kir6.2 калієвий канал внутрішнього випрямлення 6.2, Glut2 транспортер глюкози 2, GCK-глюкокіназа, PCX білок піруваткарбоксилази, Nkx6.1 NK6 гомеобокс 1, Ccnd2 циклін D2, AURKA Aurora кіназа А, Nr4a1/3 ядерний рецептор 4A1/3, Rfx6 регуляторний фактор X, 6, MafA MAFтранскрипційний фактор А, Mnx1 гомеобокс мотонейронів та ПШЗ 1, Tle3 -трансдуцин-подібний енхансерний білок 3, G6pc2 глюкоза-6-фосфатаза каталітична субодиниця 2, Ero1lb оксиредуктаза ендоплазматичного ретикулуму 1 бета, Slc30a8 член 8 сімейства транспортерів розчинених речовин 30.

Notes: Sur1 sulfonylurea receptor 1, Kir6.2 potassium inner-rectifying channel 6.2, Glut2 Glucose transporter 2, GCK glucokinase, PCX pyruvate carboxylase protein, Nkx6.1 NK6 homeobox 1, Ccnd2 cyclin D2, AURKA Aurora Kinase A, Nr4a1/3 nuclear receptor 4A1/3, Rfx6 regulatory factor X, 6, MafA MAF transcription factor A, Mnx1 motor neuron and pancreas homeobox 1, Tle3 transducin-like enhancer protein 3, G6pc2 glucose-6phosphatase catalytic subunit 2, Ero1lb endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 beta, Slc30a8 solute carrier family 30 member 8.

Ген NKX6.1 фактора транскрипції, що містить homeobox, був ідентифікований на 4 хромосомі. NKX6.1 уперше виділений із ліній клітин острівців та інсуліноми. Він експресується на ранніх стадіях розвитку ПШЗ, а також у дорослих р-клітинах, де він бере участь у кількох функціях під час розвитку залози. Під час розвитку ПШЗ існують три різні популяції клітин NKX6.1+: клітини-попередники ПШЗ (PDX1+/NKX6.1+), ендокринні клітини-попередники (NGN3+/NKX6.1+) та р-клітини (інсулін+/PDX1+/NKX6.1+). Протягом усього розвитку ПШЗ експресія NKX6.1 зростає в зоні епітелію стовбура ПШЗ, що згодом дає початок ендокринній лінії [43]. Експресія Nkx6.1 починається на 9.5 день ембріона миші (E9.5) в епітелії ПШЗ і триває до E13, де його експресія обмежується р-клітинами. У мишей на E10.5 Nkx6.1 та Ptf1a ко-експресуються у великому відсотку MPC. До E12.5 Nkx6.1 та Ptf1a функціонують за окремими шляхами, оскільки Nkx6.1 міститься виключно у стовбуровій області ПШЗ, що розвивається, яка породжує ендокринну лінію, тоді як Ptf1a повністю причетний до розвитку екзокринних клітин, що походять від tip домену зародкової залози [41].

ДНК-зв'язуючі та трансактиваційні властивості NKX6.1. Існує кілька стратегій за якими Nkx6.1 розпізнає свої конкретні мішені. Аналізи вибору сайтів зв'язування показали, що Nkx6.1 контактує з високоспецифічною послідовністю ДНК, що складається з восьми пар основ. Ця послідовність містить класичне для більшості факторів із гомеодоменом ядро зв'язування 5'TAAT'3. Крім того, консервативність пар основ, що оточують ядро зв'язування, має важливе значення для належної ідентифікації його гомеодоменом Nkx6.1. Зміна навіть в одній парі основ, має великий вплив, зменшуючи спорідненість зв'язування. Специфіка флангових послідовностей може бути причиною звуження потенційних цілей Nkx6.1. Іншою стратегією NKX6.1 для знаходження своєї мішені є домен, що перешкоджає зв'язуванню (binding interference domain, BID).

BID міститься на COOH-кінцевій ділянці гомеодомену NKX6.1. BID може безпосередньо взаємодіяти з ДНК-зв'язуючим доменом. Негативно заряджений COOH може переривати взаємодію між позитивними зарядами в ДНК-зв'язуючому домені та фосфатними групами ДНК. BID може забезпечувати дві важливі властивості Nkx6.1: специфічність та регулювання. NKX6.1 рідше зв'язується з ДНК in vitro, коли функціонує BID і для належного функціонування NKX6.1 необхідна модифікація BID. Взаємодія між NKX6.1 та іншими білками, які зв'язуються поблизу сайту або є частиною комплексу регуляції транскрипції, може забезпечити послаблення гальмування. Щодо модифікації BID, то певні ферменти, такі як кінази, фосфатази або протеази, можуть регулювати його активність. Загалом, NKX6.1 вважається репресором транскрипції. N-кінець NKX6.1 був позначений як домен репресії транскрипції, тоді як С-кінець (BID) відповідає за позитивний зворотний зв'язок або транскрипційну активацію промотора NKX6.1. Промотор NKX6.1 містить послідовність подібну до TAAT-боксу, з якою він зв'язується позитивно саморегулюючи свою експресію [41].

Висхідні та низхідні мішені NKX6.1 пов'язані з розвитком р-клітин. Показано, що в р-клітинах є кілька мішеней NKX6.1, пов'язаних із багатьма функціями. Так, ядерний рецептор 4A1 (nuclear receptor 4A1, Nr4a1, Nur77, TR3) та Nr4a3 є однією з основних мішеней, пов'язаних із проліферацією р-клітин, опосередкованою NKX6.1 [44]. Аналогічно, c-Fos це фактор транскрипції, який регулюється експресією Nkx6.1 у клітинах інсуліноми щурів. Цікаво, що Nr4a1 та Nr4a3 є низхідними мішенями c-Fos. Це означає, що проліферація р-клітин, індукована Nr4a1 та Nr4a3, стимулюється за допомогою Nkx6.1опосередкованої up-регуляції c-Fos [45]. Крім того, показано, що Nkx6.1 безпосередньо контролює експресію важливих для р-клітин генів процесингу інсуліну, включаючи Glut2, G6pc2, Pcx, Ero1lb та Slc30a8. Він також контролює експресію факторів транскрипції, що беруть участь у розвитку p-клітин, включаючи Rfx6, MafA, Mnx1 та трансдуцин-подібний енхансерний білок 3 (transducin-like enhancer protein 3, Tle3). Є дані, що Nkx6.1 контролює регулятори клітинного циклу, цикліни та циклінзалежні кінази; однак нещодавнє дослідження показало, що гени цикліну не регулюються Nkx6.1 [46].

Іншою мішенню, яка асоціюється з опосередкованою NKX6.1 проліферацією p-клітин, є Aurora кіназа А (Aurora Kinase A, AURKA). NKX6.1 зв'язується з промотором AURKA, яка безпосередньо індукується за надекспресії Nkx6.1 у первинних острівцях щурів, що призводить до деградації регулятора клітинного циклу p53. Крім того, було виявлено, що NKX6.1 регулює експресію HNF1a, який експресується як у гепатоцитах, так і під час розвитку ПШЗ. HNF1a є ключовим чинником специфікації ПШЗ [43]. Транскрипція регулюється через TATAподібний бокс та проксимальний a-зв'язуючий сайт фактора гепатоцитів. У p-клітинах NKX6.1 є важливим регулятором HNF1a завдяки його зв'язуванню з промотором HNF1a. Аналіз мутацій сайту зв'язування показав, що 5'-ТААТ-3' є справжнім сайтом зв'язування NKX6.1, який бере участь в ініціації транскрипції HNF1a. NKX6.1 активує HNF1a залежно від концентрації. Надекспресія NKX6.1 у p-клітинах NIT1 призводить до помітного збільшення експресії ендогенного HNF1a в 3 рази порівняно з контролем, а нокдаун NKX6.1 за допомогою специфічної siРНК зменшує експресію HNF1a на 80% порівняно з контролем [47]. трансплантація фізіологічний стовбуровий ендокринний діабет

Мало що відомо про шляхи контролю експресії NKX6.1 під час розвитку p-клітин, особливо в людей. Припускають, що під час розвитку p-клітин ПШЗ NKX6.1 є мішенню PDX1. У PDX1-нульових мишей експресія Nkx6.1 в AURKA епітелії ПШЗ зупиняється. Однак клітини, що експресують Gcg (Glucagon) у дорсальній бруньці ПШЗ на ранніх стадіях, все ще демонструють незначну експресію Nkx6,1. Це означає, що продукція Nkx6.1 у цих подвійних позитивних клітинах Gcg+/Nkx6.1+ не залежить від PDX1. На hPSC досліджували сайти зв'язування PDX1 під час розвитку ПШЗ людини, переважно його роль на ранній стадії MPC, яка не експресує NKX6.1 [48]. Однак на первинних дорослих p-клітинах людини показано, що NKX6.1 є одним із сайтів зв'язування PDX1, що вказує на те, що PDX1 контролює NKX6.1 у p-клітинах людини. Крім того, було показано, що NGN3 опосередковано індукує експресію NKX6.1 шляхом активації PAX4. Було виявлено, що NGN3 зв'язується з регуляторною областю PAX4 для опосередкування його експресії в ендокринних попередниках (EP) [49]. Надекспресія або нокдаун SOX9 у фетальних острівцях людини суттєво впливала на експресію NKX6.1, а згодом і на рівні мРНК інсуліну, що свідчить про важливість SOX9 для експресії NKX6.1 [41].

Nkx2.2. Транскрипційний фактор із сімейства NK2, Nkx2.2, необхідний для розвитку та диференціації ендокринних клітин ПШЗ. Виходячи з ієрархії факторів транскрипції, що спрямовують розвиток ПШЗ, Nkx6.1 є низхідним фактором щодо Nkx2.2 [43] оскільки мутація в Nkx6.1 не призводила до повного блокування диференціації p-клітин, на відміну від ембріонів із мутаціями в Nkx2.2. Це, головним чином, пов'язано з тим, що навіть якщо функція Nkx6.1 порушена, експресія Nkx2.2 зберігається в ПШЗ із мутацією в Nkx6.1 [41]. В іншій роботі показано, що Nkx6.1 безпосередньо регулюється Nkx2,2. Варто відзначити, що в гризунів експресія Nkx2.2 була виявлена в MPC до розвитку ендокринних попередників, тоді як у людей Nkx2.2 не виявлено в MPC фетальної ПШЗ і фактор починає експресуватися після ендокринної індукції [43]. У сукупності ці результати свідчать про видову різницю в експресії та функції NKX6.1 під час розвитку ПШЗ [50].

Nkx2.2 експресується як в a-, так і в p-клітинах. Nkx2.2 регулює експресію aristaless-пов'язаного гомеобоксу (aristaless-related homeobox, ARX) як репресора транскрипції в ендокринних клітинах. Дефіцит Nkx2.2 призводить до серйозної втрати p-клітин і зменшення aі 5-клітин, а також збільшення s-клітин в ембріоні миші. У p-клітинах Nkx2.2 переважно зв'язується з промотором ARX, стан метилювання якого може впливати на специфічність зв'язування за допомогою модифікацій, індукованих ДНК (цитозин-5)-метилтрансферазою 3А (DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A, DNMT3A), що експресується як в a-, так і в p-клітинах. Ідентичність p-клітин підтримується шляхом опосередкованої ДНК-метилуванням репресії ARX.

Nkx2.2 зв'язується з гіперметильованим промотором ARX у комплексі з DNMT3A і рекрутує транскрипційний ко-репресор Tle3 та HDAC1, пригнічуючи ARX у диференційованих P-клітинах. Під час проліферації та регенерації p-клітин регуляторна область ARX підтримується в статусі метилювання, індукованого DNMT1. Метильована область локусу ARX у P-клітинах зв'язується метил-зв'язуючим білком 2 (methyl CpG binding protein 2, MeCP2), який рекрутує гістонову метилтрансферазу (histone methyltransferase, HMT) білкову аргінін метилтрансферазу 6 (protein arginine methyltransferase 6, PRMT6), яка опосередковує метилювання H3R2, що призводить до репресії ARX [50].

Це вказує на те, що переважне рекрутування DNMT3A на промотор ARX залежить від специфічного фактора p-клітин NKX6.1, що підтверджується зв'язуванням останнього з промотором ARX під час специфікації p-клітин. Nkx6.1 та Isl1 регулюють ARX антагоністично, що необхідно для визначення долі ата p-клітин, у яких Nkx6.1 зв'язується з консервативним контрольним доменом Re та пригнічує ARX [51].

Pax4. Фактор транскрипції Pax4 (Paired box 4) білок, який кодується однойменним геном, розташованим у людей на короткому плечі 7-ї хромосоми. Довжина поліпептидного ланцюга білка становить 350 амінокислот, а молекулярна маса 37 833. Кодований геном білок за функціями належить до репресорів, білків розвитку. Залучений до таких біологічних процесів, як транскрипція, регуляція транскрипції, диференціація клітин, альтернативний сплайсинг. Білок має сайт для зв'язування з ДНК. Локалізований у ядрі [50].

Це гомеопротеїн, який функціонує на початку розвитку клітин острівців, сприяючи диференціації рта 5-клітин. Pax4 є незамінним фактором транскрипції для генерації, диференціювання, розвитку та виживання р-подібних клітин ПШЗ (pancreatic p-like cells, ppCs). Про це свідчить спостереження, що в мишей із нокаутом Pax4 відсутня ПШЗ і вони гинуть через 1-2 дні після народження. Останні дослідження підкреслюють важливу роль гена Pax4 в стимулюванні формування ppCs з інших типів клітин, включаючи 5та а-клітини ПШЗ. На основі цих результатів можна припустити, що ген Pax4 синергетично діє з транскрипційними факторами PDX1, NGN3 і MafA, щоб сприяти розвитку ppCs [52].

ARX і Pax4 це пара факторів транскрипції, що взаємно репресують один одного. Pax4 сприяє утворенню pі 5-клітин, тоді як ARX визначає долю а-клітин. Обидва вони діють як транскрипційні репресори, які контролюють рівень експресії іншого, щоб опосередкувати правильний розподіл ендокринних клітин залози. Варто зауважити, що ARX зберігає свою роль у диференціації а-клітин від риб до ссавців, а Pax4 набув своєї суттєвої ролі в диференціації p-клітин досить пізно в еволюції хребетних [53].

ISL1 та Ldb1. ISL1 був виявлений у кількох тканинах і є першим відомим активатором транскрипції ARX в а-клітинах [54]. Результати експериментів показують, що ген ISL1 необхідний для розвитку дорсальної мезенхіми ПШЗ і для утворення та проліферації ендокринних клітин.

LIM домен-зв'язуючий білок 1 (LIM domainbinding protein 1, LDB1) має важливе значення для біологічної активності ISL1 як кофактора [55], що поширюється в ранньому епітелії ПШЗ та навколишній мезенхімі й, нарешті, експресується в зрілих ендокринних та протокових клітинах. Видалення LDB1 в ембріональних ендокринних клітинах призводить до зниженої регуляції експресії ARX [50].

FoxOI. Клітини, що виробляють інсулін (insulinproducing cells, IPC), отримані з ембріональних SC людини (human embryonic stem cells, hESC), мають великий потенціал для клітинної трансплантаційної терапії при ЦД. Було досягнуто величезного прогресу в індукції диференціації hESC в IPC in vitro, для чого широко використовується протокол дефінітивної ентодерми, що імітує розвиток ПШЗ плода. Однак незрілість отриманих IPC обмежує їх подальше застосування в лікуванні ЦД. FoxO1 (Forkhead box O1) бере участь у диференціації та функціональній підтримці p-клітин ПШЗ мишей, але його роль у диференціації p-клітин людини ще з'ясовується.

Отримані дані засвідчили VER-E багатообіцяючий вплив інгібування FoxOl на профіль експресії генів під час диференціації та, своєю чергою, на дозрівання IPC за допомогою модуляції субклітинної локалізації FoxOl та PDX1. Визначено нову роль інгібування FoxOl у сприянні диференціації IPC із hESCs, що може дати ключ для індукції зрілих p-клітин із hESC та клінічного застосування в регенеративній медицині [56]. Водночас, MSC, трансплантовані трансгенним мишам із 50% панкреатектомією, індукували експресію епідермального фактора росту Epidermal growth factor, EGF) і пригнічували прозапальні цитокіни (IFN-y і TNF-a). FOXA2 і PDX-1 у клітинах-попередниках ПШЗ були активовані через сигнальний шлях Akt/ PDX-1/FoxO1 [57].

Родина FoxO еволюційно висококонсервативна і складається в ссавців із чотирьох основних факторів, включаючи FoxO1, FoxO3, FoxO4 та FoxO6. FoxO1 інтенсивно експресується в інсулін-респонсивних тканинах, таких як печінка та ПШЗ, і бере участь у регуляції метаболізму. Нокаут FoxO1 збільшував кількість p-клітин, отриманих із клітин-попередників ПШЗ миші, і сприяв генерації IPC із кишкових ендокринних клітин-попередників [58]. Більш того, інгібування FoxO1 посилювало диференціацію індукованих плюрипотентних SC людини, отриманих з органоїдної культури кишківника, до функціональних IPC та посилювало експресію маркерів p-клітин в IPC, генерованих із зародкових клітин-попередників ПШЗ людини [59] in vitro. Крім того, надмірна експресія FoxO1 у клітинах-попередниках ПШЗ миші призводила до гіпоплазії ПШЗ in vivo. Крім того, FoxO1 є негативним регулятором PDX1 у дорослих p-клітинах, а PDX1 відіграє ключову регуляторну роль у генерації та дозріванні p-клітин в ембріональному періоді. Виходячи з цих спостережень, висловлено припущення, що FoxO1 може брати участь у негативній регуляції при диференціації hESC на функціональні IPC [56].

SOX2. Ген SOX2, розташований на хромосомі 3p26.3-q27 і кодує білок із 317 амінокислот, що складається з трьох основних доменів: домену HMG на N-кінці, домен димеризації (dimerization domain, DIM) в центрі та домен трансактивації TAD на С-кінці. SOX2 відіграє ключову роль у підтримці фенотипу ембріональних стовбурових клітин ESC під час ембріогенезу. Першою подією лінеажної специфікації в ембріоні ссавців є диференціація бластоцист на внутрішню клітинну масу (inner cell mass, ICM) та трофектодерму (trophectoderm, TE). SOX2 розглядається як найраннійший маркер формування ICM і має вирішальне значення для самовідновлення та диференціації ESC. Подальші дослідження показали, що SOX2 кооперується з іншими дозаж-чутливими факторами транскрипції, такими як OCT4 та NANOG, для підтримки стану самовідновлення та пригнічення диференціації ESC шляхом ефективного зв'язування з промотор/енхансерними ділянками та впливу на активацію генів-мішеней [60] Крім того, SOX2 відіграє важливу роль у розвитку трьох зародкових шарів: ентодерми, ектодерми та мезодерми.

SOX2 регулюється на багатьох рівнях. Ген SOX2 ссавців транскрипційно регулюється кількома різними дистальними енхансерами на різних стадіях розвитку зародка. Два ранніх ідентифікованих енхансери SOX2, регуляторні області SOX (SOX regulatory regions, SRR) 1 і 2, впливають на активність промотора SOX2 і виконують специфічні функції, коли клітини знаходяться в недиференційованому стані. SRR1 демонструє активність у промоторних конструкціях, експресованих в ESC, але делеція SRR1 має мінімальний вплив на плюрипотентність SOX2. SRR2 є ще одним енхансером, розташованим на ~2,5 kb нижче області кодування SOX2. Активуючи експресію SOX2, SRR2 не тільки активний в ESC миші, але й служить біомаркером для виділення iPSC людини. Крім того, інші області SRR, розташовані в нижніх дистальних енхансерах, такі як SRR18, SRR107 і SRR111, напевно, взаємодіють із проксимальними енхансерами, утворюючи велику петлю хроматину для посилення транскрипції SOX2 в ESC [61]. Цікаво, що ектопічна надекспресія SOX2 в ESC інгібує ендогенну експресію SOX2 і є тригером диференціювання клітин, а це свідчить про те, що SOX2 може контролювати свою власну експресію за допомогою петлі негативного зворотного зв'язку. Деякі інші члени сімейства SOX також, ймовірно, позитивно регулюють експресію SOX2. Наприклад, SOX4 в кооперації з OCT4 утворює комплекс з енхансером SOX2 і посилює його експресію, таким чином зберігаючи стовбуровість клітин.