Медицинская микробиология

Размещено на http://www.allbest.ru//

1.История микробиологии. Этапы развития. Современные задачи. Вклад российский ученых в развитии микробиологии и иммунологии

1.Эмпирических знаний( до изобретения микроскопов и их применения для изучения микромира).

2.Морфологический период занял около двухсот лет. Антони ван Левенгук в 1675г. впервые описал простейших. Несовершенство микроскопа(максимальное увеличение микроскопов X300)

3.Физиологический период (с 1875г.)- эпоха Л.Пастера и Р.Коха. Л.Пастер- изучение микробиологических основ процессов брожения и гниения, развитие промышленной микробиологии, выяснение роли микроорганизмов в кругообороте веществ в природе, открытие анаэробных микроорганизмов, разработка принципов асептики, методов стерилизации, ослабления (аттенуации) вирулентности и получения вакцин (вакцинных штаммов). Р.Кох- метод выделения чистых культур на твердых питательных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями, открытие возбудителей сибирской язвы, холеры (запятой Коха), туберкулеза (палочки Коха), совершенствование техники микроскопии. Экспериментальное обоснование критериев Хенле, известные как постулаты (триада) Хенле- Коха.

4.Иммунологический период. И.И.Мечников- учение о невосприимчивости (иммунитете), разработав теорию фагоцитоза и обосновав клеточную теорию иммунитета. Одновременно накапливались данные о выработке в организме антител против бакте-рий и их токсинов, позволившие П.Эрлиху разработать гуморальную теорию иммунитета. 1892г. Д.И.Ивановский сообщил, что возбудителем мозаичной болезни табака является фильтрующийся вирус.

5. Следующим важным этапом в развитии микробиологии стало открытие антибио-тиков. В 1929г. А.Флеминг открыл пенициллин и началась эра антибиотикотерапии, приведшая к революционному прогрессу медицины. В дальнейшем выяснилось, что микробы приспосабливаются к антибиотикам, а изучение механизмов лекарственной устойчивости привело к открытию второго- внехромосомного (плазмидного) генома бактерий.Открытие плазмид существенно дополнило представления о формах существования жизни и возможных путях ее эволюции.

6. Современный молекулярно- генетический этап развития микробиологии, вирусологии и иммунологии начался во второй половине 20 века в связи с достижениями генетики и молекулярной биологии, созданием электронного микроскопа. В опытах на бактериях была доказана роль ДНК в передаче наследственных признаков. Подлинную революцию претерпела иммунология, далеко вышедшая за рамки инфекционной иммунологии и ставшая одной из наиболее важных фундаментальных медико- биологических дисциплин. Иммунология вплотную подошла к регулированию механизмов самозащиты организма, коррекции иммунодефицитов, решению проблемы СПИДа, борьбе с онкозаболеваниями. Создаются новые генно- инженерные вакцины, появляются новые данные об открытии инфекционных агентов -- возбудителей “соматических” заболеваний (язвенная болезнь желудка, гастриты, гепатиты, инфаркт миокарда, склероз, отдельные формы бронхиаль-ной астмы, шизофрения и др.). Появилось понятие о новых и возвращающийся инфекциях (emerging and reemerging infections).

Российские ученые. Начало отечественной И. положили работы И. И. Мечникова, А. А. Безредки, Г. Н. Габричевского, Н. Ф. Гамалеи, Л. А. Тарасевича. В 40--60-е гг. проблемы И. успешно решались под руководством Л. А. Зильбера, П. Ф. Здродовского, Г. В. Выгодчикова, М. П. Покровской, В. И. Иоффе.

Здродовский (1890-1976 годаИсследования по проблемам тропических болезней, бруцеллеза и др. Под руководством Здродовского разработаны методы вакцинации против столбняка, дифтерии и др. инфекций. Автор книги "Учение о риккетсиях и риккетсиозах"

Смородинцев, российский вирусолог и иммунолог. Труды по этиологии и профилактике гриппа, энцефалитов и др. вирусных инфекций. Совместно с М. П. Чумаковым разработал и внедрил вакцину против полиомиелита.

Ермольева, российский микробиолог. Получила первые отечественные образцы антибиотиков - пенициллина, стрептомицина и др.; интерферона.

2.Предмет и задачи микробиологии и иммунологии. Клиническая микробиология, ее задачи. Критерии этиологической диагностики. Диагностика нозокомиальных инфекций

Задачи медицинской микробиологии.

1.Установление этиологической (причинной) роли микроорганизмов в норме и патологии.

2.Разработка методов диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний, индикации (выявления) и идентификации (определения) возбудителей.

3. Бактериологический и вирусологический контроль окружающей среды, продуктов питания, соблюдения режима стерилизации и надзор за источниками инфекции в лечебных и детских учреждениях.

4.Контроль за чувствительностью микроорганизмов к антибиотикам и другим лечебным препаратам, состоянием микробиоценозов (микрофлорой) повехностей и полостей тела человека.

4.Методы микробиологической диагностики.

Основные задачи клинической микробиологии

* Выделение и идентификация возбудителя, включая выявление иммунных сдвигов (AT, кожные реакции) у больного.

* Выявление эффективных химиотерапевтических средств на основе результатов лабораторных исследований.

Методы лабораторной диагностики инфекционных агентов многочисленны, к основным можно отнести следующие.

1. Микроскопический- с использованием приборов для микроскопии. Определяют форму, размеры, взаиморасположение микроорганизмов, их структуру, способность окрашиваться определенными красителями.

К основным способам микроскопии можно отнести световую микроскопию (с разновидностями- иммерсионная, темнопольная, фазово -- контрастная, люминесцентная и др.) и электронную микроскопию. К этим методам можно также отнести авторадиографию (изотопный метод выявления).

2.Микробиологический (бактериологический и вирусологический) -- выделение чистой культуры и ее идентификация.

3.Биологический -- заражение лабораторных животных с воспроизведением инфекцион-ного процесса на чувствительных моделях (биопроба).

4.Иммунологический ( варианты -- серологический, аллергологический) -- используется для выявления антигенов возбудителя или антител к ним.

5.Молекулярно- генетический -- ДНК- и РНК- зонды, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и многие другие.

Микробиологическая диагностика внутрибольничных инфекций имеет свои особенности и трудности. В связи с большим разнообразием возбудителей нужно применять различные методы исследования При бактериологической диагностике гнойно-воспалительных заболеваний часто выделяют микробные ассоциации (стафилококки и грамотрицательные бактерии, несколько видов энтеробактерий т.д.) Когда выделяют условно-патогенные микроорганизмы, важно определять их количество в исследуемом материале. Но количество микробов в исследуемом материале может очень различаться. Поэтому важно проводить и видовое идентификацию бактерий и определять их потенциальные патогенные свойства. Необходимо также ставить соответствующие серологические реакции для выявления специфических антигенов в крови больного.

Предмет и задачи иммунологии.

Иммунология - медико-биологическая наука, изучающая реакции организма на чужеродные структуры, механизмы этих реакций, их проявление, течение и исход в норме и патологии, разрабатывающая методы исследования и лечения, основанные на этих реакциях. Этапы развития: 1.Эвристический период. Познание основано на постепенном накоплении фактов и выяснении истины. Попытки предохранения человека от заболевания оспой путем вдыхания, втирания в кожу материала от выздоровевших (вариоляция). Открытие вариоляции; 2. Завершение формирования классической иммунологии, распространение основных положений иммунитета на неинфекционные процессы (трансплантационный и противоопухолевый иммунитет) и создание единой общебиологической теории; 3. Молекулярно-генетический этап (с середины XX в) - развитие молекулярной и клеточной иммунологии, иммуногенетики. Задачи иммунологии: 1. изучение иммунной системы здорового человека; 2. изучение роли ИС в патогенезе инфекционных и неинфекционных заболеваний 3. разработка унифицированных и информативных методов оценки иммунного статуса 4. разработка новых высокоэффективных иммуноактивных препаратов и оптимальных схем их применения. Основным предметом исследований в иммунологии является познание механизмов формирования специфического иммунного ответа организма ко всем чужеродным соединениям.

3. Бактериологическая лаборатория. Классификация и значение. Оборудование рабочего места. Правила поведения в бактериологической лаборатории

Классификация

* бактериологические лаборатории в составе ЛПУ; * бактериологические лаборатории в составе комитетов Госсанэпиднадзора; * учебные бактериологические лаборатории вузов; * проблемные и отраслевые бактериологические лаборатории научно-исследовательских институтов и предприятий по выпуску бактерийных препаратов; * специализированные бактериологические лаборатории по контролю за особо опасными инфекциями; * специализированные бактериологические лаборатории по контролю за отдельными группами бактерий: микобактериями, риккетсиями, лептоспирами и др.

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места

Специфика микробиологических работ требует, чтобы помещение, отведённое под лабораторию, было изолировано от больничных палат, жилых комнат, пищевых блоков. В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и заражённой посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, розлива, стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.В каждой комнате должна быть раковина с водопроводной подводкой и полкой для бутыли с дезинфицирующим раствором.

В одной из комнат оборудуют застеклённый бокс с предбоксником для выполнения работ в асептических условиях. В боксе ставят стол для произведения посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбоксник помещают шкаф для хранения стерильного материала. Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок, реактивов.

Правила работы и поведения в лаборатории

В помещения бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды -- халата и белой шапочки или косынки.

Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания.

Весь материал, поступающий в лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный.

При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или в кюветы.

Переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, наполненным дезинфицирующим раствором.

О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или проливания жидкого заразного материала надо немедленно сообщать заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязнённых патогенным материалом платья частей тела, предметов рабочего места и поверхностей осуществляют немедленно.

При исследовании заразного материала и работе с патогенными культурами микробов необходимо строго соблюдать общепринятые в бактериологической практике технические приёмы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом.

Заражённый материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день. Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас посте их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места.

При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют, а заразный материал и культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят на хранение в запирающийся рефрижератор или сейф.

Работники бактериологической лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, возбудители которых могут встретиться в исследуемых объектах.

4. Основные систематические группы микроорганизмов. Понятия «популяция», «культура», «штамм», «колония», «клон». Бактерии: определение, систематическое положение. Тесты для дифференциации представителей различных семейств бактерий

Популяции микроорганизмов.совокупность особей одного вида, относительно длительно обитающих на определенной территории (в биотопе).

КУЛЬТУРА популяция микроорганизмов на питат. среде, находящаяся в состоянии размножения или закончившая его.

Колонии микроорганизмов, видимые невооруженным глазом скопления клеток (бактерии, дрожжевые грибы) или разрастания мицелия (плесневые грибы) одного вида микроорганизмов; образуются при их размножении или росте на твердом субстрате; имеют вид плоских или выпуклых образований на поверхности плотной питательной среды.

ШТАММ - объединяет мк одного и того же вида, но выделенные из опред источника и в опред время.

КЛОН - это культура мк, полученная из единичной клетки, к/я размножилась и дала начало целой популяции.

Систематическое положение бактерий определяют их размерами, морфологией клеток, характеру роста чистой культуры на разных питательных средах, форме, цвету и поверхности колоний, вырастающих на плотных средах.

Бактерии - хемоорганотрофы по морфологии и окраске по Грамму подразделяются на четыре морфо- и две хромогруппы. Среди морфогупп выделяют: 1. Палочки и кокки, образующие эндоспоры; 2. Спирохеты; 3. Спиралевидные и изогнутые бактерии (спириллы и вибрионы); 4. Актиномицеты и родственные им ветвистые бактерии. В составе хромогрупп выделяют грамположительные и грамотрицательные аэробные бактерии, размножающиеся при широком доступе кислорода, факультативно-анаэробные и анаэробные, развитие которых происходит в бескислородной среде.

Бактерии подразделяют на три класса. Первый класс - Eubacteria - объединяет бактерий, имеющих плотную клеточную стенку и не образующих плодовых тел. В этом классе различают следующие порядки: EubacterialesTrichobacterialesFerribacterialesThiobacteriales

Второй класс - Myxobacteria - объединяет бактерии с тонкой клеточной стенкой и реактивным характером движения, образующие микроцисты и плодовые тела различной формы.

К третьему классу - Hyphomicrobiales - относят клетки, дающие длинные нити, на концах которых образуются почки; отделившиеся почки подвижны.

Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразоваиия, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды.

5.Морфологические формы бактерий. Понятие о морфологических свойствах микроорганизмов. Нитчатые формы бактерий: актиномицеты, нокардии

1. Кокки -- бактерии круглой формы, имеющие в диаметре 1--2 мкм. - микрококки (отдельное изолированное расположение);- диплококки (сцепленные попарно);- тетракокки (сцепленные по четыре);- стрептококки (сцепленные в цепочку);- сарцины (сцепленные в пакеты по 8, 12, 16 и т. д.)- стафилококки (сцепленные беспорядочно в виде виноградной грозди);

2. Бактерии - имеют палочковидную .Бациллами называют палочки, которые способны образовывать споры, не превышающие в диаметре клетку. Клостридиями считают бактерии, способные к образованию спор, значительно превышающих диаметр бактериальной клетки. Палочки, не способные к спорообразованию, называются бактериями (в узком смысле этого слова).

3. Извитые формы. Если бактерия имеет один завиток спирали, она называется вибрионом ( холерный вибрион ). Длина вибрионов 1--3 мкм. Кампилобактерии имеют изгибы тела, напоминающие крылья летящей чайки. Спириллы, спиралевидные, неподвижные микроорганизмы, имеющие более одного завитка, длиной от 5 до 30 мкм .Спирохеты подвижные, извитые формы микроорганизмов. Различают следующие разновидности спирохет: трепонемы имеют 8-12 завитков, симметричны; боррелии имеют 3-8 крупных завитка, не симметричны и лептоспиры, симметричные микроорганизмы имеющие более 10 мелких завитков и 2 крупных изгиба на концах клетки, напоминающие букву S илиC.

Актиномицеты (гр. actis -- луч, гр. mykes -- гриб) долгое время относили к микроскопическим грибам, но подробное изучение их морфологии и биологических свойств позволило отнести их к бактериям. Это тонкие слегка изогнутые палочки, часто образующие нити длиной 10 -- 50 мкм, способные образовывать хорошо развитый мицелий.

Нокардии широко распространены в природе; обычно их выделяют из почвы и с разлагающихся органических субстратов. У человека вызывают оппортунистические инфекции -- нокардиозы.

Микоплазмы (гр. mykes -- гриб, гр. plasma -- имеющие форму) морфологически неоднороды, так как не имеют ригидного слоя в клеточной стенке.

Риккетсии (richettsia)-- полиморфные микроорганизмы. Могут иметь форму палочек, кокков, расположенных одиночно, по двое или в виде коротких цепочек. Иногда встречаются нитевидные (мицеллярные) клетки. Риккетсии относятся к внутриклеточным паразитам.

Хламидии (chlamydis -- плащ, мантия) -- кокковидные микроорганизмы. Инфекционной формой хламидий служат сферические клетки -- элементарные тельца.

6.Структура и химический состав бактериальной клетки. Клеточная стенка, микроорганизмы с дефектной клеточной стенкой, их характеристика, строение, репродукция, методы изучения, роль в патологии человека, лабораторная диагностика

Химический состав бактерий. Пептидогликан, тейхоевые кислоты, липополисахарид - структура, механизмы биологического действия.

В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула, жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.

Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:

Отсутствие ядерной оболочки

Отсутствие ядрышка

Отсутствие гистонов

Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной микроскопии или применение окраски по по способу Фельгена или по Романовскому-Гимза.

Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Цитоплазматическая мембрана учавствует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта вещевств. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.

Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициэнт седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания.

Сложные методы окраски используют для выявления ультраструктурных компонентов бактериальных клеток, имеющих достаточно большие размеры (макрокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки бактерий в зависимости от химического состава и особенностей их тонкой организации (ультраструктуры).

Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, учавствует в процессах обмена веществ и деления клетки.У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.

Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.

Извитые бактерии. Актиномицеты. Микоплазмы. Хламидии. Риккетсии. L-формы бактерий. Извитые бактерии подразделяют на две основные группы: вибрионы и спирохеты. Размножаются делением, почкованием и образованием элементарных телец, обладающих способностью к репродукции.

L-формы бактерий Под воздействием некоторых внешних факторов бактерии могут терять клеточную стенку, образуя L-формы. Форма подобных клеток может быть весьма разнообразной (нитевидной, шаровидной, палочковидной и т.дСоответственно, образование L-форм (равно как и спорообразование) можно рассматривать как важный механизм приспособления бактерий к неблагоприятным условиям.

Серологические исследования на хламидийные инфекции основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови животных (ретроспективная диагностика) в РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА; 2. ПЦР .3. бактериологический

7.Строение и функции цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, рибосом, мезосом бактериальной клетки. Ядерный аппарат бактерий и его особенности

Цитоплазматическая мембрана ( ЦПМ ) состоит из двух слоев липидов и встроенных в лигшдную мембрану белковых молекул. В состав ЦПМ бактерий входят белки (20-75%), липиды (25-40%), углеводы и РНК.Компоненты цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Белки цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) подразделяют на структурные и функциональные. Первые образуют различные структуры цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ), вторые представлены ферментами, участвующими в синтетических реакциях на поверхности мембраны и в окислительно-восстановительных процессах, а также некоторыми специализированными энзимами (например, пермеазы). Липиды, входящие в состав ЦПМ, представлены насыщенными или мононенасыщенными жирными кислотами, но не стеринами, как у эукариотических клеток.

барьерная -- обеспечивает регулируемый, избирательный, пассивный и активный обмен веществ с окружающей средой.

транспортная -- через мембрану происходит транспорт веществ в клетку и из клетки.

механическая -- обеспечивает автономность клетки, ее внутриклеточных структур, также соединение с другими клетками (в тканях). Большую роль в обеспечение механической функции имеют клеточные стенки, а у животных -- межклеточное вещество.

рецепторная -- некоторые белки, находящиеся в мембране, являются рецепторами (молекулами, при помощи которых клетка воспринимает те или иные сигналы).

Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Цитоплазматическая мембрана учавствует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта вещевств. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.

Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициэнт седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания.

Сложные методы окраски используют для выявления ультраструктурных компонентов бактериальных клеток, имеющих достаточно большие размеры (макрокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки бактерий в зависимости от химического состава и особенностей их тонкой организации (ультраструктуры).

Ядерный аппарат бактерий ( генетический материал )

Бактерии не имеют оформленного ядра

Генетический материал ( наследственная информация ) представлен единственной молекулой ДНК , которая имеет вид замкнутого кольца и называется бактериальной хромосомой ( имеет длину около 1 мм. и содержит несколько тысяч генов , что примерно в 500 раз меньше , чем в клетке человека )

Бактериальная хромосома локализована в ядерной области клетки - нуклеоиде

Нуклеоид - ядерная область прокариотической клетки , содержащая её генетический ( наследственный ) материал , представленный одной кольцевой молекулой ДНК не отделён от цитоплазмы мембраной и не имеет постоянной формы ДНК прокариот не имеет гистонов ( нуклепротеидов ) , высших структур и не спирализуется при делении клетки ( все гены , входящие в состав хромосомы транскрибируются с образованием единой матричной-РНК ) - ДНК не имеет интронов и поэтому нет процессинга м-РНККроме бактериальной хромосомы ДНК обнаружены в плазмидах ( эписомах )



8.Споры, капсулы, жгутики, реснички, ворсинки, фимбрии, пили. Функциональное назначение органелл. Методы выявления. Определение подвижности бактерий

Жгутики. Их количество и расположение у разных бактерий неодинаково. Монотрихии имеют только один жгутик (род Vibrio), лофотрихии - пучок жгутиков на одном полюсе клетки (род Pseudomonas), а у амфитрихов жгутики (один или пучок) расположены на обоих полюсах клетки (род Spirillum), а у перитрихов - по всей поверхности (род Escherichia, Salmonella). По своему строению жгутики представляют собой спирально закрученные нити, состоящие из специфического белка флагеллина, который по своей структуре относится к сократительным белкам типа миозина.При окраске по Граму жгутики не видны. Изучать подвижность бактерии можно как с помощью микроскопических методов (фазово-контрастная микроскопия препаратов "висячая" или "раздавленная" капля), так и посевом уколом в полужидкий агар, или специальную среду - среду Пешкова.

Ворсинки, или пили (фимбрии) - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм * 0,3-10 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина. Известно несколько типов пилей. Пили общего типа отвечают за прикрепления к субстрату, питание и водно-солевой обмен. Они многочисленны - несколько сотен на клетку. Половые пили (1-3 на клетку) создают контакт между клетками, осуществляя между ними передачу генетической информации путем конъюгации Особый интерес представляют пили IV типа, у которых концы обладают гидрофобностью, в результате чего они закручиваются, эти пили называют еще кудряшками. Располагаются они по полюсам клетки. Эти пили встречаются у патогенных бактерий. Они обладают антигенными свойствами, осуществляют контакт бактерии с клеткой-хозяином, участвуют в образовании.

Споры - своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры непревышает диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называются клостридиями, например бактерии рода Clostridium (от лат.Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нельсена в красный, а вегетативная клетка - в синий цвет.Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор бывает овальной и шаровидной, расположение в клетке - терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы). Спора долго может сохраняться из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма.

Капсула бактерий - это утолщенный наружный слой клеточной стенки. Капсулы могут быть построены из полисахаридов (пневмококк) или белков (возбудитель сибирской язвы). Большинство бактерий, особенно патогенных, образует капсулу только в организме человека или животных. Однако существует род истинно капсульных бактерий (Klebsiella), представители которого образуют капсулу и при культивировании на искусственных питательных средах. Некоторые бактерии могут иметь микрокапсулу (выявляется только при электронной микроскопии), например, эшерихии, или неявно выраженную способность к капсулообразованию - так называемую "нежную" капсулу, например, золотистые стафилококки, менингококки.Основное предназначение капсул - защита бактерий от фагоцитоза. При окраске мазков по Граму истинно капсульные бактерии имеют характерное взаиморасположение (на расстоянии друг от друга). При световой микроскопии капсулы четко не видны, в связи с чем наличие капсул у бактерий выявляется с помощью специальных методов окраски, например, по методу Гимзе. Для выявления капсул и бактерий, образующих их в организме, используют либо микроскопию мазков, приготовленных из патологического материала или мазков - отпечатков из органов погибших животных.

Подвижность

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

9.Тинкториальные свойства бактерий. Цели и методы окраски

Тинкториальные свойства бактерий, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.

Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную -- фуксин, или синюю -- метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1--2 мин.), метиленовый синий -- медленнее (3--5 мин.). Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.

Окраска по методу Грама:

На фиксированный мазок нанести основной краситель - генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек. Промыть водой. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя. Тонкий слой - грамортицательных - мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным - гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.

Промыть водой.

Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.

Промыть водой.

Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.

Промыть водой, высушить.

В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.

10.Иммерсионный микроскоп. Особенности устройства. Принцип действия. Использование в практике

Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии -- это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.

Иммерсионная система -- оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной.

Иммерсионные объективы. Качество изображения, параметры и оптическая конструкция иммерсионных объективов рассчитываются и выбираются с учетом толщины слоя иммерсии, которая рассматривается как дополнительная линза с соответствующим показателем преломления. Иммерсионная жидкость, расположенная между объектом и фронтальным компонентом объектива, увеличивает угол, под которым рассматривается объект (апертурный угол). Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива не превышает 1,0 (разрешающая способность порядка 0,3 мкм для основной длины волны); иммерсионного -- доходит до 1,40 в зависимости от показателя преломления иммерсии и технологических возможностей изготовления фронтальной линзы .

Иммерсионные объективы больших увеличений имеют короткое фокусное расстояние -- 1,5-2,5 мм при свободном рабочем расстоянии 0,1-0,3 мм (расстояние от плоскости препарата до оправы фронтальной линзы объектива).

Применяются:Кедровое или минеральное масло ,Водный раствор глицерина ,Физиологический раствор ,Вода , Вазелиновое масло ,Йодистый метилен

11.Методы микроскопического исследования (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная микроскопия). Бактериоскопический метод диагностики, ею задачи и возможности

Темнопольная микроскопия

Применяется для прижизненного изучения микроорганизмов в нативных неокрашенных препаратах.Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости эффект Тиндаля) Эффект достигается с помощью специального конденсора ( парабалоид или кардиоид), которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенное поле зрения) видны ярко освященные частицы. Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют, как и для светлого поля,заменяют конденсор на специальный, прибавляют свет до максимума, открывают конденсор до максимума. Для темнопольной микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля»

3.Люминисцентная микроскопия.

Люминисценция - способность некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи сдругой длиной волны.( например, таким свойством обладают ультрафиолетовые лучи). Объект, не видимый в ультрафиолетовом излучении, приобретает яркий блеск после обработки специальными веществами-флюорохромами. Установка для люминисцентной микроскопии состоит из источника света с сине-фиолетовым фильтром и микроскопа. На окуляр микроскопа надевают желтый светофильтр.Преимущества люминисцентной микроскопии:1.цветное изображение2.высокая степень контрастности объектов3.возможность исследования непрозрачных объектов4.возможность исследования динамики жизненных процессов5.обнаружение локализации отдельных микроорганизмов, вирусов6.развитие методов цитогистохимии, экспрессная цитодинамика.

4.Фазово-конртастная микроскопия

Предназначена для нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть прозрачные объекты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое простым глазом. Фазовое устройство состоит из особого конденсора и объектива и обеспечивает преобразование изменение фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различий в оптической плотности объектов.

5.Электронная микроскопия.

Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа.(0,2 мкм). Применяются для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов.

Световые лучи в этом микроскопе заменяют поток е, имеющий 0,005 нм. Высокая разрещающая способность электронного микроскопа (0,1-0,2 нм) позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000.

Микроскопический (бактериоскопический) метод.Суть метода: из исследуемого материала по общепринятой методике готовят мазок, окрашивают его и путем микроскопического изучения обнаруживают микробы, исследуют их морфологические, тинкториальные свойства, расположение микробов в мазке относительно друг друга. Достоинства метода:быстрое получение результатов, техническая и экономическая доступность, простота.

Недостатки метода. Морфология, особенно родственных микроорганизмов, нередко идентична, и они не идентифицируются в световом микроскопе. Под действием ряда факторов внешней среды, в первую очередь, антибиотиков микроорганизмы могут изменять свою характерную морфологию. Концентрация возбудителей может быть чрезвычайно низкой, поэтому они не обнаруживаются, или форменные элементы их маскируют. Эти обстоятельства приводят к тому, что этот метод редко используется как окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он используется как ориентировочный, предварительный метод исследований, а при некоторых видах инфекции он вообще опускается. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о предполагаемом возбудителе, его концентрации, сочетании с сопутствующей микрофлорой, определяет тактику дальнейшего выделения чистой культуры возбудителя.

12.Ферменты бактерий. Понятие о биохимических свойствах микроорганизмов. Автоматическая регуляция синтеза ферментов. Идентификация бактерий по ферментативной активности

Ферменты участвуют во всех обменных процессах. Ферменты делятся на экзоферменты, которые выделяются в окружающую среду, где они расщепляют питательные вещества. Эти вещества поступают внутрь клетки, где расщепляются эндоферментами.

По постоянству действия:

- Ферменты, постоянно участвующие в обменных процессах - конституитивные. Они принимают активное участие в синтезе структурных компонентов.

- Ферменты, действующие только при наличии субстрата - адаптационные: ферменты транспорта и катаболизма лактозы - галактоздпермиаза, -галактозидаза, галактозидацетилтрансфераза.

В целях диагностики определяют такие ферменты: лецитиназа, уреаза, сахараза, мальтаза, гиалуронидаза,

Ферменты патогенности:1) гиалуронидаза - расщепляет ГАГ (матрикс соедин. ткани), что облегчает механическое продвижение по ткани2) уреаза - расщепляет мочевину с образованием аммиака, что помогает выжить в очень кислой среде3) гемагглютинины - запускают агглютинацию крови, что создает благоприятные условия для роста и размножения моргов.4) лецитиназа - расщепляет желток куриного яйца5) пенициллаза - расщепляет пенициллин (первый антибиотик)

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты - специфические белковые катализаторы. 1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно- восстановительные реакции.2. Трансферазы - осуществляют реакции переноса групп атомов.3. Гидролазы - осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.4. Лиазы - катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.5. Лигазы или синтетазы - обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.6. Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.2.Протеолитические.3.Аутолитические.4.Окислительно - восстановительные. 5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Идентификация бактерий по ферментативной активности.

Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3--5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты -- индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.).набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

13.Типы окислительно-восстановительных процессов у бактерий

3. Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов -- АТФ и АДФ.

Органеллами дыхания у большинства бактерий являются производные цитоплазматической мембраны -- мезосомы, на которых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисления является одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать различные микроорганизмы. По этому признаку выделяют 3 группы бактерий:

* 1-я группа -- облигатные аэробы, которые способны получать энергию только путем дыхания и нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород;

* 2-я группа -- облигатные анаэробы -- бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору;

* 3-я группа -- факультативные анаэробы -- бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствие кислорода и использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Среди них могут быть:

* факультативно-анаэробные бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии);

* аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии, которые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (молочнокислые бактерии).

14.Понятие о метаболизме. Анаболизм и катаболизм. Особенности метаболизма у бактерий. Методы изучения метаболизма бактерий. Способы получения энергии бактериями, Мембранное и субстратное фосфорилирование

МЕТАБОЛИЗМ или обмен веществ, химические превращения, протекающие от момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду. АНАБОЛИЗМ ассимиляция, совокупность химич. процессов в живом организме, направленных на образование и обновление структурных частей клеток и тканей. Катаболизм совокупность химических процессов, составляющих противоположную анаболизму сторону обмена веществ; процессы К. направлены на расщепление сложных соединений

По типу питания живые существа делятся на две группы: голозойные и голофитные. Голозойный тип питания характерен для животных (от высших до простейших). Микробы относятся к голофитному типу питания. Они не имеют органов для принятия пищи, и питательные вещества у них проникают через всю поверхность тела.

Различают несколько механизмов питания микробных клеток. Питательные вещества могут поступать из внешней среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Через эти же структуры выделяются и продукты обмена, т. е. ненужные и вредные для микроорганизмов вещества. В основе механизма такого питания лежит осмотическое явление, основанное на разнице концентрации питательных веществ в теле микроба и питательном растворе. Таким образом вода и растворенные в ней питательные вещества поступают в микробную клетку. В результате биосинтеза в ней накапливается пластический материал коллоидной структуры (белки, углеводы и др. вещества), обусловливающий рост и размножение микроорганизма.

Проникновение питательных веществ в клетку может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического специфического переноса питательных веществ. Каждый из этих процессов может протекать как активно, так и пассивно. При пассивной диффузии питательные вещества проникают с током жидкости в клетку и только тогда, когда проникаемое вещество способно растворяться в клеточной стенке бактериальной клетки. При активной диффузии наблюдается проникновение питательных веществ в бактериальную клетку нерастворенными в клеточной стенке.При стереохимическом переносе питательных веществ (из внешней среды в клетку) роль переносчика выполняет пермеаза -- белковый компонент. В этот период питательные вещества среды активно транспортируются в клетку, осуществляя конструктивный и энергетический обмены.

Субстратное фосфорилирование

Реакции, в которых энергия, освобождающаяся на определенных окислительных этапах брожения запасается в молекулах АТФ , получили название субстратного фосфорилирования . Их особенностью является катализирование растворимыми ферментами. Образующийся в восстановительной части окислительно-восстановительных преобразований сбраживаемого субстрата восстановитель ( НАД*Н2 , восстановленный ферредоксин ) переносит электроны на подходящий эндогенный акцептор электрона ( пируват , ацетальдегид , ацетон и др.) или освобождается в виде газообразного водорода (Н2).

Согласно распространенным представлениям, наиболее древние формы жизни, источником энергии для которых служили реакции субстратного фосфорилирования, использовали органические соединения внешней среды одновременно по двум каналам: в качестве источника энергии и источника углерода. Постепенное исчерпание таких соединений из окружающей среды поставило организмы перед двумя проблемами: поиском новых источников энергии и новых источников углерода. В первом случае это привело к использованию энергии света, во втором - к использованию углекислоты

15.Особенности дыхательного аппарата бактерий

Дыхание (или биологическое окисление) -- это сложный процесс, который сопровождается выделением энергии, необходимой микроорганизмам для синтеза различных органических соединений. Бактерии, как и высшие животные, для дыхания используют кислород. Однако Л. Пастером было доказано существование таких бактерий, для которых наличие свободного кислорода является губительным, энергия, необходимая для жизнедеятельности, получается ими в процессе брожения.

Все бактерии по типу дыхания подразделяются на об-лигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы.

Облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха.

Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиноисцеты, бруцеллы, лептоспиры).

Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов -- возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка).

Облигатные анаэробы -- бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостри-дии столбняка, ботулизма).

Аэробные бактерии в процессе дыхания окисляют различные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и пр.

Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое мол очно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр.

олное окисление. Это процесс окисления углеводов до образования двуокиси углерода (CO2) и воды (H2O), сопровождающийся выходом энергии. Передача электронов водорода на кислород осуществляется посредством так называемой дыхательной цепи (система дыхательных ферментов), находящейся в мембране микробной клетки.

Неполное окисление. Обычно неполное окисление происходит тогда, когда наблюдается избыток углеводов. В таком случае процесс окисления идет не до конца, а образуются промежуточные продукты реакции. Например, при неполном окислении сахара могут синтезироваться лимонная, яблочная, щавелевая, янтарная и др. органические кислоты.

Нитратное дыхание представляет собой восстановление нитратов до молекулярного азота, а сульфатное дыхание - восстановление сульфатов до сероводорода. При обоих процессах происходит выделение свободной энергии.

Брожение. Этим термином принято называть расщепление органических углеродосодержащих веществ в анаэробных условиях.

16.Структурные особенности наследственного вещества бактерий. Плазмиды бактерий: определение, основные свойства, классификация