Патогенетическое обоснование антиатеросклеротической терапии в эксперименте

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Карагодин Василий Петрович

Москва 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН и НИИ атеросклероза Инновационного центра «Сколково»

Научные консультанты: Александр Николаевич Орехов доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией клеточных механизмов атерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Юрий Вениаминович Бобрышев доктор биологических наук, профессор ведущий научный сотрудник лабораторией клеточных механизмов атерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты: Малышев Игорь Юрьевич Доктор медицинских наук, профессор

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Заведующий кафедрой патологической физиологии

Орлов Сергей Николаевич Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова». Заведующий лабораторией физико-химии биомембран

Максименко Александр Васильевич Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации». Руководитель лаборатории биохимической инженерии Института экспериментальной кардиологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН

Защита состоится 26 декабря 2013 г. в ______ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан «_26_»__ноября__2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Атеросклероз и его клинические проявления занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности в России. На основании эпидемиологических исследований выявлена группа факторов риска атеросклероза. Уровень холестерина в крови, артериальное давление, курение, образ жизни - модифицируемые факторы риска. Возраст, пол и семейный анамнез относятся к немодифицируемым факторам риска ИБС и атеросклероза. Воздействие на факторы риска является как способом первичной профилактики атеросклероза, так и непрямым лечением (Информационный бюллетень ВОЗ, 2011, №317).

Существует представление о прямом лечении атеросклероза, то есть таком воздействии на сосудистую стенку, которое предотвращает возникновение и прогрессирование атеросклеротических поражений в артериях человека, а в идеале - вызывает регрессию атеросклероза. Подходы к прямому лечению атеросклероза находятся в стадии разработки, и в настоящее время не существует лекарств, в полной мере обладающих прямым антиатеросклеротическим действием. Кроме того, отсутствует система единых взглядов на патофизиологические процессы формирования атеросклеротических поражений.

Тем не менее, общепризнанно, что ведущим признаком атеросклероза является накопление липидов, главным образом свободного холестерина и его эфиров, в сосудистой стенке ((Libby P et al., 2010; 2011; Soloperto G & Casciaro S, 2012). Источником накапливающихся липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП). При этом для проявления атерогенного эффекта необходима химическая модификация липопротеидных частиц, поскольку нативные ЛНП в большинстве случаев не вызывают накопления холестерина в клетках сосудистой стенки.

Патогенетический подход к профилактике и лечению атеросклероза определяется необходимостью устранения основной причины заболевания, а именно предотвращением накопления внутриклеточных липидов или удаления их избытка. Вариантов достижения этой цели может быть много. В настоящей работе мы остановились на четырех из них, что объясняется современными представлениями о молекулярно-клеточных механизмах атеросклероза. Согласно этим представлениям, важную роль в возникновении и развитии атеросклеротического поражения играют модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), процессы воспаления в сосудистой стенке, половые гормоны и липопротеиды высокой плотности (ЛВП).

1. Обнаруженная in vivo подфракция циркулирующих модифицированных ЛНП, способная вызывать накопление липидов в клетках интимы аорты человека, формируется за счет десиалирования. Наибольшую атерогенность проявляют мелкие плотные десиалированные цмЛНП (Orekhov AN et al., 1991).

2. Не вызывает сомнения связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в этот процесс воспаления и клеточного иммунитета. Основанием для таких взглядов являются результаты исследований, подчеркивающих роль иммунокомпетентных клеток в атеросклеротических поражениях, а также присутствие в крови и сосудистой стенке аутоантител против ЛНП (Ridker PM et al., 2012).

3. Многочисленные данные позволяют заключить, что женские половые гормоны (эстрогены) являются эффективным естественным фактором защиты сосудов от атерогенеза (Bцhma B et al., 2009). Преобладающей формой защитного действия эстрогенов является их влияние непосредственно на стенки сосудов, тогда как влияние эстрогенов на липопротеидный профиль крови обеспечивает лишь 25-40% защиты.

4. Наконец, способность липопротеидов высокой плотности (ЛВП) препятствовать развитию атеросклеротических поражений была убедительно документирована в лабораторных исследованиях (Waksman R et al., 2010). Данные эпидемиологических исследований указывают на возможность применения ЛВП-терапии для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний (Nissen SE et al., 2003).

Существенным препятствием для повышения эффективности терапии атеросклероза, в том числе на ранних стадиях его развития, является отсутствие современных патофизиологических моделей и цельного алгоритма поиска и создания лекарственных и нелекарственных средств прямого антиатеросклеротического действия.

Клеточный культуральный тест представляется нам наиболее адекватным способом моделирования ранних процессов атерогенеза. Он позволяет дать оценку антиатерогенного потенциала лекарственных кандидатов и провести серийные испытания, необходимые для потокового скрининга фармакологически активных веществ.

Тем не менее, широкое использование синтетических лекарственных средств с целью профилактики атеросклероза на ранних его стадиях является проблематичным в силу наличия узких показаний для их назначения, побочного действия и высокой стоимости лечения. Для ранней профилактики и лечения атеросклероза целесообразно использование нелекарственных и лекарственных препаратов природного происхождения (ППП), поскольку многие из них не оказывают побочного действия при достаточной терапевтической эффективности, привлекательны по ценовой доступности, что обепечивает возможность длительного или даже пожизненного применения. Кроме того, препараты природного происхождения часто обладают более широким спектром эффектов, чем лекарственные препараты, оказывая влияние на ряд звеньев развития атеросклероза и осуществляя, параллельно с прямым антиатеросклеротическим эффектом, непрямое антиатеросклеротическое воздействие (Frank J. et al., 2009; Lu N. et al., 2009; Tinahones et al., 2009).

Целью данной работы является исследование клеточных и молекулярных механизмов развития атеросклероза и создание на основе накопленных знаний ППП, обладающих высоким антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.

Из этого следует, что для достижения цели работы необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить отдельные аспекты атерогенеза человека:

- механизмы возникновения атерогенности ЛНП;

- влияние эстрогенов на клеточные проявления атеросклероза;

- участие ЛВП в обратном транспорте холестерина;

- роль иммуно-воспалительных клеток в атерогенезе.

2. Разработать следующие модели для создания ППП, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом:

- модель для выявления антиатерогенной активности ППП, основанную на подавлении атерогенной модификации липопротеидов;

- клеточную модель для поиска богатых фитоэстрогенами ППП из растительного сырья, обладающего антиатеросклеротической активностью;

- клеточную модель для создания ППП, потенциально пригодных для ЛВП-терапии; атерогенез атеросклероз терапевтический молекулярный

- клеточную модель для выявления антиатеросклеротической активности ППП, основанную на определении клеточных показателей иммуно-воспалительных реакций (экспрессии цитокинов).

3. С использованием разработанных моделей выявить натуральные продукты, пригодные для получения ППП, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом и разработать рецептуру таких ППП.

4. Апробировать универсальный алгоритм НИР, направленных на исследование, разработку и создание антиатеросклеротических препаратов.

5. Разработать рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики.

Научная новизна исследования. Все приведенные в работе данные получены впервые и опубликованы в высокорейтинговых отечественных и зарубежных научных изданиях. Разработанные подходы, методики и продукты являются инновационными и соответствуют современному мировому уровню.

Уточнена роль транс-сиалидазы в патогенезе атеросклероза - изучена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы.

Изучено влияние женских и мужских половых гормонов на патогенез атеросклероза, в частности, на внутриклеточное накопление холестерина в клетках сосудов, инициированное какими-либо факторами.

Получены данные, подтверждающие, что путь оттока холестерина, использующий apoA-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов in vivo.

Проведено морфологическое исследование связи между накоплением липидов в клетках артериальной интимы и антигенпрезентирующей активностью этих клеток.

Дано экспериментальное обоснование профилактического и лечебного применения ряда растительных объектов при развитии атеросклероза. Проведена оценка эффективности этих объектов с использованием моделей, имеющих разные патогенетические основы, что позволило установить различные механизмы их действия и предложить алгоритм поиска наиболее перспективных ППП.

Инновационный характер потенциальных продуктов для антиатеросклеротической терапии определяется следующими особенностями: направленностью на процесс накопления холестерина в артериальной сосудистой стенке; плейотропным механизмом действия; патентоспособной рецептурой и технологией получения ППП.

Научно-практическая значимость. Получено экспериментальное подтверждение фармакологической эффективности (антиатерогенное и антиатеросклеротическое действие) ряда растительных объектов.

Экспериментально обоснована целесообразность применения указанных растительных объектов в составе моно- и комплексных препаратов для терапии атерослероза.

Созданы клеточные и ферментативные модели, которые целесообразно применять для оценки антиатеросклеротической активности растительного сырья для создания препаратов, обладающих антиатеросклеротическим терапевтическим потенциалом.

Разработаны и утверждены в РМАПО методические рекомендации «Биологически активная добавка к пище «Алликор»: ингредиентный состав, биологические эффекты, рекомендации по применению».

По результатам работы получен патент № 2484841 от 20 июня 2013 г. «Способ профилактики атеросклероза, основанный на подавлении атерогенной модификации липопротеидов». Подана заявка на выдачу патента: «Способ профилактики атеросклероза, основанный на оттоке холестерина из клеток сосудистой стенки».

Положения, выносимые на защиту

1. Уточнены патофизиологические механизмы, которые реализуются в возникновении и развитии атеросклеротического поражения с участием транс-сиалидазы, процессов воспаления в сосудистой стенке, половых гормонов и липопротеидов высокой плотности (ЛВП).

2. Представленные в работе клеточные модели позволяют адекватно воспроизводить важнейшие проявления атерогенеза и могут использоваться для создания эффективных препаратов природного происхождения с целью терапевтического воздействия на течение атеросклероза.

3. Транс-сиалидазная активность и ее подавление является перспективной мишенью для действия антиатеросклеротических средств. Метод определения транс-сиалидазной активности применен в ферментативной модели (тест-системе) для оценки эффективности и исследования механизмов антиатеросклеротического действия ППП.

4. Первичная культура макрофагов человека служит основой для клеточной модели с целью поиска источника фитоэстрогенов как альтернативы заместительной гормональной терапии для менопазуальных женщин.

5. Для создания препаратов ЛВП-терапии, вызывающих отток холестерина, целесообразно использовать первичные культуры субэндотелиальных клеток интимы аорты человека, полученные из атеросклеротических поражений.

6. Обнаруженная связь между инициирующими событиями атерогенеза и вовлечением в атерогенез воспаления и клеточного иммунитета позволяет рассматривать антицитокиновые средства как потенциальные антиатеросклеротические препараты. Для оценки противовоспалительных свойств таких препаратов может использоваться модель с измерением экспрессии провоспалительных молекул накопление липидов в культивируемых интимальных клетках аорты человека.

Реализация результатов работы. Разработаны рецептуры четырех препаратов и лабораторные регламенты получения этих препаратов.

Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов. Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов проведенных НИР в реальном секторе экономики. Вся нормативная документация передана для производства ППП компании ООО «ИНАТ-Фарма».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции по биологически активным добавкам к пище, Красноярск, 20-22 июня 2001; 8-й научно-практической конференции по биологически активным добавкам РАЕН «Эффективность применения БАД в различных областях медицины», Москва, 21-23 мая 2002; X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: парафармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» 2 декабря 2003, Москва; на 10-й научно-практической конференции «Эффективность применения БАД в практической медицине» в рамках международной выставки Здравоохранение-2003, декабрь 2003, Москва; научно-практической конференции «Человек и здоровье: применение биокорректоров», Москва, 22-23 ноября 2004; 17th International Conference on Environmental Bioindicators, Moscow, 18-22 May 2009; Международных научно-практических телеконференциях в 2010-2012 гг., Томск; 9-й Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» 22-23 апреля 2010, Санкт-Петербург, Россия; XVI International Symposium on Atherosclerosis, 25-29 march 2012, Sedney, Australia; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions, May 1-3, 2013, The Dolphin Hotel, Lake Buena Vista, Florida, USA; Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis: Possible Role of Stem cells and Osteoblasts. Cell Science & Stem Cell Research, 12-14 Nov 2012, San Antonio, USA и др.

Личное участие автора в выполнении исследования. Исследования выполнены на базе НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН и НИИ Атеросклероза Инновационного центра «Сколково». Автором был произведен обширный анализ отечественных и зарубежных работ по теме диссертации, планирование экспериментов. Автор явился инициатором и исполнителем основных разделов работы, что выразилось в руководстве и выполнении патофизиологических, биохимических, фармакологических исследований, проведении оценки эффективности препаратов и изучении их механизмов действия.

Публикации по теме диссертации. По результатам диссертационных исследований опубликовано 27 работ в отечественных и международных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК. Общее количество публикаций по теме диссертации, включая тезисы научных конференций, составляет 44. Автором также выпущены три монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав полученных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы (450 источников), иллюстрируется таблицами и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Водные экстракты исследуемых натуральных продуктов получали с помощью ИФБ (Gebhardt, 1995). Навеску сухой травы заливали кипящей водой и настаивали в закрытой емкости в течение 1 ч при комнатной температуре. Очистку экстракта от неполярных соединений проводили трижды равным объемом хлороформа. Настой фильтровали через бумажные фильтры 0,1 мм и хранили до употребления в холодильнике при 4єС не более 6 ч. В экспериментах ex vivo добровольцы получали также перорально настои растений и препараты растительного происхождения в форме порошка. Цитотоксичность препаратов контролировали по морфологии культивируемых клеток, включению нейтрального красного и содержанию клеточного белка.

Взятие крови, получение лейкоцитов и сыворотки крови проводили стандартными методами с участием здоровых доноров. Для получения моноцитов использовались как методы градиентного центрифугирования (Adams D.O., 1979), так и с помощью магнитной сепарации (Грачев А.Н. и др., 2010). Для выделения липопротеидов к плазме крови добавляли твердую соль NaBr и после ультрацентрифугирования отбирали зоны флотировавших градиенте концентрации NaBr липопротеидов очень низкой, промежуточной и низкой плотности.

Результаты некоторых исследований, включенные в настоящую работу, получены также при изучении тканевых сегментов артерий человека.

Биохимические методы исследования

Измерение экспрессии молекулы гистосовместимости II типа (HLA-DR), молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и интерлейкина-1 (IL-1) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-б) проводили методом иммуноферментного анализа.

Определение содержания внутриклеточного холестерина проводили ферментативным методом с помощью наборов Boehringer Mannheim.

Измерение клеточного белка проводили по Лоури, определение внутриклеточных липидов методом тонкослойной хроматографии. Определение пролиферативной активности клеток и синтеза коллагена проводили с помощью радиизотопного анализа.

Морфологические методы исследования

Для иммуноцитохимического типирования клеток в первичной культуре были использованы методы одинарного и двойного иммуноцитохимического выявления различных антигенов. Количество гематогенных клеток определяли, используя коктейль антител против CD14 и CDLC антигенов. Оседлые клетки определяли как количество неокрашенных клеток на препаратах, где были выявлены гематогенные клетки. Гладкомышечные клетки идентифицировали по экспрессии гладкомышечного -актина. Перицитоподобные клетки идентифицировали по положительному окрашиванию антителами 3G5 против антигена o-сиалоганглиозида и антителами 2А7 против высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена. Фагоцитирующие клетки идентифицировали по экспрессии макрофагального антигена CD68.

В зависимости от свойств используемых первичных антител, иммунную окраску осуществляли либо на криостатных срезах, либо на срезах, полученных из тканевых образцов, заключенных в парафин. Иммуногистохимический анализ осуществляли, используя как рутинный иммунопероксидазный метод анализа, так и многоступенчатые методы с использованием разнообразных коммерческих китов. При выполнении двойного иммуногистохимического окрашивания использовали комбинации различных вторичных антител и комбинации различных субстратов.

Помимо иммуноцитохимических методов, были использованы электронная микроскопия, методы культуры клеток, проточная цитометрия и другие методы, подробно изложенные в диссертации.

Экспериментальные модели

Ферментативная модель для определения сиалидазной активности
и поиска агентов, препятствующих атерогенной модификации ЛНП

Получение липопротеид-дефицитной плазмы, выделение сиалидазы из липопротеид-дефицитной плазмы крови методом аффинной хроматографии, мечение сиаловой кислоты, входящей в состав фетуина, тритием, получение агарозного геля, ковалентно связанного с фетуином, меченым тритием по сиаловой кислоте, получение десиалированного фетуина и трансферина методом кислотного гидролиза проводили с помощью методов, описанных в работе (Тертов и др., 1996).

Модель in vitro - определение активности сиалидазы с использованием в качестве субстрата [³H]-меченого фетуина, трансферина, липопротеидов - ковалентно связанных с агарозой. После инкубации фермента, донора и акцептора сиаловой кислоты измеряли уровень радиоактивности на жидкостно-сцинтилляционном счетчике 1215 Rack-Beta (LKB, Швеция). В модели ex vivo влияние на активность сиалидазы оценивалось в лабораторно-клинических исследованиях при измерении сиалидазной активности в крови после приема исследуемого агента (натурального продукта). Добровольцы принимали однократную дозу натурального продукта, после чего у них забирали кровь через 4 и 8 ч для получения сыворотки. Сиалидазную активность в сыворотке взятой крови сравнивали с активностью фермента в крови, взятой до приема продукта.

Клеточная модель интимы аорты для оценки накопления холестерина, оттока холестерина и образования цитокинов

Клетки, полученные из непораженных и атеросклеротических (пораженных) участков интимы аорты человека, культивировали раздельно и использовали в экспериментах различных типов, что позволяло в дальнейшем использовать две клеточные модели, различающиеся по своим свойствам.

Первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для воспроизведения процессов атерогенеза на клеточном уровне и оценки антиатерогенных свойств исследуемых веществ. Антиатерогенным действием называли эффекты, препятствующие основным проявлениям атерогенеза на клеточном уровне, и, прежде всего, накоплению внутриклеточного холестерина.

Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ. Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем.

Накопление холестерина - модель in vitro

Культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для определения атерогенности сыворотки крови (ее способности вызывать накопление внутриклеточного холестерина), для воспроизведения основных проявлений атеросклероза (липоидоза, пролиферации и фиброза) на клеточном уровне, для оценки антиатерогенного действия модифицированных ЛНП и исследуемых веществ in vitro (прямое подавление клеточных проявлений атеросклероза).

Модель ex vivo

В модели ex vivo также использовали первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты. Данную модель использовали для оценки антиатерогенного потенциала различных веществ (а также их активных метаболитов) после усвоения, распределения и биотрансформации в организме человека, то есть для получения специфических фармакодинамических характеристик. В скрининговых и пилотных исследованиях с использованием модели ex vivo принимали участие здоровые добровольцы, не имеющие признаков клинических проявлений атеросклероза или системных воспалительных заболеваний, у которых, тем не менее, при первичном обследовании в модели in vitro была выявлена атерогенность сыворотки крови - способность сыворотки крови вызывать накопление липидов в культивируемых клетках. У участников исследования брали кровь непосредственно перед приемом исследуемого вещества, а также через различные интервалы времени после его приема внутрь.

Расчет атерогенного эффекта (оценка атерогенности сыворотки крови)

После определения содержания общего холестерина и белка вычисляли соотношение холестерин/белок в каждой пробе. Атерогенный эффект исследуемых сывороток определяли по содержанию холестерина в опытных культурах и выражали в процентах от содержания внутриклеточного холестерина в контроле. Сыворотка крови пациента, вызывавшая статистически достоверное накопление внутриклеточного холестерина, рассматривалась как атерогенная.

Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта)
в модели in vitro.

Для изучения антиатеросклеротического действия исследуемых веществ использовали первичную культуру субэндотелиальных клеток из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека. Использование этого подхода не предусматривает искусственной нагрузки культивируемых клеток холестерином.

В инкубационную среду добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях. Обычно использовали логарифмический диапазон концентраций исследуемого вещества. Содержание внутриклеточного холестерина в контрольных клетках, инкубированных без добавления исследуемого вещества, принимали за 100%. Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ определяли как их способность статистически достоверно снижать исходно высокое содержание внутриклеточного холестерина.

Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта) в модели ex vivo.

У добровольцев брали кровь (для получения сыворотки) непосредственно перед приемом исследуемого вещества, а также через соответствующие интервалы времени после его приема внутрь (обычно через 2, 4 и 6 часов при скрининговых исследованиях и при оценке краткосрочного действия, а также через 4, 8, 12 и 24 часа при оценке длительности эффекта).

Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ в модели ex vivo определяли как их способность статистически достоверно снижать содержание холестерина в культивируемых атеросклеротических клетках.

Измерение экспрессии цитокинов (in vitro, ex vivo)

Для стимуляции экспрессии маркеров воспаления в культивируемых клетках в день эксперимента культуральную среду заменяли на свежую среду и к ней добавляли бактериальный липополисахарид, а также исследуемый агент в концентрации (in vitro). При оценке провоспалительного потенциала сыворотки крови человека вместо агента добавляли исследуемую сыворотку в концентрации 10% (ex vivo). Далее проводили измерение экспрессии молекулы гистосовместимости II типа (HLA-DR), молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), интерлейкина-1 (IL-1) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-б).

Клеточная модель моноцитов-макрофагов для оценки накопления
и оттока холестерина

Анализ накопления холестерина в моноцитах и макрофагах in vitro.

К клеткам добавляли ЛНП (атерогенные липопротеиды низкой плотности, выделенные из крови больных атеросклерозом) в концентрации 100 мкг/мл по белку (в ряде экспериментов - одновременно с исследуемым агентом, например, гормоном). В качестве контроля использовали клетки, которые продолжали культивировать в среде без добавления ЛНП. Липиды экстрагировали с использованием смеси гексан-изопропанол 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом и нормировали на количество клеточного белка, определяемого по методу Лоури.

Анализ накопления холестерина в моноцитах и макрофагах ex vivo.

Применялась стимуляция накопления внутриклеточного холестерина. В день эксперимента культуральную среду заменяли на свежую среду и к ней добавляли исследуемую сыворотку в концентрации 10%. Контрольные клетки инкубировали в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. По окончании эксперимента клетки фиксировали смесью гексана и изопропанола в соотношении 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом и нормировали на количество клеточного белка.

Методика in vitro для изучения оттока холестерина из культивируемых макрофагов.

Макрофаги были нагружены меченым холестерином путем инкубации в течение 48 час [³H]холестерин-олеат-ацетил-ЛНП. По сравнению с ненагруженными макрофагами, содержание эфиров холестерина в пенистых клетках возросло в 30-34 раза. Помимо радиоизотопного метода определения оттока холестерина, в качестве альтернативы применялся высокочувствительный метод определения холестерина.

Методика ex vivo для изучения оттока холестерина из культивируемых макрофагов.

Существенным отличием от методики in vitro было то, что в культуру клеток добавляли не агенты (фармакологические вещества), а сывороку крови больных, принимавших различные препараты. Оценивалось влияние препарата на отток холестерина.

Статистическая обработка данных

Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием пакета SPSS версии 12.0 (SPSS Inc., США). Графическую обработку данных проводили с использованием пакета SigmaPlot версии 7.0 (SPSS Inc., США). Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза. Для оценки связи клинико-биохимических показателей и их изменений использовали корреляционный анализ по Пирсону с поправкой Бонферрони и регрессионный анализ. В окончательном виде данные для непрерывных величин представляли в виде среднего арифметического значения с указанием стандартной ошибки. Для статистической обработки данных использовали пакет статистических программ SPSS 10.0.1. Различия считали статистически значимыми при вероятности безошибочного прогноза более 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Десиалирующая модификация липопротеидов низкой плотности как фактор атерогенности и поиск эффективных антиатерогенных ППП

При десиалировании ЛНП в плазме сиаловая кислота переносится на плазменные гликоконъюгаты - акцепторы, а не остается в свободном виде. Для характеристики этой активности и использования полученных данных при разработке клеточных моделей нами была изучена субстратная и акцепторная специфичность транс-сиалидазы. На начальной стадии этих экспериментов была экспериментально подтверждена патогенетическая важность транс-сиалидазы за счет ее способности повышать атерогенность ЛНП в культуре клеток.

Для понимания механизмов действия транс-сиалидазы, переносящей с ЛНП сиаловую кислоту на акцепторы плазмы крови, необходимо было изучить субстратную и акцепторную специфичность транс-сиалидазы и использовать эти результаты при создании ферментативной модели.

Показана высокая способность ЛНП быть донором сиаловой кислоты (по сравнению с фетуином и трансферином). Различные гликоконьюгаты компонентов крови также могут служить донором сиаловой кислоты в ходе ферментативной реакции. Было продемонстрировано, что б2-6 - связанная сиаловая кислота отщепляется и переносится сиалидазой значительно эффективнее, чем ее б2-3 изомер.

В ходе изучения акцепторной (субстратной) специфичности транс-сиалидазы плазмы крови человека было установлено, что в процессе ферментативной реакции сиаловая кислота наиболее активно переносится нативный (но не искусственно десиалированный) фетуин, а также на гликопротеиды, липопротеиды, ганглиозиды, гликоконъюгаты крови.

Полученные данные позволили не только уточнить роль транс-сиалидазы в патогенезе атеросклероза, но и перейти к созданию модельной системы, где этот фермент играет центральную роль.

Метод определения сиалидазной активности был применен в целях разработки ферментативной модели (тест-системы) для оценки эффективности и исследования механизмов антиатеросклеротического действия фармакологических веществ. На основании исследования субстратной специфичности фермента для модели был выбран [³H]-меченый фетуин. Этот выбор объясняется относительной простотой изготовления субстрата, его стабильностью, хорошей воспроизводимостью результатов. Акцептором в ферментативной системе служил десиалированный фетуин.

Для разработки ППП были изготовлены экспериментальные образцы на основе растительного сырья в количестве 14 и проведены исследования влияния стандартизированных водных экстрактов различных растений на сиалидазную активность. Установлено, что экстракты ряда натуральных продуктов подавляют активность транс-сиалидазы, выделенной из крови человека, в модели in vitro. Эффекты ex vivo были нестабильными и у большинства добровольцев не воспроизводились. Исключение составил корень солодки.

На рисунке 1 приведены результаты исследований на 5 добровольцах. Можно видеть, что сиалидазная активность у всех добровольцев существенно снижалась или исчезала после приема солодки. На основании этих данных корень солодки был отобран для создания средства, препятствующего атерогенной модификации ЛНП в крови.

Рисунок 1 Индивидуальные изменения активности транс-сиалидазы после приема солодки, относительно исходного уровня (100%)

Для этого было необходимо разработать рецептуру БАД (фитопрепарата), в состав которого войдут оптимальные или наиболее эффективные компоненты (комбинации компонентов), а также вспомогательные средства, обеспечивающие, в том числе, пролонгированность действия БАД (фитопрепаратов). Кроме того, следовало разработать лабораторный регламент получения препарата, а также произвести экспериментальную партию и осуществить исследовательские испытания по нормативным показателям СанПиН. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлении исследовательских испытаний приведены в Приложении к диссертации. Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 1.

Таблица 1

Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище (фитопрепарату) «Средство, препятствующее атерогенной модификации ЛНП в крови»

Компоненты	Содержание, %	Масса, мг
Солодка	57	200
Лактоза	36	125
Поливинилпирролидон	5	18
Стеарат кальция	2	7
Итого	100	350

Как известно, именно с «мишени», т. е. с понимания механизма развития заболевания и способности им управлять, начинается создание лекарственных препаратов на современном рынке. В нашем случае, очевидно, такой мишенью является сиалидаза, а компоненты активного начала, действующего на мишень, содержатся в солодке.

Отметим в этой связи, что корень солодки - лекарственное растение, не запрещенное для использования при производстве БАД. Активное начало корня солодки - интересные с фармакологической точки зрения флавоноиды (3-4%) и тритерпеновые сапонины (около 20%).

Влияние половых гормонов на атерогенез, ППП как альтернатива заместительной гормональной терапии

Предварительным этапом этой части работы стало уточнение влияния женских и мужских половых гормонов на патогенез атеросклероза, в частности, на внутриклеточное накопление холестерина в клетках сосудов, инициированное действием модифицированных ЛНП на моноциты/макрофаги с учетом гендерного происхождения последних. Также был проведен анализ влияния половых гормонов in vitro на аккумуляцию холестерина макрофагами, дифференцированными из выделенных моноцитов периферической крови доноров-мужчин и женщин.

Анализ содержания холестерина в макрофагах и моноцитах после их инкубации с ЛНП показал, что половые гормоны могут влиять на аккумуляцию холестерина в клетках.

Полученные данные подтвердили способность эстрогена (эстрадиола) (рисунок 2) и андрогена (дигидротестостерона) действовать однонаправленно на аккумуляцию холестерина в моноцитах-макрофагах. Представленные результаты характеризуют также факторы (моноциты или макрофаги, половые различия), влияющие на это действие.

Результаты проведенных испытаний свидетельствуют о торможении развития атеросклероза под действием половых гормонов и позволяют считать первичную культуру моноцитов-макрофагов человека подходящей основой клеточной модели для разработки альтернативы заместительной гормональной терапии для менопазуальных женщин.

Рисунок 2 Влияние эстрадиола на накопление внутриклеточного холестерина

Атерогенность сыворотки крови, то есть индуцированное этой сывороткой накопление внутриклеточного холестерина, полученной от 19 пациентов, было измерено как в первичной культуре клеток, выделенных из нормальных участков интимы аорты человека, так и в культуре моноцитов-макрофагов крови человека. Были получены сравнимые показатели, и коэффициент корреляции между двумя способами измерений составил 0,9 (p=0,01). Таким образом, мы установили, что культуру моноцитов-макрофагов крови человека целесообразно использовать при измерениях атерогенных свойств сыворотки крови с учетом относительной простоты по сравнению культурой клеток аорты.

На основании полученных данных была доработана технология клеточной модели для поиска препаратов, обладающих антиатеросклеротической активностью.

Во-первых, из всех испытанных клеточных параметров, связанных с атеросклерозом, был оставлен только общий холестерин. Этот параметр изменялся однонаправленно с другими параметрами под воздействием различных агентов.

Во-вторых, в качестве клеточной культуры были использованы первичные культуры моноцитов, выделенных из крови человека. Использование этих клеток упрощает процедуру выделения, укорачивает сроки культивирования и снижает стоимость анализа.

Далее были выявлены биологически активные компоненты, обладающие эстрогеноподобной активностью и идентифицированы растения, являющиеся естественными источниками данных компонентов. В рамках исследований был проведен скрининг растительных объектов, обогащенных фитоэстрогенами.

В качестве примера в таблице 2 приведены результаты испытаний антиатерогенного действия однократного приема танина из виноградных семян на атерогенность сыворотки крови. Добровольцы однократно принимали в дозе 250 мг. Кровь брали до приема танина (время «0») и через 2, 4 и 6 часов после приема. Из образцов крови готовили сыворотку, и образцы сыворотки добавляли в первичную культуру непораженных клеток.

Интегральная оценка антиатерогенного эффекта показала, что в среднем через 2, 4 и 6 часов после однократного приема танина из виноградных семян атерогенность сыворотки крови снизилась на 67±6%, 66±5% и 71±6% (все - р<0,05).

На основании полученных данных был сделан вывод, что танин из виноградных семян, хмель, чеснок, зеленый чай - обладают выраженными, длительными эффектами и пригодны для создания препаратов на основе фитоэстрогенов, выполняющих роль альтернативы заместительной гормональной терапии.

Таблица 2

Оценка антиатерогенного эффекта танина из виноградных семян (250 мг) в модели ex vivo в первичной культуре моноцитов крови человека

Эксперимент	Время после приема, ч	Содержание внутриклеточного холестерина, мкг/мг	Накопление холестерина, % от контроля
Доброволец № 1	Контроль	49,43,3	1007
	0	69,63,2	1416 *
	2	49,72,3	1015 #
	4	50,03,2	1016 #
	6	52,61,2	1062 #
Доброволец № 2	Контроль	49,21,1	1002
	0	64,52,8	1326 *
	2	60,62,9	1236
	4	56,52,3	1155
	6	51,34,7	1049
Доброволец № 3	Контроль	51,31,9	1004
	0	68,43,5	1337 *
	2	50,02,4	975 #
	4	54,81,5	1073 #
	6	54,51,2	1062 #
Доброволец № 4	Контроль	52,40,8	1002
	0	68,81,8	1313 *
	2	58,81,4	1123#
	4	58,31,4	1113#
	6	54,12,2	1034 #

Примечания

1 * - достоверное накопление холестерина, р<0,05;

2 # - достоверное снижение атерогенности сыворотки крови, р<0,05

Для этого необходимо было разработать рецептуру БАД (фитопрепарата). Кроме того, следовало разработать лабораторный регламент получения препарата, а также произвести экспериментальную партию и осуществить исследовательские испытания по нормативным показателям СанПиН. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлениии исследовательских испытаний приведены в Приложении к диссертации. Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 3.

Таблица 3

Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище (фитопрепарату) «Антиатеросклеротическое средство, обогащенное фитоэкстрагенами, предназначенное для женщин после менопаузы»

Наименование ингредиента	Масса, мг	Содержание, %
Шишки хмеля обыкновенного	160	33,97
Чай зеленый байховый листовой	115	24,42
Чеснок гранулированный сушеный	100	21,23
Экстракт виноградной косточки	40	8,49
Бета-каротин	0,5	0,11
Витамин С	30	6,37
Витамин Е (50%)	6,6	1,40
Стеариновая кислота	12,4	2,63
Поливинилпирролидон	6,5	1,38
ИТОГО:	471	100

C позиции лекарство-мишень следует отметить, что мишенью обнаруженных нами эффективных фитоэстрогенов являются, по-видимому, рецепторы гормонов. О компонентах растений, действующих на эти мишени, известно следующее. Хмель содержит фитоэстроген 8-пренилнарингенин. В чесноке наиболее изученные лигнаны (энтеродиол и энтеролактон) являются фитоэстрогенами и антиоксидантами. Фитоэстрогены содержатся и в зеленом чае. Основные фитоэстрогены винограда относятся к классу флавоноидов. Это танин, катехин, эпикатехин, кверцетин, кампферол, лютеин и некоторые другие. При производстве БАД разрешено использовать для рецептуры предлагаемые нами танин из виноградных семян, хмель, чеснок, зеленый чай.

Действие ЛВП на обратный транспорт холестерина и разработка эффективных ППП

Поскольку патогенетические механизмы атеросклероза включают особенности функционирования белков, участвующих в оттоке холестерина, и знание этих механизмов может быть использовано при разработке клеточных моделей, мы воспользовались новым методом высокоэффективной трансфекции макрофагов (Sviridov D.D. et al., 2011) для избирательного усиления различных путей оттока холестерина, чтобы исследовать вклад путей, использующих как акцептор апоА-I, в сопоставлении с теми путями, которые используют в качестве акцептора ЛВП, в суммарный экспорт холестерина из макрофагов in vitro и in vivo.

Когда апоВ-обедненная плазма крови человека была использована в качестве акцептора, оверэкспрессия ABCA1 или ABCA1 + SR-B1 + PLTP + CYP27A1 стимулировала отток холестерина на 30 и 40%, соответственно, в то же время оверэкспрессия кавеолина-1 или кавеолина-1 + SR- B1 не влияла на уровень оттока холестерина (рисунок 3).

Мы предполагаем, что увеличение оттока холестерина в основном происходит за счет оттока на обезлипиженый апоА-I. Наши данные указывают на то, что уровень оттока холестерина из макрофагов может быть повышен за счет манипулирования клеточными путями, ответственными за отток на апоА-I.

Можно заключить, что путь оттока холестерина, использующий apoA-I в качестве акцептора, имеет доминирующий вклад в экспорт холестерина из макрофагов. Ключевым элементом этого пути, по-видимому, является белок ABCA1, а белки CYP27A1, PLTP и SR-B1 играют вспомогательную роль.



Рисунок 3 Оверэкспрессия различных генов и отток холестерина в плазме крови человека Примечания 1 - RAW264.7 клетки были трансфицированы указанными генами. Клетки были помечены [³H]холестерином. 2 - Отток холестерина был выражен как доля [³H]холестерина, перенесенного с клеток в среду. 3 - Приведены средние значения четырех экспериментов -- SEM. 4 - * р <0,05 по сравнению с ложно-трансфицированными клетками

Таким образом, проведенные эксперименты еще раз подтвердили сложность процесса удаления избытка холестерина из клеток сосудистой стенки, участие в специфичных путях оттока большого числа транспортеров и регуляторов. С учетом цели нашей работы, следовало предложить такую клеточную модель, которая охватывала бы все или большинство этих участников и позволяла измерять некий интегральный параметр, характеризующий эффективность оттока холестерина и ее изменение в присутствии фармакологических агентов.

В серии проведенных экспериментов были предприняты попытки использования обеих клеточных моделей - культуры моноциты-макрофаги и культуры клеток аорты человека. Более подходящей оказалась методика культивирования клеток, выделенных из аутопсийного материала аорты человека. Клетки выделяли из субэндотелиального слоя интимы, поскольку именно в этом слое возникает и развивается атеросклеротическое поражение. Клетки выделяли из жировых атеросклеротических поражений. Использование этого подхода не предусматривает, в отличие от моноцитов-макрофагов, искусственной нагрузки культивируемых клеток холестерином. Состав и содержание внутриклеточных липидов полностью соответствуют составу и содержанию липидов в клетках, популирующих атеросклеротическое поражение сосудистой стенки человека.

На разработанных клеточных моделях оттока холестерина в вариантах in vitro и ex vivo были испытаны известные антиангинальные лекарственные средства. Это были гиполипидемические препараты, используемые для снижения уровня холестерина в крови, относящиеся к различным классам фармакологических веществ.

Среди них был ловастатин, относящийся к классу статинов, а также липостабил, содержащий липиды натурального происхождения. Были также испытаны ингибиторы ацил-КоА-холестерина-ацилтрансфераза (АХАТ) - фермента, принимающего участие в накоплении холестерина в клетках сосудистой стенки. Было обнаружено, что только липостабил достоверно снижал содержание холестерина в клетках, культивируемых из атеросклеротических поражений аорты человека, то есть вызывал обратный транспорт холестерина. Ни статин, ни ингибиторы АХАТ не способствовали обратному транспорту холестерина из атеросклеротических клеток. Полученные данные являются примером того, что снижение холестерина в крови не обязательно сопровождается снижением холестерина в сосудистой стенке.

Для разработки препаратов, способствующих оттоку холестерина из клеток сосудистой стенки, был проведен информационный поиск наиболее перспективных натуральных продуктов и изготовлены экспериментальные образцы в количестве 8. На моделях на основе культуры клеток интимы аорты изучались как антиатерогенный эффект, то есть подавление атерогенности (накопление холестерина), так и антиатеросклеротическое действие (отток холестерина) этих объектов.

Из таблицы 4 видно, что слабый в антиатерогенном отношении лук оказался весьма эффективным антиатеросклеротическим продуктом, вызывающим на модели ex vivo снижение содержания холестерина в культивируемых атеросклеротических клетках.

Таблица 4

Антиатерогенное и антиатеросклеротическое действие натуральных препаратов

Растительный препарат и его источник	Антиатерогенный эффект, %	Антиатеросклеротический эффект, %
Листья солянки холмовой (Salsola collina)	11,3±0,5	8,8±0,2
Порошок луковицы лука (Allium cepa)	21,2±0,4*	20,6±0,4*
Порошок сока свеклы (Beta vulgaris)	31,6±0,5*	16,7±0,6*
Порошок спирулины (Spirulina platensis)	51,5±0,4*	10,2±0,4
Экстракт хвои сосны (Pinus sylvestris)	52,5±0,2*	5,4±0,3
Порошок корня солодки (Glycyrrhiza glabra)	55,3±0,3*	17,3±0,5*
Проростки пшеницы (Triticum vulgaris)	69,8±0,6*	15,5±0,4*
Порошок луковицы чеснока (Allium sativum)	77,5±0,7*	11,9±0,5

* - достоверное увеличение показателей по сравнению с контролем, p<0,05

С другой стороны, эффективный в антиатерогенном отношении чеснок оказался довольно слабым антиатеросклеротическим натуральным продуктом, то есть не вызывал существенного оттока холестерина из культивируемых клеток, снижая содержание эфиров холестерина на 21,9±0,5%. В этой связи представляется целесообразным использовать лук в качестве растительного сырья для разработки и создания препарата, способствующего обратному транспорту холестерина.

Для этого было была разработана рецептура БАД (фитопрепарата), состав которого вошли оптимальные количества порошка лука, а также вспомогательные средства, обеспечивающие, в том числе, пролонгированность действия БАД (фитопрепаратов). Рецептура БАД (фитопрепарата) представлена в таблице 5. Сведения о регламенте получения препарата, а также производстве экспериментальной партии и осуществлениии исследовательских испытаний представлены в Приложении.

Таблица 5

Рецептура к разрабатываемой биологически активной добавке к пище «Средство, способствующее оттоку холестерина из клеток сосудистой стенки»

Наименование ингредиента	Содержание, %	Масса, мг
Лук сушеный	68,19	300
Стеариновая кислота	5,45	24
Лактоза	20,68	91
Поливинилпирролидон

Подобные документы

• Основы фармакологии

  Основные задачи фармакологии: создание лекарственных препаратов; изучение механизмов действия лекарственных средств; исследование фармакодинамики и фармакокинетики препаратов в эксперименте и клинической практике. Фармакология синаптотропных средств.
  
  презентация [5,9 M], добавлен 08.04.2013
  

• Фармацевтическая химия противоопухолевых препаратов

  Направления развития терапии злокачественных опухолей. Классификация противоопухолевых препаратов. Методика идентификации препаратов. Противоопухолевые антибиотики, гормональные средства, антагонисты гормонов и средства растительного происхождения.
  
  дипломная работа [1,0 M], добавлен 21.08.2011
  

• Маркеры воспаления при атеросклерозе и ишемической болезни сердца. Их патогенетическое и прогностическое значение

  Патогенетическая роль хронического системного воспаления в развитии атеросклероза. Содержание в крови маркеров воспаления. Уровень в крови СРП имеет высокую прогностическую значимость как маркер риска развития коронарного атеросклероза и у женщин.
  
  реферат [25,8 K], добавлен 20.03.2009
  

• Значимость острого воспаления в инициировании атеросклероза у детей

  Особенности и биохимическая основа патогенеза атеросклероза. Взаимоотношение воспаления и атеросклероза, его роль в развитии болезни. Действие на процессы клеточной адаптации вирусов и токсинов, изменение функции генов, деструкция клеточных мембран.
  
  доклад [7,0 M], добавлен 02.12.2010
  

• Патофизиология атеросклероза

  Эпидемиология атеросклероза, его общая характеристика. Морфогенез и патоморфологические этапы. Основные факторы риска атеросклероза. Инициация воспаления, образование бляшки. Изменения сосудов при атерогенезе. Принципы терапии и профилактики заболевания.
  
  презентация [7,8 M], добавлен 20.10.2014
  

• Фитотерапия при заболеваниях слизистой оболочки полости рта и пародонта у детей

  Особенности заболеваний тканей пародонта у детей. Применение противовоспалительных и репаративных препаратов растительного происхождения. Принципы применения препаратов, обладающих обволакивающим, вяжущим действием. Лечение гипертрофического гингивита.
  
  реферат [658,7 K], добавлен 23.09.2012
  

• Препараты в офтальмологии

  Антибиотики как вещества природного, полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток. Механизм действия и токсическое влияние актериостатических препаратов широкого спектра. Применение противогрибковых средств и противовирусных препаратов.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 16.09.2014
  

• Применение арт-терапии

  Общие положения арт-терапии. Создание клиентом визуальных образов. Связь художественного творчества человека с его психическим развитием. Основные виды и формы арт-терапии. Сочетание разных видов экспрессивной терапии. Фактор художественной экспрессии.
  
  контрольная работа [36,4 K], добавлен 28.01.2017
  

• Атеросклероз как медико-социальная проблема

  Общее понятие и причины появления атеросклероза. Социальные аспекты атеросклероза. Эффективность первичной профилактики атеросклероза. Медикаментозные, хирургические и немедикаментозные методы воздействия на липиды и липидтранспортную систему крови.
  
  контрольная работа [22,1 K], добавлен 09.09.2010
  

• Миокардиты в эксперименте

  Воспаление сердечной мышцы, возникающее при введении в нее инородных тел. Адреналиновый миокардит. Получение поражений миокарда аллергического происхождения. Изучение влияния на сердце различных препаратов йода, возможные поражения сердца у животных.
  
  реферат [362,4 K], добавлен 09.08.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам