Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Фрагменты рибосомных генов человека в составе внеклеточной ДНК - факторы стресс-сигнализации

03.00.15 - Генетика

Костюк Светлана Викторовна

Москва - 2007

Работа выполнена в ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Н. Вейко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.А. Мякоткин

кандидат биологических наук, С.В. Беневоленский

Ведущая организация: ГОУВПО Российский государственный медицинский университет им.Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится " 24 " сентября 2007 года в 11 час.00 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 001.016.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, г. Москва, Москворечье, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " " 2007 год

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 001.016.01 доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

Общая характеристка работы

1) В выборке здоровых доноров и работников атомного предприятия, подвергавшихся воздействию облучения в фиксированных дозах, определить концентрацию внДНК, концентрацию в плазме и содержание во внДНК плазмы периферической крови двух повторяющихся последовательностей генома: GC-богатой транскрибируемой области рибосомного повтора (ТОрДНК) и АТ-богатой субфракции сателлита 3, локализованной в прицентромерном участке длинного плеча 1-й хромосомы человека (1q12).

2) В опытах in vitro изучить влияние тотальной внДНК (тот-внДНК) и фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека; выяснить, через какие известные клеточные рецепторы реализуется действие фрагментов внДНК.

3) Определить, вырабатываются ли антитела на конкретные последовательности генома человека, накапливающиеся в составе внДНК.

Научная новизна. Впервые установлено, что по составу повторяющихся последовательностей внДНК облученных людей существенно отличается от яДНК. ВнДНК обогащена фрагментами транскрибируемой области рибосомного повтора. У облученных лиц содержание ТОрДНК и ее концентрация в плазме существенно выше, чем у контрольных доноров (КД). Впервые показано стимулирующее действие внДНК и фрагмента ТОрДНК на лимфоциты человека, которое сопровождается изменением структуры хроматина, активацией синтеза РНК и увеличением продукции цитокинов. В реализации стимулирующего действия внДНК и ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы из семейства "toll-like" (TLR9), узнающие CpG-богатые мотивы ДНК, и пока не известные рецепторы, опознающие фрагменты ДНК. Впервые в сыворотке крови человека обнаружены специфичные антитела, высокоаффинные к фрагменту ТОрДНК, которые присутствуют в свободном виде и в комплексе с внеклеточной ДНК.

Научно-практическая значимость работы. Определение в плазме крови человека трех показателей: (1) содержания ТОрДНК во внДНК плазмы периферической крови, (2) концентрации ТОрДНК в плазме крови, (3) титра антител к ТОрДНК может оказаться полезным для выявления лиц, у которых происходит интенсивный апоптоз клеток организма, увеличено количество иммуностимулирующих последовательностей ДНК и повышена вероятность развития аутоиммунных заболеваний. Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы для оптимизации диагностических методов при оценке слабовыраженного процесса апоптоза клеток в условиях длительного неблагоприятного воздействия окружающей среды. Обнаруженные в организме здорового человека высокоспецифичные антитела к последовательности ТОрДНК открывают перспективы их применения в будущем в терапии ряда аутоиммунных заболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. В составе внДНК плазмы крови при длительном действии ионизирующего излучения накапливается СpG-богатая последовательность ТОрДНК; содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3, напротив, снижается. Содержание ТОрДНК во внДНК плазмы крови - новый маркер скрыто протекающих процессов апоптоза клеток в организме. Концентрация тот-внДНК в плазме не является маркером апоптоза клеток организма при длительном действии небольших доз радиации.

2. Образцы внДНК и фрагменты ТОрДНК обладают выраженной способностью активировать in vitro лимфоциты человека; активирующее действие образцов ДНК изменяется в ряду: ТОрДНК > внДНК больных ревматоидным артритом > внДНК здоровых доноров. Тотальная яДНК активирующего действия не проявляет. Эффект стимуляции зависит от концентрации накапливающихся фрагментов ДНК и времени воздействия (т.е. от дозы).

3. В реализации стимулирующего действия ТОрДНК на клетки задействованы известные рецепторы, узнающие неметилированные CpG-богатые мотивы ДНК (TLR9), и другие, пока неизвестные, рецепторы для ДНК.

4. В сыворотке крови человека присутствуют специфичные, высокоаффинные антитела к фрагменту ТОрДНК, которые могут быть как в свободном виде, так и в комплексе с внеклеточной ДНК.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследования получены и оформлены лично автором в лаборатории молекулярной биологи ГУ МГНЦ РАМН.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), V Congress on radiation research (Москва, 2006); Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006); III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); Международной конференции “Новые направления в радиобиологии" (Москва, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 218 источников

внеклеточная геном ионизирующее излучение лимфоцит

Материалы и методы

Сбор образцов плазмы периферической крови работающих на атомном предприятии ГНЦ РФ Физико-энергетический институт (ФЭИ, г. Обнинск) проводился сотрудниками Медицинского радиологического научного центра РАМН (г. Обнинск). Выделение внДНК проводили методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию внДНК определяли флуориметрически на люминесцентном спектрометре "LS 55" ("PerkinElmer", Англия) c использованием ДНК-связывающегося красителя Hoechst 33258. Размер фрагментов ДНК определяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Содержание повторяющихся последовательностей генома определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации с биотинированными зондами на фильтрах (Hybond ExtraC, "Amerscham"). Для анализа ТОрДНК использовали зонд pHRGBB-28S (порядковый номер нуклеотидов 9346-10783, HSU 13369, GeneBank), для субфракции сателлита III - зонд pRt301 (Томилин и сотр., 1984). Биотин выявляли с помощью коньюгата стрептавидин - щелочная фосфатаза ("Sigma", США). Использовали субстрат для фосфатазы BCIP в присутствии NBT, который образует нерастворимый осадок ("Sigma", США). Интенсивность окрашенных пятен (гибридизационный сигнал) определяли компьютерным анализом изображения фильтра с помощью программы "Images" (ИнтерЭВМ, Москва). Средняя ошибка метода во всех опытах составляла (52) % от измеряемой величины.

Анализ стимулирующего действия фрагментов внДНК на лимфоциты.

Использовали образцы внДНК здоровых доноров (ЗД) и больных ревматоидным артритом (РА), в плазме крови которых ранее обнаружено высокое содержание ТОрДНК. В качестве источника фрагментов ТОрДНК использовали смесь двух лианеризованных плазмид, содержащих фрагменты ТОрДНК (участки от - 515 до 5321 и от 9346 до 10783 нуклеотида, в соответствии с HSU 13369, GeneBank), встроенные в вектор pBR322, или смесь вырезанных из этих плазмид вставок. ДНК E. coli выделяли из штамма MG 1655. Геномную ДНК человека выделяли из лейкоцитов КД. Все образцы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке: последовательно проводили обработку тритоном Х-114 [Aida et al., 1990] и гельфильтрацию на носителе HW-85.

Нестимулированные G0-лимфоциты человека, выделяли в системе фиколл-урографин из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров. Лимфоциты культивировали 2-4 часа при 37С в среде RPMI 1640 (ICN, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС, HyClone, США) в количестве 600 - 700 тыс/мл в присутствии ДНК разных типов. Определение действия фрагментов ДНК на лимфоциты человека проводили с использованием трех групп методов.

Цитохимические методы: флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с зондом на участок 1q12 (показатель перегруппировки хроматина ядер лимфоцитов); селективная окраска ядрышка фиксированных ядер лимфоцитов нитратом серебра (показатедь активности транскрипции рДНК). Окраска азотнокислым серебром проводилась сотрудником лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН Н.А. Еголиной.

Биохимические методы: определение количества тотальной РНК, активности каспазы 3 и нуклеазной активности в клеточных лизатах. РНК выделяли с использованием реагента Trizol. Концентрацию РНК определяли флуориметрически c использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iT^TM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec). Активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах лимфоцитов с помощью флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin, N-CBZ-L-aspartil-L-glutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide, ”Sigma”), возб400 нм, флу490 нм. Эндонуклеазную активность определяли по увеличению интенсивности флуоресценции с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом R6G ACC CCC AGC GAT TAT CCА AGC GCG BHQ1, включающим флуоресцирующую группу (R6G, 5 (6) - карбоксиродамин) и молекулу тушителя (BHQ1, "Синтол", Москва).

Иммунологические методы. Уровень ИЛ-6 в среде культивирования лимфоцитов определяли твердофазным ИФА с использованием набора реактивов фирмы “Innogenetics" (Бельгия). Анализ проводили в лаборатории Клинической иммунологии Института ревматологии РАМН. Активность ФНО- определялась сотрудником лаборатории иммуногенетики ГУ МГНЦ РАМН Е.А. Калашниковой по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток фибросаркомы мыши L-929.

Для ингибирования клеточного сигнала, связанного с рецепторами TLR9, использовали олигонуклеотид TCC TGG CGG GGA AGT (2088) ("Синтол", Москва) в конечной концентрации 3 мкг/мл [Lenert et al., 2006] или хлорокин ("Boots Company PLC", Англия) в концентрации 2 мкг/мл [Huang et al., 2005].

Количество мРНК TLR9 оценивалось методом real-time ПЦР. Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы “Силекс" по стандартной методике. Для оценки уровня экспрессии TLR9 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan с синтезированными праймерами (“Синтол”). В реакции амплификации использовали модифицированный олигонуклеотид, который на 5ґ-конце содержал флуоресцирующую группу (FAM), а на 3ґ-конце - тушитель флуоресценции BQH1. В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH, мРНК которого определяли с помощью меченного карбоксиметилфлуоресцеином (R6G) олигонуклеотида. ПЦР проводили в приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австр.). Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора. В серии опытов получена хорошая воспроизводимость результатов, ошибка измерения составила ~ 2%.

Анализ сыворотки (плазмы) человека на наличие специфичных антител к фрагментам ТОрДНК.

Нанесенные на мембрану (Hybound ExtraC, "Amersham") образцы ДНК инкубировали (37С, 30 мин) с сывороткой. Затем фильтр инкубировали (37С, 30 мин) с вторичными антителами к иммуноглобулину G, коньюгированными с пероксидазой и помещали в раствор проявляющего субстрата. Интенсивность окрашенных пятен (сигнал) определяли компьютерным анализом изображения фильтра с помощью программы "Images" ("ИнтерЭВМ", Москва).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics и Statistica 6.0. Анализировали распределение выборок по методу Колмогорова-Смирнова (К-С), так как не для всех выборок было характерно нормальное распределение. Средние значения величин сравнивали с использованием t-критерия. Для выяснения возможной связи между четырьмя определяемыми параметрами: концентрация внДНК, концентрация ТОрДНК в плазме, содержание ТОрДНК во внДНК, частота TCR-мутантных клеток и характеристиками индивида - возраст и накопленная доза, был применен "метод главных компонент", компьютерная программа написана Р.К. Агаповой (ГУ МГНЦ РАМН).

Результаты и обсуждение

1. Свойства внДНК плазмы крови облученных лиц.

ВнДНК была выделена из образцов плазмы периферической крови 175 индивидов, среди которых были 22 контрольных донора (КД) и 153 облученных донора (ОД), которые по роду работ соприкасались с внешними источниками радиации (среднее значение годовой дозы - 2,9 мЗв, а кумулятивной дозы - 104 мЗв). Для оценки влияния накопленной дозы радиации на свойства внДНК, всю выборку ранжировали по значениям дозы радиации и разбили на 8 групп (см. табл.1)

Определены следующие параметры внДНК: (1) общая концентрация фрагментов в плазме; (2) длины фрагментов; (3) концентрация в плазме и (4) относительное содержание во внДНК двух повторяющихся последовательностей генома человека: ТОрДНК и СатIII. В таблице 1 приводятся средние значения концентрации фрагментов внДНК в группах КД и ОД.

Низкие средние значения концентраций внДНК у облученных лиц (по сравнению с необлученными, группа 0), наблюдали как для малых доз (0,39 - 27,4 мЗв, группа 1,2), так и для и для больших доз (260,2 - 578,6 мЗв, группа 7). Максимальные значения концентрации внДНК обнаружены у ОД, получивших облучение в диапазоне доз 50-90 мЗв. Сравнение распределений концентрации внДНК в каждой группе ОД и в контрольной группе по методу Колмогорова-Смирнова позволяет сделать вывод об отсутствии различий в концентрации внДНК у КД и ОД в большинстве групп. Полученные средние значения близки к данным, полученным авторами других работ [Tamkovich et al., 2005; Raptis et al., 1980] для здоровых людей.

Таблица 1. Концентрация внДНК (С) и сравнение выборок по критерию Колмогорова-Смирнова (К-С).

*) распределения различаются.

Анализ длины фрагментов внДНК методом электрофореза в 1% агарозном геле показал, что внДНК в крови ОД, также как и в крови ЗД, циркулирует преимущественно в виде длинных фрагментов (20 и более т.п. н.). Таким образом, концентрация или длина фрагментов внДНК для данной выборки ОД не являются маркерами усиленной гибели клеток организма.

Методом нерадиоактивной количественной гибридизации определена концентрация двух повторяющихся последовательностей генома в плазме: ТОрДНК и СатIII. Выбор анализируемых последовательностей определялся их нуклеотидным составом. ТОрДНК содержит высокий процент GC - пар и обогащена неметилированными СpG - динуклеотидами [Вrock et al., 1997]. Ранее было показано, что фрагменты ТОрДНК устойчивы к двунитевым разрывам при нуклеазном гидролизе [Вейко и Спитковский, 2000] и накапливаются в сыворотке больных ревматоидным артритом [Вейко и соавт., 2006]. Последовательность СатIII обогащена АТ - парами. Рибосомный повтор человека (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22) представлен в геноме в количестве 300-700 копий [Вейко Н.Н. и соавт., 2003], анализируемый фрагмент сателлита 3 представлен в районе 1q12 тысячами копий.

Концентрация ТОрДНК у КД варьирует от 181 до 1962 пг/мл (среднее 522±92 пг/мл), а у ОД интервал варьирования более широкий - от 60 до 5880 пг/мл плазмы (среднее 1411±94 пг/мл). Концентрация СатIII изменяется от 232 до 4891 пг/мл (среднее 1835±243 пг/мл, N=22) для КД и от 12 до 5975 пг/мл (среднее 1042 пг/мл, распределение отличается от нормального, N=153) для ОД. Результаты анализа концентрации ТОрДНК и СатIII в плазме крови контрольных и облученных доноров (группы 0 - 7) представлены в таблице 2.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что среднее значение концентрации ТОрДНК у облученных людей статистически значимо выше, чем у необлученных доноров, причем не наблюдается зависимости концентрации ТОрДНК от величины накопленной дозы. Иная картина обнаружена для повтора СатIII. Для групп 3 - 6 (диапазон доз 27,4 - 245,6 мЗв) наблюдается снижение средних значений концентраций СатIII в плазме крови.

Таблица 2. Средние значения концентраций повторов ТОрДНК и СатIII в плазме крови контрольных и облученных доноров и сравнение выборок по критерию Колмогорова-Смирнова.

*) распределения не различаются.

Таким образом, в плазме крови людей, получивших дозу облучения, увеличена концентрация GC-богатой последовательности ТОрДНК и снижена концентрация АТ-богатой последовательности СатIII.

Содержание анализируемых повторов в 1 нг внДНК было рассчитано на основании данных об общей концентрации внДНК и концентраций соответствующих повторов в плазме.

Таблица 3. Содержание (m) повторов ТОрДНК и Сат III во внДНК и сравнение выборок по критерию Колмогорова-Смирнова.

*) распределение отличается от нормального, в скобках приводятся интервалы варьирования значений; **) распределения не различаются.

В изученной выборке в составе внДНК плазмы ОД содержание ТОрДНК варьировало от 1,0 до 151 пг/нг внДНК (среднее 13,8 пг/нг внДНК, N=153), содержание СатIII изменяется от 0,2 до 39,6 пг/нг внДНК (среднее 7,8 пг/нг ДНК, N=153). При этом во внДНК КД содержание ТОрДНК изменяется от 0,9 до 7,9 пг/нг ДНК (среднее 7,8 пг/нг ДНК, N=22), а содержание СатIII от 2,0 до 42,5 пг/мл ДНК (среднее 2,9 пг/нг ДНК, N=22). Далее мы проанализировали, как влияет облучение на содержание ТОрДНК и СатIII во внДНК. Данные представлены в табл.3. Во всех группах ОД от 40 до 65% образцов внДНК обогащены фрагментами ТОрДНК по сравнению с внДНК ЗД. Содержание СатIII во внДНК у облученных и необлученных людей различаются несущественно. Наиболее выражена зависимость содержания ТОрДНК во внДНК от накопленной дозы в возрастной группе сотрудников 52-59 лет (25 человек), получивших за время работы дозы радиации больше 90 мЗв (коэффициент линейной регрессии k = 0,7, p <0,001).

Мы сравнили содержание повторов в составе внДНК и яДНК, распределения приводятся на рис.1.

Рис. 1. Нормированное распределение образцов геномной ДНК (А, n=256) и образцов внДНК (Б, n=153) по относительному содержанию (m) ТОрДНК и СатIII.

К сожалению, мы не располагали образцами яДНК ОД. Поэтому мы воспользовались данными о содержании анализируемых повторов в яДНК, полученными нами для другой выборки практически здоровых индивидов, включающей 256 человек. Ранее было показано [Вейко и соавт., 2003], что при увеличении выборки свыше 30 человек вид частотного распределения и средние значения относительного содержания ТОрДНК и СатIII в яДНК человека практически не изменяются. Из сравнения распределений образцов геномной и внДНК по содержанию ТОрДНК, представленных на рис.1 по методу Колмогорова-Смирнова (D=0,46, Р>0,05), ясно видно, что внДНК ОД существенно обогащена фрагментами ТОрДНК по сравнению с яДНК. Иная картина наблюдается для повтора СатIII. Как следует из данных рис.1, содержание повтора СатIII во внДНК плазмы человека снижено по сравнению с содержанием этого повтора в яДНК (D=0,46, Р>0,05, по критерию Колмогорова-Смирнова). Аналогичные данные - повышение содержания ТОрДНК и снижение содержания СатIII были получены при изучении внДНК сыворотки больных ревматоидным артритом [Вейко и соавтр., 2006]. Из анализа литературы известно, что ДНК, выделенная из плазмы крови больных СКВ, содержит заметно больше CpG-динуклеотидов, чем геномная ДНК человека [Galeazzi et al., 2003]. Последовательность повтора СатIII содержит малое количество CpG-динуклеотидов, такое же, как и тотальная геномная ДНК, и его концентрация во внДНК снижена по сравнению с ДНК, заключенной в ядре клетки, как в норме, так и при облучении.

Одна из возможных причин качественного изменения состава внДНК - неодинаковая скорость гидролиза разных фрагментов внДНК в составе растворимого хроматина погибших клеток нуклеазами крови до коротких фрагментов, которые далее могут быть элиминированы. Поскольку, как ранее было показано, ТОрДНК существенно более устойчива к возникновению двойных разрывов, возникающих при накоплении однонитевых разрывов в ДНК вследствие нуклеазного гидролиза или химической модификации, чем последовательность СатIII [Вейко и Спитковский, 2000], во внеклеточной жидкости накапливаются фрагменты ТОрДНК. Увеличение содержания фрагментов ТОрДНК во внДНК облученных лиц по сравнению с необлученными донорами может указывать на интенсификацию процессов апоптоза клеток у облученных лиц одновременно с активацией элиминации большей части фрагментов внДНК. Причиной апоптоза части клеток при действии ионизирующей радиации является недостаточно эффективная репарация повреждений ДНК. При эффективной репарации некоторые поврежденные клетки организма могут выжить, но при этом возникает вероятность соматических мутаций в различных локусах генома. Мы сравнили содержание ТОрДНК во внДНК облученных лиц с частотой TCR - мутаций, поскольку эти два параметра должны отражать одно и то же явление - повреждение ДНК клеток ионизирующей радиацией. По данным сотрудников ГУ МРНЦ РАМН (г. Обнинск) частота TCR-мутантных лимфоцитов в группе 100 необлученных доноров изменяется от 1,4?10^-4 до 10?10^-4 (среднее значение (4,0±0,2) ?10^-4). В анализируемой группе ОД частота варьирует от 1,2?10^-4 до 63?10^-4 (среднее значение 6,2?10^-4). По критерию Мэнн-Уитни частота мутантных клеток в группе сотрудников ФЭИ статистически значимо выше, чем в контроле (р=0,003, данные получены в МРНЦ РАМН).

Для выяснения возможной связи между четырьмя определяемыми параметрами: концентрация внДНК, концентрация ТОрДНК в плазме, содержание ТОрДНК во внДНК, частота TCR-мутантных клеток и характеристиками индивида - возраст и накопленная доза, был применен "метод главных компонент". Результат анализа в графическом виде представлен на рис.2. Наиболее тесно связаны три признака: накопленная доза радиации, содержание ТОрДНК во внДНК и частота TCR-мутантных клеток. Для всей выборки обнаружена достоверная линейная корреляция между содержанием ТОрДНК и частотой TCR-мутантных клеток (k=0,32, р < 0,001, N=153). Для лиц, получивших дозы радиации больше 90 мЗв, линейная зависимость этих показателей более выражена (k=0,47, р<0,001, N=56).

Наличие корреляции между содержанием ТОрДНК во внДНК и частотой TCR-мутантных клеток подтверждает предположение о том, что эти два показателя отображают единый процесс в организме - повреждение клеточной ДНК при действии радиации. Определение cодержания ТОрДНК в составе внДНК плазмы крови может служить биомаркером при оценке слабовыраженного процесса апоптоза клеток в условиях длительного неблагоприятного воздействия окружающей среды.

Рис. 2. Графическое представление результатов анализа методом главных компонент совокупности 6 признаков для выборки ОД.

Действие внДНК и ее отдельных фрагментов на лимфоциты человека.

Мы установили, что внДНК существенно отличается от яДНК по содержанию CpG-богатых последовательностей (ТОрДНК), которые являются потенциальными иммуномодуляторами, аналогичными бактериальной и вирусной ДНК. В литературе нет работ, в которых исследовали бы действие именно внДНК на эукариотические клетки. Поэтому мы поставили задачу: изучить возможные последствия изменения состава внДНК по сравнению с яДНК и накопления в крови человека CpG-богатых последовательностей на модельной системе - выделенные из периферической крови здоровых доноров и культивируемые in vitro лимфоциты человека.

Для определения возможного действия внДНК (ТОрДНК) на лимфоциты использовали два цитохимических показателя, которые отражают активацию клеток при действии внешних агентов. Ранее было показано, что стимуляция лимфоцитов малыми дозами радиации сопровождается изменением пространственной локализации хромосомных участков, в частности перемещением прицентромерных локусов 1q12 от мембраны к центру ядра [Спитковский и соавт., 2002]. | Положение прицентромерных локусов хромосомы 1 в ядре определяли методом FISH. Для краткости вместо гистограмм частотного распределения гибридизационного сигнала (для 500 клеток) по нормированному радиус-вектору (r) клеточного ядра в табл.5 мы приводим частоты клеток с примембранной локализацией прицентромерных локусов (r [0,8; 1]). О стимуляции клеток свидетельствует уменьшение числа клеток с примембранной локализацией прицентромерных локусов (r [0,8; 1]) и увеличение числа лимфоцитов с их внутриядерной локализацией (r < 0,8).

Для анализа биологического действия внДНК использовали G₀-лимфоциты 4-х здоровых доноров (обозначенных условно А, Б, В и Г). Проанализировали действие на лимфоциты доноров образцов внДНК больных РА и здоровых людей. Ранее было показано, что внДНК больных РА значительно обогащена рибосомными повторами [Вейко и соавт., 2006] и другими последовательностями с высоким содержанием CpG-динуклеотидов [Galeazzi et al., 2003]. Кроме того, в экспериментах были использованы клонированные фрагменты ТОрДНК (р (ТОрДНК)) и ДНК, выделенная из E. coli, которая по количеству CpG-динуклеотидов и по GC-составу похожа на ТОрДНК и известна как сильный стимулятор клеток иммунной системы.

В табл.4 приводятся данные, полученные при культивировании лимфоцитов с перечисленными образцами ДНК, которые использовались в указанных в столбце 4 концентрациях.

Таблица 4. Результат воздействия различных образцов ДНК на культивируемые лимфоциты.

*) - приводятся средние значения и отклонения от среднего для независимых опытов, в которых исследовали лимфоциты донора, который в столбце 2 обозначен первым; **) - проводили сравнение образцов, обработанных ДНКазой1 и тех же интактных образцов; ***) - выборки достоверно не различаются.

Концентрации образцов внДНК здоровых доноров и больных РА в среде культивирования соответствовали их концентрациям в сыворотке крови. Для остальных образцов ДНК мы провели исследование при различных концентрациях. Анализ данных таблицы позволяет сделать следующие выводы. С точки зрения количества клеток, в которых наблюдается перемещение прицентромерных локусов хроматина при действии фрагментов ДНК, взятых примерно в одном диапазоне концентраций, фрагменты ДНК условно можно расположить в ряд:

р (ТОрДНК) ? внДНК (РА) > внДНК (ЗД) > pBR322> ДНК E. coli> яДНК ? 0; яДНК активирующего действия не проявляет.

Приведенные в таблице 4 данные позволяют заключить, что наибольшим стимулирующим действием обладают фрагменты внДНК, выделенные из сыворотки больных РА и фрагменты р (ТОрДНК). Эффект от воздействия внДНК (РА) значительно снижается после гидролиза ДНКазой 1 до олигонуклеотидных фрагментов. Действие р (ТОрДНК) проявляется при всех исследованных концентрациях в диапазоне от 2 до 20 000 нг/мл. Стимулирующее действие ДНК E. coli проявлялось только при концентрациях более 2 мкг/мл, что совпадает с данными литературы [Vollmer et al., 2004; Klinman et al., 1996]. Плазмида - вектор также обладает небольшим стимулирующим действием, что подтверждает полученные ранее данные [Beyer et al., 2001]. ДНК, выделенная из ядер лимфоцитов, не индуцирует наблюдаемый эффект даже при очень высоких концентрациях.

Известно, что стимуляция лимфоцитов сопровождается также изменениями структуры ядрышка, которые отражают увеличение синтеза рРНК: возрастает число центров, выявляемых окраской нитратом серебра, и увеличивается их суммарная площадь [Ochs et al., 1989].

В табл.5 приводятся данные о влиянии фрагментов внДНК больных РА и ЗД и перечисленных выше модельных последовательностей на структуру ядрышка лимфоцитов доноров. Данные представлены средними значениями числа серебрящихся центров на клетку (N_Ag) и средними значениями суммарных площадей серебрящихся участков ядрышка на клетку (S_Ag). Из табл.5 следует, что при действии фрагментов внДНК, (р (ТОрДНК), pBR322 и ДНК E. coli на лимфоциты наблюдаются признаки активации ядрышка: увеличение общей площади серебрящихся участков (в 1,04 - 3,24 раза) и их числа (в 1,1 - 2,56 раза). ДНК, выделенная из ядер, не вызывает активации ядрышка. С точки зрения количественных параметров активации ядрышка фрагменты ДНК условно можно расположить в ряд:

р (ТОрДНК) >> pBR322 > внДНК (РА) ? внДНК (ЗД) ? ДНК E. coli > яДНК ? 0; яДНК активирующего действия не проявляет.

Сопоставление данных табл.4 и табл.5, полученных для лимфоцитов одних и тех же доноров, показало, что параметр F^r (столбец 5, табл.4) коррелирует с параметрами S_Ag. и N_{Ag (}столбцы 5 и 6, табл.5). Таким образом, два метода (анализ перемещения хромосом и анализ структуры ядрышка) отражают один и тот же процесс: активацию лимфоцитов при инкубации с определенными фрагментами ДНК.

Таблица 5. Результат воздействия различных образцов ДНК на структуру ядрышка культивируемых лимфоцитов

*) - проводили сравнение образцов c ДНКазой1 и тех же интактных образцов; **) - выборки достоверно не различаются.

Более детальный анализ данных табл.4 и 5 выявил некоторые различия в относительных количественных характеристиках эффектов, определяемых двумя методами. Так, фрагменты внДНК больных РА наряду с фрагментами р (ТОрДНК), введенные в среду, примерно в одинаковой концентрации, вызывают перемещение локусов хромосом в подавляющем большинстве клеток (табл.4). Однако на активацию ядрышка фрагменты р (ТОрДНК) влияют гораздо сильнее, чем внДНК больных РА или здоровых доноров (табл.5). Это можно объяснить тем, что в составе внДНК не только ТОрДНК, но и другие последовательности ДНК способны индуцировать перемещения анализируемых прицентромерных локусов, но именно фрагменты ТОрДНК активнее других фрагментов внДНК влияют на стимуляцию синтеза рРНК.

Таким образом, мы установили, что фрагменты ТОрДНК обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты. Стимулирующее действие р (ТОрДНК) сопровождается изменением ряда биохимических показателей, отражающих функционирование клеточной популяции. Мы обнаружили, что в присутствии р (ТОрДНК) (50 нг/мл) наблюдается увеличение количества РНК в клетке в среднем на (37 ± 16) % (N=4, данные для лимфоцитов четырех доноров). Этот результат хорошо совпадает с данными, полученными при анализе активации ядрышка, т.к. рРНК составляет до 80% от всей клеточной РНК. Вместе с тем, можно отметить тенденцию к снижению общего количества РНК в лимфоцитах ЗД при инкубации с ДНК E. coli на 3 - 10%, по сравнению с контролем (N=4, различия недостоверны). Однако, при анализе активации ядрышка при действии ДНК E. coli в части клеток наблюдали увеличение синтеза рРНК.

Действие рибосомного повтора на лимфоциты трех доноров сопровождается снижением активности каспазы 3 в клеточных лизатах на (23 ±9) % (N=3). В лимфоцитах одного из 4-х доноров в присутствии р (ТОрДНК) активность каспазы 3 возрастала на 10% (различия с контролем недостоверны). В присутствии ДНК E. coli активность каспазы 3 возрастает в среднем на (20 ± 8) % (N=4). Таким образом, ДНК E. coli в концентрации 50 нг/мл индуцирует апоптоз в части клеток, в отличие от р (ТОрДНК), которая снижает уровень спонтанного апоптоза в лимфоцитах.

ТОрДНК повышает активность клеточных нуклеаз в среднем на (40 ± 8) % (N=4), а ДНК E. coli в среднем - на (32 ± 16) % (N=4). Таким образом, и р (ТОрДНК) и ДНК E. coli вызывают увеличение нуклеазной активности в клетках. Вероятно, возрастание нуклеазной активности является одним из возможных защитных механизмов клетки при накоплении как фрагментов чужеродной бактериальной ДНК, так и эндогенных продуктов разрушения клеток. Обладая пониженной чувствительностью к действию нуклеаз, ТОрДНК может способствовать активации нуклеазного гидролиза других фрагментов ДНК, попадающих во внеклеточное пространство при апоптозе.

Одним из показателей активации клеток иммунной системы является синтез цитокинов. Мы проанализировали изменение концентрации в среде культивирования лимфоцитов двух хорошо изученных белков - ИЛ-6 и ФНО-. На рис.3 показано, что р (ТОрДНК) стимулирует синтез значительно большего количества ИЛ-6 по сравнению с ДНК E. coli; яДНК не индуцирует синтез ни ИЛ-6, ни ФНО-. В отличие от ИЛ-6, для синтеза ФНО- ДНК E. coli оказалась гораздо более сильным стимулятором, чем ТОрДНК. (рис.3).

Рис.3. Концентрация ИЛ-6 (А) и активность ФНО- (Б) в среде культивирования лимфоцитов после инкубации в течение 24 часов в присутствии 2 мкг/мл (А) или 200 нг/мл (Б) образцов ДНК, указанных на рисунке.

Определение клеточных сигнальных путей, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты человека.

Далее мы постарались ответить на вопрос, какие клеточные сигнальные пути активируются в клетке в присутствии фрагментов ТОрДНК. Известно, что фрагменты ДНК, содержащие неметилированные CpG-мотивы, обладают способностью связываться с белками семейства "Toll-like" рецепторов, обозначаемыми как TLR9. Эти рецепторы расположены в эндосомах. Для блокирования связывания ДНК с рецепторами использовался ингибитор хлорокин в концентрации 2 ммоля/л, который изменяет рН в эндосомах. При добавлении в среду культивирования лимфоцитов (предварительно инкубированных с хлорокином) фрагментов р (ТОрДНК) не наблюдали перемещения локусов хромосом, активации ядрышка или увеличения активности ФНО-. Таким образом, можно предполагать, что ТОрДНК реализует стимулирующее действие через рецепторы, расположенные в эндосомах.

Чтобы проверить предположение об участии в проведении сигнала именно рецепторов TLR9, мы провели эксперимент, в котором проведение сигнала через TLR9 конкурентно ингибировали супрессорным олигонуклеотидом (2088) без изменения рН в эндосомах. При добавлении р (ТОрДНК) (50 нг/мл) к среде культивирования лимфоцитов, содержащей супрессорный олигонуклеотид (3 мкг/мл), мы не наблюдали эффекта перемещения прицентромерных локусов хромосом. При этом тестировали активацию ядрышка: средняя площадь окрашенных серебром ЯОР возрастала в 1,5 раза, среднее число ядрышек на ядро - в 5 раз. Активность ФНО- в среде возрастала в 1,2 раза. При отсутствии олигонуклеотида-супрессора активность ФНО- увеличивалась в 3,5 раза. Подобная ситуация позволяет высказать предположение, что в эндосомах существует еще один тип рецепторов, связывающих определенные мотивы в ТОрДНК. Взаимодействие ТОрДНК с этими рецепторами не сопровождается перемещением анализируемых локусов хромосом и стимуляцией синтеза ФНО-, но существенно влияет на активность ядрышка.

Предположение о существовании дополнительных рецепторов для связывания рибосомного повтора подтверждается при исследовании изменения экспрессии TLR9 в лимфоцитах в присутствии р (ТОрДНК) методом real-time ПЦР. Данные приведены на рис.4.

Рис.4. Количество мРНК TLR9 в лимфоцитах (А) и эмбриональных фибробластах кожи (Б) после стимуляции различными фрагментами ДНК (50 нг/мл, 24 часа). Количество мРНК в вариантах опыта измеряли относительно количества мРНК в контроле

ДНК Е. coli является известным лигандом, взаимодействующим с рецепторами TLR9. При действии фрагментов ТОрДНК и ДНК Е. coli на лимфоциты наблюдается увеличение количества мРНК белка TLR9 соответственно в 2,8 и в 5,4 раза (рис.4). Таким образом, ДНК Е. coli. является более сильным стимулятором экспрессии TLR9, чем р (ТОрДНК). Кроме того, мы обнаружили, что ТОрДНК стимулирует экспрессию TLR9 и в клетках неиммунной природы, какими являются, например, эмбриональные фибробласты (рис.4). Как и в случае лимфоцитов, экспрессия TLR9 в присутствии ДНК E. coli выше, чем в присутствии р (ТОрДНК). Мы обнаружили, что хлорокин полностью блокирует синтез мРНК TLR9 при действии на лимфоциты ДНК Е. coli (рис.4). При стимуляции лимфоцитов фрагментами рибосомного повтора количество мРНК в присутствии хлорокина снижалось на 20%, но тем не менее, в 2 раза превышало контрольные значения (рис.4).

На наш взгляд, возможны два объяснения столь различного действия р (ТОрДНК) и ДНК Е. coli на транскрипцию гена TLR9 в лимфоцитах. Во-первых, можно предположить наличие дополнительных рецепторов для ТОрДНК, которые расположены не в эндосомах, а на поверхности клетки. Во-вторых, возможно, не столь высокая экспрессия TLR9 при действии р (ТОрДНК) по сравнению с ДНК E. coli - один из вариантов приспособительной реакции организма, противодействующей активации клеток продуктами их распада. Механизмы реализации приспособительной реакции еще не исследованы, и их изучение требует дальнейшего осмысления. Например, нельзя исключить, что экспрессия TLR9 подавляется какими-то ингибиторными молекулами, нарабатывающимися в результате воздействия на клетки ТОрДНК.

Антитела к фрагментам ТОрДНК.

В предыдущем разделе мы показали, что фрагменты рибосомного повтора обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты. Логично предположить, что в организме должны существовать механизмы блокирования стимулирующего действия фрагментов рибосомного повтора. В сыворотке крови здоровых людей обнаружены анти-ДНК антитела (аД-антитела) к бактериальным ДНК, которые отличаются от аД-антител, наблюдаемых при аутоиммунной патологии, специфичностью к эпитопам ДНК и другими свойствами [Pisetsky et al., 1999].

Для поиска сывороточных антител к фрагментам ТОрДНК мы использовали вариант ИФА на ДНК-связывающих мембранах. На фильтры наносили одинаковые количества денатурированных и нативных образцов р (ТОрДНК) и тот-ДНК человека и обрабатывали разведенной сывороткой с последующим выявлением ДНК-белкового комплекса вторичными антителами к иммуноглобулину G, конъюгированными с пероксидазой (рис.5). В случае сыворотки больного СКВ (вверху слева) примерно одинаковые сигналы тестируются для всех образцов ДНК, так как при СКВ в сыворотке присутствуют аД-аутоантитела, которые узнают определенную конформацию ДНК, независимо от последовательности оснований [Pisetsky et al., 1999].

Рис.5. Доказательство присутствия в сыворотке здоровых людей антител к ТОрДНК, отличных от аД-антител больных СКВ.А.