Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Поиск генетических и экспрессионных маркеров риска развития болезни Паркинсона в российской популяции

03.01.03 - Молекулярная биология

Филатова Елена Владиславовна

МОСКВА - 2011

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (зав. отделом доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская).

Научный руководитель: кандидат биологических наук Мария Игоревна Шадрина ИМГ РАН

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков ФГУП «ГосНИИ генетика»

доктор биол. наук, профессор Александр Васильевич Карпухин Медико-генетический научный центр РАМН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится « » 2011 г. в 14 часов

на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд д.1. Тел: (495)315-3747.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стремительный прогресс в области технологий и накопление большого объема данных о строении и работе как отдельной клетки, так и всего организма в целом в последние десятилетия привели к активному развитию новых дисциплин в области молекулярной генетики, таких как геномика и протеомика. Одним из важнейших направлений геномики является медицинская геномика, которая занимается определением генных дефектов при наследственных и других болезнях, изучением экспрессии мутантных генов и разработкой новых методов диагностики, лечения и профилактики. Особый интерес в этом направлении представляет изучение молекулярно-генетических основ нейродегенеративных заболеваний. Это связано с тем, что изучение этой группы болезней позволяет выявить и охарактеризовать новые экспрессирующиеся в нервной системе гены, что существенно расширит генетическую базу, закладывающую основы изучения молекулярных принципов функционирования нервной системы.

К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции. Отличительной особенностью болезни Паркинсона является то, что характерные для заболевания клинические признаки проявляются при гибели приблизительно 60% дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции и 80%-ном снижения уровня дофамина в полосатом теле.

С генетической точки зрения БП является гетерогенным заболеванием. В 10-15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер и обусловлено сложным взаимодействием между генетическим строением организма и факторами окружающей среды. Активное изучение молекулярных основ развития моногенных форм БП позволил идентифицировать семь генов (PARK2, SNCA, PINK1, PARK7, LRRK2, UCHL1, ATP13A2), вовлеченных в их патогенез. Это позволило расширить представления об этиопатогенезе заболевания и начать более целенаправленную работу по изучению генетических факторов более частой спорадической формы БП. Так в настоящее время показано, что мутации в гене PARK2 вносят существенный вклад в развитие спорадической формы этого заболевания особенно с ранним началом его развития. Полученные данные говорят о необходимости продолжения такого рода работ и изучения мутаций и полиморфизмов генов моногенных форм заболевания у больных со спорадической формой болезни Паркинсона. Кроме того, выявлен ряд потенциальных кандидатных генов (SLC6A3, MAPT, ST13, GSK3B, GBA и др.), которые могут быть вовлечены вовлеченных в патогенез БП и влиять на риск его развития. наследственный нейродегенеративный паркинсон

Однако вклад этих генов, а также мутаций и полиморфизмов в них в патогенез спорадической формы БП изучен не до конца. В последнее годы также начаты работы по изучению транскриптома при БП в post mortem тканях мозга на поздних стадиях заболевания. Однако для выявления всех патогенетических процессов, протекающих при БП необходимо изучать изменения экспрессии генов-кандидатов на разных стадиях заболевания и в первую очередь на самых ранних (доклинических).

Основная проблема при проведении таких исследований - недоступность тканей головного мозга человека на ранних стадиях заболевания. В то же время оценку относительных уровней мРНК исследуемых генов можно проводить в периферической крови, самой доступной ткани человека.

Проведение работ по анализу полиморфизмов и мутаций генов, вовлечённых в патогенез БП, а также изменения экспрессии генов-кандидатов позволит с одной стороны лучше понять причины и механизмы развития этого заболевания, а с другой стороны разработать молекулярно-генетические тесты для определения риска развития БП и её ранней диагностики. Возможность проведения доклинической диагностики этого заболевания позволит начать разработку принципов и подходов профилактического лечения в тот момент, когда дегенерация дофаминэргических нейронов находится на ранней стадии и затронула лишь ограниченное число нейронов этого типа. Осуществление этой работы позволит разработать в дальнейшем новые методы терапии, которые могли бы замедлить (если не остановить) развитие патологических процессов в нервной ткани и тем самым сдвинуть возраст клинического дебюта заболевания на более поздний срок и снизить его клиническую тяжесть.

Целью настоящей работы являлись поиск и анализ генетических и экспрессионных маркеров риска развития болезни Паркинсона в российской популяции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Анализ точковых мутаций в генах, вовлечённых в патогенез БП, у пациентов с семейной и спорадической формами БП с ранним и поздним началом развития заболевания из России.

2. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах, вовлечённых в патогенез БП, у пациентов с семейной и спорадической формами БП с ранним и поздним началом развития заболевания из России.

3. Анализ относительных уровней мРНК генов GSK3B, SLC6A3, MAPT, PARK2, SNCA, ST13 в периферической крови пациентов с БП из России, находящихся на ранних стадиях заболевания, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, и в группах сравнения.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые при анализе 68 известных точковых мутаций в генах моногенных форм БП было выявлено только три известных точковых мутаций (M1L, A82G и C253Y) в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической формой БП с ранним началом развития, что свидетельствует о малом вкладе известных мутаций в патогенез спорадической формы БП в России.

Впервые была показана ассоциация полиморфизма rs2736990 (C/T) в гене SNCA с риском развития спорадической формы болезни Паркинсона в российской популяции. Показано, что носительство аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA повышает риск развития болезни Паркинсона в 1,70 раза.

Впервые в России был проведён анализ относительных уровней экспрессии генов GSK3B, SLC6A3, MAPT, PARK2, SNCA, ST13, вовлечённых в патогенез БП, в периферической крови у пациентов, находящихся на ранних стадиях развития БП. Было показано, что уровень мРНК генов SLC6A3, MAPT, PARK2 крайне низок - это усложняет их использование для анализа транскриптома при БП в периферической крови. Обнаружено, что уровни мРНК генов GSK3B и ST13 в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях не отличаются от таковых у здоровых добровольцев. Впервые было выявлено значительное увеличение уровня мРНК гена SNCA в периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях заболевания более чем в 5 раз, у больных церебральным атеросклерозом более чем в 2 раза и у пациентов с различными неврологическими заболеваниями в 3 раза.

Установлено, что полиморфизм rs2736990 в гене SNCA ассоциирован с риском развития болезни Паркинсона и в дальнейшем может быть включён в панель маркеров для определения индивидуального риска развития БП. В будущем, результаты данного исследования могут быть использованы для создания единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП. Установлен разный спектр направлений изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 у пациентов с БП и в группах сравнения. В дальнейшем эти гены могут быть включены в панель экспрессионных маркеров для диагностики БП и в первую очередь на ранних её стадиях.

Показано, что при изучении транскриптома при БП в периферической крови необходимо использовать в качестве групп сравнения больных с другими неврологическими заболеваниями и в первую очередь с церебральным атеросклерозом.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи и 3 материала симпозиумов и конференций.

Апробация диссертации. Результаты, полученные в данной работе, были представлены на Втором всемирном конгрессе по болезни Паркинсона (The Second World Parkinson Congress, Глазго, Шотландия), 2010 г., VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону), 2010 г., XII научной конференции молодых учёных по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва), 2008 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 21 марта 2011 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 21 марта 2011 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 288-х источников, среди которых 6 источников отечественной и 282 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 155 страницах машинописного текста, содержат 10 таблиц и 8 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В настоящей работе исследовали четыре группы пациентов с БП:

1) 346 пациентов со спорадической формой БП с ранним и поздним началом развития заболевания,

2) 21 пациент с ювенильной формой БП из семей с аутосомно-доминантным типом наследования,

3) 13 пациентов с недавно поставленным диагнозом БП и ещё не подвергавшихся лечению (1-2 стадия БП по шкале Хен и Яра),

4) 29 пациентов с недавно поставленным диагнозом БП, подвергавшихся лечению, (1-2 стадия БП по шкале Хен и Яра).

В качестве групп сравнения в настоящей работе исследовали следующих пациентов и здоровых добровольцев:

1) 18 больных с разными неврологическими заболеваниями (болезнь Вильсона-Коновалова, эссенциальный тремор, мозжечковая атаксия),

2) 59 пациентов с церебральным атеросклерозом,

3) в качестве контроля для анализа ТМ и ОНП была сформирована популяционная выборка в количестве 224 человек, для которых отбирались лица русского происхождения из Архангельской, Тверской и Ивановской областей,

4) в качестве контроля для анализа экспрессии генов были отобраны 56 неврологически здоровых добровольцев.

В группы пациентов с различными неврологическими патологиями и группы контроля отбирались лица обоих полов русского происхождения в возрасте от 30 до 70 лет. Все пациенты и неврологически здоровые добровольцы были отобраны в Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук, г. Москва.

Все пациенты с БП для постановки диагноза были исследованы по международной унифицированной оценочной шкале болезни Паркинсона (Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS) и шкале Хен и Яра (Hoehn and Yahr scores) в Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук, г. Москва.

Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц. Для анализа брали периферическую кровь, из которой геномную ДНК выделяли стандартным методом, а тотальную РНК - с помощью набора ZR Whole-Blood Total RNA Kit™ «Zymo Research Corp.» (Orange, USA).

Анализ точковых мутаций и ОНП в генах, вовлечённых в патогенез БП, у пациентов с семейной и спорадической формами БП с ранним и поздним началом развития заболевания из России проводили с помощью микрочиповой технологии удлинения праймера APEX (Arrayed primer extension), полимеразной цепной реакции в реальном времени и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. В работе использовали ДНК-чипы Genorama microarray slides (Sal-01, 30211) производства фирмы «Asper Biotech Ltd.» (Tartu, Estonia), а также реактивы фирм «Fermentas» (Vilnius, Lithuania), «BioAtlas» (Tartu, Estonia), «Genomed GmbH» (Lцhne, Germany), «Invitrogen» (Carlsbad, USA), «Синтол» (Москва, Россия). Праймеры, зонды и рестрикционную эндодезоксирибонуклеазу подбирали с помощью программ Vector NTI Advance 10.0.1 «Invitrogen» (Carlsbad, USA), Beacon designer 7.0 «Premier Biosoft International» (Palo Alto, USA) и нуклеотидных последовательностей генов LRRK2, SNCA, PARK2, WNT3 (ссылки на последовательности в базе данных NCBI (Reference Sequence): NT_029419.12, NT_016354.19, NT_007422.13, NT_010783.15). Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 1.

Таблица 1. нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для анализа ОНП в генах LRRK2, SNCA, PARK2, WNT3. FAM, ROX - флуоресцентные красители, RTQ-1, RTQ-2 - тушители флуоресценции.

Ген, ОНП	Нуклеотидные последовательности
LRRK2, rs7966550	Lrs79-f 5'-CCTATTAAAATTTCATGGTTCCTTCC Lrs79-r 5'-CATTAGGTAAATATATATGAAGATTATGTAAGATG
SNCA, rs2736990,	273-SN-f 5'-GATAATGGCTTACAAGTTAATCTCCTC 273-SN-r 5'-GACTAGCAGATGATGAGCAGGC 273SN-C-probe 5'-FAM-TGTTACACACATATACACCTTCTTCCTAAACAGC-RTQ-1 273SN_T_probe 5'_ROX_TGTTACACACATATACATCTTCTTCCTAAACAGC_RTQ_2
PARK2, rs1801582	P-V380L-f 5'-GGGAATGTAAAGAAGCGTACC P-V380L-r 5'-TGCTTGGAGGAATGAGTAGG V380L-C-probe 5'-ROX-AGTGCAGTGCCCTATTTGAAGCCTC-RTQ-2 V380L-G-probe 5'-FAM-AGTGCAGTGCCGTATTTGAAGCCTC-RTQ-1
WNT3, rs415430	MAPT-snp-f 5'-AGGAAGAGGGAATTAGACTAGACC MAPT-snp-r 5'-AAGGAGGGATGGTGCTTGC MWsnpT-probe 5'-FAM-CAGCCTTCAACTTTGCACCTAGAGCCC-RTQ-1 MWsnpC-probe 5'-ROX-CAGCCTTCAACTTСGCACCTAGAGCCC-RTQ-2

Для анализа полученных изображений после APEX-реакции использовали пакет программ GENORAMA Genotyping Software: Genorama BaseCaller и Genorama PicDB «Asper Biotech» (Tartu, Estonia).

Анализ относительной экспрессии генов SLC6A3, GSK3B, MAPT, PARK2, SNCA, ST13 проводили с помощью реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени. В работе использовали набор RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase kit «Fermentas» (Vilnius, Lithuania) и реактивы фирмы «Синтол» (Москва, Россия). Праймеры и зонды подбирали с помощью программы Beacon designer 7.0 «Premier Biosoft International» (Palo Alto, USA) и нуклеотидных последовательностей генов SLC6A3, GSK3B, MAPT, PARK2, SNCA (инвентарные номера в базе данных GenBank (Accession numbers): NM_001044.2, NM_002093.2, NM_001123066.2, NM_004562.1, NM_000345.2), кроме гена ST13 - последовательности праймеров и зонда были опубликованы ранее (Dong и др., 2005). В качестве внутренних генов сравнения мы использовали гены POLR2F и PSMB6 (инвентарные номера в базе данных GenBank (Accession numbers): NM_021974.3, NM_002798.1). Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 2.

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для анализа относительной экспрессии генов SLC6A3, GSK3B, MAPT, PARK2, SNCA, ST13.

Ген	Нуклеотидные последовательности
SLC6A3	DAT-probe 5'-ROX-AGCAGCACGATGACCAGCACC-RTQ-2 DAT-for 5'-TTTTGGGACCACACCTGCTG DAT-rev 5'- GTCTTCACGCCCTTCCAGAG
GSK3B	GSK3b-probe 5'-ROX-CCGGAAACAGTATACAGAGTTGCCAGACAC-RTQ-2 GSK3b-f 5'-GTCTATCTTAATCTGGTGCTGGAC GSK3b-r 5'-AGCTGATACATATACAACTTGACATAAATC
MAPT	MAPT-probe 5'-ROX-CCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCC-RTQ2 MAPT-f 5'-TCTACAAACCAGTTGACCTGAGC MAPT-r 5'-CCAGGGACGTGGGTGATATTG
PARK2	PARK2-probe 5'-ROX-TTCACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTG-RTQ2 PARK2-For 5'-CTGTGTGACAAGACTCAATGATCG PARK2-Rev 5'-CCGGTTGTACTGCTCTTCTCC
POLR2F	PolR2F_probe 5'_FAM_CTTCATCCTCCTCCACATCATCAAAGTCGTCG-RTQ-1 PolR2F-f 5'-ATGTCAGACAACGAGGACAATTTTG PolR2F-r 5'-TCTTCGGCATTCTCCAAGTCATC
PSMB6	PSMB6-probe 5'-FAM-AGCCGAGAAGTTTCCACTGGGACCACTATC-RTQ-1 PSMB6-f 5'-CGGAGGCGTTCACTCCAG PSMB6-r 5'-TCGATTGGCGATGTAGGACC
SNCA	NACPprobe 5'-ROX-TGTTCTCTATGTAGGCTCCAA-RTQ2 NACP-f 5'-AGCAGGAAAGACAAAAGAGG NACP-r 5'-TTGCTCTTTGGTCTTCTCAG
ST13	ST13probe 5'-ROX-CCAAGAGGGCCAGTGTCTTCGTCAAA-RTQ2 ST13-f 5'-CCTCGCTTGGCCATTTTGT ST13-r 5'-TGGCAGCATTTGGCTTCTG

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 8.0” (StatSoft, Inc. (2007). STATISTICA (data analysis software system), version 8.0. www.statsoft.com) и программного обеспечения MS Excel 2007 (Microsoft). Для расчета относительных шансов применяли программное обеспечение GraphPad InStat v3.06 (GraphPad Software, Inc.).

Для расчёта соответствия распределения генотипов в популяционной выборке закону Харди-Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml).

Для оценки относительных уровней экспрессии генов использовали метод сравнения пороговых уровней амплификации. Данные анализировали с применением непараметрических тестов (U-тест Манна-Уитни, тест Колмогорова-Смирнова).

Результаты исследования

Анализ точковых мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах при болезни Паркинсона

ДНК-чиповые технологии являются весьма перспективным подходом для поиска и определения генетических маркеров риска развития самых разнообразных заболеваний, в том числе и БП.

Основная задача, которую ставят перед собой учёные в таких исследованиях, как полногеномный анализ ассоциаций или более детальный анализ генов, основанных на ДНК-чиповых технологиях, заключается в поиске генетических маркеров, которые бы показали чёткую связь маркера и развития спорадической формы БП.

Это позволило бы быстро, надёжно и с малыми затратами выявлять лиц с предрасположенностью к БП из всей популяции. В рамках поиска и анализа генетических маркеров БП мы также решили изучить распределение частот генотипов некоторых ТМ и ОНП в генах, так или иначе вовлечённых в патогенез БП.

Анализ ТМ и ОНП в настоящей работе проводили с помощью, так называемой, реакции удлинения праймера, Arrayed Primer Extension - APEX.

При создании этого чипа были выбраны наиболее часто (более чем в двух семьях) встречающиеся ТМ в генах моногенных форм БП и целый ряд ОНП, расположенных в генах, вовлечённых в патогенез данного заболевания.

Таким образом, мы проанализировали 68 точковых мутаций и 31 ОНП в генах PARK2, PARK7, LRRK2, PINK1, STH/Tau haplotype, MAPT, UCHL1, NR4A2 (NURR1), PSEN1, SNCB, WFS1, POMC. Необходимо отметить, что большинство ТМ и ОНП, представленных на чипе, располагается в генах PARK2 и LRRK2, что составляет соответственно более 58% и 19% от всех ТМ и ОНП на чипе.

Данная часть работы проводилась на двух выборках пациентов с БП с ранним началом развития, поскольку считается, что именно у этой группы пациентов генетический фактор в развитии заболевания выражен сильнее. Именно поэтому в первую выборку вошёл 21 пациент с ювенильной формой БП, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу.

Выбор именно этих пациентов для анализа ТМ и ОНП объясняется большой представленностью на чипе ТМ в гене PARK2, которые приводят к развитию семейных форм БП с ранним началом развития и быстрым прогрессированием.

Во вторую выборку вошёл 41 пациент со спорадической формой БП также с ранним началом развития, поскольку считают, что к данной форме БП могут приводить мутации в гене PARK2.

Из 68 изученных нами ТМ мы обнаружили только три различных ТМ в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической БП с ранним началом развития.

Ранее было показано, что эти три ТМ (M1L, A82G и C253Y) в гене PARK2 приводят в гомозиготном состоянии к развитию БП с наследованием по аутосомно-рецессивному типу. Частоты генотипов по выявленным нами ТМ представлены в таблице 3. Частота встречаемости ТМ в гене PARK2 у пациентов с БП из российской популяции составила 0,05.

Таблица 3. Частоты генотипов выявленных точковых мутаций.

Ген, ТМ	Впервые обнаружена	Пациенты со спорадической формой БП
PARK2
M1L (AA/AT/TT)	(Rawal и др., 2003)	0,976/0,024/0
A82G (CC/CA/AA)	(Hedrich и др., 2001)	0,976/0,024/0
C253T (GG/GA/AA)	(Oliveira и др., 2003)	0,976/0,024/0

Согласно литературным данным, различные ТМ в гене PARK2 в разных популяциях (Польша, Италия, Турция, Бразилия, Куба, Северо-Западная Индия, Северная Америка, Австралия) приводят к развитию БП с ранним началом развития реже, чем делеции и дупликации экзонов в этом гене. К тому же, авторы подчёркивают, что существует большое разнообразие ТМ в гене PARK2, каждая из которых сама по себе встречается довольно редко (Abbas и др., 1999, Bertoli-Avella и др., 2005, Koziorowski и др., 2010, Sun и др., 2006, Vinish и др., 2010). Таким образом, можно предположить, что для российской популяции также характерна крайне высокая микрогетерогенность исследованных нами ТМ.

Нам также удалось выявить 12 ОНП (из 31 представленного на чипе) в генах PARK2, NR4A2, LRRK2 и PARK7. Частоты генотипов выявленных ОНП отражены в таблице 4. Для оценки возможного вклада выявленных нами ОНП в развитие БП мы провели сравнительный анализ распределения генотипов по этим ОНП в центральной европейской популяции (данные по популяции CEU, central Europe, из проекта по картированию гаплотипов HapMap) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) с полученными нами результатами, что также отражено в таблице 4. Как видно из таблицы 4, частоты как аллелей, так и генотипов большинства выявленных нами ОНП для российских пациентов почти равны или совпадают с таковыми в центральной Европе (CEU).

Таблица 4. Частоты генотипов и аллелей выявленных ОНП.

Ген, ОНП	Европейская популяция (численность)	Пациенты с ювенильной формой БП	Пациенты со спорадической формой БП
PARK2
S167N (rs1801474) (GG/GA/AA)	0,967/0,033/0 (120)	0,952/0,048/0	0,951/0,049/0
V380L (rs1801582) (CC/CG/GG)	0,683/0,300/0,017 (90)	0,81/0,19/0	0,927/0,073/0
D394N (rs1801334) (CC/CT/TT)	0,883/0,117/0 (90)	1/0/0	0,902/0,098/0
NR4A2 (NURR1)
N16PinsG (AA/AG/GG)	Нет данных	0,524/0,476/0	0,634/0,366/0
LRRK2
N551K (rs7308720) (CC/CG/GG)	0,883/0,117/0 (174)	0,952/0,048/0	0,927/0,073/0
P1542S (rs33958906) (CC/CT/TT)	Нет данных	0,762/0,238/0	0,805/0,195/0
L153L (rs10878245) (CC/CT/TT)	0,367/0,467/0,167 (174)	0,667/0,333/0	0,366/0,341/0,293
I723V (rs10878307) (AA/AG/GG)	0,833/0,150/0,017 (174)	1/0/0	0,927/0,073/0
rs7966550 (TT/TC/CC)	0,750/0,200/0,050 (174)	0,952/0,048/0	0,951/0,049/0
R1514Q (rs35507033) (GG/GA/AA)	С = 0,980; Т = 0,020 (24)	С = 0; Т = 0	С = 0,976; Т = 0,024
S461S (rs35847451) (TT/TC/CC)	Нет данных	0,952/0,048/0	0,976/0,024/0
PARK7 (DJ-1)
R98Q (rs71653619) (GG/GA/AA)	G = 0,980; A = 0,020 (24)	G = 0,976; A = 0,024	G = 0,988; A = 0,012

Однако необходимо отметить, что для двух ОНП в генах LRRK2 и PARK2 у пациентов с БП из России характерна большая встречаемость частых аллелей именно в гомозиготном состоянии. Так встречаемость генотипа ТТ ОНП rs7966550 в гене LRRK2 и генотипа СС ОНП rs1801582 (V380L) в гене PARK2 у российских пациентов была больше, чем в европейской выборке (см. таблицу 4).

Таким образом, на основе первых результатов, полученных в ходе APEX, можно было сделать предположение, что два ОНП в генах LRRK2 и PARK2 (rs7966550 и rs1801582 (V380L), соответственно) могут влиять на риск развития БП в российской популяции.

Поэтому мы решили исследовать распределения генотипов по этим ОНП на более представительной выборке пациентов со спорадической формой БП и контрольной выборке из российской популяции.

Анализ ОНП в гене PARK2 мы проводили с помощью ПЦР в реальном времени. Для этого нами была разработана система «праймеры-зонды» (с помощью программы Beacon designer 7.0) и подобраны условия амплификации. Для анализа ОНП в гене LRRK2 мы применили метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Результаты более детального анализа ОНП rs1801582 и rs7966550 в генах LRRK2 и PARK2 с помощью ПЦР в реальном времени и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах LRRK2 и PARK2.

	Аллели, N (f)	Генотипы, N (f)	Отношение рисков (95% доверительный интервал (CI))	P value
LRRK2 rs7966550	T	C	TT	TC	CC
Пациенты со спорадической формой БП	596 (0,89)	72 (0,11)	266 (0,80)	64 (0,19)	4 (0,01)	1,16 (0,80 -1,69)	0,44
Контроль	386 (0,88)	54 (0,12)	169 (0,77)	48 (0,22)	2 (0,01)
PARK2 rs1801582	G	C	GG	GC	CC
Пациенты со спорадической формой БП	578 (0,84)	114 (0,16)	238 (0,69)	102 (0,29)	6 (0,02)	1,16 (0,85-1,58)	0,38
Контроль	363 (0,81)	83 (0,19)	148 (0,66)	67 (0,30)	8 (0,04)

N - количество

f - частота

Как видно из представленных данных, частоты и аллелей, и генотипов по обоим ОНП rs1801582 (PARK2) и rs7966550 (LRRK2) у пациентов со спорадической формой БП совпадают с таковыми в контрольной выборке. Таким образом, проведённый нами более детальный анализ не подтвердил наличие ассоциаций ОНП rs1801582 и rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2 с БП.

Анализ дополнительных однонуклеотидных полиморфизмов в генах SNCA и MAPT

Согласно последним данным полногеномных исследований ассоциаций, далеко не последнюю роль в развитии БП могут играть ОНП в генах SNCA и MAPT (Gandhi and Wood, 2010). Так неоднократно была показана ассоциация некоторых ОНП в гене SNCA и локусе MAPT с риском развития данного заболевания, тем более, что эти гены вовлечены в патогенез БП.

Поэтому на основе анализа работ по полногеномному исследованию ассоциаций (Edwards и др., 2010, Simon-Sanchez и др., 2009, Simуn-Sбnchez и др., 2009) мы выбрали ещё два ОНП в генах SNCA и WNT3, расположенном рядом с MAPT, - rs2736990 и rs415430 соответственно.

Полиморфизм rs2736990 расположен в самом длинном интроне гена SNCA, и, вероятно, может влиять на регуляцию экспрессии этого гена. Функция гена WNT3 пока неизвестна, но белок, кодируемый этим геном, относят к семейству секретируемых сигнальных белков, принимающих участие в некоторых процессах при эмбриогенезе (Liu и др., 1999). Однако, несмотря на это, полиморфизм rs415430 ассоциируют с локусом гена MAPT.

ОНП rs2736990 и rs415430 были проанализированы на тех же выборках, что и предыдущие два в генах PARK2 и LRRK2, с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты, полученные нами в ходе этого этапа работы, представлены в таблице 6.

Таблица 6. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах SNCA и MAPT/WNT3.

	Аллели, N (f)	Генотипы, N (f)	Отношение рисков (95% доверительный интервал (CI))	P value
SNCA rs2736990	C	T	CC	CT	TT	(СС+СТ)/ТТ
Пациенты со спорадической формой БП	354 (0,52)	332 (0,48)	88 (0,26)	178 (0,52)	77 (0,22)	1,70 (1,17-2,48)	0,01
Контроль	198 (0,44)	250 (0,56)	48 (0,21)	102 (0,46)	74 (0,33)
MAPT/WNT3 rs415430	A	G	AA	AG	GG	(AA+AG)/GG
Пациенты со спорадической формой БП	611 (0,88)	83 (0,12)	268 (0,77)	75 (0,22)	4 (0,01)	0,17 (0,01-3,18)	0,16
Контроль	402 (0,90)	46 (0,10)	178 (0,79)	46 (0,21)	0

N - количество

f - частота

Как видно из таблицы 6, присутствие аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA достоверно повышает риск развития БП. Таким образом, нам удалось показать чёткую ассоциацию полиморфизма rs2736990 в гене SNCA с риском развития спорадической формы БП в российской популяции. Мы получили соотношение шансов OR = 1,70 при доверительном интервале (95% CI) 1,17_2,48 и достоверности p = 0,01, что отражает повышение риска развития БП у носителей аллеля С почти в два раза.

Распределение генотипов в популяционной выборке соответствует закону Харди-Вайнберга при Х² = 1,32 и р = 0,25. Кроме того, наши данные также сопоставимы с результатами полногеномных исследований Simуn-Sбnchez и др. и Edwards и др. (OR = 1,29 при p = 0,01, OR = 1,27 при р = 6,17Ч10^-13 и OR = 1,23 при р = 2,24Ч10^-16), полученных на больших выборках пациентов с БП (более 2000 и 1700 человек соответственно) (Edwards и др., 2010, Simon-Sanchez и др., 2009, Simуn-Sбnchez и др., 2009), что свидетельствует о действительном влиянии данного ОНП на риск развития БП в российской популяции.

Разные группы исследователей сообщают, что различные полиморфизмы в локусе MAPT влияют на риск развития БП. Так в одной из недавних работ Simon-Sanchez и др. было показано, что ОНП rs415430 в гене WNT3, расположенном в локусе MAPT, может влиять на риск развития БП (отношение шансов 1,34 при р = 4,5Ч10^-8) (Simon-Sanchez и др., 2009).

Поэтому мы также решили сравнить распределение генотипов этого полиморфизма у русских пациентов со спорадической формой БП и в популяционном контроле. Тем не менее, несмотря на обнадёживающие результаты Simon-Sanchez и др. (Simon-Sanchez и др., 2009), нам не удалось показать ассоциации полиморфизма rs415430 в гене WNT3 с риском развития БП в российской популяции.

Анализ изменения экспрессии генов GSK3B, SLC6A3, MAPT, PARK2, SNCA, ST13

Первые клинические симптомы БП появляются после гибели 60-80% ДА нейронов компактной части чёрной субстанции головного мозга и 80%_ого уменьшения содержания ДА в скорлупе (Bernheimer и др., 1973, Cookson и др., 2008). Однако даже в настоящее время большинство современных методов диагностики БП на ранних стадиях, особенно на доклинической, не дают возможности однозначно поставить диагноз. В связи с этим, поиск и разработка новых доступных методов диагностики пресимптоматических стадий БП, в том числе биомаркеров в крови, позволят выявлять людей, находящихся в группе риска развития БП. Далее уже в этой группе будет возможно проводить более дорогостоящие уточняющие исследования. В частности, такими маркерами БП могут быть относительные уровни экспрессии генов-кандидатов в клетках периферической крови. Поэтому нами был проведён анализ относительной экспрессии генов-кандидатов GSK3B, SLC6A3, MAPT, PARK2, SNCA, ST13 в периферической крови в двух группах пациентов с БП на ранних стадиях, получавших лечение и не получавших его, и в трёх группах сравнения (пациенты с церебральным атеросклерозом, с различными неврологическими заболеваниями и контрольная группа здоровых добровольцев). Подбор групп сравнения осуществлялся таким образом, чтобы патогенез заболевания у пациентов из группы сравнения принципиально отличался от такового при БП, но затрагивал в основном ЦНС.

Для анализа экспрессии выбранных генов-кандидатов с помощью программы Beacon designer 7.0 нами были подобраны системы «праймеры-зонд» (кроме гена ST13 (Dong и др., 2005)) и условия амплификации, где в качестве матрицы использовали РНК, выделенную из мозжечка и гиппокампа мозга человека. Также для каждой пары «ген-кандидат - ген сравнения» были проведены эксперименты по проверке систем «праймеры-зонд» согласно руководству Applied Biosystems (Applied Biosystems, 2001).

Анализ изменения экспрессии генов SLC6A3, MAPT и PARK2

Нам не удалось выявить стабильной и выраженной экспрессии генов SLC6A3, MAPT, PARK2 в крови, несмотря на то, что разные исследователи находят транскрипты генов SLC6A3 и PARK2 в крови (Frankhauser и др., 2006, Tan и др., 2005c). В некоторых образцах мы наблюдали экспрессию этих генов, хотя пороговые циклы амплификации были больше 35, что свидетельствует об очень малом количестве кДНК и, соответственно, РНК в образце.

В ходе предварительных экспериментов по подбору условий работы и проверке систем «праймеры-зонд» с помощью ПЦР в реальном времени с использованием тотальной РНК из мозжечка и гиппокампа человека было показано, что системы для всех трёх генов (SLC6A3, MAPT, PARK2) оказались рабочими. На рисунке 1 на примере анализа экспрессии гена PARK2 в головном мозге (мозжечке) человека (тёмная кривая) показана работоспособность этих систем. Для сравнения на рисунке 1 также представлена кинетическая кривая, полученная в ходе ПЦР в реальном времени, где матрицей служила РНК, выделенная из периферической крови одного из пациентов с БП (светлая кривая).

Рисунок 1. Кинетические кривые, полученные в ходе ПЦР с кДНК гена PARK2.

Тёмная кривая - в качестве матрицы использовали РНК из мозга человека

Светлая кривая - в качестве матрицы использовали РНК из периферической крови

И - относительная интенсивность флуоресценции

Ц - циклы амплификации

Таким образом, можно предположить, что гены SLC6A3, MAPT и PARK2 экспрессируются в крови незначительно, а количество их транскриптов находится ниже порога чувствительности используемого нами метода.

Анализ изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA и ST13

Как уже было сказано ранее, ген GSK3B может быть вовлечён в патогенез БП и, следовательно, отражать ход её развития. Поэтому мы провели анализ изменения экспрессии гена GSK3B в периферической крови. Результаты исследования относительной экспрессии этого гена представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Относительные уровни экспрессии гена GSK3B у пациентов с БП, НК и ЦА по сравнению с контрольной группой.

ЦА - пациенты с церебральным атеросклерозом;

НК - пациенты с различными неврологическими заболеваниями (неврологический контроль)

БП(не леч) - пациенты с БП, не получавшие лечения;

БП(леч) - пациенты с БП, получавшие лечение;

БП - все пациенты с БП;

R - относительный уровень экспрессии гена GSK3B

Из представленных данных видно, что в крови пациентов с БП как получавших, так и не получавших лечение, практически не наблюдается изменения количества транскриптов гена GSK3B (медианы 1,03 и 0,91 соответственно) по сравнению с группой здоровых добровольцев.

За единицу принят уровень экспрессии гена GSK3B в группе неврологически здоровых добровольцев.

В тоже время в крови пациентов с ЦА было выявлено значительное снижение относительной экспрессии гена GSK3B (рисунок 2). При этом у данных больных наблюдалось статистически значимое уменьшение уровня мРНК гена GSK3B в три раза, и полученные результаты являются статистически значимыми (0,33, p < 0,001).

Уровень экспрессии этого гена в крови пациентов с различными неврологическими заболеваниями также оказался сниженным, однако, это изменение количества транскриптов гена GSK3B не было статистически значимым (0,61, р = 0,24).

Более того, изменения уровней экспрессии гена GSK3B могут носить неспецифический характер, так как мы обнаружили снижение экспрессии гена GSK3B у пациентов с церебральным атеросклерозом (рисунок 2). Эти изменения можно объяснить повреждением и гибелью нейронов вследствие нарушения кровообращения в головном мозге. Выбор именно этой группы сравнения объясняется тем, что патогенез церебрального атеросклероза принципиально отличается от такового при БП, но затрагивает в основном ЦНС.

Таким образом, на основании наших данных можно сделать вывод о том, что уровни экспрессии гена GSK3B не могут служить биомаркером пресимптоматической или ранних стадий БП.

Сейчас уже ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что альфа-синуклеин вовлечён в патогенез БП. В связи с этим, изменение экспрессии гена SNCA может служить маркером данного заболевания. Поэтому мы исследовали количества транскриптов гена SNCA в периферической крови пациентов с БП и пациентов и здоровых добровольцев из групп сравнения.

Результаты исследования относительной экспрессии гена SNCA представлены на рисунке 3. Из представленных данных видно, что в крови всех пациентов с БП как подвергавшихся лечению, так и не подвергавшихся, наблюдается статистически значимое увеличение количества транскриптов гена SNCA почти в три и более раз. Для объединённой группы пациентов с БП медиана составила 5,57, для групп пациентов с БП, не подвергавшихся и подвергавшихся лечению, медианы составили 2,85 и 7,32 (р < 0,0005), соответственно, по сравнению с группой здоровых добровольцев.

В тоже время в крови пациентов с ЦА и НК также было выявлено статистически значимое увеличение относительной экспрессии гена SNCA по сравнению с контрольной группой (рисунок 3). При этом у данных больных наблюдалось увеличение уровня мРНК гена SNCA более чем в два раза (2,34 и 2,86 соответственно, p < 0,0001). Однако такое увеличение количества транскриптов в группах пациентов с неврологическими заболеваниями оказалось меньше, чем в группе пациентов с БП, особенно подвергавшихся лечению.

Мы также показали статистически значимое увеличение экспрессии гена альфа-синуклеина более чем в три раза в крови пациентов с БП, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению (рисунок 3). Однако эти изменения не являются специфичными для БП. Количество транскриптов гена SNCA также увеличивалось и в группах пациентов с церебральным атеросклерозом и различными неврологическими заболеваниями (рисунок 3). Не исключено, что повышение экспрессии этого гена является реакцией на стресс и связано с шаперонной функцией альфа-синуклеина или какой-либо до сих пор неизвестной функцией этого белка.



Рисунок 3. Относительные уровни экспрессии гена SNCA у пациентов с БП, НК и ЦА по сравнению с контрольной группой.

ЦА - пациенты с церебральным атеросклерозом;

НК - пациенты с различными неврологическими заболеваниями (неврологический контроль)

БП(не леч) - пациенты с БП, не получавшие лечения;

БП(леч) - пациенты с БП, получавшие лечение;

БП - все пациенты с БП;

R - относительный уровень экспрессии гена SNCA

За единицу принят уровень экспрессии гена SNCA в группе неврологически здоровых добровольцев.

Таким образом, можно заключить, что уровень экспрессии этого гена не может служить биомаркером ранних стадий БП.

Ген ST13 и, следовательно, белок ST13 также может играть роль в патогенезе БП, так как было показано его косвенное участие в сборке альфа-синуклеина (Scherzer и др., 2007). Более того, ранее также было показано уменьшение экспрессии гена ST13. В связи с этим, мы также исследовали изменения экспрессии гена ST13 в периферической крови пациентов с БП и с другими заболеваниями и здоровых добровольцев. Результаты исследования относительной экспрессии гена ST13 представлены на рисунке 4.

Рисунок 4. Относительные уровни экспрессии гена ST13 у пациентов с БП, НК и ЦА по сравнению с контрольной группой.

ЦА - пациенты с церебральным атеросклерозом;

НК - пациенты с различными неврологическими заболеваниями (неврологический контроль)

БП(не леч) - пациенты с БП, не получавшие лечения;

БП(леч) - пациенты с БП, получавшие лечение;

БП - все пациенты с БП;

R - относительный уровень экспрессии гена ST13

За единицу принят уровень экспрессии гена ST13 в группе неврологически здоровых добровольцев.

Из представленных данных видно, что в крови пациентов с БП как получавших, так и не получавших лечение, не наблюдается статистически значимых изменений количества транскриптов гена ST13 (медианы 1,02 и 1,44 соответственно) по сравнению с группой здоровых добровольцев.

Однако в крови пациентов с ЦА было выявлено статистически значимое изменение относительной экспрессии гена ST13 (рисунок 4). При этом у данных больных наблюдалось уменьшение уровня мРНК гена ST13 в 2,63 раза (0,38, p < 0,0001). Количество транскриптов гена ST13 в группе пациентов с различными неврологическими заболеваниями также оказалось сниженным почти в 2 раза (0,60, р < 0,05).

Как уже было сказано, ранее Scherzer и др. показали, что уровень транскриптов этого гена уменьшается у пациентов с БП (Scherzer и др., 2007). Однако в отличие от предыдущих исследователей мы не обнаружили значимых изменений в экспрессии этого гена у наших пациентов с БП, как подвергавшихся лечению, так и не подвергавшихся.

Это можно объяснить тем фактом, что мы исследовали кровь пациентов, находящихся на более ранних стадиях заболевания. Большинству наших пациентов, не подвергавшихся лечению, диагноз БП был поставлен в то же время, когда производили забор крови.

У всех наших de novo пациентов была первая или вторая стадия БП по шкале Хен и Яра. Более того, у русских пациентов с БП, подвергавшихся лечению, уровень экспрессии гена ST13 также не отличался от контроля (рисунок 4).

Однако даже пациенты, подвергавшиеся лечению, находились не более чем на 2-й стадии болезни. Изменения же в экспрессии этого гена, наблюдаемые Scherzer и др., вероятно возникают на более поздних стадиях заболевания: 2,3 по шкале Хен и Яра (Scherzer и др., 2007).

К тому же, изменения количества транскриптов гена ST13 могут быть неспецифичными, так как мы обнаружили статистически значимое снижение экспрессии гена в группах пациентов с церебральным атеросклерозом и различными неврологическими заболеваниями (рисунок 4). Эти изменения можно объяснить повреждением и смертью нейронов вследствие нарушения микроциркуляции.

К сожалению, в мировой литературе практически нет никаких данных о том, влияет ли лечение на экспрессию гена ST13 или нет. Также нет и данных по изменению экспрессии этого гена при цереброваскулярной патологии.

Таким образом, на основании наших данных можно заключить, что уровни экспрессии гена ST13 также не могут служить биомаркером на досимптоматической и ранних стадиях БП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Болезнь Паркинсона - второе по распространённости нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера. В настоящее время БП неизлечима, однако сейчас разработаны методы коррекции симптомов БП, позволяющие существенно облегчать протекание заболевания и продлевать жизнь. Эффект такого лечения тем лучше, чем раньше начата терапия.

В связи с этим актуальным становится вопрос о возможности ранней (доклинической) ДНК-диагностики этого заболевания с целью проведения профилактического лечения. Поэтому особенно актуальными являются задачи поиска и разработки биомаркеров для раннего и доклинического выявления данной патологии. Такого рода биомаркеры позволят выявлять лиц, находящихся в группе риска развития БП.

Одним из возможных способов выявления групп риска является поиск и анализ генетических маркеров БП, например, ТМ и ОНП в генах, вовлечённых в патогенез данного заболевания. Также выявлять людей, находящихся в группе риска развития БП, возможно позволят и такие биомаркеры в периферической крови, как относительные уровни экспрессии генов, вовлечённых в патогенез БП.

В настоящей работе мы проанализировали распределение ТМ и различных генотипов ОНП в генах, связанных с развитием БП, в группе пациентов с БП и контрольной группе из российской популяции.

Нам удалось выявить только три ТМ в гетерозиготном состоянии у трёх различных пациентов со спорадической формой БП, что свидетельствует о высокой микрогетерогенности ТМ в российской популяции и необходимости ресиквенса экзонов ключевых генов, принимающих участие в патогенезе БП.

Кроме того, нам удалось показать ассоциацию ОНП rs2736990 в гене SNCA с риском развития спорадической формы БП в российской популяции: у носителей аллеля С риск развития БП повышен в 1,70 раза (95% CI: 1,17-2,48 при р = 0,01). В дальнейшем данный ОНП rs2736990 в гене SNCA может быть включён в панель маркеров для определения индивидуального риска развития БП.

В ходе анализа относительных уровней экспрессии генов GSK3B, SLC6A3, MAPT, PARK2, SNCA, ST13 было показано, что только транскрипты генов GSK3B, SNCA, ST13 присутствуют в крови в достаточном для анализа количестве. Изучение экспрессии этих генов позволило выявить разные паттерны уровней их мРНК у пациентов с БП и в группах сравнения, что отражено в таблице 10.

Таблица 10. Направления изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA и ST13 у пациентов с БП и в группах сравнения.

	Изменение экспрессии гена
Заболевание	GSK3B	SNCA	ST13
Болезнь Паркинсона	--	^^	--
Церебральный атеросклероз	vv	^	vv
Неврологические заболевания	~v	^	v

^ - увеличение количества мРНК по сравнению с уровнем мРНК у здоровых добровольцев.

v - уменьшение количества мРНК по сравнению с уровнем мРНК у здоровых добровольцев.

-- - отсутствие изменения количества мРНК по сравнению с уровнем мРНК у здоровых добровольцев.

И хотя с одной стороны полученные нами данные по изменению экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 не могут по отдельности служить биомаркерами БП, однако, с другой стороны эти данные позволяют предположить, что совместный анализ количества транскриптов генов GSK3B, SNCA, ST13, а также других генов, вовлечённых в патогенез БП, в дальнейшем послужит основой для создания панели маркеров для диагностики этого заболевания.

Также анализ относительных уровней экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 позволил высказать рекомендацию использовать в экспериментах по анализу экспрессии генов в периферической крови у пациентов с БП в качестве групп сравнения больных с церебральным атеросклерозом и другими неврологическими заболеваниями.

ВЫВОДЫ

1. Анализ 68 известных точковых мутаций в генах моногенных форм болезни Паркинсона выявил в гене PARK2 три мутации (M1L, A82G и C253Y) в гетерозиготном состоянии у трёх различных пациентов со спорадической болезнью Паркинсона с ранним началом развития. Это свидетельствует о малом вкладе известных мутаций в патогенез спорадической формы болезни Паркинсона в России.

2. Выявлена ассоциация полиморфизма rs2736990 (C/T) в гене SNCA с риском развития спорадической формы болезни Паркинсона в российской популяции. Показано, что носительство аллеля С по данному полиморфизму повышает риск развития болезни Паркинсона (OR=1,70 при доверительном интервале (95% CI) 1,17-2,48, p=0,01).

3. Обнаружено, что уровни мРНК гена ST13 в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях и здоровых добровольцев не отличаются. Установлено снижение уровня мРНК данного гена в 2,63 раза (p<0,0001) в периферической крови больных церебральным атеросклерозом.

4. Выявлен одинаковый уровень мРНК гена GSK3b в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях и здоровых добровольцев. Показано снижение уровня мРНК данного гена в 3 раза (p<0,001) в периферической крови больных церебральным атеросклерозом.

5. Обнаружено значительное увеличение уровня мРНК гена SNCA в периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях заболевания в 5,57 раза (р<0,0005), у больных церебральным атеросклерозом в 2,34 раза (p<0,0001) и у пациентов с различными неврологическими заболеваниями в 2,86 раза (p<0,0001).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ