Молекулярно-генетичні механізми патогенезу і шляхи оптимізації діагностики, лікування та профілактики появи інгібітору у хворих на гемофілію

Таким чином, отримані результати, разом з іншими нещодавніми повідомленнями, переконливо показують, що формування інгібітору у хворих на гемофілію це складний полігенний процес, який включає як тип мутації FVIII, так і поліморфізм генів імунної відповіді, у першу чергу тих, що кодують рівень білка CTLA-4, негативного регулятора передачі костимулюючого антигенного сигналу з антигенпрезентуючих клітин на Т-клітини і активації клонів В-клітин.

Типи мутацій F8, при яких існує високий ризик виникнення інгібітору, знаходяться в стадії обговорення, і система HLA класу II може бути одним з ключів до визначення цієї групи. Молекули основного комплексу гістосумісності (МНС) класу II відіграють центральну роль в імунній відповіді, вони детермінують пов'язані пептиди і представляють їх Т-клітинам. Хоча проведені дослідження показали, що система HLA, зокрема HLA класу ІІ, може мати істотне значення в розвитку інгібіторів, асоціація між HLA і формуванням інгібіторів FVIII відрізняється у різних етнічних груп і залежить від географічного регіону, причому виявлено деякі міжетнічні відмінності в розподілі алельних поліморфізмів HLA. Ці відомості можуть слугувати підставою для виявлення груп з високим ризиком виникнення інгібіторів у різних популяціях.

Нами встановлено десятикратне зростання носійства алельної групи DRB1*1501-1502 та DQВ1*0602 (OR=10,7; CI 95%: 0,58-198,91), які підвищують ризик розвитку інгібітору у хворих на гемофілію, проте довірчий інтервал не відповідає вірогідному рівню, що може бути зумовлено невеликою вибіркою та відсутністю пацієнтів з таким генотипом в групі без інгібітору. На противагу цьому носійство DQВ1*0302 достовірно в 5 разів менше у хворих з інгібітором (OR=5,5; CI 95%: 1,29-23,17); ці результати свідчать про те, що наявність цього маркера може впливати на зниження ризику розвитку інгібітору.

У більшості (70,0%) пацієнтів з постійним інгібітором виявлено 1 або 2 алелі-агресори на відміну від пацієнтів з транзиторним інгібітором, у яких тільки у 21,4% випадків наявний 1 алель-агрессор генів MHC ІІ класу. У 53,9% обстежених пацієнтів без інгібітору виявлено алель-протектор як ізольовано (30,8%) так і в поєднанні з алелями-агресорами. Послідовно визначити алелі ризику розвитку інгібітору в системі HLA важко, імовірно, через безсистемність і неоднорідність пептидів, з якими вони зв'язуються. Однак, це не применшує їх значення і, можливо, вирішальну роль у цьому процесі.

Ми встановили тип генетичної мутації, яка призвела до захворювання на гемофілію А, у частини попередньо лікованих пацієнтів з гемофілією А (у 70,0%; 35/50) та у 21 пацієнта (100%) з гемофілією В, яким проводили регулярну замісну терапію препаратами фактора VIII та ІХ. Серед хворих на гемофілію А у 23 (46,0%) виявлено «великі» мутації гена фактора VIII: великі делеції у 4 (8,0%), інверсії інтрону 22 у 16 (32,0%), інверсії інтрону 1 у 3 (6%). У 12 (24,0%) стверджено «малі» мутації, з них: точкові мутації у 4 (8%), нонсенс-мутації у 2 (4,0%), міссенс-мутації у 2 (4,0%) та фрейм-шифт (зсув рамки зчитування) мутації у 4 (8,0%) осіб. Серед 21 пацієнта з гемофілією В у 10 (47,6%) констатовано нонсенс мутацію, у 10 (47,6%) - міссенс мутацію, в 1 (4,8%) - зсув рамки зчитування. В нашій групі досліджених хворих не виявлено залежності появи інгібітору від типу генетичної мутації у попередньо лікованих пацієнтів як при гемофілії А, так і при гемофілії В.

В розділі 4 представлено результати дослідження зовнішніх факторів утворення інгібіторів у хворих на гемофілію. Встановлено, що у хворих на гемофілію А і гемофілію В, попередньо лікованих плазмовими препаратами різного ступеня очищення та у яких не було виявлено інгібітору до FVIII(IX), при переході на профілактичне лікування або лікування «на вимогу» модифікованими рекомбінантними препаратами, виготовленими за різними виробничими технологіями, нейтралізуючі інгібітори до FVIII(IX) не виникають. У поодиноких хворих з'являються неінгібіторні (зв'язуючі) антитіла до FVIII, як неспецифічні, так і препарат-специфічні, які не впливають на ефективність лікування та клінічний перебіг хвороби. У хворих, які отримують лікування в режимі профілактики, достовірно (р<0,0001) скорочується річний рейтинг кровотеч, як загальний (ABR), так і спонтанних кровотеч (AsBR) і крововиливів у суглоби (AjBR) порівняно з пацієнтами, які отримували препарати «за вимогою», незалежно від дози. Модифіковані рекомбінантні препарати FVIII(IX) мають здовжений період піврозпаду, що дозволяє зменшити частоту їх введення, підтримуючи рівень фактора ?1%.

В розділі 5 ми проаналізували фактори, які потенційно можуть впливати на ризик появи інгібітору. Відібрано і опрацьовано 15 ознак, пов'язаних з хворобою пацієнта і його лікуванням, які потенційно можуть бути факторами ризику виникнення інгібітору при гемофілії. За допомогою однофакторних логіт-моделей визначено предиктори появи інгібітору у хворих на гемофілію та їх статистичну значущість. Методом множинних логіт-регресій виділено сукупність предикторів появи інгібітору у хворих на гемофілію та оцінено їх значущість. До таких предикторів відносяться: кількість ЕД введення препарату на 1 епізод кровотечі, зміна препарату під час лікування, ступінь очищення препарату зсідання крові, вік хворого, наявність гнійних ускладнень, об'єм і характер хірургічних втручань, інгібіторний анамнез.

На основі розробленої багатовимірної логіт-модель нами встановлено, що найбільший ефект на ймовірність розвитку інгібітору створює такий показник як кількість EД/1 епізод: якщо він збільшується більше ніж на 5 ЕД, то ймовірність розвитку інгібіторів збільшується на 27%. Це підтверджує раніше виявлену багатьма дослідниками залежність появи інгібітору від інтенсивності замісної трансфузійної терапії препаратами FVIII.

Хоча деякі автори вважають, що зміна препарату під час лікування не впливає на розвиток інгібітору, нами встановлено, що для пацієнтів, які змінювали тип та вид препаратів, ймовірність появи інгібітору збільшується на 23%. Наші ж результати були отримані з аналізу ретроспективних та проспективних даних протягом більше, ніж 30 років, у яких ми оцінювали перехід з кріопреципітату на плазмові препарати проміжного очищення та високоочищені. Крім того, ми встановили, що ступінь очищення плазмового препарату значущий, але негативний предиктор появи інгібітору, тобто, чим більш високоочищеним є плазмовий препарат, тим менше він впливає на появу інгібітору.

Наші результати підтверджують той факт, що інгібітор частіше розвивається у молодших пацієнтів, тобто вік хворого є значущим і негативним предиктором (p<0,05) у створеній нами багатовимірній моделі. Безперечним фактором ризику є обтяжений «інгібіторний» анамнез (наявність інгібітору у членів родини пацієнта, хворих на гемофілію), який зумовлює збільшення ймовірності розвитку інгібітору в групі обстежених нами хворих на 12%, що також підтверджується більшістю опублікованих досліджень.

Не виявлено різниці у розвитку інгібітору при профілактичному та лікуванні «за потребою» в обстежених хворих, що на нашу думку пов'язано з незначною часткою пацієнтів, які отримували профілактичне лікування (16,2% в групі хворих з інгібітором і 24,6% в групі хворих без інгібітору). Згідно з теорією «моделі небезпеки», яка зараз домінує, ендогенним джерелом сигналів небезпеки є пошкоджені тканини з некротичною загибеллю клітин і викидом внутрішніх сигналів, які стимулюють вроджену імунну систему через Toll-like рецептори. При гемофілії тяжкі кровотечі та хірургічні операції, очевидно, пов'язані з таким некротичним пошкодженням клітин і можуть впливати на ризик розвитку інгібітору. У створеній нами прогностичній моделі виникнення інгібітору пацієнти, яким проводили невідкладні хірургічні втручання, мають на 40% вищу ймовірність розвитку інгібітору порівняно з пацієнтами, яким не проводили хірургічних втручань, причому об'єм хірургічного втручання значущий, але негативний предиктор, тобто за нашими спостереженнями «малі» хірургічні втручання - фактор ризику появи інгібітору. Ми виявили, що гнійні ускладнення, зокрема гемофлегмони, нагноєні гемартрози та гемофільні псевдокісти, при багатофакторному аналізі на 21% збільшують ймовірність появи інгібітору у наших пацієнтів. Встановлено, що пацієнти, які отримували лікування з приводу черепно-мозкової та шлунково-кишкової кровотечі, відповідно на 58% і 59% більш схильні до розвитку інгібітору. Водночас пацієнти з ретроперитонеальними кровотечами та гемофільними псевдопухлинами мають на 41% і 38% вищу ймовірність розвитку інгібітору порівняно з пацієнтами без кровотеч.

За результатами множинної логіт-регресії на основі встановлених незалежних предикторів і їхньої прогностичної значущості створено зручну, клінічно адаптовану номограму для оцінки ризику розвитку інгібіторів у хворих на гемофілію, яка дозволяє з точністю 94,1% прогнозувати виникнення інгібітору (рис.1). Запропонована модель характеризується значною діагностичною ефективністю: має високу чутливість (94,6%) та специфічність (93,4%).

Рис.1. Номограма для визначення балу і ймовірності виникнення інгібітору у хворих на гемофілію за незалежними предикторами

У розділі 6 представлено результати коагулологічного дослідження у хворих на гемофілію. В обстеженій групі хворих патологічні інгібітори до факторів зсідання VIII(ІХ) виявлено у 16,7% хворих на гемофілію А та значно рідше (у 3,9% хворих) при гемофілії В. Частота гемофілії з інгібітором вірогідно зростає залежно від тяжкості гемофілії. За повідомленнями літератури, непрямим підтвердженням впливу типу генетичної мутації фактора VIII на появу інгібітору є його залежність від тяжкості гемофілії: найвища частота появи інгібітору (20-30%) спостерігається в осіб з тяжкою формою (FVIII <1%). В групі хворих, які знаходилися під нашим спостереженням, при статистичному аналізі встановлено істотно вищу частоту інгібітору при тяжкій гемофілії А, порівняно з помірною та легкою формами (2=18,89; р=0,00001; 2=39,12; р<0,00001) відповідно, а при гемофілії В інгібітор виник тільки у хворих з тяжкою формою хвороби.

Ми встановили транзиторний характер інгібітору у 22 (23,9%) пацієнтів з гемофілією А та в 3 (75%) з гемофілією В. У більшості пацієнтів транзиторний інгібітор був у високому титрі (?5 БО/мл; 14 (63%) хворих при гемофілії А та 2 (50%) при гемофілії В). Постійний характер інгібітору спостерігали у 70 (83,7%) хворих на гемофілію А, у більшості з них, 51 (55,4%) пацієнтів з постійним інгібітором констатовано сильну імунну відповідь на введення концентратів FVIII(IX), що клінічно проявлялося резистентністю до замісної терапії. Отримані нами результати узгоджуються з повідомленнями літератури, у яких в перспективному довгостроковому реєстраційному дослідженні препарату рекомбінантного FVIII показано, що приблизно одна третина виявлених інгібіторів були транзиторним, і що тільки близько половини з них були у високому титрі (>5 БО/мл).

Ми провели, в середньому, 12,6 визначень інгібітору в 1 хворого з постійним інгібітором протягом, в середньому, 9,78 років (медіана становить 8 [1-22] років) у плановому порядку в період ремісії і під час лікування, залежно від частоти, виду та тяжкості кровотечі і/або хірургічного втручання. Загальний показник смертності в нашій групі з 639 хворих на гемофілію А та В становив 5,9% за 25 річний період спостереження. Причому, у групі хворих з інгібітором частка померлих (22,9%) достовірно більша (ч2=58,166, р<0,001), ніж у групі осіб без інгібіторних антитіл (3,0%), що підтверджує висновки про вплив інгібітору на частоту смертності хворих на гемофілію, отримані іншими дослідниками [Darby SC., 2007].

До чинників, які впливають на вибір тактики і ефективність лікування хворих з інгібітором, відноситься природа інгібітору, які можуть мати алоімунний, аутоімунний або змішаний характер. Важливою властивістю, яка відображає природу інгібітору є кінетична реакція інактивації інгібітором FVIII у нормальній плазмі. Для з'ясування типу патологічного інгібітору ми використовували модифікацію корекційного якісного тесту на інгібітор З цією метою ми визначали кінетику корекції нормальною плазмою подовженого АЧТЧ, зумовленого дефіцитом FVIII(IX), за наявності/відсутності патологічних інгібіторів, у 20 хворих на гемофілію А та В. Серед них було 12 хворих з виявленими антитілами до дефіцитного фактора зсідання (11 хворих на гемофілію А та 1 хворий на гемофілію В). Дослідження кінетики корекції подовженого АЧТЧ нормальною плазмою у зростаючій пропорції до і після інкубації протягом 1 год. дозволило виявити у хворих на гемофілію два типи патологічних інгібіторів. І тип - нейтралізуючий інгібітор FVIII(IX) з пролонгованою (прогресивною) дією і простою кінетикою нейтралізації нормальною плазмою. ІІ тип - набутий інгібітор негайної дії із складною кінетикою нейтралізації, аналогічний до ВА у хворих на АФС. Ми провели визначення кривих корекції подовженого АЧТЧ у хворих на гемофілію А, у яких за допомогою коагулологічних тестів виявлено два типи інгібіторів зсідання - специфічний інгібітор до FVIII та ВА (рис. 2-5). Запропонований метод дозволив виявити, що комплексна дія інгібіторів у цих хворих має доволі виразний індивідуальний характер. В одному випадку ми спостерігали переважну прогресивну активність імунного інгібітору до FVIII, а ВА не впливав на перебіг процесу зсідання крові. В інших хворих дія ВА проявлялася більш яскраво. Цей антикоагулянт (негайно реагуючий ІІ типу) зумовлює комплексну кінетику, під час реакції додатково гальмує процес зсідання.

Нами виявлено ВА у 29,6% хворих на гемофілію з наявністю патологічних інгібіторів зсідання і/або клінічними ознаками резистентності до замісної терапії препаратами факторів зсідання, в тому числі у 38,3% пацієнтів з наявним нейтралізуючим інгібітором і у 17,6% хворих без нейтралізуючого інгібітору.

Рис. 2. Кінетика корекції АЧТЧ Рис. 3. Кінетика корекції АЧТЧ

нормальною плазмою у хворих нормальною плазмою у хворих

на гемофілію без інгібітору на гемофілію з інгібітором І типу

Рис. 4. Кінетика корекції АЧТЧ Рис. 5. Кінетика корекції АЧТЧ

нормальною плазмою у хворих нормальною плазмою у хворих

на гемофілію з інгібітором ІІ типу на АФС з ВА

Причому ВА спостерігають достовірно частіше у хворих з постійним інгібітором, ніж у хворих з транзиторним інгібітором. ВА ускладнює перебіг гемофілії і призводить до підвищеної смертності хворих: частка померлих у групі з виявленим ВА (+) достовірно вища, ніж у групі без ВА (-) і становить 55,6% (10,18; ч2=7,503, р=0,006).

В нашому дослідженні у поодиноких попередньо лікованих хворих ми виявили неінгібіторні (зв'язуючі) антитіла до FVIII, як неспецифічні, так і препарат-специфічні, які не впливають на ефективність лікування та клінічний перебіг хвороби при переході на профілактичне лікування або лікування «за потребою» модифікованими рекомбінантними препаратами, виготовленими за різними виробничими технологіями. Нейтралізуючі інгібітори до FVIII(IX) у цьому випадку не виникають. Тому у всіх пацієнтів з низьким титром інгібіторів, в тому числі з підтвердженими інгібіторами, завжди повинно проводитися фармакокінетичне дослідження з метою оцінки клінічного значення інгібітору.

При гемофілії А очікуваний рівень FVIII (у %) після інфузії повинен бути, в середньому, вдвічі вищий від введеної дози препарату (в МО/кг). Для оцінки ефективності замісної терапії препаратами зсідання крові і можливого виявлення інгібіторної активності проводять тест відновлення (ТВ), який показує, на скільки % підвищується активність FVIII у хворого на гемофілію через 0,5 год. після введення певної дози препарату в МО/кг. На цій основі розраховують індекс відновлення (ІВ) як співвідношення визначеної через 0,5 год. активності FVIII у хворого до дози введеного препарату.

У нашому дослідженні у всіх пацієнтів без підозри на інгібітор ІВ визначався в межах 1,5-2,6, що відповідає нормальним величинам. У пацієнта з 0 (І) групою крові при введенні двох різних препаратів, причому одного з них в різному дозуванні, рівень FVIII знаходився на нижній межі розрахованого значення (ІВ=1,5 та ІВ=1,6), але перевищував 66% від очікуваного.

Серед пацієнтів з підозрою щодо наявності інгібітору нами виявлено, що ТВ у двох дітей через 0,5 год. після введення препарату становив відповідно 0,1% та 0,3% від розрахованого, тому індекс відновлення FVIII був 0,004 та 0,009, тобто виявлено ознаки резистентності. При подальшому дослідженні у цих дітей виявлено інгібітор FVIII у титрі 150 та 132 БО/мл відповідно. У пацієнта № 3 значення ТВ знаходилося в очікуваних межах (76,0±18,0%), ІВ=2,4, тобто в цього пацієнта не виявлено ознак резистентності до введеного FVIII і наявності інгібітору, що підтверджено якісним та кількісним визначенням інгібіторних антитіл. Таким чином, ми встановили, що тест відновлення з розрахунком індексу відновлення високоінформативний для виявлення резистентності до замісної терапії, може бути її лабораторною ознакою і підтвердженням клінічних симптомів резистентності.

На основі проведених досліджень виявлено, що міжіндивідуальні відмінності відновлення рівня FVIII(ІХ) у хворих на гемофілію А та В більш значні, ніж внутрішньоіндивідуальні, залежні від типу препарату. Тому перед призначенням того чи іншого препарату необхідно виконати тест відновлення FVIII(ІХ) у кожного пацієнта з метою індивідуального підбору відповідного препарату та лікувальної дози. Особливо це актуально при призначенні профілактичного введення препаратів та забезпеченні гемостазу при хірургічних втручаннях, що підтверджено рекомендаціями UKHCDO.

В 7 розділі представлено результати лікування хворих на гемофілію А та В з інгібітором. Наявність інгібіторів ускладнює лікування гемофілії і спричиняє підвищену захворюваність та смертність хворих. Лікування кровотеч, в загальному, менше ефективне у пацієнтів з інгібітором, ніж у пацієнтів без інгібіторів [Collins PW. et al., 2013], тому що генерація тромбіну не повністю відновлюється при використанні «обхідних» агентів [Berntorp E., et al., 2009] і, отже, більша захворюваність спостерігається у хворих з інгібіторами, ніж у пацієнтів без інгібіторів.

На відміну від пацієнтів із слабкою імунною відповіддю і низьким титром інгібітору (<5 БО/мл), у яких при підвищенні дози введеного FVIII досягається гемостаз, у пацієнтів з сильною відповіддю і високим титром інгібітору (>5 БО/мл) введення цих препаратів неефективне. З метою зупинки кровотечі у таких хворих застосовують препарати з «шунтовим» або «обхідним» механізмом дії, які спричиняють формування тромбіну незалежно від FVIII [Young G. et al., 2006].

На сьогоднішній день лише два терапевтичні продукти довели свою ефективність у зупинці кровотеч у хворих на гемофілію з інгібітором: препарат активованого протромбінового комплексу (аPСС) та рекомбінантний активований фактор VII (rVIIa) [Hay C. et al., 2006]. Але, на жаль, жоден з них нездатний повністю нормалізувати гемостаз у цих хворих до рівня осіб без гемофілії. Крім того, кожен з шунтових препаратів демонструє неоднаковий лікувальний ефект у окремих пацієнтів [Young G. et al., 2006].

У хворих на гемофілію без інгібіторних антитіл рівень FVIII(IX), отриманий після введення концентрату дефіцитного фактора, достатньо чітко корелює з очікуваною клінічною відповіддю. У пацієнтів з інгібітором однією з причин недостатнього вивчення механізмів забезпечення гемостатичної відповіді на аРСС та rFVIIa іn vivo, є відсутність надійних лабораторних методів контролю за ефективністю «шунтових» препаратів, за їх впливом на гемостаз in vivo та in vitro

Для визначення гемостатичної дії препаратів «шунтової» дії, які активують обхідні шляхи зсідання крові, у хворих на гемофілію без інгібітору та з інгібітором запропоновано використовувати тест корекції здовженого АЧТЧ ex vivo/in vitro з використанням плазми хворого і досліджуваного препарату в терапевтичній дозі [Livnat T.et al., 2008; Klintman J. et al., 2010; Y. Nakatomi T. et al., 2010]. У нашому дослідженні виявлено, що у хворих на гемофілію з інгібітором індекс скорочення АЧТЧ ex vivo/in vitro при доданні 2,5 мкг/мл rFVIIa складає (медіана) 29,5 [26,0-32,5]%, при доданні 0,25 од/мл аPCC - 15,3 [8,5-23,2]%, а під дією PCC - -9,9 [-16,4-(-4,1)]%, тобто подовжується. Таким чином, у тесті АЧТЧ ex vivo/in vitro найвищий терапевтичний потенціал серед препаратів «шунтової» дії має рекомбінантний активований фактор VII і дещо менший - активований протромбіновий комплекс, однак обидва препарати у хворих на гемофілію з інгібітором ex vivo/in vitro не нормалізують повністю зсідання крові. Неактивований протромбіновий комплекс (PCC) не має суттєвого впливу на корекцію продовженого АЧТЧ у цих хворих. Відповідь хворого на гемофілію з інгібітором на препарат «шунтової» дії, у першу чергу, зумовлена тим самим механізмом, за яким протромбіновий комплекс (аРСС, РСС) та rFVIIa спричиняють утворення тромбіну як кінцевого продукту зсідання.

В тестах АЧТЧ, проведених ex vivo/in vitro в нашому дослідженні, на результати могли впливати лише біологічні чинники, які містяться в плазмі. Ми не враховували такі фактори як локалізація, тривалість та тяжкість кровотечі, наявність суглоба-“мішені” та ін.

Ми спробували виявити кореляційний зв'язок між лабораторними показниками та клінічною ефективністю rFVIIa та аРСС у кожного обстеженого пацієнта. Встановлено високий ступінь кореляції між індексом скорочення АЧТЧ ex vivo/in vitro та клінічною відповіддю (зупинкою кровотечі) після введення препарату «шунтової» дії, який становить для rFVIIa r=+0,971 і для аPCC r=+0,950, що свідчить про інформативність тесту АЧТЧ ex vivo/in vitro для моніторингу гемостатичного ефекту «шунтових» препаратів у хворих на гемофілію з інгібітором. Цей тест доступний для прогнозування клінічної відповіді пацієнта на введення одного або обох препаратів з «шунтовим» механізмом дії з метою поліпшення терапевтичної та економічної ефективності лікування.

Як повідомляють зарубіжні автори, у пацієнтів з інгібітором спостерігається вищий рівень захворюваності на артропатії порівняно з хворими без інгібіторів за результатами їхньої клінічної оцінки, підтвердженої за шкалами Гілберта і Петтерсона [Morfini M., et al., 2007].

Ми оцінювали клінічну ефективність лікування гемартрозів препаратами «шунтової» дії rFVIIa і аРСС у хворих з інгібітором, яка була проведена на підставі зміни інтенсивності болю, відновлення об'єму рухів в уражених суглобах, рейтингу гемостатичного ефекту, кількості інфузій для лікування 1 епізоду кровотечі. Обидва препарати показали високу ефективність у більшості випадків з незначною перевагою препарату rFVIIa перед аРСС. Зокрема, при застосуванні rFVIIa спостерігається більш швидкий (у перші (6±0,5) год. після його введення) гемостатичний ефект (p<0,05), хоча через (24±1) год. ефект препаратів майже вирівнювався (56,9% проти 47,0% при застосуванні аРСС).

Ми спостерігали протягом 1 року за динамікою інгібітору у двох групах пацієнтів, які отримували монотерапію шунтовими препаратами. Титр інгібітору у хворих на гемофілію А і В протягом року монотерапії препаратом aPCC виявляє виражену тенденцію до підвищення, хоча у кожного пацієнта реакція на введення препарату індивідуальна і не залежить від початкового титру інгібітору, типу імунної реакції, дози препарату аРСС та виду лікування (профілактичне, «за вимогою») (рис. 6, рис.7).

При застосуванні препарату rFVIIa протягом року активність інгібіторних антитіл у хворих на гемофілію А до кінця спостереження зменшується, у 50% з них змінився тип реакції із сильної на слабку, що пояснюється обхідним механізмом дії препарату і відсутністю в ньому залишкової кількості білка фактора FVIIІ, на відміну від аРСС. Проте у жодного пацієнта після 12 міс. монотерапії aPCC або rFVIIa інгібітор не зник (рис. 8).

Рис. 6. Динаміка змін титру інгібітору протягом 12 міс. у хворих на гемофілію А №№ 1, 2, 9 при лікуванні препаратом аРСС

Рис. 7. Динаміка змін титру інгібітору протягом 12 міс. у хворих на гемофілію А №№ 3-8 при лікуванні препаратом аРСС

Рис. 8. Динаміка змін титру інгібітору протягом 12 міс. У хворих на гемофілію А і В №№ 1-11 при лікуванні препаратом rFVIIa

Для лікування геморагічних проявів у хворих на гемофілію з транзиторними, у низькому титрі (<5 БО/мл) та слабкою реакцією інгібіторами використовують більш широкий спектр препаратів, зокрема, у них ефективне застосування підвищених доз концентратів факторів зсідання крові VIII(IX), однак зупинка кровотечі й у цьому випадку доволі складна задача. Поки що немає достовірних методів розрахунку дози препаратів для нейтралізації інгібітору. Всі спроби створити такі формули до сих пір не дали результату. Це пов'язано з індивідуальною відповіддю на введений препарат, яку дуже складно передбачити, тому що до кінця не з'ясовано фактори, від яких вона залежить. Тому у цих хворих дози треба підбирати емпірично з подальшим лабораторним моніторингом, а ефективність визначати за клінічними ознаками. В таких випадках важливий ступінь ризику кровотечі, яку визначають за локалізацією та інтенсивністю. Нами опрацьовано тактику лікування кровотеч і забезпечення гемостазу під час операційних втручань у хворих на гемофілію з низьким титром інгібітору та слабкою реакцією. Виділено групи високого, проміжного і низького ризику залежно від групи ризику геморагічного прояву за локалізацією та інтенсивністю і/або об'єму хірургічного втручання. Гемостатичну терапію у цих хворих розпочинають з введення нейтралізуючих доз препаратів факторів VIII(IX). Дозу FVIII для першого введення розраховують за формулою (20-40 МО/кг + 20 МО/1 БО/мл інгібітору). Подальшу дозу і частоту введення препарату встановлюють емпірично, залежно від інтенсивності, локалізації кровотечі, титру інгібітору та клінічної відповіді на лікування. У випадку зростання титру інгібітору доцільно використовувати методи його викорінення (кортикостероїдні препарати, плазмаферез) та перейти на препарати «шунтової» дії (табл. 1)

Високий ступінь ризику становлять кровотечі в ділянці голови та шиї, шлунково-кишкова кровотеча, великі хірургічні втручання, особливо невідкладні. Необхідно негайно, до початку всіх діагностичних і лікувальних процедур, особливо інвазивних, ввести великі дози антигемофільних препаратів з досягненням рівня FVIII(IX) до 100% і надалі вести спостереження за хворим. При появі/зростанні титру інгібітору з метою швидкого досягнення гемостазу слід застосувати препарати «шунтового» механізму дії (rFVIIa, аРСС).

До проміжного ступеня ризику відносяться великі міжм'язові крововиливи з компресією нервів та судин, крововиливи у заочеревинний простір, макрогематурія, малі хірургічні втручання, зокрема, планові. Вони не становлять загрози для життя, проте потребують негайного і тривалого введення антигемофільних препаратів у великих дозах з досягненням рівня FVIII(IX) >50%. За наявності інгібітору у титрі <5 БО та із слабкою реакцією основним методом лікування є введення нейтралізуючих доз препаратів фактора VIII(IX) та кортикостероїди (преднізолон в дозі 1-2 мг/кг). Рекомендовано провести один або декілька сеансів плазмаферезу, якщо це дозволяє загальний стан хворого.

Низький ступінь ризику включає гемартрози, поверхневі рани і порізи, носові кровотечі. У хворих на гемофілію з інгібітором у початковому низькому титрі при розвитку спонтанного гемартрозу доцільне одноразове введення препаратів FVIII(IX) у нейтралізуючій дозі, проведення іммобілізації суглоба з накладенням холоду. Поверхневі рани, носові кровотечі не завжди потребують введення препаратів концентратів факторів VIII(IX), часто достатньо місцевого лікування (гемостатичні шви, стискаюча пов'язка, тампонування носових ходів) з місцевим та загальним застосуванням антифібринолітичних препаратів. У зв'язку з тим, що у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором, під час хірургічних операцій ризик кровотечі суттєво вищий, ніж у хворих без інгібітору, підходи до хірургічної корекції гемофільної артропатії вимагають застосування методів, які мінімізують цей ризик. Лікування хронічного синовіту, який виникає внаслідок частих рецидивних крововиливів у суглоби в хворих на гемофілію і призводить до деформуючих змін в них, одна з найскладніших проблем терапії хворих на тяжку гемофілію. Якщо консервативне лікування препаратами концентрованих факторів VIII(IX) стає неефективним, для попередження суглобових уражень пацієнти можуть підлягати процедурі, яка формує фіброз у синовіальніи? оболонці (синовіортез). Основним показанням для синовіортезу є хронічний гіпертрофічний синовіт з рецидивними гемартрозами. Антибіотик рифампіцин можна застосовувати одночасно для декількох суглобів, крім того, він дешевий та доступний [Raffini L., 2007].

Таблиця 1

Тактика лікування кровотеч у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором у низькому титрі (<5 БО/мл) та із слабкою реакцією

В нашій клініці проліковано 6 хворих на гемофілію з інгібітором у низькому титрі, які страждали на хронічний гіпертрофічний синовіт з рецидивними гемартрозами, артропатією ІІ-ІІІ стадії колінних, гомілково-ступневих та ліктьових суглобів методом хімічної синовектомії або синовіортезу з ріфампіцином. Профілактику кровотеч проводили препаратом FVIII в дозі 45-50 МО/кг маси тіла тільки перед першою пункцією у 4 хворих, у 2 хворих синовіортез проводили без застосування гемостатичних препаратів. Після лікування, через 5-7 тижнів, титр інгібітору в цих пацієнтів суттєво не змінювався. У 5 (83%) випадках результат лікування оцінено як ефективний (відмінно/добре). У пацієнтів з відмінним/добрим результатом у 5 (100%) зник хронічний біль, у 4 (75%) збільшилася амплітуда рухів у суглобі, у 2 (50%) вдвічі зменшилася потреба у гемостатичних препаратах.

Як видно з нашого досвіду, ефективність синовіортезу з рифампіцином складає більше ніж 80%, що відповідає результатам провідних центрів з лікування хворих на гемофілію [Mulder K., 2004]. Ефективність синовіортезу залежить від своєчасності розпочатого лікування. Найбільший ефект ми спостерігали у хворих молодого віку (від 10 до 18 років) при І-ІІ стадії хронічного синовіту з помірною гіпертрофією синовіальноі? оболонки та збереженою суглобовою щілиною [Стасишин О.В., 2009]. Особливе місце займає синовіортез у лікуванні хронічного синовіту у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором. За висновками більшості клінічних досліджень, найбільш ефективний синовіортез в ІІ стадії артропатії (постійний синовіт з гіпертрофією синовіальноі? оболонки і обмеженням рухомості суглоба), що підтверджено також результатами нашого дослідження [Стасишин О.В., 2009].

Ще одною тяжкою хворобою, пов'язаною з появою інгібіторів до факторів зсідання крові VIII(IХ) в осіб, які раніше не мали будь-яких проявів геморагічного синдрому, є набута імунна коагулопатія або набута гемофілія (НГ). Ми спостерігали 5 випадків захворювання на набуту гемофілію (з них 4 - на гемофілію А і 1 - на гемофілію В); у 3 (60%) хворих набутий інгібітор виник на фоні основної хвороби: у 2 осіб діагностовано хронічну вірусну інфекцію, в 1 - онкологічний процес. У 2 (40%) хворих зв'язку з будь-якою іншою хворобою не виявлено. Така невелика кількість описаних випадків за тривалий період часу вказує на відсутність настороженості щодо цієї хвороби та її недостатню діагностику. За результатами проведеної лабораторної діагностики при неоднозначності показників гемограми та коагулограми привертає увагу, що у всіх хворих був продовжений АЧТЧ, який корелює з дефіцитом фактора VIII/IХ, і є патогномонічною ознакою НГ. У деяких хворих спостерігається продовжений ПЧ, тромбоцитопенія, порушення функції тромбоцитів, збільшення кількості РФМК, анемія, лейкоцитоз, які, в цілому, корелюють з тяжкістю стану хворого. При аналізі кінетичної реакції нейтралізації інгібітору нормальною плазмою виявлено складну кінетику реакції, яка притаманна аутоімунним антитілам (інгібіторам ІІ типу).

Кровотечі у хворих, як правило, мають раптовий початок, в більшості випадків вони спонтанні, хоча біля 25% випадків виникають після травми або інвазивних процедур. Кровотечі частіше тяжкі (понад 67% випадків), але можуть бути легкими, і близько 25% пацієнтів не потребують кровоспинного лікування. Клінічно кровотеча не корелює з рівнем FVIII(ІХ) або з титром інгібітору і відрізняється від спадкової гемофілії тим, що кровотечі локалізуються в шкірі і підшкірній клітковині, слизових оболонках, м'язах, м'яких тканинах, в той час, як гемартрози нехарактерні для НГ. Рівень смертності внаслідок кровотеч або з інших причин, пов'язаних з HГ, високий і становить від 7,9% до 22,0% [Collins W., 2007]. З 5 пацієнтів, які знаходилися під нашим спостереженням, помер 1 (20%) пацієнт від ускладнень, пов'язаних з набутим інгібітором.

Гемостатичні препарати, які рекомендують використовувати для контролю кровотечі при HГ, - це рекомбінантний активований FVII (rFVIIa) або активований концентрат протромбінового комплексу (аPCC), концентрати FVIII (ІХ) або індукція вивільнення FVIII з використанням 1-дезаміно-8-D-аргінін-вазопресину (десмопресину). У хворих, які знаходилися під нашим спостереженням, найбільш ефективним для зниження титру інгібітору була імуносупресивна терапія та плазмаферез, який, однак, не завжди можна проводити в умовах кровотечі та анемії. Але ці способи переважно дають тимчасовий ефект, радикальне видалення інгібітору залежить від характеру і тяжкості основної хвороби. Слід підкреслити, що важливе значення для успішної терапії має лікування основної хвороби, яка зумовила появу інгібітору.

Щодо гемостатичної терапії, то, на жаль, не завжди можна керувалися стандартними схемами лікування, тому що кожен випадок НГ унікальний і потребує індивідуального підходу. Ми застосовували замісну терапію концентратами факторів зсідання крові VIII(IX), препаратами з шунтовим механізмом дії - рекомбінантним активованим фактором VII, антиінгібіторним комплексом (аРСС), свіжозамороженою плазмою та кріопреципітатом, використовували антифібринолітики, неспецифічну гемостатичну терапію. Таким чином, на основі проаналізованих клінічних випадків можна зробити висновок, що набута коагулопатія це поліетіологічна аутоімунна хвороба, яка ще недостатньо вивчена і методи лікування якої недосконалі та недостатньо ефективні, а методи профілактики її не розроблені. На основі наших спостережень за хворими з вродженою гемофілією, ускладненою інгібітором, та хворими з набутим інгібітором, базуючись на дослідженнях інших авторів можна зробити висновок, що підходи до лікування кровотеч у цих обох групах хворих суттєво не відрізняються та залежать від інтенсивності, локалізації кровотечі, титру інгібітору та сили імунної відповіді на введення препаратів FVIII(IX). Схематично алгоритм лікування тяжких кровотеч у хворих на вроджену гемофілію з інгібітором і набуту гемофілію представлено на рис 9.

У розділі 9 проведено аналіз та узагальнення результатів молекулярно-генетичних досліджень факторів формування імунної відповіді, які виявили генетичні фактори схильності до утворення інгібітору зі сторони імунної системи хворого, з'ясування потенційних факторів ризику появи інгібітору у хворих на гемофілію, аналіз коагулологічних, імунологічних та клінічних особливостей інгібітору дозволили визначити закономірності його розвитку, розробити підходи до оптимізації лікування з урахуванням індивідуальних особливостей та характеристики інгібітору. Обґрунтовано стратегію та тактику лікування кровотеч і забезпечення гемостазу під час операційних втручань у хворих на гемофілію з інгібітором, що в комплексі з визначеними предикторами будуть сприяти поліпшенню ефективності лікування та якості життя хворих на гемофілію.

Рис. 9. Алгоритм лікування тяжких кровотеч при вродженій гемофілії з інгібітором та набутій гемофілії

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне обгрунтування та нове рішення наукової проблеми сучасної гематології, а саме, удосконалення діагностики, лікування та попередження виникнення імунних інгібіторів факторів зсідання крові VIII(IX) у хворих на гемофілію шляхом визначення молекулярно - генетичних маркерів та факторів ризику появи інгібітору, зумовлених клінічним перебігом хвороби та лікуванням, удосконалення діагностичних методів та індивідуалізації програм лікування і профілактики у цих хворих.

1. Встановлено роль генетичних факторів у схильності хворих на гемофілію до виникнення інгібітору. Молекулярно-генетичні дослідження дозволили виявити однонуклеотидні поліморфізми (SNP) генів факторів регуляції імунної відповіді IL-10, TNFб, CTLA-4, які супроводжують схильність до утворення інгібітору. При постійному інгібіторі встановлено вищу частоту алеля G і генотипу GG SNP -308 G - A гена TNFб. У хворих з постійним інгібітором рідше виявляється комбінований генотип АG -1082 IL-10/AG -308 TNFб та частіше генотип GG -1082 IL-10/GG -308 TNFб. У пацієнтів з транзиторним інгібітором з більшою частотою спостерігається генотип АA -1082 IL-10/GG -308 TNFб. При гемофілії, ускладненій появою інгібітору, вища частота А-алеля та АА-генотипу SNP +49 A>G екзону 1 гена CTLA-4 порівняно з хворими без інгібітору. За наявності постійного інгібітору достовірно рідше трапляється поєднаний генотип CC промотера -318 С>Т / AG екзону 1 49 A>G гена CTLA-4 порівняно з хворими з транзиторним інгібітором.

2. З'ясовано наявність асоціативного зв'язку між виникненням постійного або транзиторного інгібітору і алельними варіантами (гаплотипами) генів локусів HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 у хворих на гемофілію А. Встановлено, що алелі DRB1*1501-1502, DRB1*0701-0702 та DQВ1*0602 слід розглядати як алелі-агресори, які підвищують ризик появи інгібітору, а алель DQВ1*0302, навпаки, як алель-протектор, який знижує цей ризик. Носійство алельної групи DRB1*1501-1502 та DQВ1*0602 підвищує ризик розвитку інгібітору у хворих на гемофілію вдесятеро, а носійство DQВ1*0302 у п'ять разів знижує цей ризик. У 70% хворих з постійним інгібітором виявлено 1 або 2 алелі-агресори, у пацієнтів з транзиторним інгібітором тільки у 21% випадків наявний 1 алель-агресор. У 54% хворих без інгібітору виявлено алель-протектор як ізольовано (31%), так і у поєднанні з алелями-агресорами.

3. У хворих на гемофілію А і В без інгібітору, попередньо лікованих плазмовими препаратами різного ступеня очищення, при переході на профілактичне лікування або лікування «на вимогу» модифікованими рекомбінантними препаратами нейтралізуючі інгібітори до FVIII(IX) не виникають. У поодиноких хворих з'являються неінгібіторні (зв'язуючі) антитіла до FVIII, як неспецифічні, так і препарат-специфічні, які не впливають на ефективність лікування та клінічний перебіг хвороби.

4. Визначено статистично значущі предиктори появи інгібітору у хворих на гемофілію: кількість експозиційних днів (ЕД) введення препарату на 1 епізод кровотечі; зміна препарату під час лікування; ступінь очищення препарату зсідання крові; вік хворого; наявність гнійних ускладнень; об'єм і характер хірургічних втручань; інгібіторний анамнез. За результатами логіт-регресії на основі встановлених предикторів і їхньої прогностичної значущості вперше створено зручну, клінічно адаптовану номограму, яка дозволяє з точністю 94,1% прогнозувати виникнення інгібітору у хворих на гемофілію.

5. Нейтралізуючі інгібітори до FVIII(ІХ) виявлено у 16,7% хворих на гемофілію А та значно рідше (у 3,9% хворих) при гемофілії В. На основі дослідження кінетики корекції подовженого АЧТЧ нормальною плазмою встановлено два типи патологічних інгібіторів у хворих на гемофілію: І тип - нейтралізуючий інгібітор FVIII(IX) з пролонгованою (прогресивною) дією і простою кінетикою нейтралізації нормальною плазмою; ІІ тип - набутий інгібітор негайної дії із складною кінетикою нейтралізації, аналогічний до вовчакового антикоагулянту при антифосфоліпідному синдромі. Наявність інгібітору - чинник підвищеного ризику смерті хворих на гемофілію.

6. ВА виявлено у 29,6% хворих на гемофілію з наявністю патологічних інгібіторів зсідання і/або клінічними ознаками резистентності до замісної терапії препаратами факторів зсідання, у тому числі у 38,3% пацієнтів з наявним нейтралізуючим інгібітором і у 17,6% хворих без нейтралізуючого інгібітору. ВА спостерігають достовірно частіше у хворих з постійним інгібітором, ніж у хворих з транзиторним інгібітором. ВА ускладнює перебіг гемофілії і призводить до підвищеної смертності хворих.

7. У хворих на гемофілію з інгібітором найвищий терапевтичний потенціал у тесті АЧТЧ ex vivo/in vitro серед препаратів «шунтової» дії виявляє рекомбінантний активований фактор VII (rFVIIa) і дещо менший - активований протромбіновий комплекс (аPCC), однак обидва препарати не нормалізують повністю зсідання крові. Неактивований протромбіновий комплекс (PCC) не має суттєвого впливу на корекцію здовженого АЧТЧ у цих хворих. Встановлено високий ступінь кореляції між індексом скорочення АЧТЧ ex vivo/in vitro та клінічною відповіддю (зупинкою кровотечі) після введення препарату «шунтової» дії, який становить для rFVIIa r=+0,971 і для аPCC r=+0,950.

8. Клінічна оцінка гемостатичної ефективності препаратів «шунтової» дії rFVIIa і аРСС у хворих на гемофілію з інгібітором, проведена на підставі зміни інтенсивності болю, відновлення об'єму рухів в уражених суглобах, рейтингу гемостатичного ефекту, кількості інфузій для лікування 1 епізоду кровотечі, показала їхню високу ефективність у більшості випадків з незначною перевагою препарату rFVIIa перед аРСС. Зокрема, при застосуванні rFVIIa спостерігається більш швидкий (у перші (6±0,5) год. після його введення) гемостатичний ефект.

9. Титр інгібітору у хворих на гемофілію А і В протягом 1 року монотерапії препаратом aPCC виявляє виражену тенденцію до підвищення, хоча у кожного пацієнта реакція на введення препарату індивідуальна і не залежить від початкового титру інгібітору, типу імунної реакції, дози аРСС та виду лікування (профілактичне, «за вимогою»). При застосуванні препарату rFVIIa протягом 1 року активність інгібіторних антитіл у хворих на гемофілію А до кінця спостереження зменшується, у 50% з них тип реакції змінюється із сильної на слабку, що пояснюється обхідним механізмом дії препарату і відсутністю в ньому залишкової кількості білка FVIIІ, на відміну від аРСС. Проте у жодного пацієнта після 12 міс. монотерапії aPCC або rFVIIa інгібітор не зникає. Застосування препаратів «шунтової» дії не може повністю викорінити інгібітор, а після відновлення субституційної терапії препаратами FVIII його титр знову може зростати.

10. Опрацьовано вперше тактику лікування кровотеч і забезпечення гемостазу під час операційних втручань у хворих на гемофілію з низьким титром інгібітору та слабкою реакцією. Виділено групи високого, проміжного і низького ризику залежно від групи ризику геморагічного прояву за локалізацією та інтенсивністю і/або об'єму хірургічного втручання. Гемостатичну терапію у цих хворих розпочинають з введення нейтралізуючих доз препаратів FVIII(IX). Дозу FVIII для першого введення розраховують за формулою (20-40 МО/кг + 20 МО/кг на 1 БО/мл інгібітору). Подальшу дозу і частоту введення препарату встановлюють емпірично, залежно від інтенсивності, локалізації кровотечі, титру інгібітору та клінічної відповіді на лікування. У випадку зростання титру інгібітору доцільно використовувати методи його викорінення (кортикостероїдні препарати, плазмаферез) та перейти на препарати «шунтової» дії.

11. Імунна коагулопатія (набута гемофілія) характеризується появою аутоімунних антитіл до факторів зсідання крові VIII(IX) - інгібіторів негайної дії ІІ типу, причому відсутня залежність між титром інгібітору, ступенем зниження фактора зсідання і тяжкістю геморагічних проявів. Терапія потребує індивідуального, нестандартного підходу і включає два основних напрямки: зупинка кровотечі та ліквідація інгібітору.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для прогнозування появи інгібітору у хворого на гемофілію рекомендовано враховувати такі предиктори: кількість ЕД введення препарату на 1 епізод кровотечі, зміна препарату під час лікування, ступінь очищення препарату зсідання крові, вік хворого, наявність гнійних ускладнень, об'єм і характер хірургічних втручань, інгібіторний анамнез.

2. Для розрахунку ризику появи інгібітору слід використовувати номограму, яка враховує прогностичну значущість встановлених предикторів і дозволяє з точністю 94,1% прогнозувати його виникнення у хворих на гемофілію; її діагностична чутливість становить 94,6%, специфічність - 93,4%.

3. Для ранньої діагностики інгібітору доцільно проводити тест відновлення з розрахунком індексу відновлення (ІВ) FVIII(IX). Зниження відновлення рівня фактора в плазмі пацієнта після введення препаратів FVIII(IX) <0,66 - ознака резистентності до замісної терапії внаслідок появи інгібітору. ІB треба використовувати для розрахунку індивідуальної дози препаратів при замісній терапії.

4. Для визначення гемостатичної дії препаратів «шунтової» дії, які активують обхідні шляхи зсідання крові, у хворих на гемофілію без інгібітору та з інгібітором рекомендовано використовувати тест корекції продовженого АЧТЧ ex vivo/in vitro з використанням плазми хворого і досліджуваного препарату в терапевтичній дозі.

5. Для прогнозування та моніторингу гемостатичного ефекту «шунтових» препаратів у хворих на гемофілію з інгібітором рекомендовано використовувати інформативний та доступний метод на основі тесту АЧТЧ ex vivo/in vitro.

6. Для вибору тактики та стратегії лікування кровотеч у хворих з інгібітором у низькому титрі та слабкою реакцією необхідно враховувати групи високого, проміжного і низького ризику залежно від локалізації та інтенсивності геморагічного прояву і/або об'єму хірургічного втручання.

7. Для зниження титру інгібітору та для підготовки пацієнта до проведення терапії індукції імунної толерантності (ІІТ) лікування кровотеч доцільно проводити препаратом rFVIIa.

8. Для лікування набутої гемофілії рекомендовано застосовувати концентрати FVIII(IX), препарати з «шунтовим» механізмом дії (rFVIIa, aPCC), свіжозаморожену плазму, кріопреципітат, антифібринолітики, неспецифічну гемостатичну терапію. Для зниження рівня інгібітору рекомендовано імуносупресивну терапію (кортикостероїди, цитостатики) та плазмаферез. Важливе значення має лікування основної хвороби, яка зумовила появу інгібітору.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стасишин A.В. Гемофилия, осложненная ингибитором / Молекулярная патология белка // Под ред. член-кор. АМН Украины, проф. Д. И. Заболотного. - К. Логос. - 2008, 236 с. - С. 55-73.

2. Stasyshyn A.V. Hemophilia, aggravated by the inhibitor / in: Molecular pathology of proteins. // Edit. D.I. Zabolotny. - New York: Nova Science Publishers, Inc. - 2009, 191 p. - P. 41-55.

3. Характеристика імунної дисфункції у хворих на гемофілію інгібіторної форми / О.В. Стасишин, В.П. Руденко, Г.Б. Лебедь, Г.О. Потемкіна, В.Є.Логінський // Український медичний часопис. - 2004. - №5 (43). - С. 128-131. (Здобувачем опрацьовано відомості вітчизняної та зарубіжної літератури, проаналізовано та представлено власні дані, сформульовано висновки).

4. Характеристика імунної дисфункції у хворих на гемофілію залежно від тривалості замісної терапії антигемофільними препаратами / О.В. Стасишин, В.Л. Новак, Г.Б. Лебедь, О.М., В.В. Красівська, О.М. Тушницький, В.Є. Логінський // Гематологія і переливання крові: міжвід. зб. - Харків: НТМТ. - 2004. - Вип. 32, ч. 1. - С. 294-299. (Здобувачем опрацьовано відомості вітчизняної та зарубіжної літератури, проаналізовано та представлено власні дані, сформульовано висновки).

5. Красівська В.В. Тест корекції активованого парціального тромбопластинового часу нормальною плазмою у хворих на гемофілію А з різними типами патологічних інгібіторів / В.В. Красівська, В.Є. Логінський, О.В Стасишин, В.Л. Новак // Кровообіг і гемостаз. - 2006. - № 3. - С. 5-12. (Здобувачем опрацьовано дані літератури за темою публікації, здійснено відбір хворих, обґрунтовано актуальність теми, сформульовано висновки).

6. Стасишин О.В. Частота і клініко-лабораторна характеристика гемофілії, ускладненої розвитком інгібітору / О.В. Стасишин, В.В. Красівська, В.Є. Логінський, В.Л. Новак // Гематологія і переливання крові: міжвід. зб. Вип. 33. - Київ: Нора-Друк. - 2006. - С. 214-218. (Здобувачем опрацьовано дані літератури за темою публікації, опрацьовано результати обстеження хворих, обґрунтовано актуальність теми, сформульовано висновки)

7. Стасишин О.В. Поширеність інфікування хворих на гемофілію гемотрансмісивними вірусами / О.В. Стасишин, В.Є. Логінський, В.Л. Новак // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2008. - №1 (8). - С. 17-20. (Здобувачем проведено відбір хворих, проаналізовано та представлено дані обстежень, проведено статистичну обробку даних, сформульовано висновки).

8. Стасишин О.В. Ревматоїдний фактор та артропатії у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором / О.В. Стасишин // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2008. - № 6 (8). - С. 21-23.

9. Стасишин О.В. Успішне ендопротезування обох колінних суглобів у хворого на гемофілію В / О.В. Стасишин, В.В. Красівська, Я.М. Васильчишин, В.Л. Новак // Гематологія і переливання крові: міжвід. зб. - К.: Атіка-Н. - 2008. - Вип. 34, т. 1. - С. 239-353. (Здобувачем проведено обстеження хворого та розроблено схему замісної трансфузійної терапії під час операції та в післяопераційному періоді, опрацьовано відомості вітчизняної та зарубіжної літератури, описано клінічний випадок, сформульовано висновки).

10. Стасишин О.В. Хімічна синовектомія з рифампіцином у хворих на гемофілію // Шпитальна хірургія. - 2009. - № 2. - С. 62-65.

11. Стасишин О.В. Досвід застосування препарату Фейба у хворих з інгібіторною формою гемофілії / О.В. Стасишин, В.В. Красівська, С.В. Примак, В.Л. Новак // Укр. мед. часопис. - 2009. - № 6 (74). - С. 84-87. (Здобувачем опрацьовано літературні джерела, проаналізовано та представлено власні дані, проведено статистичний аналіз, сформульовано висновки).