Молекулярно-генетичні механізми патогенезу і шляхи оптимізації діагностики, лікування та профілактики появи інгібітору у хворих на гемофілію
Частота розвитку інгібіторів серед хворих на гемофілію в Україні. Характеристика типів інгібіторів. Зв'язок між поодинокими поліморфізмами генів імунорегуляторних факторів та наявністю інгібітору. Два типи патологічних інгібіторівку хворих на гемофілію.
Рубрика | Медицина |
Вид | автореферат |
Язык | украинский |
Дата добавления | 23.10.2018 |
Размер файла | 1,1 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ НАМН України»
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук
молекулярно-генетичні механізми патогенезу і шляхи оптимізації діагностики, лікування та профілактики появи інгібітору у хворих на гемофілію
14.01.31 - гематологія та трансфузіологія
Стасишин Олександра Василівна
Київ - 2018
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»
Науковий консультант
доктор медичних наук, професор Логінський Володимир Євстахович, ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України», заступник директора з наукової роботи
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Видиборець Станіслав Володимирович, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології і трансфузіології
доктор медичних наук, професор ДубейЛеонід Ярославович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, професор кафедри педіатрії і неонатології факультету післядипломної освіти
доктор медичних наук, професор Клименко Сергій Вікторович, ДУ «Національний науковий центр радіаційної медицини НАМН України», завідувач відділу медичної генетики
Захист відбудеться __________2018 р. о______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).
Автореферат розісланий ___________2018 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Р.П. Павлюк
АНОТАЦІЯ
Стасишин О.В. Молекулярно-генетичні механізми патогенезу і шляхи оптимізації діагностики, лікування та профілактики появи інгібітору у хворих на гемофілію.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.01.31 - гематологія і трансфузіологія. - ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України». - Київ. 2018.
Дисертація присвячена актуальній проблемі сучасної гематології - діагностиці, лікуванню та профілактиці інгібітору у хворих на гемофілію.
Визначено частоту розвитку інгібіторів серед хворих на гемофілію в Україні, яка складає 16,7% при гемофілії А і 3,9% при гемофілії В, подано характеристику типів інгібіторів.
Розкрито зв'язок між поодинокими поліморфізмами (SNP) генів імунорегуляторних факторів IL-10, TNFб, CTLA-4 та наявністю інгібітору. З'ясовано відмінності у розподілі частот алельних варіантів генів локусів HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 у хворих на гемофілію А з постійним та транзиторним інгібітором. На основі множинних логіт-регресіи? узагальнено фактори ризику появи інгібітору у хворих на гемофілію, що дозволило ідентифікувати пацієнтів з високим ризиком розвитку інгібітору, створити модель для передбачення його появи і запропонувати шляхи профілактики.
Відзначено два типи патологічних інгібіторівку хворих на гемофілію: І тип - нейтралізуючий інгібітор FVIII(IX) та ІІ тип - набутий інгібітор. З'ясовано вплив на зсідання крові препаратів «шунтової» дії: rFVIIa, аPCC та PCC у хворих на гемофілію на підставі змодельованого ex vivo/in vitro досліду на основі тесту АЧТЧ та встановлено високий ступінь кореляції між індексом скорочення АЧТЧ та клінічною відповіддю після введення цих препаратів.
Здійснено клінічну оцінку монотерапії препаратами rFVIIa і аРСС у хворих на гемофілію з інгібітором протягом тривалого періоду на підставі стандартизованих критеріїв та обґрунтовано тактику лікування кровотеч і забезпечення гемостазу під час операційних втручань у хворих на гемофілію з низьким титром інгібітору та слабкою реакцією
Ключові слова: гемофілія, інгібітор, SNP IL-10, TNFб, CTLA-4, МНС II клас, фактори ризику, логіт-регресія, rFVIIa, аPCC.
інгібітор гемофілія ген поліморфізм
АННОТАЦИЯ
Стасишин А.В. Молекулярно-генетические механизмы патогенеза и пути оптимизации диагностики, лечения и профилактики появления ингибитора у больных гемофилией.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.31 - гематология и трансфузиология. - ГУ «Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины». - Киев. 2018.
Диссертация посвящена актуальной проблеме современной гематологии - диагностике, лечению и профилактике ингибитора у больных гемофилией.
Целью работы было повысить эффективность оказания медицинской помощи больным гемофилией, осложненной ингибитором, путем определения молекулярно-генетических маркеров и факторов риска появления ингибитора, связанных с течением болезни и лечением, совершенствование его диагностики, программ лечения и профилактики.
На основе клинических и коагулологических исследований определена частота развития ингибитора к дефицитному фактору свертывания среди больных гемофилией в Украине, которая составляет 16,7% при гемофилии А и 3,9% при гемофилии В, представлен подробный анализ зависимости их возникновения от тяжести гемофилии и представлена характеристика типов ингибитора (постоянный, транзиторный, сильного и слабого иммунного ответа) согласно рекомендациям WFH и ISTH.
Получены приоритетные результаты о роли генетических факторов в появлении ингибиторов у больных гемофилией. Впервые в Украине раскрыто связь между одиночными полиморфизм (SNP) генов таких иммунорегуляторных факторов, как IL-10, TNFб, CTLA-4 и наличием ингибитора у этих больных.
Выяснено различия в распределении частот аллельных вариантов генов локусов HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 у больных гемофилией А с постоянным и преходящим ингибитором по сравнению с больными без ингибитора. Установлено, что аллели DRB1*1501-1502, DRB1*0701-0702 и DQВ1 0602 можно рассматривать как аллели-агрессоры, которые повышают риск появления ингибитора, а аллель DQВ1*0302, наоборот, как аллель-протектор, который снижает этот риск, что дополняет научные знания о роли полиморфной системы МНС II класса в патогенезе появления ингибитора при гемофилии.
На основе множественных логит-регрессий обобщены факторы риска появления ингибитора у больных гемофилией, что позволило идентифицировать пациентов с высоким риском развития ингибитора, создать модель (номограму) для предсказания его появления и предложить пути профилактики. Установлено, что наибольшее влияние на вероятность развития ингибитора создают факторы, связанные с лечением, а именно, интенсивность заместительной трансфузионной терапии (количество EД / 1 эпизод), изменение типа и вида препаратов при лечении одного эпизода кровотечения.
Дополнены знания о неоднородной природе ингибиторных антител у больных гемофилией на основе разработанного нами метода - исследования кинетики коррекции удлиненного АЧТВ нормальной плазмой в возрастающей пропорции до и после инкубации в течение 1 ч. Отмечено два типа патологических ингибиторов: I тип - нейтрализующий ингибитор FVIII (IX) с пролонгированным (прогрессивным) действием и простой кинетикой нейтрализации нормальной плазмой; II тип - приобретенный ингибитор немедленного действия со сложной кинетикой нейтрализации, что указывает на неоднородность иммунного ответа на введенный FVIII (IX) и требует различных подходов к лечению.
Впервые у больных гемофилией с ингибитором и без ингибитора на основании смоделированного ex vivo / in vitro опыта на основе теста АЧТВ выяснено влияние на свертываемость крови препаратов «шунтирующего» действия рекомбинантного активированного фактора VII (rFVIIa), активированного протромбинового комплекса (антиингибиторний комплекса - аPCC) и неактивированной протромбинового комплекса (PCC). Установлено высокая степень корреляции между индексом сокращение АЧТВ ex vivo / in vitro и клиническим ответом (остановкой кровотечения) после введения препарата «шунтирующего» действия, который составляет для rFVIIa r = + 0,971 и для аPCC r = + 0,950.
Впервые в Украине проведена клиническая оценка гемостатической эффективности монотерапии препаратами «шунтирующего» действия rFVIIa и аРСС у больных гемофилией с ингибитором во время кровотечений и гемартрозов в течении длительного периода на основании стандартизированных критериев. Дополнены научные данные о механизме действия шунтирующих препаратов на основе исследования динамики титра ингибитора у больных гемофилией А и В в течение 1 года монотерапии препаратами aPCC и rFVIIa. Установлены различия действия этих препаратов.
Впервые обосновано тактику лечения кровотечений и обеспечения гемостаза во время операционных вмешательств у больных гемофилией с низким титром ингибитора и слабой реакцией с выделением групп высокого, промежуточного и низкого риска в зависимости от группы риска геморрагического проявления по локализации и интенсивности и / или объема хирургического вмешательства. Разработаны схемы лечения тяжелых кровотечений у больных гемофилией, осложненной ингибитором и у больных с приобретенной гемофилией.
Ключевые слова: гемофилия, ингибитор, SNP IL-10, TNFб, CTLA-4, МНС II класса, факторы риска, логит-регрессия, rFVIIa, аPCC.
SUMMARY
Stasyshyn O.V. Molecular genetic mechanisms of pathogenesis and ways of optimization of diagnosis, treatment and prevention of inhibitors in hemophilia patients. - Manuscript.
Thesis for application of degree of Doctor of Medical Sciences in specialty 14.01.31 - Hematology and Transfusiology. - SI "Institute of Hematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine". - Kiev 2017
The thesis is focused on аn actual problem of modern hematology - diagnostics, treatment and prevention of an inhibitors in hemophilia patients.
On the basis of clinical and coagulation studies, the rate of inhibitors to FVIII(IX) in hemophiliacs in Ukraine is estimated to be 16.7% for hemophilia A and 3.9% for hemophilia B, presented characterization of types of inhibitors.
The connection between SNPs of genes of IL-10, TNFб, CTLA-4 and the presence of an inhibitor in these patients has been revealed.
The differences in the distribution of the allelic variants of the HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 loci genes in patients with hemophilia A with a permanent and transient inhibitors compared with patients without inhibitors were found. On the basis of multiple logit regressions, the risk factors for the appearance of an inhibitors in hemophilia patients have been summarized, which made it possible to identify patients at high risk of developing inhibitors, to create a model to predict its occurrence and to propose ways of prevention.
Two types of pathological inhibitors are noted: type I is a neutralizing inhibitor of FVIII (IX) and type II - an immediate inhibitor with complex kinetics of neutralization.
Based on an ex vivo / in vitro simulated aPTT test, the effect on blood clotting of the bypassing agents: rFVIIa, aPCC and PCC has been determined. A high degree of correlation was found between the extinct vivo / in vitro aPTT reduction index and the clinical response.Clinical evaluation of hemostatic effectiveness of monotherapy with rFVIa and aPCC in hemophilia patients with inhibitors during bleeds and hemarthrosis for a long period was performed on the basis of standardized criteria. The programs of the treatment of the bleeds and providing hemostasis during surgery in hemophilia patients with low titre of inhibitors and low responders are substantiated.
Key words: hemophilia, inhibitor, SNP IL-10, TNFб, CTLA-4, MHC II, risk factors, logit regression, rFVIIa, aPCC.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Незважаючи на успіхи, досягнуті у лікуванні гемофілії, пов'язані з появою сучасних високоочищених та відносно безпечних препаратів факторів зсідання, викликають занепокоєння ускладнення, зумовлені їхнім застосуванням. У частини пацієнтів у відповідь на введення цих препаратів виникають алоантитіла - інгібітори факторів зсідання крові, які призводять да неефективності терапії [Berntorp E. et al., 2012; Srivastava A. et al., 2013; Green D., 2011; Astermark J. et al., 2008]. На сьогоднішніи? день поява інгібітору у хворих на гемофілію є одним з наи?тяжчих та наи?складніших до подолання ускладненням, яке призводить не тільки до значного погіршення якості життя пацієнтів, але и? несе великии? економічнии? тягар [Gringeri A. et al., 2003; Bohn RL. et al., 2004; Бездітко Н.В. зі співавт., 2017]. Частота появи інгібітору у попередньо нелікованих пацієнтів (ПНП) досягає 30%, і тенденціі? до зниження цього показника не спостерігається [Darby S. C. et al., 2007; Iorio A. et al., 2010; van den Berg HM. et al., 2016]. Зусилля дослідників, прикладені до вивчення факторів ризику інгібітору, увінчалися значним успіхом. Зокрема, очевидною є роль генетичних, або пов'язаних з пацієнтом чинників, таких як тип мутаціі? фактора VIII, сімеи?нии? «інгібіторнии?» анамнез, ступінь тяжкості гемофіліі?, гаплотип HLA-комплексу, однонуклеотидні поліморфізми (SNP) в генах, які модифікують імунну відповідь [van den Berg HM., et al., 2011; Astermark J.et al., 2009; Pavlova A. et al., 2009]. Інші чинники, пов'язані з лікуванням, зокрема такі як вік, у якому розпочинають замісну трансфузіи?ну терапію, причина першого введення препарату, інтенсивність лікування, тип лікування, вид та тип антигемофільних препаратів, інші подіі?, які впливають на імунну систему пацієнта, вивчаються і і?х роль ще не до кінця встановлена [van der Bom .G. et al., 2003; Gouw SC. et al., 2013; Marcucci M. et al., 2015; Eckhardt CL. et al., 2011].
На сьогоднішній день набула поширення теорія про важливість первинних змін в імунній системі, заснована на «моделі небезпеки». Виявлено, що чинники, які неспецифічно стимулюють імунну систему (інфекційні хвороби, вакцинації, масивні кровотечі, особливо в ЦНС, хірургічні втручання, запальні процеси) можуть впливати на частоту формування інгібітору при гемофілії [White GC II. et al., 2005; Wroblewska A. et al., 2013]. Однак невідомим залишається ступінь впливу цих факторів у хворих на гемофілію в Україні, які до недавнього часу отримували переважно низькоочищені препарати, як от кріопреципітат, а лише протягом останніх років застосовують різні типи концентратів факторів зсідання крові з частою зміною препаратів [Стасишин О.В. зі співавт., 2004].
Методи профілактики розвитку інгібітору, основані на знанні чинників ризику, до цього часу невідомі, лікування його недосконале. Найбільші труднощі виникають при забезпеченні гемостазу у хворих з інгібітором і небезпечними для життя кровотечами і крововиливами, особливо, при хірургічних втручаннях [DiMichele DM. et al., 2006; Berntorp E. et al., 2009; Young G. et al., 2006; Gringeri A. et al., 2011]. Тому з'ясування причин та факторів ризику виникнення імунних інгібіторів у хворих на гемофілію з метою попередження та мінімізації їх розвитку - важлива наукова проблема з перспективним практичним застосуванням.
Лікування хворих на інгібіторну форму гемофілії необхідно розглядати у двох аспектах: забезпечення гемостазу під час гострих геморагічних епізодів та можливість повного видалення інгібітору. Важливим фактором при виборі тактики лікування є початковий титр інгібітору (низький <5 БО/мл або високий ?5 БО/мл) та тип реакції імунної системи пацієнта (слабка або сильна відповідь), об'єм, інтенсивність та локалізація кровотечі або оперативного втручання [Hay C. et al., 2006; T. Livnat et al., 2008; Стасишин О.В. зі співавт., 2010].
У практиці провідних світових центрів гемофілії для досягнення гемостазу у хворих на гемофілію з інгібітором застосовують і випробовують різні засоби і методи лікування [DiMichele D.M. et al., 2006; Hay C. et al., 2006; Стасишин О.В. та співавт., 2015]. Найвищу ефективність і безпечність для лікування кровотеч у хворих на гемофілію з інгібітором виявили підвищені дози препаратів FVIII(IX) (при інгібіторі із слабкою імунною відповіддю) та препарати з «обхідним» механізмом дії - рекомбінантний активований FVII та концентрат факторів II, VII, IX, X (антиінгібіторний коагуляційний комплекс або аРСС). За різними повідомленнями ефективність кожного з цих препаратів становить від 43% до 100% випадків [Berntorp E. et al., 2009; Gringeri A., et al., 2011]. Відмінності механізмів гемостатичної дії аРСС та rFVIIa сприяють різній відповіді хворих на ці препарати, і їхня лікувальна ефективність потребує подальшого вивчення. Специфічні чинники, пов'язані з хворим, сприяють різній ефективності rFVIIa та аРСС, хоча причини та закономірності цього явища остаточно не з'ясовано [Young G. et al., 2006]. В Україні описано застосування тільки окремих методів у поодиноких хворих. Тому створення алгоритмів лікування геморагічних проявів у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором на основі вивчення коагулологічних, імунологічних та клінічних критеріїв ефективності залишається актуальною проблемою.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Обраний напрямок досліджень пов'язаний з науково-дослідними роботами ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»: «Дати коагулологічну, імунологічну та клінічну характеристику вовчакового антикоагулянту та вияснити його роль в розвитку резистентності до замісної терапії у хворих на гемофілію» (№ Державної реєстрації 0103U000295; шифр 02.03 АМНУ); «Розробити схеми лікування геморагій у хворих на гемофілію з інгібітором» (№ Державної реєстрації 0106U002100; шифр 02.06 АМНУ), «Вивчити фактори ризику появи імунних інгібіторів у хворих на гемофілію» (№ Державної реєстрації 0109U000463; шифр 01.09 АМНУ), «Провести аналіз кореляційних взаємозв'язків лабораторних та клінічних показників з метою прогнозування ефективності гемостатичної терапії у хворих на гемофілію з інгібітором» (№ Державної реєстрації 0112U001373; шифр 01.12 НАМН), «Вивчити тип патологічних інгібіторів зсідання крові та їх патогенетичне значення у хворих на гемофілію, імунну коагулопатію та з антифосфоліпідним синдромом» (№ Державної реєстрації 0115U000127; шифр 01.15 НАМН), у яких дисертант була відповідальним виконавцем.
Мета дослідження: Підвищити ефективність надання медичної допомоги хворим на гемофілію, ускладнену інгібітором шляхом визначення молекулярно - генетичних маркерів та факторів ризику появи інгібітору, зумовлених клінічним перебігом хвороби та лікуванням; удосконалити діагностику, програми лікування і профілактики у цих хворих.
Завдання дослідження
1. Дослідити частоту алелів і генотипів SNP -1082 G - A гена IL-10, SNP -308 G - A гена TNF-б, промотера -318 С>Т та екзону 1 49 A>G гена CTLA-4, розподілу алелів генів HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 МНС людини ІІ класу у хворих на гемофілію залежно від наявності інгібітору.
2. З'ясувати вплив факторів, пов'язаних з пацієнтом та перебігом хвороби, і факторів, пов'язаних з лікуванням хворого, на частоту виникнення інгібітору, проаналізувати взаємозв'язок цих факторів, виділити серед них найбільш значимі для прогнозу виникнення інгібітору.
3. Визначити статистично значущі предиктори розвитку інгібіторів у хворих на гемофілію, розробити клінічно ефективну систему їх прогнозування і профілактики.
4. Дослідити час відновлення FVIII(ІХ), фармакокінетичні показники у хворих на гемофілію після введення препаратів FVIII(IX) та встановити їхнє прогностичне значення для раннього виявлення розвитку резистентності до замісної терапії.
5. Дослідити гемостатичний ефект ex vivo/in vitro препаратів факторів зсідання крові з «обхідним» механізмом дії у плазмі, дефіцитній за FVIII, при різних титрах інгібітору та провести кореляцію з клінічною відповіддю на введення цих препаратів у хворих на гемофілію з інгібітором.
6. Розробити схеми лікування кровотеч і забезпечення хірургічних втручань у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором та набуту гемофілію.
Об'єкт дослідження: вроджена гемофілія А і В, ускладнена інгібітором, набута гемофілія (імунна коагулопатія) з інгібітором до FVIII або FІХ.
Предмет дослідження: спадкові і молекулярно-генетичні чинники схильності до розвитку інгібітору; клінічні та коагулологічні показники у перебігу гемофілії з інгібітором; пов'язані з лікуванням фактори ризику інгібітору; клініко-лабораторна характеристика типів інгібіторів; діагностика і прогностичне значення резистентності до замісної терапії; вплив на зсідання крові препаратів «обхідної» дії (rFVIIa, aPCC); клінічна відповідь хворих на гемофілію з інгібітором на препарати «обхідної» дії; способи прогнозування та лікування хворих на гемофілію А та В з інгібітором; характеристика інгібітору і лікування хворих на набуту гемофілію А і В.
Методи дослідження: генеалогічний аналіз; молекулярно-генетичні; клінічні (анамнез, скарги, об'єктивне обстеження); інструментальні (рентгенологічні, сонографічні, КТ, МРТ); загальні клініко-лабораторні, гематологічні, коагулологічні (визначення активності факторів зсідання VIII(IX); нейтралізуючого інгібітору до FVIII(IX), вовчакового антикоагулянту), фармакокінетичні, дослідження гемостатичної активності препаратів «шунтової» дії в тесті, змодельованому на основі АЧТЧ ex vivo/in vitro; статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів
Вперше на основі клінічних і коагулологічних досліджень визначено частоту розвитку інгібіторів до дефіцитного фактора зсідання серед хворих на гемофілію в Україні, яка складає 16,7% при гемофілії А і 3,9% при гемофілії В, представлено детальний аналіз залежності їхнього виникнення від тяжкості гемофілії та подано характеристику типів інгібіторів (постійний, транзиторний, сильної і слабкої імунної відповіді) згідно рекомендацій WFH та ISTH.
Отримано пріоритетні результати про роль генетичних чинників у появі інгібіторів у хворих на гемофілію. Вперше в Україні розкрито зв'язок між поодинокими поліморфізмами (SNP) генів таких імунорегуляторних факторів, як IL-10, TNFб, CTLA-4, та наявністю інгібітору у цих хворих. Встановлено, що у хворих з постійним інгібітором рідше виявляється комбінований генотип АG -1082 IL-10/AG -308 TNFб, та вища частота А-алеля та АА-генотипу SNP +49 A>G екзону 1 гена CTLA-4 порівняно з хворими без інгібітору. В результаті аналізу розподілу генотипів поліморфних локусів промотера -318 С>Т та екзону 1 49 A>G гена CTLA-4 показано, що у хворих на гемофілію А частіше трапляється поєднаний генотип ТТ/АА, а за наявності постійного інгібітору достовірно рідше генотип CC/AG порівняно з хворими з транзиторним інгібітором.
Вперше в Україні з'ясовано відмінності у розподілі частот алельних варіантів генів локусів HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 у хворих на гемофілію А з постійним та транзиторним інгібітором порівняно з хворими без інгібітору. Встановлено, що алелі DRB1*1501-1502, DRB1*0701-0702 та DQВ1*0602 можна розглядати як алелі-агресори, які підвищують ризик появи інгібітору, а алель DQВ1*0302, навпаки, як алель-протектор, який знижує цей ризик. У більшості (70,0%) пацієнтів з постійним інгібітором уперше виявлено 1 або 2 алелі-агресори на відміну від пацієнтів з транзиторним інгібітором, у яких тільки у 21,4% випадків наявний 1 алель-агресор. У 53,9% обстежених пацієнтів без інгібітору виявлено алель-протектор як ізольовано (30,8%), так і в поєднанні з алелями-агресорами, що доповнює наукові знання про роль поліморфної системи МНС II класу у патогенезі появи інгібітору при гемофілії.
Вперше на основі множинних логіт-регресіи? узагальнено фактори ризику появи інгібітору у хворих на гемофілію, що дозволило ідентифікувати пацієнтів з високим ризиком розвитку інгібітору, створити модель (номограму) для передбачення його появи і запропонувати шляхи профілактики. Встановлено, що найбільший вплив на ймовірність розвитку інгібітору створюють чинники, пов'язані з лікуванням, а саме: інтенсивність замісноі? трансфузіи?ноі? терапіі? (кількість EД/1 епізод), зміна типу та виду препаратів під час лікування одного епізоду.
Доповнено знання про неоднорідну природу інгібіторних антитіл у хворих на гемофілію на основі опрацьованого нами методу - дослідження кінетики корекції подовженого АЧТЧ нормальною плазмою у зростаючій пропорції до і після інкубації протягом 1 год. Відзначено два типи патологічних інгібіторів: І тип - нейтралізуючий інгібітор FVIII(IX) з пролонгованою (прогресивною) дією і простою кінетикою нейтралізації нормальною плазмою; ІІ тип - набутий інгібітор негайної дії із складною кінетикою нейтралізації, аналогічний до ВА у хворих на АФС, що вказує на неоднорідність імунної відповіді на введений FVIII(IX) і вимагає різних підходів до лікування. Вперше в Україні стверджено, що не-нейтралізуючі інгібіторні антитіла до FVIII(IX) можуть слугувати критерієм безпеки нових рекомбінантних препаратів факторів зсідання крові.
Вперше у хворих на гемофілію з інгібітором та без інгібітору на підставі змодельованого ex vivo/in vitro досліду на основі тесту АЧТЧ з'ясовано вплив на зсідання крові препаратів «шунтової» дії: рекомбінантного активованого фактора VII (rFVIIa), активованого протромбінового комплексу (антиінгібіторного комплексу - аPCC) та неактивованого протромбінового комплексу (PCC). Встановлено високий ступінь кореляції між індексом скорочення АЧТЧ ex vivo/in vitro та клінічною відповіддю (зупинкою кровотечі) після введення препарату «шунтової» дії, який становить для rFVIIa r=+0,971 і для аPCC r=+0,950.
Вперше в Україні здійснено клінічну оцінку гемостатичної ефективності монотерапії препаратами «шунтової» дії rFVIIa і аРСС у хворих на гемофілію з інгібітором під час кровотеч і гемартрозів протягом тривалого періоду на підставі стандартизованих критеріїв. Стверджено високу ефективність цих препаратів у більшості випадків з незначною перевагою препарату rFVIIa перед аРСС.
Доповнено наукові дані про механізм дії шунтових препаратів на основі дослідження динаміки титру інгібітору у хворих на гемофілію А і В протягом 1 року монотерапії препаратами aPCCта rFVIIa. Встановлено відмінності дії цих препаратів. Титр інгібітору під час лікування aPCC виявляє виражену тенденцію до підвищення, а при застосуванні препарату rFVIIa до кінця спостереження він знижується, у 50% хворих змінюється тип реакції із сильної на слабку. Однак у жодного пацієнта після 12 міс. монотерапії aPCC або rFVIIa інгібітор не зникає.
Вперше обґрунтовано тактику лікування кровотеч і забезпечення гемостазу під час операційних втручань у хворих на гемофілію з низьким титром інгібітору та слабкою реакцією з виділенням груп високого, проміжного і низького ризику залежно від групи ризику геморагічного прояву за локалізацією та інтенсивністю і/або об'єму хірургічного втручання. Розроблено схеми лікування тяжких кровотеч у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором та у хворих з набутою гемофілією.
Практичне значення одержаних результатів
У дисертаційній роботі запропоновано нові підходи до оптимізації прогнозування, діагностики, лікування та профілактики інгібітору у хворих на гемофілію.
Розроблено нову методику розрахунку ризику появи інгібітору у хворих на гемофілію. На основі аналізу впливу генетичних факторів та факторів, пов'язаних з лікуванням, створено для практичного застосування номограму, з допомогою якої можна спрогнозувати появу інгібітору з високою чутливістю (94,6%) та специфічністю (93,4%), а її точність складає 94,1%. Встановлено предиктори появи інгібітору у хворих на гемофілію, які необхідно враховувати при призначенні лікування. На підставі цих предикторів обґрунтовано засади профілактики інгібіторів у хворих на гемофілію шляхом зміни підходів до лікування,
У хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором, доцільно проводити визначення типу інгібітору за кінетикою корекції подовженого АЧТЧ нормальною плазмою: І тип - нейтралізуючий інгібітор FVIII(IX) з пролонгованою дією і простою кінетикою нейтралізації нормальною плазмою; ІІ тип - набутий інгібітор негайної дії із складною кінетикою нейтралізації, аналогічний до ВА у хворих на АФС (патент на корисну модель №16967 «Спосіб діагностики вовчакового антикоагулянту у хворих на гемофілію»).
Для розрахунку індивідуальної дози препаратів при замісній терапії хворих на гемофілію рекомендовано використовувати тест відновлення рівня FVIII(IX) з розрахунком індексу відновлення (ІВ), що також дозволяє провести ранню діагностику резистентності до замісної терапії внаслідок появи інгібіторів до FVIII(IX).
Запропоновано використовувати тест корекції продовженого АЧТЧ ex vivo/in vitro з використанням плазми хворого і досліджуваного препарату в терапевтичній дозі для визначення гемостатичної дії препаратів «шунтової» дії у хворих на гемофілію з інгібітором з метою прогнозування індивідуальної гемостатичної відповіді на введення цих препаратів у хворого з кровотечею.
Для практичного використання розроблено тактику лікування кровотеч та забезпечення виконання хірургічних та ортопедичних операцій у хворих з інгібітором у низькому титрі та із слабкою реакцією з врахуванням групи ризику: високого, проміжного і низького - залежно від групи ризику геморагічного прояву за локалізацією та інтенсивністю і/або об'єму хірургічного втручання.
Видано методичні рекомендації «Діагностика антифосфоліпідних антитіл. Методика визначення вовчакового антикоагулянту» (Київ, 2007).
Основні результати досліджень та положення роботи впроваджено у практику відділення загальної та гематологічної хірургії, консультативної поліклініки, хірургічного відділення клініки ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України»; 5-ої міської клінічної лікарні м. Львова; Львівського міжрегіонального медико-генетичного центру на базі ДУ «Інститут спадкової патології НАМН України», гематологічних відділень Івано-Франківської ОКЛ, Чернівецької ОДКЛ, Закарпатської ОКЛ, гематологічному центрі Дніпровської МБКЛ №4.
Особистий внесок здобувача
Дисертантом особисто проведено аналіз наукових літературних джерел за темою роботи, обґрунтовано напрям досліджень, актуальність теми, сформовано мету та завдання дослідження, розроблено дизайн дисертаційної роботи, відібрано тематичних хворих, у яких проведено загальноклінічне, коагулологічне, молекулярно-генетичне обстеження. Автором було здійснено вибір предикторів розвитку інгібітору, виконано клінічне спостереження та лікування хворих, оцінено результати лікування, складено комп'ютерну базу даних, проведено статистичну обробку та інтерпретацію одержаних даних. Молекулярно-генетичні дослідження виконано у співпраці з лабораторією генетичних досліджень ДУ “Інститут спадкової патології НАМН України” (завідувач лабораторії генетичних досліджень - д.б.н. Макух Г.В.). Коагулологічні дослідження виконано спільно із с.н.с., к.б.н. Красівською В.В.
Дисертантом самостійно написано всі розділи дисертаційної роботи, проведено аналіз і узагальнення отриманих даних, сформульовано всі наукові положення, висновки та практичні рекомендації, розроблено стратегію оцінки прогностичних критеріїв появи інгібітору. В опублікованих із співавторами наукових працях запозичених матеріалів немає.
Апробація результатів дисертації
Основні положення дисертаційної роботи було представлено у вигляді усних та постерних доповідей на Ювілейному VIII з'їзді ВУЛТ, присвяченому 15-річчю організації (Івано-Франківськ, 2005); Науково-практичній конференції, присвяченої 65-річчю заснування Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України (Львів, 2005); Міжнародному симпозиумі «Гемостаз: проблеми та перспективи» (Київ, 2006) , XXI конгресі Міжнародного товариства з тромбозу та гемостазу (ISTH; Geneva, Швейцарія, 2007); 12-ому конгресі Європейської асоціації гематологів (ЕНА; Vienna, Австрія, 2007); І Міжнародному конгресі «Сучасні досягнення інфузійної терапії» (Черкаси, 2008); V з'їзді гематологів та трансфузіологів України з міжнародною участю “Підсумки та перспективи розвитку гематології та трансфузіології України” (Вінниця, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції «Актуальні питання діагностики та лікування захворювань крові» (Яремче, 2008); Ювілейній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини» (Львів, 2010); Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Клінічні та експериментальні аспекти гематології та трансфузіології», присвяченої 85-річчю з дня народження професора Б.В. Качоровського (Львів, 2011); 55 Щорічному зїзді Американського товариства гематологів (ASH; New Orlean, США, 2013); 7 щорічному конгресі Європейської асоціації з гемофілії і споріднених розладів (EAHAD; Brussels, Бельгія, 2014); XXXI Міжнародному конгресі Всесвітньої Федерації гемофілії (WFH; Melbourn, Австралія, 2014); IV міжнародному медичному конгресі «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України» (Київ, 2015); 67 Щорічному з?їзді Aмериканської асоціації тромбозів і гемостазу (AATH; Dallas, США, 2015), VI з'їзді гематологів та трансфузіологів України (Львів, 2015); 9 щорічному конгресі Європейської асоціації з гемофілії і споріднених розладів (EAHAD; Malmш, Швеція, 2016); V Ювілейному міжнародному медичному конгресі «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоровя України» (Київ, 2016); ІІІ Міжнародному конгресі з інфузійної терапії (Київ, 2016), XXXII Міжнародному конгресі Всесвітньої Федерації гемофілії (WFH; Orlando, США, 2016).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 69 наукових праць: 2 розділи у монографіях (з них 1 розділ у зарубіжній монографії), 38 статтей (з них 22 у фахових журналах і збірниках, рекомендованих ДАК України, 10 статтей у зарубіжних журналах), 1 посібник, 1 патент на корисну модель та 27 тез доповідей, з них - 15 закордонних.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, який містить 370 найменувань українською, англійською, російською мовами, 3 додатків. Дисертація викладена на 359 сторінках друкованого тексту, з них - 268 сторінок основного тексту, ілюстрована 75 таблицями та 23 рисунками,
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал та методи дослідження. Проведено аналіз клінічних проявів, анамнестичних, клініко-лабораторних, коагулологічних, цитогенетичних даних, та результатів лікування 652 хворих на гемофілію А і В, 5 хворих на набуту коагулопатію, віком від 1 до 75 років. Хворі знаходилися на лікуванні у хірургічному відділенні 5 МКЛ м. Львова, у клініці ДУ «ІПКТМ НАМН України» або спостерігалися в диспансерно-методичному відділенні гемофілії та коагулопатій та дитячому гематологічному відділенні інституту. 230 хворих на гемофілію було обстежено 2 і більше разів та клініці інституту з 1991 по 2017 рр.
Серед всіх обстежених хворих на гемофілію А у 251 (45,6%) встановлено тяжку форму хвороби (рівень FVIII <1%), у 176 (31,9%) хворих на гемофілію А виявлено форму середньої тяжкості або помірну (рівень FVIII - 1,0-5,0%) та у 124 хворих (22,5%) - легку форму (рівень FVIII >5,0%). Серед 101 хворого на гемофілію В проведено такий розподіл за ступенем тяжкості - тяжку форму діагностовано у 59 (58,4%) хворих, помірну у 27 хворих (26,7%), легку у 15 (14,9%) хворих.
У плановому порядку в період ремісії було обстежено 434 хворих на гемофілію А і В. Із загостренням основної хвороби (різноманітними геморагічними проявами - носовими та шлунково-кишковими кровотечами, гематурією, гемартрозами, та їх наслідками - гемофілічними артропатіями, псевдопухлинами, гнійно-септичними ускладненнями) - поступали в клініку 219 хворих на гемофілію для лікування або для проведення ургентного або планового хірургічного втручання. Хворі, у яких виявлено інгібітор, знаходилися під постійним спостереженням; дослідження у них проводили кожних три місяці, визначали рівень фактора та титр інгібітору в динаміці.
Ефективність лікування оцінювали за такими показниками як от: біль, об'єм рухів у суглобі, рейтинг гемостатичної ефективності за класифікатором кількість інфузій для лікування геморагічних епізодів, зміни рівня інгібіторів FVIII та FIX. Біль, спричинений кровотечею, у підлітків та дорослих вимірювали перед інфузією і через (6±0,5) год. та (24±1) год. після інфузії (після останньої інфузії, отриманої для лікування геморагічного епізоду) за візуальною аналоговою шкалою (ВАШ).
В усіх хворих, яким призначено профілактичне або лікування «на вимогу», розраховували: річний рейтинг кровотеч ABR для всіх крововиливів і кровотеч, AsBR для спонтанних кровотеч, AjBR для гемартрозів. ABR розраховували за такою формулою: (кількість пролікованих крововиливів / період оцінки ефективності) Ч 365,25. Описова статистика для індивідуального ABR, AsBR, AjBR включали середнє, стандартне відхилення (SD), медіану і міжквартильний діапазон.
Контрольну групу для досліджень склали 50 здорових осіб (25 чоловіків і 25 жінок середнього віку), які не приймали жодних ліків.
Дослідження системи гемостазу проводили в атестованій (свідоцтва про атестацію №№ РЛ 1074/07, РЛ 1865/11, РЛ 124/14) і щорічно сертифікованій Всесвітньою Федерацією Гемофілії (ВФГ; WFH) лабораторії ДУ ІПКТМ.
Коагулологічні дослідження виконували на напівавтоматичному коагулометрі Helena-С4 № С4-2489 (Helena Bioscience Europe, Великобританія).
Для загальної оцінки стану системи гемостазу виконували скринінгові дослідження, які включали: протромбіновий час за Quick (ПЧ); активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ); тромбіновий час (ТЧ); визначення концентрації фібриногену гравіметричним методом за Niewiarowski [Kitchen S. et al., 2000]. Для коректного співставлення результатів розраховували індекс АЧТЧ (ІАЧТЧ), як відношення часу зсідання хворого до часу зсідання нормальної плазми [Kitchen S. et al., 2010].
Судинно-тромбоцитарний гемостаз оцінювали на підставі кількості тромбоцитів, оцінки агрегації тромбоцитів під дією агоністів - аденозиндифосфорної кислоти (АДФ) та рістоцитину [Красівська В.В. зі співавт., 2014].
Діагностику та диференціацію різних форм коагулопатій здійснювали за допомогою корекційних проб на основі АЧТЧ [Kitchen S. et al., 2010]. Визначення активності дефіцитного фактора зсідання проводили за уніфікованою одностадійною методикою визначення FVIII(IX) [Kitchen S. et al., 2010]. Рівень дефіцитного FVIII або FIX виражали у відсотках (%) від його вмісту у нормальній плазмі за стандартною кривою розведення. Дослідження на наявність інгібіторних антитіл до FVIII(IX) проводили у два етапи. На першому виконували скринінговий (якісний) тест на основі АЧТЧ. Позитивним результатом щодо наявності інгібітору вважали різницю більше ніж 2 с. На наступному етапі проводили кількісне (метод Bethesda) визначення інгібіторів до дефіцитного FVIII(IX) за методикою Kasper (1975). Результати подавали у Bethesda од/мл (БО/мл). Позитивним вважали результат при титрі ?0,6 БО/мл.
Зв'язуючі антитіла (класів IgG і IgM) до FVIII, ПЕГ-FVIII, ПЕГ, антитіла до білка яєчника китайського хом'ячка (СНО), які розглядаються як потенційні домішки з виробничого процесу аналізували з використанням ІФА методу.
Діагностика вовчакового антикоагулянту (ВА) полягала у послідовному виконанні трьохетапного комплексу тестів для виявлення активності ВА відповідно до міжнародних критеріїв та сучасних рекомендацій [Brandt JT. et al., 1995, Arnout J., Janovski M., 2004].
Визначення кінетики нейтралізації інгібітору (відповіді інгібітору) проводилося на основі модифікованого корекційного тесту за зміною показників АЧТЧ плазми хворого при додаванні до неї у різних співвідношеннях нормальної плазми від пулу донорів [Lutze GB. et al., 1996] двічі - до інкубації суміші обох плазм і після їх інкубації протягом 1 год. з побудовою відповідного графіка. У роботі використовували такі зростаючі пропорції (%) нормальної плазми до дослідної плазми: 0% , 25% , 50% , 75% , 100%. Дослідження гемостатичної активності препаратів «шунтової» дії (рекомбінантного активованого фактора VII (rFVIIa), активованого протромбінового комплексу (антиінгібіторного комплексу - аPCC) та неактивованого протромбінового комплексу (PCC) у хворих на гемофілію А в тесті, змодельованому на основі АЧТЧ ex vivo / in vitro проводили у хворих на гемофілію з інгібітором та без інгібітору.
Молекулярно-генетичне дослідження гена F8 проводили у відділенні лабораторної медицини Віденського університету (Prof. Dr. G. Hoerman). Аналіз послідовностей F8 методом двонаправленого секвенування всіх кодуючих екзонів гена F8, 5'-UTR і переходів екзон / інтрон проводили за методом Sanger на генетичному аналізаторі ABI Genetic Analyzer. Секвеновані варіанти представлено згідно номенклатури HGVS. Всі потенційно патологічні варіанти генетичних аберацій підтверджено незалежним секвенуванням.
Для молекулярно-генетичного дослідження у всіх пацієнтів дослідної та контрольної груп проводили виділення та очистку ДНК з лейкоцитів периферичної крові комерційним набором DiatomDNAPrep 200.
Ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro проводили, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в автоматичному режимі на термоциклері «Терцик» («ДНК-технология», Росія). Специфічність продуктів ПЛР визначали за послідовністю специфічних праймерів, температурою відпалу та складом реакційного буферу. Програма ПЛР включала такі етапи: активація 12 хв (95 °C); 5 циклів ПЛР у послідовному режимі: денатурація ДНК (94 оС) 30 с, відпал праймерів (62 оС) 30 с, елонгація ДНК (72 °С) 45 с; 30 циклів ПЛР за таким режимом: денатурація ДНК (94 оС) 30 с, відпал праймерів (57 оС) 30 с, елонгація ДНК (72 °С) 45 с та фінальна елонгація - 10 хв (72 °С). Для детекції поліморфних варіантів гена IL-10 використовували алель-специфічну ПЛР. В роботі використовали загальний праймер для двох алелів (G і A) та контрольного фрагменту:
IL-10-R - 5'-GTA AGC TTC TGT GGC TGG AGTC-3'.
Також використовували два специфічні праймери для кожного з алелів та контрольного фрагменту:
IL-10-A - 5'-AAC ACT ACT AAG GCT TCT TTG GGT A-3';
IL-10-G - 5'-AAC ACTA CTA AGG CTT CTT TGG GTG-3';
IL-10-C - 5'-TTT CCA GAT ATC TGA AGA AGT CCT G-3'.
Для детекції поліморфних варіантів TFNб-308 використовували алель-специфічну ПЛР. Цей метод передбачає постановку двох реакцій ампліфікації для кожного досліджуваного зразка ДНК. В роботі використовували загальний праймер для двох алелів (G і A):
CP - 5'-AAG AAT CAT TCA ACC AGC GG-3';
та два специфічні праймери для кожного з алелів:
AP-1 - 5'-ATA GGT TTT GAG GGG CAT CG-3';
AP-2 - 5'-ATA GGT TTT GAG GGG CAT CA-3'.
Детекцію поліморфних варіантів промотерної ділянки -318 С>Т та екзону 1 49 A>G гена CTLA-4 виконано за допомогою ПЛР - Н-ARMS-PCR (tetra-primer алель-специфічна реакція) [Mc. Pherson M. J. et al., 1993]. Використовували олігонуклеотидні праймери та 2ЧPCR MasterMix (0,05 units/µl TaqDNA Polymerase, 4mM MgCl2, 0,4mM dNTPs) виробництва Fermentas (Литва).
Електрофорез тотальної ДНК та продуктів ПЛР в агарозному гелі. Наявність та специфічність проходження ПЛР перевіряли шляхом електрофорезу в 1,6% агарозному гелі. Сканували електрофореграму на ультрафіолетовому трансілюмінаторі «ECX-15. M» (VILBERLOURMAT, Франція). Отримані сигнали порівнювали з маркерами довжин і на основі цього детектували розміри отриманих фрагментів. Результати сканування гелів фотографували цифровою камерою GelImager («HELICON», Росія) при довжині хвилі 256 нм.
Генотипування DRB1, DQA1 та DQB1 проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на термоциклері «Терцик» («ДНК-технология», РФ) в автоматичному режимі за відповідною програмою. Для типування алелів зазначених генів використано набір реагентів «GenPak HLA-DRB1 PCRtest», «GenPak HLA-DQA1 PCRtest» «GenPak HLA-DQB1 PCRtest» (ООО «Лаборатория Изоген», РФ). Набори реагентів, призначених для ампліфікації ДНК методом ПЛР, містили секвенс-специфічні праймери. Алелі детектували шляхом проведення електрофорезу в 3%-му агарозному гелі, забарвленому бромистим етидієм в УФ-світлі за довжини хвилі 302 нм.
Статистичну обробку матеріалу виконали за допомогою пакетів прикладних програм STATISTICA for Windows 5,0 (Statsoft, USA). Порівняння параметричних показників між групами здійснювали за допомогою непараметричного критерію Манн-Уітні та подавали їх як медіану, мінімум, максимум, нижній-верхній квартилі, оскільки у багатьох випадках їх розподіл у вибірках був неґаусівським (перевірка на нормальність розподілу за критеріями Колмогорова-Смирнова та Шапіро-Вілкса). Статистичне опрацювання результатів проводили з використанням критерію Пірсона чІ. Для порівняння якісних характеристик (таблиці частот) застосовували критерій ч2 і точний критерій Фішера при малому об'ємі сукупності (<30 випадків) у разі таблиць 2Ч2. Вірогідність отриманих результатів для всіх видів статистичного аналізу визначали за критичним рівнем значущості (достовірності) не менше 95% (р<0,05). Асоціацію генотипів та алелів з ризиком інгібітору оцінювали, розраховуючи співвідношення шансів (Odds ratio, OR) з 95%-м довірчим інтервалом.
Для обґрунтування дослідження взаємозв'язку між різними факторами ризику та ймовірністю розвитку інгібітору ми використовували регресіи?ні моделі дискретного вибору. Дослідження ґрунтувалося на використанні низки однофакторних регресіи?них моделей бінарного вибору, які виявляють окремі ефекти впливу кожного чинника на ймовірність розвитку інгібітору. Наступним кроком був аналіз впливу факторів ризику на підставі оцінювання множинних логіт-регресій, які дають змогу дослідити ефекти та важливість кожного з чинників, враховуючи одночасність і?х впливу. Обґрунтування адекватності побудованих логіт-моделеи? проведено на підставі критерію чІ, а значущість коефіцієнтів регресіі? - на підставі статистик Стьюдента і Вальда. Також обчислено теоретичні значення ймовірності розвитку інгібітору для кожного пацієнта і діапазони (95% довірчі інтервали) прогнозованого ризику розвитку інгібітору в групі хворих із значенням залежної змінної «ні» та в групі хворих із значенням «так».
Результати дослідження, їх аналіз та узагальнення. В розділі 3 представлено результати дослідження генетичних факторів схильності до утворення інгібітору у хворих на гемофілію. Для з'ясування ролі особливостей імунної системи хворого на гемофілію у виникненні інгібіторів, ми провели дослідження молекулярно-генетичних факторів формування імунної відповіді, зокрема важливих однонуклеотидних поліморфізмі (SNP) генів IL-10, TNFб, CTLA-4 та генів системи HLA ІІ класу, у хворих як з інгібітором, так і без нього. На противагу до даних літератури, отримані нами результати дослідження однонуклеотидних поліморфізмів -1082 G - A гена IL-10 у хворих на гемофілію А, які проживають, в основному, на території Західної України, не показали відмінностей залежно від тяжкості захворювання (ступеня дефіциту FVIII) та наявності інгібітору. Виявлено тільки достовірно нижчу частоту генотипу нормальної експресії (AG) -1082 G - A IL-10 у пацієнтів з помірною формою гемофілії порівняно з легкою формою. Очевидно, цей SNP не відіграє ролі у патогенезі інгібітору при гемофілії А у нашій популяції хворих.
Співвідношення частот A- і G- алелів та частота генотипів SNP -308 G - A TNFб, які вони формують (AA, GG, AG), достовірно не відрізняється від контролю та не залежить від тяжкості захворювання. В нашому дослідженні генотип АА виявлено в 1 (11,1%) хворого з легкою формою гемофілії та в 1 (2,0%) особи контрольної групи. Ці результати свідчать, що цей генотип доволі рідкісний у нашій популяції хворих, що суттєво відрізняється від даних Astermark J. et al., які оцінюють наявність алеля А як фактор ризику появи інгібітору.
У хворих на гемофілію всіх форм тяжкості, порівняно із здоровими особами, виявлено вищу частоту алеля Т та генотипу ТТ SNP -318 С > Т промотера гена CTLA-4, продукт якого білок CTLA-4 - антиген 4, асоційований з цитотоксичними Т-лімфоцитами, відіграє ключову роль у гальмуванні активації Т-лімфоцитів під час імунної відповіді. У пацієнтів з легкою формою хвороби частота Т-алелі та ТТ-генотипу достовірно вища порівняно з хворими на тяжку та помірну форми гемофілії. При класичній гемофілії, ускладненій появою інгібітору, за результатами наших досліджень, суттєвих відмінностей у розподілі поліморфізму +49 A > G екзону І гена CTLA-4 порівняно з хворими на неускладнену гемофілію та із здоровими не виявлено. З іншого боку, у пацієнтів з -318 C > T поліморфізмом промотера гена CTLA-4 виявлено його протекторний ефект щодо появи інгібітору у хворих на гемофілію А. Наявність Т-алеля надає захисний ефект за рахунок підвищення продукції білка CTLA-4 і посилення його експресії на активованих Т-клітинах, що протидіє і гальмує імуногенний вплив будь-яких сигналів, які викликають імунну відповідь на введений FVIII, не допускаючи активації специфічних клонів В-клітин. У зв'язку з тим, пацієнти, які не мають Т-алеля, більш схильні до розвитку інгібіторів порівняно з тими, що несуть цей алель (57,6% порівняно з 31,2%).
Оскільки T-алель промотера -318 С > Т пов'язаний з підвищеною експресією CTLA-4, то вища частота цього алеля у хворих на гемофілію незалежно від наявності інгібітору може свідчити про те, що цей механізм у хворих на гемофілію А не відіграє суттєвої ролі у розвитку інгібітору. Очевидно, переважають інші механізми імунної відповіді на введений FVIII. Результати наших досліджень також можуть підтверджувати алоімунний характер інгібітору та свідчити про незначну роль автоімунного механізму в розвитку інгібітору у хворих на вроджену гемофілію. Можливо, навпаки, переважання Т-алелі, Т-фенотипу та ТТ-генотипу у хворих на гемофілію А сформувалося еволюційно з метою пригнічення імунної відповіді на зовнішній FVIII у хворих із спадковим дефіцитом цього фактора. Такий висновок може підтверджувати виявлений нами факт, що у хворих на спорадичну гемофілію А (хвороба у І поколінні) інгібітор виникає частіше, ніж у хворих на спадкову форму гемофілії А.
Ми встановили, що у хворих з постійним інгібітором достовірно частіше трапляється поєднання генотипів GG -1082 G - A IL-10 / GG -308 G - A TNFб та достовірно рідше - генотип АG/AG. Також виявлено, що генотип АА/GG достовірно з вищою частотою поширений у пацієнтів з транзиторним інгібітором порівняно з групою пацієнтів без інгібітору та з постійним інгібітором. У хворих на гемофілію встановлено достовірно вищу частоту поєднаних поліморфізмів промотерної ділянки -318 С > Т та екзону 1 +49 A > G гена CTLA-4 TT/AA порівняно із здоровими та достовірне зниження частоти генотипу CC/AG у хворих з постійним інгібітором порівняно як з групою хворих, у яких виявлявся транзиторний інгібітор, так і з контрольною групою.
Подобные документы
Особливості терапії гемофілії. Поліклінічний етап реабілітації дітей, хворих на гемофілію. Лікування парагемофілії (хвороби Стюарта — Прауер). Особливості терапії з ідіопатичною тромбоцитопенічною пурпурою. Лікувальна програма при геморагічному васкуліті.
реферат [343,8 K], добавлен 12.07.2010Закономірності розвитку уражень АНС при цукровому діабеті. Методи ранньої діагностики, патогенетично-обґрунтованого лікування і профілактики ДАН у хворих на цукровий діабет 1 типу. Лікування сірковмісними препаратами та вплив їх на перебіг хвороби.
автореферат [147,5 K], добавлен 17.02.2009Особливості патогенезу, клінічного перебігу, лабораторної діагностики, морфологічних і морфометричних змін печінки у хворих на хронічний гепатит і цироз печінки з синдромом холестазу, розробка концепції діагностики і лікування виявлених порушень.
автореферат [61,6 K], добавлен 21.03.2009Нові методи лікування із застосуванням лізиноприлу і глутаргіну на основі вивчення клініко-патогенетичних особливостей мозкового і периферійного кровоплину у хворих на артеріальну гіпертензію, аналіз впливу лікування на клінічний перебіг захворювання.
автореферат [32,9 K], добавлен 21.03.2009Поліпшення результатів лікування хворих-наркоманів на хірургічний сепсис шляхом корекції ступеня тяжкості ендотоксикозу та своєчасної переорієнтації програми лікування. Етіологічні чинники, особливості клінічної картини та симптоматики сепсису у хворих.
автореферат [49,7 K], добавлен 09.04.2009Клінічні особливості перебігу хронічного бронхіту у хворих з наявністю фонової тонзилярної патології. Перспективність використання вітчизняного імуноактивного препарату рослинного походження протефлазіду при проведенні медичної реабілітації хворих.
автореферат [41,3 K], добавлен 08.02.2009Клініко-лабораторне обґрунтування і розробка медикаментозного лікування хворих на генералізований пародонтит при ротовій протоінвазії. Порівняльна оцінка методів прогозоологічної діагностики і діагностика інвазії протистів у пародонтологічних хворих.
автореферат [135,2 K], добавлен 15.08.2009Важливість проблеми псоріазу. Поглиблене клініко-лабораторне обстеження в динаміці хворих на псоріаз. Порівняльний аналіз найближчих (після лікування) та віддалених результатів клінічної ефективності лікування хворих на псоріаз за алгоритмом клініки.
автореферат [49,0 K], добавлен 04.04.2009Ранній післяопераційний період з використанням традиційного лікування хворих після стандартних хірургічних втручань у щелепно-лицевій ділянці. Часткова паротидектомія при аденомі привушної залози. Комплексне лікування хворих стоматологічного профілю.
автореферат [94,7 K], добавлен 21.03.2009Фізична реабілітація в системі комплексного відновного лікування хворих на гіпертонічну хворобу. Клінічна характеристика хворих контрольної і експериментальної груп. Динаміка показників в період відновної терапії. Використання засобів фізіотерапії.
дипломная работа [1,1 M], добавлен 05.03.2013