Експериментальне та квантово-хімічне обгрунтування створення комбінованого протизапального препарату

Вивчення місцевоподразнювальної та алергізувальної дії МГП. Місцевоподразнювальну дію МГП вивчали у спеціальній серії дослідів на кроликах шляхом закапування 1 краплі у кон'юнктивальний мішок правого ока, а ліве було контрольним. Спостереження за станом слизової оболонки проводили через 1, 2 і 24 години і потім протягом 7 діб та відмічали стан очей: гіперемію, набряк кон'юнктиви, сльозотечіння, реакцію зіниць на світло, стан очної щілини. Крім того, за місцевоподразнювальною дією МГП спостерігали і в дослідах на щурах у процесі вивчення гострої і хронічної токсичності препарату, який було введено протягом 30 днів. Можливу алергізувальну дію МГП вивчали згідно методичних рекомендацій по оцінці алергенних властивостей фармакологічних засобів, використовуючи комбінований (пероральний і нашкірний спосіб сенсибілізації) (1988 р.). Досліди виконано на мурчаках світлої масти. Тварини були розподілені на 2 групи по 6 штук в кожній. Мурчаки першої групи були контрольні і одержували 3% крохмальний слиз, тварини другої (дослідної) групи одержували МГП. Враховуючи пероральний шлях введення, тварин дослідної групи сенсибілізували за схемою: мурчакам вводили МГП внутришньошлунково із розрахунку 2 мл на 200 г тварини 20% зависем препарата у 3% крохмальному слизу 1 раз на день протягом 10 днів і паралельно проводили шкірну сенсибілізацію (Хаджай Я.И., Щербакова Н.Р., 1978). Через 10 днів сенсибілізації проводили внутришньошкірне алерготестування. У тварин на 20-й день сенсибілізації брали кров і проводили діагностичні тести in vitro: реакцію специфічної агломерації лейкоцитів (РСАЛ) і реакцію альтерації нейтрофілів (РАН) (Сосонкин И.Е., 1968, Фрадкин В.Н., 1975, Юренев П.Н. и др., 1972). Також визначали абсолютну кількість еозинофілів у крові, підраховували їх у камері Фукс-Розенталя фарбуванням за методом І.С. Піралішвілі (Колб В.Т., Камышников В.С., 1968). У динаміці вимірювали температуру у прямій кишці тварин і на депільованній ділянці шкіри електротермометром ТПЕМ-1 та визначали масу тіла тварин. Із специфічних методів для виявлення сенсибілізувальних властивостей МГП в окремій серії дослідів на мурчаках ставили кон'юнктивальну пробу. Дослідження проводили відповідно до методичних рекомендацій Державного фармакологічного центру МОЗ України (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). При виборі кількості тварин і розподілі їх за групами враховували економний підхід, біоетичні правила та вимоги статистики.

Всього для експериментальних досліджень використано 583 статевозрілих щурів лінії WAG масою 180-400 гр обох статей, 178 білих безпородних мишей статевозрілого віку масою 25-30 гр обох статей, 12 мурчаків масою 610-700 гр обох статей, 6 кролів масою 1,8-2,0 кг обох статей. Досліди на тваринах проводили у згоді з вимогами гуманного ставлення до них.

Статистичну обробку отриманих даних проводили загальноприйнятими методами (Гланц С., 1998).

Роботу виконано на лабораторних тваринах з експериментально-біологічної клініки ХНМУ з урахуванням норм зберігання, догляду і годування, затверджених згідно принципів «Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей» (Страсбург, 1986) і ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2007). Досліди проводилися в першій половині дня, що за даними літератури узгоджується з залежністю основних фармакологічних параметрів і фармакологічною активністю прийнятих до дослідження препаратів від циркадних ритмів (Западнюк И.П. и др., 1983; Дорогой А.П., 1992). Заключний етап дослідження був присвячений розробці кількісного складу майбутнього лікарського засобу - таблеток «Мігрепін». Для цього дози діючих компонентів МГП було перераховано за допомогою КВЧ на людину. Допоміжні речовини було обрано на підставі загально існуючих технологічних правил.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

За допомогою комп'ютерної програми PASS прогнозовано можливі види фармакологічної активності КСДХБК. Отримано 127 видів потенційної активності КСДХБК. Для подальших експериментальних досліджень відібрано 10, серед яких - протизапальна, жарознижувальна, протибольова. У результаті квантово-хімічних досліджень за допомогою QSAR встановлено основні структурні, енергетичні та електронні характеристики молекул 2,4 - дихлорбензойної кислоти (КСДХБК гідролізується до катіону калію та 2,4 - дихлорбензойної кислоти), кофеїну і карбамазепіну. За хімічною структурою 2,4-дихлорбензойна кислота є м'яким реагентом, тому найбільш активно може проявлятися її взаємодія з речовинами лужного характеру - лужними амінокислотами, ненасиченими і ароматичними сполуками. Центром протонування та утворення водневих зв'язків в молекулі 2,4-дихлорбензойної кислоти є атом оксигену карбоксильної групи. Головними реакційними центрами молекули кофеїну є атоми оксигену та нітрогену; за хімічною структурою ці молекули належать до м'яких реагентів; центрами протонування та утворення водневих зв'язків у них є атоми оксигену та атом нітрогену N12. Найактивніше виявляється взаємодія молекули кофеїну з м'якими речовинами лужного характеру - лужними амінокислотами, ненасиченими й ароматичними сполуками. Квантово-фармакологічні властивості кофеїну можуть бути основою для встановлення фізіологічних, біохімічних та молекулярних механізмів його дії. Встановлені основні просторові, енергетичні та електронні характеристики молекули карбамазепіну. Головними реакційними центрами молекули є атоми оксигену та нітрогену карбамоїльної групи. За розподілом зарядів у молекулі та напрямком диполя найбільш імовірним є зв'язування карбамазепіну з ІІ центром сироваткового альбуміну людини. За хімічною структурою карбамазепін - м'який реагент, тому найактивніше може виявлятися його взаємодія з речовинами лужного характеру - лужними амінокислотами, ненасиченими й ароматичними сполуками. Центром протонування та утворення водневих зв'язків у молекулі карбамазепіну є атом оксигену карбамоїльної групи. Квантово-хімічними та квантово-фармакологічними дослідженнями, як фрагментом фармакокінетики кофеїну, карбамазепіну та 2,4-дихлорбензойної кислоти встановлено, що дані сполуки є м'якими реагентами, які взаємодіють з речовинами лужного характеру або з альбуміном. Центрами протонування досліджених сполук є: для кофеїну - атоми оксигену та атом нітрогену N12; карбамазепіну - атоми оксигену та нітрогену карбамоїльної групи, для 2,4-дихлорбензойної кислоти - атом оксисену карбоксильної групи. За допомогою квантово-хімічних розрахунків встановлено, що не відбувається взаємодії між карбамазепіном, 2,4-дихлорбензойною кислотою та кофеїном; в біологічних рідинах компоненти суміші транспортуються окремо: 2,4-дихлорбензойна кислота та кофеїн - в розчиненому стані, а карбамазепін - в комплексі з сироватковим альбуміном. Компоненти суміші не конкурують один з одним за зв?язування з кофеїном, отже, не знижують біодоступність один одного.

Вивчення специфічної фармакологічної дії нового вітчизняного комбінованого лікарського засобу МГП, показало виражену фармакологічну активність. З метою пошуку оптимальної дози МГП вивчено його специфічну фармакологічну активність у різних дозах (Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації, 2001). Досліди проведено з використанням різних експериментальних моделей, відповідно до фармакологічних ефектів. У скринінгових дослідженнях визначено протизапальну, жарознижувальну, анальгетичну, антиоксидантну, антиагрегантну, протиалергічну, антимігренозну дії МГП.

На моделі формалінового набряку МГП виявив антиексудативну протизапальну дію в щурів (табл. 1).

Відсоток пригнічення запалення у разі застосування МГП дозою 0,1 мг/кг аналогічний до D-Na (8 мг/кг). Зі збільшенням доз спостерігалася така картина: відсоток пригнічення запалення при застосуванні МГП значно більший, аніж від D-Na (9,4%), а саме: 25,2% (1 мг/кг), 65,3% (5 мг/кг), 84,4% (12,5 мг/кг), 78% (20 мг/кг), 22,9% (0,6 г/кг). Відзначено підвищення антиексудативної дії МГП зі збільшенням дози від 0,1 мг/кг до 12,5 мг/кг і зменшення при подальшому її зростанні. Тому саме цю дозу вважаємо оптимальною як антиексудативну.

Для визначення механізму антиексудативної дії МГП вивчено його вплив в дозі 12,5 мг/кг на процеси ексудації на моделях зимозанового та карагенінового набряків у щурів. На моделі зимозанового набряку зафіксовано ефект на рівні нордигідрогваяретової кислоти (НДГК) (400 мг/кг), яку обрали за модельну речовину (протягом 1 та 2 годин спостережень), і стероїдного протизапального засобу дексаметазону дозою 0,06 мг/кг (упродовж 1, 2 та 3 годин спостережень).

Значний антиексудативний вплив МГП на моделі зимозанового набряку свідчить про наявність антиліпоксигеназного компоненту в механізмі його дії (табл. 2).

Таблиця 1

Антиексудативна дія «Мігрепіну» на моделі формалінового набряку у щурів

Умови дос-ліду	Конт-роль (n= 6)	МГП, 0,1 мг/кг (n= 6)	МГП, 1 мг/кг (n= 6)	МГП, 5 мг/кг (n= 6)	МГП, 12,5 мг/кг (n= 6)	МГП, 20 мг/кг (n= 6)	МГП, 0,6 г/кг (n= 6)	D-Na, 8 мг/кг (n= 6)
Вихід-ний об'єм лапи, мм	15,7± 0,4	14,8± 0,3	14,8± 0,3	14,9±0,4	15,3±0,4	14,8±0,3	14,8±0,8	14,3± 0,4
Об'єм лапи через 4 години, мм	25,3± 2,3*	24,8± 0,9*	21,3± 0,8*	18,3± 0,6*,**, ***	16,8± 0,6*,**, ***	16,9± 0,3*,**, ***	17,0± 2,1*,**,***	23,3± 1,3*

Примітки:

1. * - різниця, статистично вірогідна з вихідним фоном;

2. ** - різниця, статистично вірогідна з контролем;

3. *** - різниця, статистично вірогідна з групою, що отримувала D-Na.

Таблиця 2

Вивчення антиліпоксигеназного механізму антиексудативної дії «Мігрепіну» на моделі зимозанового набряку у щурів

Умови дослідів	Антиексудативна активність, %
	0,5 год.	1 год.	2 год.	3 год.	6 год.
МГП (12,5 мг/кг) (n= 6)	22,1	47,4	57,9	44,2	38,9
НДГК (400 мг/кг) (n= 6)	38,9	49,5	56,8	52,6	44,2
Дексаметазон (0,06 мг/кг) (n= 6)	26,3	51,5	57,9	44,2	46,3
Піроксикам (1,3 мг/кг) (n= 6)	21,2	23,8	28,2	29,4	27,4
D-Na (8 мг/кг) (n= 6)	24,2	28,4	36,8	30,5	28,4

Для об?єктивізації одержаних даних проведено біохімічне дослідження з визначення антиліпоксигеназного компонента в механізмі антиексудативної дії МГП. Отримані результати показали, що найбільшу пригнічувальну дію на утворення ЛТВ4 справляли МГП та НДГК, які у 2 - 2,5 рази знижували рівень ЛТВ4 у дослідних тканинах порівняно з групою «запалення». Ці препарати пригнічували продукцію ЛТВ4 нейтрофілами та еозинофілами, завдяки чому зменшувалася роль ексудативного компонента гострої запальної реакції (табл. 3).

Таблиця 3

Зміни вмісту лейкотриєну В4 у щурів на моделі зимозанового набряку

Умови дослідів	Сироватка крові, нг/мл	Слизова оболонка шлунка, нг/мг	Головний мозок, нг/мг
Інтактні (n=6)	1,40 ± 0,22	0,30 ± 0,02	0,60 ± 0,04
Запалення (n=6)	9,15 ± 1,06 *	0,89 ± 0,07 *	3,62 ± 0,41 *
МГП, 12,5 мг/кг (n=6)	3,71 ±0,74 *;**	0,41 ± 0,03 *;**	1,47 ± 0,07 *;**
НДГК, 400 мг/кг (n=6)	3,35 ± 0,86 *;**	0,43 ± 0,03 *;**	1,26 ± 0,11 *;**
Дексаметазон, 0,06 мг/кг (n=6)	5,81 ± 0,55 *;**;***	0,62 ± 0,008 *;**;***	2,53 ±0,24 *;**;***
Піроксікам, 1,3 мг/кг (n=6)	9,75 ±2,48 *;***	0,93 ± 0,13 *;***	3,67 ± 0,43 *;***
Д-Na, 8 мг/кг (n=6)	10,26 ±1,68 *;***	0,95 ± 0,11 *;***	3,84 ± 0,64 *;***

Примітки:

1.* - різниця статистично вірогідна відносно інтактної групи;

2. ** - різниця статистично вірогідна відносно групи «Запалення»;

3. *** - різниця статистично вірогідна відносно групи МГП.

Одержані дані свідчать про те, що МГП пригнічував ліпоксигеназний шлях перетворення арахідонової кислоти і тому суттєво знижував рівень ЛТВ4 у тканинах організму при запаленні.

Враховуючи те, що інгібування 5-ЛОГ не впливає на циклооксигеназний шлях розвитку запалення, вважаємо, що особливо ефективним при запальних захворюваннях може бути застосування таких лікарських засобів, які поєднували б властивості інгібіторів як ЛОГ, так і ЦОГ. Тому для вивчення антициклооксигеназного компоненту в механізмі антиексудативної дії МГП було використано модель карагенінового набряку стоп у щурів. Ця модель вважається найбільш інформативною, оскільки можливо в динаміці простежити механізм пригнічення препаратом біогенних амінів.

Встановлено, що механізм антиексудативної дії МГП пов?язаний із пригніченням гістаміну і серотоніну (1 год), кінінів (2 год), ПГ (3 год). МГП (12,5 мг/кг) зумовлював ефект, аналогічний до D-Na (8 мг/кг) протягом 24 годин у щурів. Одержані дані свідчать про наявність антициклооксигеназного компонента у механізмі антиексудативної дії МГП (табл. 4).

Для обґрунтування одержаних в експерименті даних було проведено біохімічне дослідження антициклооксигеназного компонента в механізмі антиексудативної дії МГП за активністю ЦОГ-1 і ЦОГ-2 спектрофлуорометричним методом. Активність ЦОГ-1 і ЦОГ-2 визначали в сироватці крові, гомогенатах тканин головного мозку і слизової оболонки шлунка. МГП практично не впливав на активність ЦОГ-1.

Таблиця 4

Вивчення циклооксигеназного механізму антиексудативної дії «Мігрепіну» на моделі карагенінового набряку в щурів у динаміці

Умови дослідів	Антиексудативна активність, %
	1 год.	2 год.	3 год.	24 год.	48 год.
МГП (12,5 мг/кг) (n=6)	50,0	66,7	55,0	33,3	3,0
Дексаметазон (0,06 мг/кг) (n=6)	63,3	83,3	70,0	38,3	28,3
Піроксикам (1,3 мг/кг) (n=6)	54,2	67,3	60,1	31,2	4,5
D-Na (8 мг/кг) (n=6)	53,3	70,0	58,3	25,0	3,0

Картина зміни активності ЦОГ-2 мала інший характер: МГП в усіх досліджуваних об?єктах пригнічував активність ЦОГ-2 в умовах карагенінового запалення, залишаючи цей показник у межах інтактної групи (102% - 107% інтактного контролю). Порівняльний аналіз інгібування активності ЦОГ-1 і ЦОГ-2 свідчить про високу селективність МГП стосовно ЦОГ-2. Співвідношення КІЦОГ-2/КІЦОГ-1 показує ступінь «селективності» і вказує на інтенсивність протизапальної дії та можливість виникнення побічних ефектів. МГП притаманні максимальні показники селективності щодо ЦОГ-2 (8,8 - 9,6), що в 1,6 - 2 рази вищі, ніж у разі використання піроксикаму, дексаметазону, D-Na. Це підтверджує високу функціональну активність та безпечність застосування МГП. Враховуючи той факт, що досліджений МГП (12,5 мг/кг щурам) одночасно блокує активність ЦОГ-2 і утворення ЛТВ4 у всіх об?єктах експерименту, вважаємо, що механізм його антиексудативної дії реалізується антициклооксигеназним і антиліпоксигеназним шляхами.

Оскільки МГП селективно інгібує ЦОГ-2, можна його класифікувати як

селективний інгібітор ЦОГ-2 й очікувати, що застосування МГП буде ефективним при запальних процесах з мінімальними побічними ефектами (табл. 5).

Таблиця 5

Вивчення селективності протизапальних засобів до інгібування ЦОГ-1 і ЦОГ-2 у сироватці крові та досліджуваних тканинах щурів

Умови дослідів	Сироватка крови	Слизова оболонка шлунка	Головний мозок
	KI ЦОГ-1	KI ЦОГ- 2	KI ЦОГ-2 / ЦОГ-1	KI ЦОГ- 1	KI ЦОГ-2	KI ЦОГ-2 / ЦОГ-1	KI ЦОГ- 1	KI ЦОГ- 2	KI ЦОГ- 2 / ЦОГ- 1
МГП (12,5 мг/кг) (n=6)	1,1	10,6	9,6	1,1	9,7	8,8	1,1	10,1	9,2
Дексаме-тазон (0,06 мг/кг) (n=6)	1,6	8,0	5,0	1,5	7,6	5,1	1,6	8,2	5,1
Піроксикам (1,3 мг/кг) (n=6)	1,4	7,7	5,5	1,3	7,9	6,1	1,4	8,0	5,7
D-Na (8 мг/кг) (n=6)	2,0	7,1	3,7	2,1	8,1	4,1	2,2	7,6	3,5

Для комплексного вивчення впливу МГП на запалення визначено дію препарату на процеси альтерації та проліферації. У щурів з метою економії лабораторних тварин вплив МГП досліджували в двох дозах - 12,5 мг/кг (оптимальна антиексудативна доза) і 0,6 г/кг (1/10 ДЛ50). Результати експерименту засвідчили відсутність впливу МГП в обох досліджених дозах і референс-препарату D-Na (8 мг/кг) на хронічне асептичне запалення шкіри і підшкірної клітковини у щурів, при якому наявні альтеративні зміни, а МГП лише уповільнював вираженість місцевого ушкодження на початковому етапі запалення. На процеси проліферації МГП в обох вивчених дозах впливав не активно. Він, аналогічно до D-Na, пригнічував проліферативну реакцію лише у вигляді тенденції, тому антипроліферативний ефект оцінюємо як помірний.

Активація вільнорадикальних процесів є ключовим фактором розвитку патологічних станів і може призвести до ушкодження мембран і клітинних структур: вільні радикали та гідроперекиси пошкоджують мембрани, змінюють фізико-хімічні властивості фосфоліпідів, знижують активність ліпідозалежних мембранопов'язаних ферментів, ферментів дихального ланцюга мітохондрій, моноаміноксидази, аденілатциклази. У динамічній рівновазі з процесами ПОЛ перебувають антиоксидантні процеси. Антиоксидантна активність (АОА) організму забезпечується функцією таких ферментів, як СОД, Кат та інших і перебуває у динамічній рівновазі з процесами ПОЛ, забезпечуючи у фізіологічних умовах антиокислювальний гомеостаз. Характер змін ПОЛ-АОА відображає інтенсивність і хід патологічного процесу. Використання антиоксидантів у комплексній терапії багатьох захворювань не виключає можливості встановлення антиоксидантної дії і в деяких препаратів, які за своїми фармакологічними властивостями належать до інших фармакологічних груп. Тому доцільно було вивчити участь процесів ПОЛ у механізмі формалінового ексудативного запалення та вплив на них МГП. МГП (0,6 г/кг) не може нормалізвати процеси пероксидації при ексудативному запаленні: досить високим залишається рівень ДК та МДА. МГП (12,5 мг/кг) знижує рівень МДА, нормалізує рівень ДК і таким чином стабілізує процеси пероксидації (табл. 6).

Антиоксидантний ефект спостерігався від обох досліджених доз МГП, про що свідчить активація СОД і Кат у сироватці крові щурів.

Отже, МГП (12,5 мг/кг) пригнічує процеси ПОЛ, виявляє антиоксидантну активність значно більше, ніж МГП (0,6 г/кг) і D-Na (8 мг/кг). Це можна пояснити тим, що до складу МГП входить компонент метаболічного типу дії кофеїн (табл 7).

Дослідження дії МГП на стан окиснювальної рівноваги за показниками ПОЛ та антиоксидантної системи допомогло визначити у МГП антиоксидантні властивості.

Аналіз динаміки жарознижувальної активності МГП показав, що вже через 1 годину після його введення зафіксовано зниження температури, що спостерігалося протягом 3 годин. МГП (5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг) знижував температуру аналогічно до рівня D-Na (5 мг/кг) на 3 - 5%.

Таблиця 6

Вплив «Мігрепіну» на стан пероксидного окиснення ліпідів у сироватці крові щурів

Умови дослідів	ТБК-реактант, мкмоль/л	ДК, мкмоль/л
Інтактний контроль (n=6)	1,650±0,076**	27,000±0,635**
Контроль (n=6)	3,175±0,117*,***	31,632±0,874*,***
МГП, 12,5 мг/кг (n=6)	2,203±0,124*,**,***	28,810±0,383**,***
МГП, 0,6 г/кг (n=6)	4,303±0,084*,**,***	37,193±0,447*,**,***
D-Na, 8 мг/кг (n=6)	1,778±0,086**	25,922±1,082**

Примітки:

1. * - різниця статистично вірогідна з інтактним контролем;

2. ** - різниця статистично вірогідна з групою без лікування (контроль);

3. *** - різниця статистично вірогідна з групою, що отримувала D-Na.

Зв?язок процесу запалення з алергічною реакцією визначається запальними тканинними медіаторами, перш за все гістаміном. Тому протиалергічну дію МГП вивчено на моделі дегрануляції тучних клітин у сенсибілізованих щурів. Одержані дані свідчать про наявність у МГП в обох досліджених дозах (12,5 мг/кг та 0,6 г/кг) протиалергічної дії на основі антигістамінного ефекту (відсоток ДТК при застосуванні МГП становив 12,3±3,7 та 18,9±3,9 відповідно при 75±6,7 у групі без лікування.

Таблиця 7

Вплив «Мігрепіну» на показники антиоксидантної системи у сироватці крові щурів

Умови дослідів	СОД, од. акт.	Кат, мкмоль/л
Інтактний контроль (n=6)	27,350±0,812**,***	1,100±0,175**,***
Контроль (n=6)	34,735±0,697*,***	4,077±0,112*,***
МГП, 12,5 мг/кг (n=6)	40,675±0,468*,**	4,817±0,171*,**
МГП, 0,6 г/кг (n=6)	40,545±0,552*,**	4,778±0,160*,**
D-Na, 8 мг/кг (n=6)	40,513±0,628*,**	4,732±0,309*,**

Примітки:

1. * - різниця статистично вірогідна з інтактним контролем;

2. ** - різниця статистично вірогідна з групою без лікування (контроль);

3. *** - різниця статистично вірогідна з групою, що отримувала D-Na.

Підвищення ризику серцево-судинних ускладнень під впливом інгібіторів ЦОГ-2 можна пояснити відсутністю антиагрегатної дії. Селективне пригнічення синтезу простацикліну, спричинене інгібуванням ЦОГ-2, призводить до зменшення його захисної дії щодо запобігання тромбозу і дає змогу реалізуватися прокоагулянтному ефекту тромбоксану тромбоцитів, зумовлюючи розвиток тромбозу (у пацієнтів з підвищеним ризиком). Одночасне інгібування двох ізоферментів ЦОГ, яке розвивається при застосуванні традиційних НПЗЗ, навпаки, сприяє підтриманню балансу гомеостазу. Тому, за наведеними даними, можна вважати, що селективна блокада ЦОГ-2 підвищує ризик виникнення серцево-судинних побічних ефектів більшою мірою, ніж блокада і ЦОГ-1, і ЦОГ-2. Отримані експериментальні дані показали, що МГП селективно пригнічує ЦОГ-2, а на ЦОГ-1 не впливає. Отже важливо було вивчити дію МГП на процеси агрегації. Встановлено, що МГП має антиагрегантну дію. Тому немає необхідності призначати з МГП антиагреганти. Наявність антиагрегантної дії у МГП пов?язана з тим, що до його складу входить кофеїн, який, за даними літератури, має антиагрегантний ефект на основі інгібування фосфодіестерази і накопичування внутрішньоклітинного цАМФ. Досліджено МГП у дозах 12,5 мг/кг та 0,6 г/кг. Відзначалося, що час утворювання агрегатів при застосуванні МГП в дозі 12,5 мг/кг (14,8±2,2 с) аналогічний до препарату порівняння дипіридамолу (2 мг/кг) 15,0±6,3 с. Антиагрегантна дія у МГП в дозі 0,6 г/кг виражена слабко: 12,0±4,2 с і практично відповідає інтактному контролю (9,0±4,2 с). Це пов?язано, на наш погляд, з тим, що до складу МГП входить метаболітний препарат кофеїн, а дані літератури свідчать про те, що метаболітні препарати в малих дозах можуть виявляти інтенсивніший фармакологічний ефект, аніж у великих.

Фармакологічно коригувати біль можна впливаючи як на центральні, так і на периферічні механізми його розвитку. Вплив МГП на периферичний компонент вивчено на моделі оцтовокислих корчів у щурів та ацетилхолінових корчів у мишей. Під впливом оцтової кислоти відбувається активація калікреїн-кінінової системи, простагландинів (ПГ), біогенних амінів, ЛТ, які є ендогенними медіаторами запалення і сприяють розвитку корчів черевних м?язів щурів. Оцтовокислі корчі - класична модель вісцерального болю, який виникає при внутрішньоочеревинному введенні 0,6% розчину оцтової кислоти. МГП у всіх досліджених дозах (0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг, 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, 0,6 г/кг) виявляв на щурах протибольову дію периферичного генезу, сприяючи статистично вірогідному зменшенню корчів на 35%, 52%, 55%, 67%, 68%, 69% відповідно стосовно референс-препарату. Це свідчить про інтенсивнішу протибольову дію МГП щодо D-Na. Під впливом ацетилхоліну відбувається активація метаболізму арахідонової кислоти під дією ЦОГ, тому зростють біосинтез та вивільнення ПГ, які спричинюють розвиток корчів черевних м?язів. МГП у дозах 7 мг/кг, 17,65 мг/кг, 28 мг/кг виявив значну анальгетичну активність на мишах на рівні референс-препарату D-Na. Одержані дані свідчать про високу протибольову ефективність МГП та його інгібуючі властивості стосовно медіаторів болю (ПГ, ЛТ, гістамін, серотонін, брадикінін). Оптимальними вважаємо такі дози МГП: 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг - щурам, 7 мг/кг, 17,65 мг/кг, 28 мг/кг - мишам. МГП виявив значну периферичну анальгетичну дію в діапазоні ізоефективних доз 0,1 - 20 мг/кг щурам та 7 - 28 мг/кг мишам. Збільшення дози до 0,6 г/кг не сприяло підвищенню фармакологічного протибольового ефекту. Оскільки в таких невеликих дозах МГП виявляв сильну периферичну протибольову дію, можна передбачити наявність центрального компоненту в його механізмі протибольового впливу. Центральний протибольовий ефект пов?язаний з пригніченням міжнейронної передачі больових імпульсів у ділянці таламуса, який визначали за СПП, як критерієм безумовно-рефлекторної рухової реакції щурів у відповідь на поступове збільшення електроподразнення від імпульсного стимулятора. МГП у дозах 5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг, введений щурам, виявляв центральну протибольову дію. Дози 12,5 мг/кг та 20 мг/кг діяли аналогічно референс-препарату з ГАМК-ергічною активністю - діазепаму (3 мг/кг), що також свідчить про центральний механізм протибольового впливу МГП. Тому саме ці дози є оптимальними як протибольові. Оскільки МГП у дозі 12,5 мг/кг показав найкращу антиексудативну дію, вивчено його анальгетичну активність на центральний компонент ноцицептивної системи на моделі термічного подразнення (гаряча пластина) кінцівок мишей в дозі 17,65 мг/кг. Виявлено наявність у МГП центрального компонента анальгетичної дії на рівні препарату порівняння діазепаму (3 мг/кг). Одержані результати свідчать про наявність центрального компоненту в механізмі анальгетичного ефекту МГП.

У результаті здійснених досліджень вивчено вплив компонентів МГП на його фармакологічну ефективність. Основними фармакологічними ефектами МГП є протибольовий, антиексудативний, жарознижувальний. Тому на відповідних моделях з?ясовано, які саме діючі компоненти МГП забезпечують той чи інший специфічний ефект.

Вивчено вплив компонентів на антиексудативну активність МГП (0,6 г/кг та 12,5 мг/кг) на моделі формалінового набряку у щурів. Встановлено, що антиексудативну дію композиції МГП забезпечує КСДХБК. Одержані дані свідчать про значний антиексудативний ефект КСДХБК, плавну, але статистично не вірогідну потенціювальну антиексудативну дію кофеїну й антиексудативну індиферентність щодо карбамазепіну та допоміжних речовин.

Так, досліди з МГП (0,6 г/кг) на щурах показали: % пригнічення ексудативного запалення порівняно з контролем (0%) при введенні КСДХБК - 18,7%, КСДХБК + кофеїн - 22,9%, КСДХБК + кофеїн + карбамазепін - 21,2%, КСДХБК + кофеїн + карбамазепін + допоміжні речовини - 22,9%. Аналогічна тенденція спостерігалася в дослідах з МГП (12,5 мг/кг) на щурах: пригнічення ексудативного запалення порівняно з контролем (0%) при введенні з КСДХБК становило 65,2%, КСДХБК + кофеїн - 76,9%, КСДХБК + кофеїн + карбамазепін - 78%, КСДХБК + кофеїн + карбамазепін + допоміжні речовини - 84,4%.

Вивчено вплив компонентів на жарознижувальну активність МГП (0,6 г/кг та 12, 5 мг/кг) на моделі молочної лихоманки у щурів. Досліди з МГП у дозі 0,6 г/кг та 12,5 мг/кг свідчать про те, що саме КСДХБК забезпечує жарознижувальну дію МГП, а кофеїн, карбамазепін та допоміжні речовини гіпотермічно індиферентні.

Встановлена дія компонентів на протибольову активність МГП (0,6 г/кг та 12,5 мг/кг) на моделі оцтових корчів у щурів. Кожний компонент МГП виявляв протибольовий вплив периферичного характеру, кофеїн потенціював анальгетичний ефект КСДХБК, а карбамазепін - анальгетичну дію і дослідної солі, і кофеїну. Допоміжні речовини не впливали на протибольову активність МГП, що свідчить про їх анальгетичну індиферентність. Так, у дослідах з МГП (0,6 г/кг) на щурах відзначено, що кількість тварин із корчами порівняно з контролем (100%) при введенні КСДХБК становила: 41,3%, КСДХБК + кофеїн - 31,6%; КСДХБК + кофеїн + карбамазепін - 20,9%; КСДХБК + кофеїн + карбамазепін + допоміжні речовини - 21,6%. Аналогічна тенденція потенціювання спостерігалася і в дослідах з МГП (12,5 мг/кг) на щурах: кількість тварин з корчами порівняно з контролем (100%) при введенні КСДХБК дорівнювала - 56,1%; КСДХБК + кофеїн - 39,2%; КСДХБК + кофеїн + карбамазепін - 22,3%; КСДХБК + кофеїн + карбамазепін + допоміжні речовини - 22,3%.

У проведених дослідженнях вивчали вплив допоміжних речових на фармакологічну ефективність діючих компонентів МГП в експерименті на тваринах. Одержані дані свідчать про фармакологічну індиферентність допоміжних речовин, що входять до складу МГП.

З даних літератури відомо: якщо речовина пригнічує нейрональну активність у ТЦК, то їй притаманні потенціальні антицефалгічні властивості і тому її можна рекомендувати до клінічної апробації (Goadsby P.I, Knight, 1997, De Vriss P. et al, 1999). Враховуючи в/в шлях введення, МГП вивчали у трьох дозах - 12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 37,5 мг/кг. Досліджено вплив МГП на фонову та спричинену активність. Результати скринінгових досліджень показали, що всі досліджені дози чинять антимігренозний ефект. Усередині каудального ядра пригнічення активності нейронів ТЦК може реалізовуватися як на пре-, так і на постсинаптичному рівнях. Перше пов?язано з гальмуванням відповідей нейронів на стимуляцію ТМО, а друге - з пригніченням фонової нейрональної активності. Як фонова, так і спричинена активність у сумі являють собою інтегративну характеристику нейронального збудження, загальна оцінка зміни якої під впливом МГП і було першочерговим завданням нашого дослідження. Нейрохімічний механізм дії МГП складається з ефектів його компонентів. Анальбен (КСДХБК) відомий як протибольовий засіб (Левитин Е.Я, Кабачный В.И., Яковлева Л.В., Черных В.П., 1998), який інгібує синтез ПГ (Яковлева Л.В., 1999), що мають проалгетичний вплив, зокрема на сегментарному рівні ЦНС (Соколов А.Ю. и др., 2009, Iakubowski M. Et al, 2005). Антиконвульсант карбамазепін успішно використовується як засіб для профілактики мігрені (Амелин А.В. и др., 2007). Він характеризується складною фармакодинамікою, поєднує блокаду потенціал-залежних натрієвих каналів нервового волокна, глутамат-літичну і ГАМК-міметичну дію (Palmer L. et al, 1973; Van Belle K et al, 1995). Кофеїн - відомий ад?ювант анальгетиків (Chelardini C, 1997; Zhang W.I., Po A. C., 1997, Seymour Diamond M.D. et al, 2000) має протибольову дію за рахунок блокади пуринових рецепторів першого типу (Карелов и др., 2007) і потенціювання холінергічного впливу ендогенної антиноцицептивної системи (Chelardini C, 1997; Shapiro R.E., 2008). Усі ці механізми зумовлюють зменшення функціональної активності нейронів ТЦК і сегментарного гальмування проведення больової інформації у вищерозташовані структури ЦНС. Інтенсивність антимігренозного ефекту МГП має дозозалежний характер (табл. 8).

Таблиця 8.

Зміни нейрональної активності при введенні «Мігрепіну» в різних дозах

ефект доза	Середня частота викликаної активності за весь час досліду,%	Достовірність змін (критерій Манна-Уїтні) у порівнянні з:
		вихід-ними показни-ками	контро-лем	дозой, мг/кг
				12,5	25	37,5
Вихідні значення	100,0
Контроль (n=5)	111,83,2	р=0,01		р=0,001	р=0,0002	р=0,0002
МГП, 12,5 мг/кг (n=4)	90,53,3	р=0,1	р=0,001		р=0,1	р=0,0002
МГП, 25 мг/кг (n=5)	81,13,6	р=0,0002	р=0,0002	р=0,1		р=0,0002
МГП, 37,5 мг/кг (n=7)	39,02,4	р=0,0002	р=0,0002	р=0,0002	р=0,0002
Значи-мість ефекту дози, критерій Крускал-Уолліса	р<0,0001

Примітка:

Зміни нейрональної активності (наведено як середнє значення за весь час експерименту в інтервалі 5-75 хв) і оцінка його достовірності порівняно з контролем, вихідними значеннями і між дозами після введення МГП в дозах 12,5 мг / кг, 25мг/кг і 37,5 мг / кг.

Найкращі показники спостерігалися в дослідах із дозою МГП 37,5 мг/кг (рис. 2).

А)

Б)

Рис. 2 . Вплив Мігрепіну в дозі 37,5 мг/кг на активність нейронів тригеміно-цервікального комплексу, викликану електричним подразненням твердої мозкової оболонки.

Примітки:

1. На (А): * і ** - достовірно при р <0,05 і р <0,01, відповідно, у порівнянні з контролем (тест Манна-Уїтні для непарних вимірювань);

2. На (Б): *, ** та *** - достовірно при р <0,05 и р <0,001, відповідно, у порівнянні з вихідними показниками до введення препарату (тест Вілкоксона для парних вимірів і критерій Фрідмана);

3. На (А) і (Б): по осі абцис - час у хв, 0 хв - вихідні показники; по осі ординат - середня частота розрядів нейронів у відсотках до вихідного значення.

У той же час, у дозі 37,5 мг / кг препарат надавав значне пригнічення викликаної активності, значення якої вже через 5 хв після введення становило 28,1 ± 12,4% від початкового рівня (вірогідно при р <0,001).

За весь час досліду (75 хв) мінімальна ступінь інгібування відповідей була зареєстрована на 50-ої хв, коли значення нейрональної активності було 47,3 ± 9,2% (вірогідно у порівнянні з вихідними показниками при р <0,05).

Це єдина з восьми часова фіксацій, в якій не виявилося значущих у порівнянні з контролем відмінностей; в інтервалах від 5 до 40 хв і від 60 до 75 хв пригнічення відповідей було достовірним (р <0,05).

Це свідчить про можливість застосування МГП як антимігренозного засобу в усіх досліджених дозах, але доза 37,5 мг/кг для щурів дає максимальний антимігренозний ефект. Тому можна рекомендувати МГП для лікування мігрені у дозах 12,5-25 мг/кг, а для уривання гострого нападу - у максимально дослідженій дозі 37,5 мг/кг (для щурів).

Відзначені ефекти МГП обумовлені фармакологічними властивостями його компонентів, а поєднання цих видів дії в одній комбінації забезпечує патогенетичний вплив на основні симптоми патології. Проведене дослідження свідчить про раціональне сполучення компонентів комбінованого лікарського засобу МГП, більшість ефектів яких зберігається, забезпечуючи водночас його основне призначення.

Поєднання в комбінованому препараті кількох компонентів може як оптимізувати його фармакотерапевтичну активність, так і підсилити токсичність, тому ми вивчили гостру і хронічну токсичність МГП. МГП має низьку токсичність: ДЛ50 для мишей становить 2,9 г/кг, для щурів - 6,0 г/кг. За класифікацією К.К. Сидорова МГП можна віднести до малотоксичних речових (IV клас токсичності).

Мікроскопічні дослідження підтвердили, що за одноразового введення МГП відсутні дистрофічні, некробіотичні і запальні зміни внутрішніх органів, зокрема у слизовій оболонці шлунка. До МГП відсутня видова чутливість (КВЧ становить 2,07), що свідчить про можливість екстраполяції одержаних результатів на людину.

Вивчення хронічної токсичності МГП показало, що за тривалого (30 діб) регулярного (щодоби) введення препарату щурам дозою 2 г/кг він не спричинював негативної резорбтивної дії на загальний стан тварин, ЦНС, роботу серця, клітинний склад і формулу крові, функції нирок, печінки. Це підтвердили патоморфологічні дослідження внутрішніх органів. Одержані дані свідчать про можливість безпечного застосування МГП протягом одного місяця.

МГП як за одноразового, так і за тривалого введення різним видам тварин (миші, щури, кролі) не спричинював місцевоподразнювальної дії.

Алергізувальний вплив МГП вивчено на мурчаках: тривала комбінована сенсибілізація МГП протягом 20 днів не змінювала загальний стан тварин і не зумовлювала алергічних реакцій. Відсутність алергізувальної дії МГП підтверджують діагностичні тести in vitro (РСАЛ, РАН). Показник агломерованих лейкоцитів становить 1,82±0,07% проти 1,58±0,08 % у контролі, а показник пошкоджених нейтрофілів - 0,022±0,005 проти 0,018±0,003. Абсолютна кількість еозинофілів у крові після введення дозволяючої дози МГП сягала 567,5±116,8 проти 502,1±27,6 у контролі, тобто статистично вірогідних змін не спостерігалося. МГП за даними кон?юнктивальної проби, проведеної на мурчаках, не впливав на показники специфічної сенсибілізації як негайного, так і сповільненого типів.

Таким чином, одержані в експерименті дані свідчать про значну антиексудативну, жарознижувальну, протибольову, протимігренозну, антиоксидантну, антиагрегатну, протиалергічну активність за низької токсичності МГП.

За допомогою коефіцієнтів видової чутливості нами було перераховано дози компонентів МГП на людину. В результаті кількісний склад майбутньої таблетки «Мігрепін» (0,2 г) має таке значення: 0,025 г (12,5%) - КСДХБК, 0,01 г (5%) - кофеїн, 0,1 (50%) - карбамазепін, 0,065 г (32,5%) - допоміжні речовини. Допоміжні речовини обрано на підставі загальноіснуючих технологічних правил. Склад допоміжних речовин МГП: лактоза 0,04 г, картопляний крохмаль 0,021 г, натрію кроскармелоза 0,002 г, кальцію стеарат 0,002 г.

ВИСНОВКИ

У дисертації зроблено теоретичне узагальнення і запропоновано новий підхід до розв?язання наукової проблеми створення комбінованих протизапальних засобів на основі композицій відомих лікарських засобів. З урахуванням квантово-хімічних, квантово-фармакологічних та експериментальних підходів розроблено новий вітчизняний комбінований протизапальний лікарський засіб «Мігрепін», який містить діючі (калієву сіль 2,4 - дихлорбензойної кислоти, кофеїн, карбамазепін) речовини і допоміжні компоненти (картопляний крохмаль, кальцію стеарат, лактозу, натрію кроскармелозу).

1. За результатами аналізу літератури обгрунтовано сумісність калієвої солі 2,4 - дихлорбензойної кислоти, кофеїну та карбамазепіну за фармакодинамічними і фармакокінетичними властивостями, що стало підставою для створення нового вітчизняного комбінованого протизапального лікарського засобу «Мігрепін».

2. Калієва сіль 2,4 - дихлорбензойної кислоти за даними комп?ютерного моделювання має протизапальну, протибольову, жарознижувальну дію, що стало підставою до використання цієї речовини як діючої основи нової лікарської комбінації.

3. Кофеїн, карбамазепін і 2,4-дихлорбензойна кислота за даними квантово-хімічних та квантово-фармакологічних досліджень є м'якими реагентами, які взаємодіють з речовинами лужного характеру або з альбуміном. Центрами протонування досліджених сполук є: для кофеїну - атоми оксигену та атом нітрогену N12; для карбамазепіну - атоми оксигену та нітрогену карбамоїльної групи, для 2,4-дихлорбензойної кислоти - атом оксигену карбоксильної групи. Між собою сполуки не взаємодіють, комплекси не утворюють, взаємного впливу на біодоступність один одного не виявляють.

4. У скринінгових дослідженнях встановлено оптимальну протизапальну, анальгетичну, жарознижувальну, антиоксидантну, антиагрегантну, антиалергічну дозу «Мігрепіну»; вона становить 12,5 мг/кг для щурів.

5. Механізм антиексудативної дії «Мігрепіну» (12,5 мг/кг - щурам) комбінований: антициклооксигеназний і антиліпоксигеназний, про що свідчить зменьшення синтезу лейкотриєнів В4 та активності циклооксигенази-2 у сироватці крові, слизовій оболонці шлунку, тканинах головного мозку.

6. «Мігрепін» (5 мг/кг, 12,5 мг/кг, 20 мг/кг - щурам; 17,65 мг/кг - мишам) виявляє протибольову центральну і периферичну дії на рівні референс-препаратів (діазепаму та диклофенак-натрію).

7. Обгрунтовано в експерименті доцільність застосування «Мігрепіну» при запальних процесах, больових синдромах, гіпертермії.

8. Діючі компоненти «Мігрепіну» забезпечують фармакологічний ефект препарату: антиексудативну і жарознижувальну дію - калієва сіль 2,4 - дихлорбензойної кислоти; анальгетичну - кожен діючий компонент при взаємному потенціюванні. Допоміжні речовини фармакологічно індиферентні.

9. Встановлено прямий дозозалежний антимігренозний ефект «Мігрепіну» у дозах 12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 37,5 мг/кг на моделі краніо-васкулярного головного болю з максимумом у дозі 37,5 мг/кг.

10. «Мігрепін» належить до малотоксичних речовин (IV клас токсичності за класифікацією К.К. Сидорова). ДЛ50 для мишей - 2,9 г/кг, для щурів - 6 г/кг. При вивченні хронічної токсичності «Мігрепін» не впливає негативно на загальний стан щурів, функцію ЦНС, роботу серця, клітинний склад, формулу крові, функції нирок і печінки. Патоморфологічні дослідження при вивченні гострої і хронічної токсичності підтверджують нешкідливість препарату. «Мігрепін» не чинить місцевоподразнювальну та алергізувальну дії.

11. На основі аналіза проведених досліджень встановлено, що новий комбінований препарат «Мігрепін» має виразну протизапальну, протибольову, жарознижувальну та антимігренозну дії і перспективний для подальшого дослідження та впровадження в медичну практику.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вивчення гострої токсичності комбінації похідного 2,4-дихлорбензойної кислоти з карбамазепіном і кофеїном / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, С. І. Миронченко, Н. І. Горголь, І. В. Трутаєв // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 1. - С. 59-62; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

2. Вивчення хронічної токсичності комбінації 2,4-дихлорбензойної кислоти, кофеїну та карбамазепіну / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, І. В. Трутаєв, С. І. Миронченко, Т. В. Горбач, Н. І. Горголь // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 83-86; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

3. Патоморфологічне підтвердження нешкідливості нової комбінації карбамазепіну, калієвої солі 2,4-дихлорбензойної кислоти і кофеїну / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, С. І. Миронченко, Н. І. Горголь, І. В. Трутаєв // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 4. - С. 123-126; (особисто здобувачем сплановано проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

4. Вивчення специфічної активності нової комбінації похідного 2,4-дихлорбензойної кислоти, кофеїну та карбамазепіну в експерименті / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, І. В. Трутаєв, С. І. Миронченко // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2008. - № 1. - С. 102-105; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

5. Квантово-фармакологічне обгрунтування потенціювальних протибольових властивостей кофеїну / Г. О. Сирова, Т. В. Звягінцева, І. С. Чекман, Т. Ю. Небесна // Фармац. журн. - 2008. - № 6. - С. 85-91; (особисто здобувач приймав участь в експерименті, написано статтю).

6. Дослідження квантово-фармакологічних властивостей молекули карбамазепіну / Г. О. Сирова, Т. Ю. Небесна, Т. В. Звягінцева, І. С. Чекман // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2008. - №5-6. - С. 25-29; (особисто здобувач приймав участь в експерименті, написано статтю).

7. Кофеїн: Фізіологічні, біохімічні та квантово-фармакологічні властивості / І. Чекман, Н. Горчакова, Т. Звягінцева, Г. Сирова, Н. Небесна // Вісник фармакології та фармації. - 2009. - № 6. - С. 2-7; (особисто здобувач провів аналіз і узагальнення літературних даних, написано статтю).

8. Сирова Г. О. Експериментальне вивчення антиоксидантної дозозалежної ефективності нового комбінованого препарату з групи нестероїдних протизапальних лікарських засобів / Г. О. Сирова // Український біофармацевтичний журнал. - 2009. - Т. 1, № 2. - С. 30-33.

9. Сирова Г. О. Вивчення дозозалежних жарознижуючих властивостей нового лікарського засобу / Г. О. Сирова // Український біофармацевтичний журнал. - 2009. - Т. 1, № 3. - С. 8-11.

10. Сирова Г. О. Експериментальне вивчення протибольових властивостей нового препарату «Мігрепін» / Г. О. Сирова // Клінічна фармація. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 58-61.

11. Сирова Г. О. Експериментальне вивчення протизапальної дії препарату «Мігрепін» / Г. О. Сирова // Український біофармацевтичний журнал. - 2009. - № 4(4). - С. 35-38.

12. Звягінцева Т. В. Експериментальне вивчення специфічної дії Мігрепіну / Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова, Т. І. Єрмоленко // Фармаком. - 2009. - № 4. - С. 73-77; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

13. Сирова Г. О. Експериментальне обгрунтування дозозалежної антиексудативної дії нового нестероїдного протизапального лікарського засобу / Г. О. Сирова // Клінічна фармація. - 2010. - Т. 14, № 1. - С. 52-54.

14. Сирова Г. О. Вплив мігрепіну в різних дозах на периферичний компонент ноцицептивної реакції / Г. О. Сирова // Медична хімія. - 2010. - Т. 12, № 1. - С. 16- 18.

15. Сирова Г. О. Вивчення в експерименті протибольової та протисудомної дії нової комбінації, що містить карбамазепін / Г. О. Сирова // Медична хімія. - 2009. - Т. 11, № 2. - С. 119-122.

16. Вплив комбінації кофеїну, карбамазепіну та калієвої солі 2,4-дихлорбензойної кислоти на функціональний стан ЦНС у хронічному досліді / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, С. І. Миронченко, І. В. Трутаєв // Фармац. журн. - 2009. - № 5. - С. 101-104; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

17. Експериментальне підтвердження фармакологічної індиферентності допоміжних компонентів «Мігрепіну» / Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова, Т. І. Єрмоленко, І. В. Трутаєв, В. В. Лапшин, Е. П. Бойко // Запорожский мед. журн. - 2010. - Т. 12, № 1. - С. 63-65; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

18. Прогнозування фармакологічної активності калієвої солі 2,4- дихлорбензойної кислоти / Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова, І. С. Чекман, Т. Ю. Небесна // Фармац. журн. - 2010. - № 1. - С. 75-79; (особисто здобувач приймав участь в експерименті, написано статтю).

19. Сирова Г. О. Експериментальне підтвердження прогнозованої фармакологічної активності калієвої солі 2,4-дихлорбензойної кислоти / Г. О. Сирова // Фармаком. - 2010. - № 1. - С. 115-118.

20. Антиліпоксигеназний компонент у механізмі протизапальної дії мігрепіну / Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова, Л. П. Абрамова, Т. І. Єрмоленко // Медична хімія. - 2010. - Т 12, №2. - С. 114-117; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

21. Антициклооксигеназний компонент у механізмі протизапальної дії «Мігрепіну» / Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова, Л. П. Абрамова, Т. І. Єрмоленко // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2010. - № 3(16). - С. 31-36; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

22. Влияние Мигрепина на активность нейронов каудального ядра тройничного нерва/ А.Ю. Соколов, О.А. Любашина, Ю.Д. Игнатов, С.С. Пантелеев, А.О. Сыровая, Т.В. Звягинцева//Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, №5. - С. 13-16; (особисто здобувачем сплановано алгоритм проведення досліджень, здійснено експеримент, проаналізовано результати, зроблено висновки, написано статтю).

23. Патент на корисну модель №29769 Україна, МПК А61К 31/00 Застосування мігрепіну як речовини з протизапальними та жарознижуючими властивостями / Звягінцева Т. В., Сирова Г. О., Киричок Л. Т., Трутаєв І. В., Миронченко С. І. - № 11038; заявл. 05.10.07; опубл. 25.01.08, Бюл. № 2. (Особистий внесок здобувача: участь у проведенні досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів).

24. Патент на корисну модель №29770 Україна, МПК А61К 31/00 Застосування мігрепіну як речовини з протибольовими властивостями / Киричок Л. Т., Сирова Г. О., Звягінцева Т. В., Трутаєв І. В., Миронченко С. І. - № 11045; заявл. 25.01.08; опубл. 05.10.07, Бюл. № 2. (Особистий внесок здобувача: участь у проведенні досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів).

25. Патент на корисну модель №37105 Україна, МПК А61К31/100). Спосіб визначення фармакологічної активності калієвої солі 2,4-дихлорбензойної кислоти / Небесна Т. Ю., Сирова Г. О., Звягінцева Т. В., Чекман І. С., Сирова Г. О., Звягінцева Т. В., Чекман І. С., Небесна Т. Ю. - № 11199; заявл. 16.09.08.; опубл. 10.11.08, Бюл. № 21. (Особистий внесок здобувача: участь у проведенні досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів).

26. Вивчення протиалергічної дії нового комбінованого засобу, що містить похідне 2,4-дихлорбензойної кислоти, карбамазепін і кофеїн / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, С. І. Миронченко, І. В. Трутаєв // Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини : матеріали міжнар. наук.-практ. конф. студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів, присвяч. Дню науки України. - Суми, 2007. - ч.2. - С. 28.

27. Доклиническое изучение специфической активности комбинации производного 2,4-дихлорбензойной кислоты, карбамазепина и кофеина / Т. В. Звягинцева, Л. Т. Киричек, А. О. Сыровая, И. В. Трутаев, С. И. Миронченко / Фармакология - практическому здравоохранению : материалы III съезда фармакологов России. - СПб., 2007. - Т.7, ч.1. - С. 1703.

28. Изучение в эксперименте антиоксидантного действия новой комбинации / А. О. Сыровая, Т. В. Звягинцева, Л. Т. Киричек, С. И. Миронченко, Т. В. Горбач, И. В. Трутаев // Сьогодення та майбутнє фармації : тез. доп. всеукр. конгр., м. Харків, 16-19 квіт. 2008 р.- Х., 2008.- С.428.

29. Изучение антиагрегантного действия комбинации, содержащей кофеин, карбамазепин и калиевую соль 2,4-дихлорбензойной кислоты в эксперименте / Т. В. Звягинцева, А. О. Сыровая, С. И. Миронченко, И. В. Трутаев // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2008. - 12. - С. 253.

30. Сирова Г. О. Вивчення потенціюючих протибольових властивостей кофеїну в експерименті / Г. О. Сирова, Т. В. Звягінцева // ХІІ Конгрес Світової федерації українських лікарських товариств. - Івано-Франківськ, 2008. - С. 454.

31. Изучение аллергизирующего действия комбинации производного 2,4-дихлорбензойной кислоты, карбамазепина и кофеина / Т. В. Звягинцева, Л. Т. Киричек, А. О. Сыровая, С. И. Миронченко, И. В. Трутаев // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2007. - 11(2/2). - С. 766-767.

32. Вивчення хронічної токсичності нової комбінації 2,4-дихлорбензойної кислоти, кофеїна та карбамазепіна / Т. В. Звягінцева, Л. Т. Киричок, Г. О. Сирова, С. І. Миронченко, І. В. Трутаєв, Н. І. Горголь // Человек и лекарство - Украина : І нац. конгр. - К., 2008. - С. 160.

33. Конъюнктивальная проба - показательный тест аллергической безопасности новых лекарственных средств / Т. В. Звягинцева, Л. Т. Киричек, А. О. Сыровая, С. И. Миронченко, И. В. Халин // Сучасні аспекти клініки, діагностики та лікування очних хвороб : матеріали Міжнар. наук. конф., присвяч. 100-річчю з дня народж. акад. Н. О. Пучківської. - Одеса, 2008. - С. 346-347.

34. Сирова Г. О. Експериментальне вивчення антиліпоксигеназного компоненту у механізмі антиексудативної дії нового протизапального засобу / Г. О. Сирова // Людина та ліки : ІІІ Нац. конгр. - К., 2010. - С. 41.

35. Квантово-хімічне дослідження кофеїну / І. С. Чекман, Т. Ю. Небесна, Т. В. Звягінцева, Г. О. Сирова // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии : материалы VI Междунар. науч.-технич. конф. - Севастополь, 2010. - Т. 1. - С. 174-176.

36. Boiko I. Experimental confirmation of the caffeine's potentiation of the analgetic properties / I. Boiko, G. Syrova, T. Ermolenko // 3th International Scientific interdisciplinary Congress of medical students and young doctors14-16 April, 2010. - Kharkiv, 2010. - P. 14.

37. Сирова Г. О. Патоморфологічне підтвердження нешкідливості нової лікарської композиції / Г. О. Сирова // Актуальні проблеми сучасної патоморфології : матеріали наук.-практ. конф. патологоанатомів України. -Харків-Одеса, 2010. - С. 94-95.

38. Влияние мигрепина на функциональную активность нейронов тригемино-цервикального комплекса. / А. Ю. Соколов, О. А. Любашина, С. С. Пантелеев, Ю. Д. Игнатов, А. О. Сыровая, Т. В. Звягинцева // Экспериментальная и клиническая фармакология. Прил.: Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средством. - 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам: материалы конференции - Москва, 2010. - С. 81.