Експериментальне та квантово-хімічне обгрунтування створення комбінованого протизапального препарату

Размещено на http://www.allbest.ru/

АНОТАЦІЯ

Сирова Г.О. Експериментальне та квантово-хімічне обгрунтування створення комбінованого протизапального препарату . - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Національний фармацевтичний університет. - Харків, 2011.

Дисертація присвячена розробці основ для створення і обгрунтуванню складу нового вітчизняного комбінованого лікарського засобу з умовною назвою «Мігрепін», що містить діючі речовини (калієву сіль 2,4 - дихлорбензойної кислоти 12,5%, кофеїн - 5%, карбамазепін - 50%) та допоміжні компоненти (картопляний крохмаль, кальцію стеарат, лактоза, натрію кроскармелоза) - 32,5%, з урахуванням квантово-хімічних, квантово-фармакологічних та експериментальних підходів. Співвідношення діючих і допоміжних речовин знайдено емпіричним шляхом.

Дослідження включають квантово-фармакологічне та експериментальне обґрунтування раціональності поєднання компонентів у запропонованій композиції за їх фармакодинамічними і фармакокінетичними властивостями на різних моделях запалення, больового синдрому, лихоманки. Проведено скринінгові дослідження протизапальної, протибольової, жарознижувальної, антиоксидантної, антиагрегантної, протиалергічної, антимігренозної дії різних доз «Мігрепіну», а також порівняльний аналіз нової запропонованої комбінації з монопрепаратами - компонентами «Мігрепіну» та із сучасними референс-препаратами. Вибір методик вивчення специфічної дії «Мігрепіну» залежав від фармакологічних властивостей його компонентів. Вивчено гостру і хронічну токсичність нового комбінованого засобу.

Прогнозовано спектр фармакологічної активності калієвої солі 2,4 - дихлорбензойної кислоти методами комп?ютерного моделювання Prediction of Activity Spectra for substances. Здійснено квантово-хімічні та квантово-фармакологічні дослідження молекул 2,4-дихлорбензойної кислоти, кофеїну і карбамазепіну за допомогою Quantative Structure Activity Relationship. Встановлено, що дані сполуки є м'якими реагентами, які взаємодіють з речовинами лужного характеру або з альбуміном. Центрами протонування досліджених сполук є: для кофеїну - атоми оксигену та атом нітрогену N12; для карбамазепіну - атоми оксигену та нітрогену карбамоїльної групи, для 2,4-дихлорбензойної кислоти - атом оксигену карбоксильної групи. За допомогою квантово-хімічних розрахунків встановлено, що не відбувається взаємодії між карбамазепіном, 2,4-дихлорбензойною кислотою та кофеїном; в біологічних рідинах компоненти суміші транспортуються окремо: 2,4-дихлорбензойна кислота та кофеїн - в розчиненому стані, а карбамазепін - в комплексі з сироватковим альбуміном. Компоненти суміші не конкурують один з одним за зв?язування з кофеїном, отже, не знижують біодоступність один одного. Обґрунтовано сумісність діючих компонентів «Мігрепіну» за фармакодинамічними і фармакокінетичними властивостями, що послужило основою для створення нового вітчизняного комбінованого протизапального лікарського засобу. Встановлено значні протизапальні, анальгетичні, жарознижувальні, антиоксидантні, антиагрегантні, антиалергічні властивості «Мігрепіну». В результаті скринінгових досліджень встановлено оптимальну терапевтичну дозу «Мігрепіну»: 12,5 мг/кг - щурам та 17,65 мг/кг - мишам. Встановлено, що в механізмі антиексудативної дії «Мігрепіну» мають місто два компоненти: антициклооксигенозний (селективний інгібітор ЦОГ-2) та антиліпоксигеназний. Експериментально обґрунтовано, що діючі компоненти «Мігрепіну» забезпечують фармакологічний ефект препарату: антиексудативну і жарознижувальну дію - калієва сіль 2,4-дихлорбензойної кислоти; протибольову - кожен діючий компонент, потенціюючий анальгетичний ефект один одного. Допоміжні речовини фармакологічно індиферентні. Встановлено, що «Мігрепін» пригнічує функціональну активність нейронів тригеміно-цервікального комплексу, гальмує проведення больової інформації від мозкових оболонок до вищерозташованих структур ЦНС. Встановлено прямий дозозалежний антимігренозний ефект «Мігрепіну» у дозах 12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 37,5 мг/кг на моделі краніоваскулярного головного болю з максимумом при введенні дози 37,5 мг/кг. «Мігрепін» належить до малотоксичних речовин (IV клас токсичності за класифікацією К.К. Сидорова). ДЛ50 для мишей - 2,9 г/кг, для щурів - 6 г/кг. Коефіцієнт видової чутливості становить 2,07, що дає можливість екстраполяції одержаних даних на людину. При вивченні хронічної токсичності «Мігрепін» не впливає негативно на загальний стан щурів, функцію ЦНС, роботу серця, клітинний склад, формулу крові, функції нирок і печінки. Патоморфологічні дослідження, проведені в гострому і хронічному дослідах, підтверджують нешкідливість препарату. «Мігрепін» не зумовлює місцевоподразнювальної та алергізувальної дії.

Ключові слова: комбінований лікарський засіб, протизапальна, антиоксидантна, протибольова, жарознижувальна, антимігренозна, антиагрегантна, антиалергічна активність, гостра та хронічна токсичність.

АННОТАЦИЯ

Сыровая А.О. Экспериментальное и квантово-химическое обоснование создания комбинированного противовоспалительного препарата. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора фармацевтических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Национальный фармацевтический университет. - Харьков, 2011.

Диссертация посвящена обоснованию и разработке основ для создания состава нового комбинированного противовоспалительного средства с учетом квантово-химических, квантово-фармакологических и экспериментальных подходов. С учетом этих подходов разработан новый отечественный комбинированный противовоспалительный лекарственный препарат «Мигрепин», содержащий действующие вещества (калиевую соль 2,4 дихлорбензойной кислоты - 12,5%, кофеин - 5%, карбамазепин - 50%) и вспомогательные компоненты (картофельный крахмал, кальция стеарат, лактоза, натрия кроскармелоза) - 32,5%. Соотношение действующих и вспомогательных веществ найдено эмпирическим путем.

Исследования включают квантово-фармакологическое и экспериментальное обоснование рационального сочетания компонентов в предложенной композиции с учетом их фармакодинамических и фармакокинетических свойств на различных моделях воспаления, болевого синдрома, лихорадки. Проведены скрининговые исследования противовоспалительного, жаропонижающего, антиоксидантного, антимигренозного, противоаллергического, антиагрегантного действия различных доз «Мигрепина», сравнительный анализ новой предложенной комбинации с монопрепаратами - компонентами «Мигрепина», а также с современными референс - препаратами. Выбор методик изучения специфического действия «Мигрепина» зависел от фармакологических свойств его компонентов. Изучена острая и хроническая токсичность нового комбинированного средства.

Прогнозирован спектр фармакологической активности калиевой соли 2,4-дихлорбензойной кислоты методами компьютерного моделирования Prediction of Activity Spectra for substances. Проведены квантово-химические и квантово-фармакологические исследования молекул 2,4 - дихлорбензойной кислоты, кофеина и карбамазепина с помощью Quantitative Structure Activity Relationship. Установлено, що данные соединения являются мягкими реагентами, которые взаимодействуют с веществами щелочного характера или с альбумином. Центрами протонирования исследуемых соединений являются: для 2,4 - дихлорбензойной кислоты - атом кислорода карбоксильной группы, для кофеина - атомы кислорода и атом азота N12, для карбамазепина - атомы кислорода и азота карбамоильной группы. С помощью квантово-химических расчетов установлено, что не происходит взаимодействие между карбамазепином 2,4- дихлорбензойной кислотой и кофеином; в биологических жидкостях компоненты смеси транспортируются отдельно: 2,4-дихлорбензойная кислота и кофеин - в растворённом состоянии, а карбамазепин - в комплексе с сывороточным альбумином. Компоненты смеси не конкурируют друг с другом за связывание с кофеином, то есть, не влияют на биодоступность друг друга.

Обоснована совместимостью действующих компонентов «Мигрепина» с учетом их фармакодинамических и фармакокинетических особенностей, что и послужило основой для создания нового отечественного комбинированного противовоспалительного лекарственного препарата. Установлены значительные противовоспалительные, противоболевые, жаропонижающие, антиоксидантные, антиаллергические, антиагрегантные свойства «Мигрепина». В результате скрининговых исследований установлена оптимальная терапевтическая доза «Мигрепина»: 12,5 мг/кг - для крысы и 17,65 мг/кг - для мышей. Установлено, что в механизме антиексудативного действия «Мигрепина» имеют место два компонента: антилипоксигеназный и антициклооксигеназный (селективный ингибитор циклооксигеназы - 2). Действующие компоненты «Мигрепина» обеспечивают фармакологический эффект препарата: антиэксудативное и жаропонижающее действие - калиевая соль 2,4 - дихлорбензойной кислоты; противоболевое - каждый действующий компонент, потенцируя анальгетический эффект друг друга. Вспомогательные вещества - фармакологические индиферентны.

«Мигрепин» угнетает функциональную активность нейронов тригемино- цервикального комплекса, тормозит проведение болевой информации от мозговых оболочек до вышерасположенных структур ЦНС .Установлен прямой дозозависимый антимигренозный эффект «Мигрепина» в дозах 12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 37,5 мг/кг на модели кранио-васкулярной боли (максимум при введении дозы 37,5 мг/кг). «Мигрепин» относится к малотоксичным веществам (IV класс токсичности по классификации К.К. Сидорова) . Установлены ДЛ50 для мышей - 2,9 г/кг; для крыс - 6 г/кг. Коэффициент видовой чувствительности составляет 2,07, что дает возможность экстраполяции полученных данных на человека. При изучении хронической токсичности «Мигрепин» не влияет негативно на общее состояние крыс, функцию ЦНС, работу сердца, клеточный состав, формулу крови, функции почек и печени. Патоморфологические исследования, проведенные в остром и хроническом опытах, подтверждают безвредность препарата. «Мигрепин» не вызывает местнораздражающего и аллергизующего действия.

Ключевые слова: комбинированное лекарственное средство, противовоспалительная, антиоксидантная, противоболевая, жаропонижающая, антимигренозная, антиагрегантная, противоаллергическая активность, острая и хроническая токсичность.

SUMMARY

Syrovaya A.O. Experimental and quantum - chemical ground of combined anti-inflammatory drug creation. - The manuscript.

Thesis for a Doctor of Pharmaceutical Sciences degree by specialty 14.03.05 - pharmacology. - National Pharmaceutical University. - Kharkov, 2011.

The thesis is devoted to the development approaches to the creation of combined anti-inflammatory drugs based on quantum-pharmacological, quantum-chemical and experimental substantiation. Taking into account these approaches, a new domestic combined anti-inflammatory drug "Migrepine" containing the active ingredients (potassium 2,4-dihlorbenzoate - 12,5%, cоffeine - 5%, carbamazepine - 50%) and other ingredients (starch, calcium stearate, lactose, sodium croscarmellose) - 32,5% was created. Ratio of active ingredients and fillers was found empirically.

Studies include quantum-pharmacological and experimental substantiation of rational combination of components in the proposed composition with regard to their pharmacodynamic and pharmacokinetic properties on the various models of inflammation, pain, fever, convulsions. Screening studies of anti-inflammatory, analgesic, antipyretic, antioxidant, antimigraine, antiallergic, and antiplatelet action of various doses of "Migrepine", comparative analysis of the newly proposed combination with individual components of "Migrepine", as well as with modern reference-drugs were carried out. Choice of studying methods of specific action of "Migrepine" depended on the pharmacological properties of its components. The acute and chronic toxicities of new combined drug are studied.

The spectrum of pharmacological activity of potassium 2,4-dihlorbenzoate is predicted by means of computer modeling methods “Prediction of Activity Spectra for substances”. The quantum-chemical and quantum-pharmacological investigations of the molecules of 2,4-dihlorbenzoic acid, caffeine, and carbamazepine using “Quantitative Structure Activity Relationship” are carried out. It is established that these compounds are mild reagents which react with alkaline substances or with albumin. Sites of protonation of the compounds are as follows: for 2,4-dihlorbenzoic acid - oxygen atom of carboxyl group, for caffeine - atoms of oxygen and nitrogen atom N12, for carbamazepine - oxygen and nitrogen atoms of carbamoyl group. The compatibility of active ingredients of "Migrepine" is proved with account of their pharmacodynamic and pharmacokinetic characteristics. This fact served as the basis for creation of a new domestic combined anti-inflammatory drug. Significant anti-inflammatory, analgesic, antipyretic, antioxidant, anticonvulsant, anti-allergic, antiplatelet properties of "Migrepine" are discovered. As a result of screening studies the optimal therapeutic doses of "Migrepine" are established: 12.5 mg / kg - for rats and 17.65 mg / kg - for mice. It is established that the mechanism of anti-exudative action of "Migrepine" is based on two components: antilipoxygenase and anticyclooxygenase (selective inhibitor of cyclooxygenase-2). Active components of "Migrepine" provide a pharmacological effect of the drug: anti-exudative and antipyretic actions are due to the presence of potassium 2,4-dihlorbenzoate; analgesic effect is due to all active components which potentiate analgesic effect of each other. Other ingredients are pharmacologically inert.

"Migrepine" inhibits the functional activity of neurons of trigeminy-cervical complex, slows down the transmission of pain information from the meninges to the higher-lying structures of the CNS. Direct dose-dependent antimigraine effect of "Migrepine" is established in the doses 12.5 mg / kg, 25 mg / kg, 37.5 mg / kg on a model of craniovascular pain (maximum at 37.5 mg / kg administered dose). "Migrepine" refers to low-toxic substances (IV class of toxicity according to K.K. Sidorov's classification). DL50 is found for mice - 2,9 g / kg, for rats it is 6 g / kg. Coefficient of species sensitivity is 2.07, which allows extrapolation of the data on human. During the investigation of chronic toxicity "Migrepine" does not adversely affect the general health of rats, CNS function, heart function, cell composition, blood formula, kidneys and liver functions. Pathomorphological studies in acute and chronic experiments confirm the harmlessness of the drug. "Migrepine" does not cause local irritating and allergic action.

Keywords: combination drug, anti-inflammatory, antioxidant, analgesic, antipyretic, antimigraine, antiplatelet, antiallergic activity, acute and chronic toxicity.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фармакотерапія багатьох захворювань характеризується комплексним підходом до лікування. У сучасній медичній практиці все частіше застосовуються комбіновані лікарські засоби (Киричок Л.Т. та ін., 2001). Комбінована фармакотерапія стала стандартом лікування злоякісних пухлин, СНІДу, артеріальної гіпертензії (АГ), захворювань шлунка, суглобів тощо (Ларионов Л.П. и др., 2007; Мамчур В.И. и др., 2007). Комбінація в одному препараті кількох компонентів розширює його фармакологічний спектр, підвищує комплаєтність та ефективність при застосуванні (Киричок Л.Т. та ін., 2001). Крім того, комплексність дає змогу до складу лікарського засобу вводити інгредієнти в менших дозах за ті, які використовуються для монотерапії, що передбачає зменшення токсичності препарату. Можливість підсилення фармакологічних ефектів і зменшення побічних реакцій стимулювала збільшення в умовах лікування за принципом поліпрагмазії комбінованих препаратів.

Створення ефективних вітчизняних лікарських засобів на основі комбінацій відомих препаратів є актуальною проблемою сучасної фармакології та фармації. Застосування комбінованих препаратів сприяє тому, що призначення одного лікарського засобу забезпечує фармакотерапевтичний вплив на системи, які пов'язані спільною патологією (Богачик О., 1998). Створення комбінованих лікарських препаратів з вираженими протизапальними та анальгетичними властивостями, фармакологічні ефекти яких досягаються завдяки раціональній комбінації інгредієнтів, потребує розробки нових фармакологічних підходів. Перевага таких лікарських засобів порівняно з монопрепаратами полягає в тому, що вони ефективніше пригніічують процес запалення і його прояви, в тому числі біль, ніж кожний окремий компонент (Лоуренс Д.Р., Беннит П.Н., 1991), бо впливають одночасно на різні ланки патологічного процесу.

При різноманітних запальних процесах, больових синдромах вибір інгредієнтів нової комбінації ґрунтується на різних механізмах фармакологічної дії препаратів, які забезпечують лікувальний ефект (McGregor A. et al.,1993; Caghman J.N., 1996; Kolaczkowska E., 2002). Передумовою терапії больових синдромів є визначення причини, що викликала біль, зумовила участь різних відділів нервової системи у формуванні больової реакції. Від болю різної етіології, інтенсивності та тривалості потерпає майже 40% населення (Мамчур В.Й., 2000). Тривалий або сильний біль може формувати осередок патологічного збудження, який поглиблює функціонально-морфологічні зміни в органах і системах (Kolaczkowska E., 2002; Румянцева С.А., 2003). Мігрень є одним з найпоширеніших первинних видів головного болю (ГБ) і соціально значущих захворювань серед населення та діагностується з частотою 12% у дорослих (6% у чоловіків і 18% у жінок) і 4% у дітей (Стеценко Т.И, 2007). Біль - головна скарга пацієнта при різноманітних запальних захворюваннях, а запалення як типовий патологічний процес - основа понад 70% відомих хвороб людини (Трещинский А. И. и др., 1996)

На сьогодні існує значний арсенал протизапальних і знеболювальних засобів (Vane J.R. et al, 1998; Kolaczkowska E., 2002; Румянцева С.А., 2003). Але ризик побічної дії (гастро-, нефро-, гемато-, гепатотоксичність тощо) зменшує коло пацієнтів, які підлягають лікуванню (Caghman J.N., 1996; Kolaczkowska E., 2002; Викторов А.П., 2002). Найновіші препарати - селективні інгібітори циклооксигенази-2 (ЦОГ-2) теж мають побічні ефекти (Kolaczkowska E., 2002; Викторов А.П., 2002). Крім того, вони, хоча і є на фармацевтичному ринку України, але через високу ціну недоступні широкому колу пацієнтів (Герасимова О.О. та ін., 2004). Тому розробка нових вітчизняних ефективних і нешкідливих нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ), ненаркотичних анальгетиків (ННА), у тому числі комбінованих, - актуальна проблема сучасної фармакології та фармації.

При створенні нового комбінованого протизапального препарату ми виходили з того, що біль - головна скарга пацієнтів при запальних захворюваннях. Одним із принципів фармакотерапії болю є принцип «анальгетичної драбини» (Шухов В.С., 2007). На будь-якій її сходині є НПЗЗ. У зв'язку з цим до складу нової лікарської комбінації з умовною назвою «Мігрепін» ми вирішили ввести новий вітчизняний ефективний та безпечний лікарський засіб анальбен, що містить калієву сіль 2,4-дихлорбензойної кислоти (КСДХБК) і має протизапальні, анальгетичні, жарознижувальні та гепатопротекторні властивості (Е.Я. Левитин, В.И. Кабачный, Л.В. Яковлева, В.П. Черных, 1998). Другим компонентом, який вирішили ввести до складу композиції, був відомий ад?ювант НПЗЗ та ННА, компонент багатьох комбінованих лікарських препаратів - кофеїн (1,3,7 - триметилксантин). Третім компонентом майбутнього лікарського засобу було обрано вторинний анальгетик, антиконвульсант карбамазепін. На основі літературних даних проаналізовано фармакодинамічні та фармакокінетичні властивості діючих компонентів майбутнього лікарського препарату, зроблено висновки про їх фармакодинамічну та фармакокінетичну корисність і сумісність (Яковлева Л.В., 1999; Амелин А.В. и др., 2007; Карелов и др., 2007; Соколов А.Ю. и др., 2009; Palmer L. et al., 1973; Van Belle K et al., 1995; Chelardini C, 1997; Zhang W.I., Po A. C., 1997; Chelardini C, 1997; Seymour Diamond M.D. et al., 2000; Iakubowski M. еt al., 2005; Shapiro R.E., 2008).

Але введення до складу комбінацій декількох фармакологічно активних речовин може не тільки позитивно впливати на клінічну ефективність препарату, а і спричинити зростання його токсичності. Тому необхідно грунтовно і всебічно вивчати, як впливає нова комбінація лікарських речовин на показники гострої та хронічної токсичності (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до планових науково-дослідних тем кафедри фармакології та медичної рецептури Харківського національного медичного університету «Створення, дослідження та патогенетичне обґрунтування застосування нових комбінованих лікарських засобів і лікарських засобів політропної дії» (№ державної реєстрації 0109U001748), як частина наукового напрямку кафедри (автор був співвиконавцем теми), кафедри медичної та біоорганічної хімії Харківського національного медичного університету «Хіміко-фармацевтичне обґрунтування композицій, що містять кофеїн» (№ державної реєстрації 0110U001809), як частина наукового напрямку кафедри (автор є науковим керівником теми).

Мета та завдання дослідження. Теоретично і експериментально обґрунтувати склад нового вітчизняного ефективного комбінованого лікарського засобу з умовною назвою «Мігрепін», що містить калієву сіль 2,4-дихлорбензойної кислоти, кофеїн, карбамазепін та допоміжні речовини, і встановити його фармакологічні властивості при запаленні та больовому синдромі в експерименті.

Для досягнення мети в роботі вирішувалися такі завдання:

1. Теоретично обгрунтувати фармакодинамічну і фармакокінетичну сумісності компонентів «Мігрепіну»: КСДХБК, кофеїну і карбамазепіну.

2. Прогнозувати спектр фармакологічної активності КСДХБК за допомогою комп'ютерної програми Prediction of Activity Spectra for substances (PASS) і дослідити в експерименті прогнозовані види фармакологічної активності.

3. Вивчити структуру й квантово-фармакологічні властивості молекул 2,4- дихлорбензойної кислоти, кофеїну та карбамазепіну напівемпіричним методом РМЗ за допомогою алгоритму Рібера-Полака для обгрунтування доцільності композиції «Мігрепін».

4. Дослідити спектр фармакологічної дії «Мігрепіну». Встановити оптимальні антиексудативну, протибольову, жарознижувальну, антиоксидантну, протиалергічну, антиагрегантну дози «Мігрепіну» у фармакологічному експерименті.

5. Вивчити антициклооксигеназний та антиліпоксигеназний компоненти механізму протизапальної дії «Мігрепіну» на моделях карагенінового та зимозанового набряку в щурів.

6. Вивчити центральній та периферичний компоненти у механізмі протибольової дії «Мігрепіну» на лабораторних тваринах.

7. Експериментально обґрунтувати доцільність застосування «Мігрепіну» при запальних процесах, больових синдромах та гіпертермії.

8. Порівняти в експерименті вплив окремих компонентів на ефективність комбінації «Мігрепін» за антиексудативною, протибольовою та жарознижувальною дією.

9. Дослідити можливість використання «Мігрепіну» при мігрені на моделі краніо-васкулярного болю на щурах.

10. Вивчити гостру і хронічну токсичність дослідної комбінації «Мігрепін» та патоморфологічно підтвердити її нешкідливість на лабораторних тваринах.

11. Обгрунтувати перспективність подальшого вивчення та впровадження нового комбінованого препарату «Мігрепін» як протизапального, протибольового, жарознижувального та антимігренозного засобу.

Об'єкт дослідження - створення протизапальних та протибольових комбінованих лікарських засобів з політропною дією.

Предмет дослідження - протизапальна, протибольова, жарознижувальна, антиоксидантна, протиалергічна, антиагрегантна та антимігренозна дія, гостра і хронічна токсичність нового вітчизняного комбінованого лікарського засобу «Мігрепін», що містить КСДХБК, кофеїн, карбамазепін та допоміжні речовини.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети й розв'язання перелічених завдань використано комплексний методичний підхід, що включає фармакологічні, квантово-хімічні, біохімічні, електрофізіологічні, гістологічні, морфометричні , статистичні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. За допомогою комп'ютерної програми PASS прогнозовано десять можливих видів фармакологічної активності КСДХБК, за результатами яких КСДХБК введено до складу протизапального комбінованого препарату «Мігрепін». За допомогою методів квантової хімії встановлені просторові, енергетичні та електронні характеристики молекул 2,4 - дихлорбензойної кислоти, кофеїну, карбамазепіну, які стали основою до включення КСДХБК, кофеїну та карбамазепіну до складу комбінованого лікарського засобу з протизапальною дією.

Уперше проведено експериментальне дослідження нового вітчизняного комбінованого засобу «Мігрепін». Вивчено його специфічну фармакологічну дію, гостру та хронічну токсичність. Встановлені протизапальна антиексудативна, протибольова, жарознижувальна, антиоксидантна, антимігренозна, протиалергічна, антиагрегантна ефективність препарату. Виявлено дозозалежність цих ефектів. Експериментально обґрунтовано, що КСДХБК забезпечує «Мігрепіну» антиексудативний, протибольовий, жарознижувальний ефект. Кофеїн і карбамазепін потенціюють протибольовий ефект КСДХБК, а індиферентні речовини не впливають на фармакологічну активність «Мігрепіну».

Показано, що механізм протизапальної дії «Мігрепіну» обумовлено пригніченням лейкотрієнів (ЛТ В4), циклооксигенази (ЦОГ) ЦОГ-2 у сироватці крові, гомогенатах тканин головного мозку, оболонці шлунка.

Експериментально обґрунтовано доцільність фармакокорекції «Мігрепіном» запалення, больових синдромів, гіпертермії, мігрені.

Уперше встановлено, що досліджена комбінація є низькотоксичною (IV клас токсичності за класифкацією К.К. Сидорова). Вперше доведено, що у мишей і щурів відсутня видова чутливість до «Мігрепіну». Коефіцієнт видової чутливості становить 2,07, що дає можливість екстраполяції одержаних даних на людину.

За результатами дослідження одержано 3 патенти на корисну модель: №29769, МПК А61К31/00 (заявка № U2007 11038 від 05.10.2007), №29770, МПК А61К31/00 (заявка № U2007 11045 від 05.10.2007), №37105, МПК А61К31/00 (заявка № U2008 11199 від 16.09.2008).

Практичне значення одержаних результатів. Уперше створено й експериментально досліджено комбінований лікарський засіб «Мігрепін» і патогенетично обґрунтовано його застосування при запаленні, болях різного ґенезу, гіпертермії, мігрені. Показано, що комбінація КСДХБК, кофеїну та карбамазепіну може вважатися доцільною на підставі односпрямованої фармакологічної дії, можливості компонентів потенціювати фармакологічні ефекти один одного. Виконане експериментальне доклінічне дослідження ефективності використання «Мігрепіну» обґрунтувало необхідність клінічних досліджень. На підставі результатів експериментальних та квантово-хімічних досліджень обгрунтовано створення і впровадження у виробництво нового вітчизняного комбінованого препарату «Мігрепін» на ВАТ «Хімфармзавод «Червона зірка». За матеріалами дисертації оформлено 3 інформаційні листи: «Мигрепин: оптимальное сочетание ингредиентов, потенцирующих действие друг друга», «Мигрепин: новое лекарственное средство, рекомендуемое для лечения мигрени», «Оптимізація пошуку біологічно активних субстанцій серед похідних орто-галогенбензойних кислот». Результати дисертаційної роботи впроваджено в практику охорони здоров?я у вигляді методичних рекомендацій «Методологічне обґрунтування використання квантово-фармакологічних основ для встановлення фармакокінетичних властивостей лікарських засобів» та в навчальний процес на кафедрі фармакології та клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, на кафедрі фармакології, патофізіології, клінічної фармакології і фармації Київського медичного університету Української асоціації народної медицини, кафедрі фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедрі медичної, біологічної та біоорганічної хімії ВДНЗ України «УМСА», кафедрі біологічної, біоорганічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто провів патентно-інформаційний пошук, самостійно здійснив огляд літератури з даної тематики, обґрунтував актуальність проблеми і обсяг експериментальних досліджень. Самостійно виконав експериментальну частину, статистичний аналіз одержаних цифрових даних, їх узагальнення, сформулював основні положення і висновки дисертаційної роботи, оформив усі матеріали впровадження.

Квантово-хімічні та квантово-фармакологічні дослідження виконано спільно зі співробітниками кафедри фармакології та клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (зав. кафедри - доктор медичних наук, чл.-кореспондент НАН і НАМН проф. І.С. Чекман).

Патоморфологічні дослідження виконано на кафедрі патологічної анатомії ХНМУ (зав. кафедри - доктор медичних наук, проф. А.Ф. Яковцова).

Вивчення впливу «Мігрепіну» на фонову та спричинену електричною стимуляцією твердої мозкової оболонки активність нейронів ядра спинального тракту трійчастого нерва щурів на експериментальній моделі краніоваскулярного болю виконано на базі Інституту фармакології ім. А.В. Вальдмана Санкт-Петербурзьського державного медичного університету ім. академіка І.П. Павлова, лабораторії кортико-вісцеральної фізіології Інституту фізіології ім. І.П. Павлова РАН. Дослідження антимігренозної активності «Мігрепіну» здійснено на підставі міжнародного договору про науково-практичне співробітництва від 01.06.09

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації представлені та доповідалися на Міжнародній науково-практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів «Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини» (Суми, 2007), ІІІ з'їзді фармакологів Росії «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання фармакології», присвяченій 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (Вінниця, 2007), ХІІ Конгресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Івано-Франківськ, 2008), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження академіка Н.О. Пучковської (Одеса, 2008), І Національному конгресі «Человек и лекарство - Украина» (Київ, 2008), Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, 2008), VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» (Севастополь, 2010), науково-практичній конференції патологоанатомів України «Актуальні проблеми сучасної патоморфології» (Харків - Одеса, 2010), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології, присвяченій 90-річчю з дня народження професора О.О. Столярчука (Вінниця, 2010), Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды» (Санкт-Петербург-Колтуши 2010), 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010),

VIІ Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии» (Севастополь, 2011), IV Національному з?їзді фармакологів України (Київ, 2011).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 48 робіт. З них - 22 статті (у тому числі 20 статей у фахових журналах, затверджених ВАК України, та 1 стаття у журналі, затвердженому ВАК Російської Федерації) та 19 тез доповідей. Одноосібних праць - 11, серед них 8 статей, 3 тези. Одержано 3 патенти на корисну модель. Надруковано 1 методичні рекомендації, 3 інформаційні листи.

Структура та обсяг дисертації дисертація викладена на 271 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали та методи дослідження», 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів проведених досліджень, висновків, списку використаних джерел, що включає 314 публікацій, з них 172 латиницею та 142 кирилицею. Робота ілюстрована 78 таблицями та 46 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

дихлорбензойний кислота антиліпоксигеназний фармакологічний

Матеріали і методи дослідження. Етапи дослідження наведено на рис. 1. За допомогою сучасної комп'ютерної програми PASS (Sadym A. V et al, 2002) прогнозовані можливі види фармакологічної активності першого інгредієнту комбінації МГП - перспективного українського бренду - КСДХБК синтезованого вченими Національного фармацевтичного університету (Е.Я. Левитин, В.И. Кабачный, Л.В. Яковлева, В.П. Черных, 1998). За допомогою Quantitative Structure Activity Relationship (QSAR) проведено вивчення просторових характеристик молекул 2,4 - дихлорбензойної кислоти, кофеїну і карбамазепіну послідовно методами молекулярної механіки та напівемпіричним РМЗ. Для всіх досліджень використаний алгоритм Рібера-Полака (Флениген М. и др., 1980; Соловьев М.Е., Соловьев М.М., 2005; Небесна Т.Ю., Чекман И.С., 2006; Небесна Т.Ю. та ін., 2007).

Рис.1. Основні етапи дослідження

Дослідженні показники: відстані між атомами (Е); значення кутів між зв'язками (°); розподіл електронної щільності тільки зовнішніх валентних електронів; розподіл електростатичного потенціалу в молекулі; загальна енергії напруги молекули (ккал/моль); енергія зв'язування (ккал/моль); електронна енергія (ккал/моль); енергія між'ядерної взаємодії (ккал/моль); теплота утворення (ккал/моль); заряди на атомах (ат. од.); значення дипольного моменту молекули (Д); локалізація та енергія вищої зайнятої (ВЗМО) і нижчої вакантної (НВМО) молекулярних орбіталей (еВ); значення абсолютної жорсткості (Ю) (еВ) (Апостолова Е.С. и др. 1999).

Для встановлення % складу компонентів майбутнього лікарського засобу МГП проведено скринінгові дослідження. Після визначення оптимального співвідношення компонентів (КСДХБК 12,5%, кофеїн 5%, карбамазепін 50%, допоміжні речовини 32,5%) виконували дослідження з цим складом майбутнього лікарського засобу.

Вибір методів вивчення специфічної дії МГП залежав від фармакологічних властивостей його компонентів, що в свою чергу і визначало показання до застосування.

Вибір референс-препаратів залежав від виду вивченої специфічної дії. Референс-препарати: диклофенак натрію, таблетки по 50 мг, Hemofarm, Сербія; дексаметазон, розчин для ін'єкцій 4 мг/1 мл, KRKA, Словенія; піроксикам, капсули по 10 мг, Sopharma, Болгарія; діазепам, таблетки по 5 мг, Тархомінський фармзавод, Польфа. Польша; дипиридамол, таблетки по 25 мг, ДНЦЛЗ, Україна.

В дослідах використовували МГП - порошкоподібний склад майбутніх таблеток у вигляді 0,01-20% завису на 3% крохмальному слизу, який вводили внутришньошлунково у дозах 0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг (1/10 ДЛ50) щурам.

По-перше вивчали протизапальну дію МГП. Антиексудативну дію МГП вивчали на трьох моделях: формалінового, зимозанового та карагенінового набряку у щурів. Антиексудативну активність МГП вивчали в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг на моделі формалінового запалення у щурів. Референс-препарат диклофенак натрію (D -Na) вводили в дозі 8 мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Зіставлення протизапальної активності речовин на моделях карагенінового та зимозанового набряків дозволяє визначити механізм антиексудативної дії (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001; Герасимова О.О. та ін.; 2004; Vane I.R., et al., 1998; Iannedohloand E.L., Yue Q.Y, 2000; Kolaczkowska E, 2002). Тому з метою найбільш точного визначення механізму дії МГП вивчали його антиексудативну протизапальну активність в дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг на моделях карагенінового та зимозанового набряку стоп у щурів.

Для визначення антиліпоксигеназного механізму дії використано модель асептичного ексудативного зимозанового запалення у щурів у зв'язку з тим, що зимозан сприяє утворенню і виділенню лейкотриєнів (ЛТ), тому провокує локальну гостру запальну реакцію. Його вводили субплантарно з розрахунку 0,1 мл на тварину у вигляді 2% суспензії (Sigma). Об'єм стоп вимірювали онкометром за О.С. Захаревським до і через 0,5, 1, 2, 3 години після введення флогогену. Визначення вмісту ЛТВ4 у сироватці крові, гомогенатах слизової оболонки шлунка та головного мозку проводили імуноферментним методом за допомогою комерційного набору виробництва фірми NEOGEN (США/Канада) на імуноферментному аналізаторі «Лаблайн-90» (Австрія). Для гомогенізації тканин використовували 96% етиловий спирт (1 : 5).

Для визначення антициклооксигеназного компоненту у механізмі антиексудативної дії МГП використано модель карагенінового набряку в щурів. Об?єм стоп визначали в динаміці до і через 1, 2, 3, 24 та 48 годин після введення флогогену за допомогою онкометру за О.С. Захаревським. Антиексудативну активність визначали у відсотках за властивостями зменшувати набряки стоп піддослідних тварин. Через 2,5 години визначали активність ЦОГ-1 та ЦОГ-2 у сироватці крові, гомогенатах слизової оболонки шлунка та головного мозку спектрофлуорометричним методом з використанням комерційного набору виробництва фірми Cayman Chemical Company (США) на спектрофлуориметрі «Хітачі» (Японія). Для гомогенізації тканин використовували фосфатно-сольовий буфер рН 7,4 (1 : 5). Коефіцієнти інгібування (КІ) ЦОГ-1 і ЦОГ-2 визначали за формулою: активність ферменту (ЦОГ-1 або ЦОГ-2) при запаленні / активність ферменту (ЦОГ-1 або ЦОГ-2) при дії препарату на фоні запалення. Потім визначали КІ ЦОГ-2 / КІ ЦОГ-1 за їх співвідношенням. У всіх дослідах тваринам МГП і референс-препарати вводили внутрішньошлунково, одноразово у вигляді 0,01-1% завису на 3% крохмальному слизу. Через 1 годину субплантарно - флогогенний агент. При вивченні антиліпоксигеназного та антициклооксигеназного компонентів у механізмі дії МГП використано референс-препарати: інгібітор ліпази дексаметазон в дозі 0,06 мг/кг, піроксикам в дозі 1,3 мг/гк (перераховані за допомогою коефіцієнту видової стійкості Риболовлева Ю.П., виходячи з доз для людини), D-Na в дозі 8 мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001).

Антиальтеративні властивості МГП вивчали в дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг на моделі експериментального запалення шкіри та підшкірної клітковини у щурів за властивостями зменшувати некротичні зміни в осередку запалення. Антипроліферативні властивості МГП в дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг вивчали на моделі «ватної гранульоми» у щурів (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Проліферативне запалення викликали у щурів під комбінованим наркозом (кетамін+ефір). Референс-препарат D-Na в дозі 8 мг/кг.

Вплив МГП на процеси перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантний захист організму вивчали на фоні ексудативного формалінового запалення у щурів за зміною у сироватці крові кількості дієнових кон'югатів (ДК) і продуктів, що реагують із тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактантів), а також активності супероксиддисмутази (СОД) і каталази (Кат), які віддзеркалюють стан ферментативної ланки антиоксидантного захисту. В сироватці крові визначали вміст ТБК-АП (Федорова Г.Н., 1983) та ДК (Гаврилова Б.В. 1983) спектрофотометрично. Активність СОД (Чевари И.С., 1985) та каталази (Королюк І.В., 1988) визначали теж спектрофотометрично. Референс-препарат D-Na в дозі 8 мг/кг. Жарознижувальна активність МГП в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг оцінювалася за його властивістю проявляти гіпотермічну дію у щурів на фоні молочної лихоманки. Реєстрацію ректальної температури проводили в динаміці електротермометром ТПЕМ-1 протягом трьох годин після введення препарату та через добу. Використано референс-препарат D-Na (5 мг/кг) (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Протиалергічну дію МГП в дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг вивчали шляхом визначення кількості дегранульованих тучних клітин (ДТК) після двотижневої сенсибілізації (однократне підшкірне введення 1 мл конячої сироватки, підсилене однією дозою АКДС) (Фрімель Г., 1987). Антигістамінну дію препарату визначали за кількістю ДТК у мазку перитонеальної рідини, що пофарбований нейтральним червоним. Порівняння проводили з інтактним контролем та групою без лікування. Кількість ДТК визначали у відсотках. Протибольову дію МГП вивчали за впливом на центральний і периферичний компонент больової реакції на щурах та мишах. Для вивчення впливу МГП на периферичний компонент ноцицептивної реакції використано моделі оцтовокислих (МГП - щурам в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг, референс-препарат D-Na в дозі 5 мг/кг) і ацетилхолінових (МГП мишам в дозах 0,14 мг/кг, 1,4 мг/кг, 7 мг/кг, 17, 65 мг/кг, 28 мг/кг, референс-препарат D-Na в дозі 7 мг/кг) корчів (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001).

Центральну протибольову дію МГП в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг вивчали за сумаційно-пороговим показником (СПП) у щурів, референс-препарати D-Na (5 мг/кг), діазепам (3 мг/кг) (Сперанський С.В., 1965) і у мишей на моделі термічного подразнення («гаряча пластина», «hot plate») (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). МГП вводили в дозі 17,65 мг/кг (дозу мишам перераховано за допомогою коефіцієнту видової чутливості з оптимальної антиексудативної дози щурам (12,5 мг/кг)), референс-препарати піроксикам (1,3 мг/кг), діазепам (4,2 мг/кг).

Антиагрегантну активність МГП в дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг визначали за часом утворювання тромбоцитарних агрегатів, ініційованих розчином аденозиндифосфату (АДФ) у концентрації 20 мкг/мл у щурів. Референс-препарат дипиридамол в дозі 2 мг/кг.

Вивчали вплив діючих і допоміжних компонентів на фармакологічну ефективність композиції МГП на щурах в дозах 0,6 г/кг (1/10 ЛД50) і 12,5 мг/кг (оптимальна антиексудативна). Антиексудативні властивості вивчено на моделі формалінового набряку в щурів. Жарознижувальні - на моделі молочної лихоманки у щурів: лікувальне на фоні максимальної температури (4 години) і профілактичне за 1-2 години до максимальної температури. Протибольові властивості визначали за впливом на периферичний компонент больової реакції, який вивчали на моделі оцтових корчів у щурів. При вивченні фармакологічних властивостей компонентів МГП в дозі 0,6 г/кг піддослідних щурів було розподілено на VІ груп по 6 в кожній. Тварини І групи (контрольної) одержували 3% крохмальний слиз однократно внутрішньошлунково (2 мл на 200 г щура); тваринам ІІ групи вводили КСДХБК (0,075 г/кг); тварини ІІІ групи отримували комбінацію КСДХБК (0,075 г/кг), кофеїну (0,03 г/кг); тваринам IV групи вводили комбінацію КСДХБК (0,075 г/кг), кофеїну (0,03 г/кг) і карбамазепіну (0,3г/кг); тварини V групи отримували МГП (0,6 г/кг) - комбінацію дослідної солі (0,075 г/кг), кофеїну (0,03 г/кг), карбамазепіну (0,3г/кг) і допоміжних речовин (картопляний крохмаль, лактоза, кальцію стеарат, натрію кроскармелоза); тваринам VI групи вводили референс-препарат Д-Na у дозах 5 (при вивченні протибольової та жарознижувальної активності) або 8 (при вивченні антиексудативної активності) мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001).

При вивченні фармакологічних властивостей компонентів МГП в дозі 12,5 мг/кг піддослідних щурів було розподілено на VІ груп по 6 в кожній. Тварини І групи (контрольної) одержували 3% крохмальний слиз однократно внутрішньошлунково (2 мл на 200 г щура); тваринам ІІ групи вводили КСДХБК (1,563 мг/кг); тварини ІІІ групи отримували комбінацію КСДХБК (1,563 мг/кг), кофеїну (0,625 мг/кг); тваринам IV групи вводили комбінацію КСДХБК (1,563 мг/кг), кофеїну (0,625 мг/кг) і карбамазепіну (6,25 мг/кг); тварини V групи отримували МГП (12,5 мг/кг) - комбінацію дослідної солі (1,563 мг/кг), кофеїну (0,628 мг/кг), карбамазепіну (6,25 мг/кг) і допоміжних речовин. Тварини VI групи референс-препарат Д-Na у дозах 5 (при вивченні протибольової та жарознижувальної активності) або 8 (при вивченні антиексудативної активності) мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Дослідні речовини вводили однократно, внутрішньошлунково у вигляді завису на 3% крохмальному слизу.

Для проведення досліджень по вивченню антимігренозної дії МГП використовувалася експериментальна модель краніо-васкулярного болю. Ця модель базується на сучасних уявленнях про структурно-функціональну організацію тригеміно-васкулярної системи і полягає у вивченні фонової і викликаної електричною стимуляцією твердої мозкової оболонки (ТМО) активності нейронів трігеміно-цервікального комплексу (ТЦК). Дана модель дозволяє не тільки досліджувати нейрофізіологічні механізми ГБ, а й проводити скринінгові і поглиблені випробування потенційних антімігренозних препаратів (Соколов А.Ю., 2007). Наркотизацію тварин здійснювали введенням суміші уретану («ICN», США, 800 мг/кг) внутришньоочеревинно (в/оч) і альфа-хлоралози («ICN», США, 60 мг/кг, в/оч).

Моніторинг та аналіз активності досліджуваних нейронів, а також управління електричною стимуляцією ТМО здійснювали в режимі реального часу за допомогою спеціальної комп'ютерної програми Spikes 1.3 (Пантелеев С.С., 2001). Вплив МГП на фонову і викликану електричним подразненням ТМО активність нейронів каудального ядра трійчастого нерва оцінювали в дозах 12.5, 25,0 і 37,5 мг / кг у щурів. Досліджувану речовину розводили ex tempore в 0,75 мл розчинника і вводили в/в повільно, протягом 1 хв. У контрольній групі вводили еквівалентний об'єм розчинника за інших рівних умов експерименту. Рецепт розчинника було одержано емпіричним шляхом. До його складу входять: диметилсульфоксид ? 5%, етанол ? 10%, поліетиленгліколь-400 ? 20% і фізрозчин ? 65%. Після додавання в розчинник МГП суміш гріли на водяному огрівнику 5-7 хв для одержання однорідної дрібнодисперсної суспензії. У контрольній групі тварин обов'язково здійснювалося «холосте» прогрівання суміші.

Після знаходження нейрона, що відповідає умовам відбіру і який має стабільні показники фонової і викликаної електричним подразненням верхнього сагітального синуса активності проводили їх контрольний запис (0 хв) як вихідні значення. Далі вводили МГП у певній дозі і через 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 і 75 хвилин після закінчення інфузії проводили вимірювання та запис фонової і викликаної нейрональной активності. Висновки про вплив речовини на фонову і викликану активність нейронів робили на підставі порівняння одержаних через вказані інтервали часу даних з вихідними значеннями і з даними контрольної групи. Первинна обробка даних здійснювалася за допомогою спеціально розробленої комп'ютерної програми SpikesHist3 (Пантелеев С.С., 2001). Результати первинної обробки зберігалися у форматі, що дозволяє імпортувати їх у програмний пакет «Origin 7.5», за допомогою якого проводили подальшу обробку та графічне оформлення результатів експериментів. Визначення значимості одержаних результатів проводили за допомогою програми InStat (версія 3.02) з використанням непараметричних методів для парних (критерій Фрідмана і тест Вілкоксона) і непарних (критерій Крускал-Уолліса і тест Манна-Уітні) вимірів.

При використанні комбінації може бути потенціювання не тільки фармакологічних ефектів, а й загальнотоксичного впливу окремих компонентів на життєвоважливі функції організму або на процеси, що пов'язані з детоксикацією препарату. Тому необхідним і доцільним є дослідження нешкідливості нового комбінованого лікарського засобу.

Вивчення гострої токсичності МГП. Досліди виконано на статевозрілих білих мишах обох статей лінії BALB/С загальноприйнятим методом вивчення гострої токсичності (Беленький М.Л., 1963) і білих статевозрілих щурах обох статей лінії WAG експрес-методом за Deschmann et la Blanc, що дозволяє зменшити кількість тварин у досліді (Саноцкий И.В., 1970). У дослідах використовували МГП у вигляді 20-30% завісу на 3% свіжевиготовленому крохмальному слизу, вводили одноразово внутрішньошлунково в наростаючих дозах від максимальних, що переносяться до абсолютно токсичних. При цьому визначали верхні параметри токсичності (максимально переносиму дозу - ДЛ0, ДЛ50, та ДЛ100) за виразністю інтегральної реакції у вигляді загибелі тварин у відповідь на введення зростаючих доз препарату. За тваринами, які вижили, спостерігали протягом 14 діб (загальний вигляд, поведінка, стан слизових оболонок, шерсті, харчова та питна активність), обчислювали масу кожні 7 днів. ДЛ50 розраховували на підставі загибелі мишей (від 0 до 100%) за методом Кербера. У дослідах на щурах, відповідно до застосованого експрес-методу, кожну з наростаючих доз препарату вводили одній тварині однократно внутришньошлунково. За ДЛ50 брали найменшу дозу, яка призводила до загибелі тварини. Нагляд за щурами, які вижили, проводили так само, як у дослідах на мишах (Саноцкий И.В., 1970). При спостереженні за дослідними тваринами звертали увагу на клінічну картину гострого отруєння, користуючись методичними рекомендаціями Державного Фармакологічного Центру (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Ступінь токсичності визначали за ДЛ50 - відповідно до класифікації Сидорова К.К., 1973. Наприкінці дослідів загибель тварин викликали згідно правил забою (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Внутрішні органи (печінка, нирки, селезінка, шлунок, серце, легені, наднирники, мозок, гонади) зважували, розраховували масові коефіцієнти, робили патоморфологічні дослідження на парафінових зрізах, які виготовлялися за допомогою мікротома товщиною 5 мкм і фарбували згідно загальноприйнятому гістологічному методу гематоксилином-еозіном.

Вивчення хронічної токсичності МГП. Досліди виконано на 20 статевозрілих щурах лінії WAG обох статей вагою 170-285 г, розподілених в дві групи. Перша група була контрольною (10 щурів) і одержувала 3% крохмальний слиз в об'ємі 2 мл на 200 грамів, тваринам другої групи (10 щурів) вводили досліджену комбінацію у дозі 2 г/кг (із розрахунку 2 мл 20% зависі препарату у 3% крохмальному слизу на одного щура вагою 200,0). Введення комбінації і 3% крохмальної зависі проводили кожного дня протягом 30 днів внутрішньошлунково (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Вивчали стан ССС за допомогою електрокардіографа (Мурашко В.В., Струтынский А.В., 1991), рівень артеріального тиску - на хвостовій артерії електроп'єзографічним методом (Расин М.С. и др., 1971); функціональний стан ЦНС за СПП (Сперанский С.В., 1965) та емоційно-поведінковими реакціями у «відкритому полі» (Hall C.S., 1969); показники периферичної крові: кількість еритроцитів і вміст гемоглобіну на еритрогемометрі, кількість лейкоцитів у камері Горяєва (Кигель Т.Б. и др., 1981). При проведенні електрофізіологічних методів дослідження на щурах використовували нембуталовий наркоз (30 мг/кг внутрішньочеревинно). Для всіх біохімічних методик дослідження евтаназію щурів здійснювали шляхом одномоментної декапітації при зберіганні умов, передбачених наказами МОЗ СРСР № 755 від 12.08.1977 р., МОЗ УССР №32 від 22.02.1988 р. і вимогами «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, що використовуються в дослідних і інших наукових цілях» (Strasbourg, 18.03.1986). Визначали масові коефіцієнти головного мозоку, легень, тимусу, серця, печінки, селезінки, наднирників, нирок, гонад. Фрагменти цих органів, а також шлунка і тонкого кишечника підлягали патоморфологічному дослідженню (фарбування гематоксиліном-еозіном та пікрофуксином за Ван Гізон). Після забою визначали вміст аскорбінової кислоти у внутрішніх органах (Birch R. Wetal, 1933). Функціональний стан печінки оцінювали за величиною в крові загального білка, глюкози, активності лужної фосфатази (ЛФ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), аланінамінотрансферази (АлАТ), загальної лактатдегідрогенази (ЛДГ) за допомогою наборів реактивів фірми La Chema (Чехія). Функціональний стан нирок визначали за показниками добового діурезу, вмістом креатиніну та сечовини у сечі та крові (Колб В.Т., Камышников В.С., 1968). Одержаний цифровий матеріал обробляли статистично загальноприйнятими методами (Гланц С.,1998).