Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
На фильтры 1-4 нанесено по 60 нг на пятно образцов ДНК (по три пятна для образца). Обозначения ДНК слева: буквы ss и ds - соответственно денатурированные и нативные образцы ДНК. Фильтры 1 и 3 - обрабатывали сывороткой больного СКВ, фильтры 2 и 4 - сывороткой донора. Разведение сывороток - 1: 200. Фильтры 1 и 2 - отмывку солевым раствором не применяли; фильтры 3 и 4 - применили отмывку 1,5 М раствором NaCl.Б. Средние интенсивности пятен, определенные для фильтров 1 и 2. Черные столбики - фильтр 1 (СКВ), серые - фильтр 2 (донор)
В случае использования сывороток здоровых людей мы обнаружили устойчивые к действию 1,5 M NaCl сигналы на образцах ТОрДНК и практически полное отсутствие сигнала на денатурированной геномной ДНК (рис.5).
Чтобы подтвердить специфичность аД-антител в сыворотке здоровых доноров к определенным эпитопам ДНК, мы протестировали 8 образцов двуспиральной ДНК, нанесенных на один фильтр (рис.6). Только два образца - ETS-18SрДНК и ДНК E. coli дали воспроизводимый для сывороток здоровых доноров сигнал. Вместе с тем, все 8 образцов взаимодействовали с аД-антителами сыворотки больного СКВ. Эти опыты говорят о том, что основная часть аД-антител в сыворотке больных СКВ связывается с эпитопами ДНК, имеющими определенную конформацию, независимо от последовательности оснований. Полученные данные позволяют утверждать, что обнаруженные антитела специфично вырабатываются в ответ на присутствие GC-богатых последовательностей ТОрДНК.
Рис.6. Сигналы, полученные при обработке 8 образцов ДНК, нанесенных на один фильтр в количестве 100 нг (по 3 пятна для образца) сывороткой СКВ (черные столбики) и донора (серые столбики) взятых в разведении 1: 200.
Более подробно мы исследовали взаимодействие аД-антител сыворотки здорового донора с фрагментом ETS-18SрДНК, который включает промоторный участок, внешний транскрибируемый спейсер и ген 18SрДНК. На рис.7 приводятся зависимости сигнала от количества ДНК в пятне, полученные для разных разведений сыворотки. Для приблизительной количественной оценки взаимодействия аД-антител с ETS-18SрДНК использовали упрощенную модель, в которой это взаимодействие рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной степенью связывания, что позволяет применить уравнение Скэтчарда. Эти допущения помогают оценить нижние значения Касс комплекса аД-антител с ETS-18SрДНК: 5*109 М-1.
Прогрев сыворотки (550С, 30мин.) не влияет на образование комплекса. Предварительная обработка сыворотки ДНКазой 1 с последующей инактивацией фермента прогреванием, приводит к увеличению сигнала в среднем в 1,4 раза.
Рис.7. Взаимодействие аД-антител сыворотки здорового донора с ETS-18SрДНК. Зависимость сигнала от количества ДНК в пятне, полученная для разных разведений сыворотки (указаны на рис.).
Каждая точка на графиках - среднее значение для пяти пятен ДНК. Средняя стандартная ошибка составляет (10 5) % от измеряемой величины
Таким образом, ДНК-антитела к ETS-18SрДНК в сыворотке здоровых доноров присутствуют как в свободном, так и в связанном с внеклеточной ДНК виде.
Заключение
В ходе проведенного исследования обнаружены ранее не известные свойства внДНК человека, что позволяет высказать некоторые предположения о возможных функциях внДНК в организме. Мы установили, что в составе внДНК как облученных, так и необлученных людей накапливается СpG-богатая неметилированная последовательность ТОрДНК. У 54% облученных людей содержание ТОрДНК во внДНК увеличено по сравнению с содержанием во внДНК необлученных доноров. Напротив, содержание АТ-богатой последовательности сателлита 3 во внДНК снижено.
В плазме крови 22% облученных людей увеличена концентрация фрагментов ТОрДНК и, вероятно, других GC-богатых последовательностей генома. Мы предположили, что увеличение концентрации этих последовательностей в крови не безразлично для иммунной системы организма, так как ТОрДНК содержит большое число неметилированных CpG-мотивов связывания с "toll"-рецепторами TLR9, которые представлены в иммунных клетках. Для подтверждения этого предположения мы провели серию опытов на модельной клеточной системе - выделенные лимфоциты здоровых доноров, культивируемые в присутствии фрагментов внДНК человека и модельных фрагментов ДНК с различной последовательностью.
Было показано, что фрагменты внДНК и фрагменты ТОрДНК в небольших концентрациях обладают выраженным стимулирующим действием на лимфоциты человека in vitro. Результатом действия внДНК и ТОрДНК на популяцию лимфоцитов является изменение структуры хроматина в первые часы культивирования в большом числе клеток, которое выражается в перемещении прицентромерных локусов 1-й хромосомы от мембраны внутрь ядра и в увеличении числа окрашиваемых серебром плотных фибриллярных центров ядрышка и их площади. Активация лимфоцитов фрагментами ТОрДНК сопровождается значительным увеличением продукции ИЛ-6 и, в меньшей степени, ФНО-. Кроме того, обнаружено увеличение количества общей РНК клетки и количества мРНК TLR9, снижение активности каспазы 3 и возрастание нуклеазной активности в клеточных лизатах.
При анализе действия фрагментов ДНК на клетки очень важно определить возможные рецепторы ДНК, через которые активируются клеточные сигнальные пути. Несомненно, рецепторы TLR9 принимают участие в реализации действия ТОрДНК на клетки. Блокирование этих рецепторов ингибиторами (хлорокин и олигонуклеотид-супрессор) сопровождается исчезновением эффектов перемещения хромосом в ядре и стимуляции синтеза ФНО- при действии ТОрДНК. Однако активация ядрышка в присутствии ТОрДНК при блокировании TLR9 олигонуклеотидом-супрессором сохраняется.
Сравнительный анализ стимулирующего действия одинаковых количеств известного лиганда для TLR9 - ДНК Е. coli и ТОрДНК на лимфоциты, выявил существенные различия. При действии ТОрДНК структурная перестройка ядра и активация ядрышка наблюдаются в заметно большем числе клеток и при меньших концентрациях стимулирующих фрагментов ДНК. Продукция ИЛ-6 в присутствии ТОрДНК на порядок выше, а активность ФНО?- на порядок ниже, чем при культивировании лимфоцитов с ДНК Е. coli. ДНК Е. coli, в отличие от ТОрДНК, стимулирует увеличение активности каспазы 3, т.е. индуцирует апоптоз в части клеток. Бактериальная ДНК является гораздо более сильным стимулятором экспрессии TLR9, чем ТОрДНК. Стимуляция экспрессии TLR9 фрагментами ДНК Е. coli, в отличие от стимуляции фрагментами ТОрДНК, полностью блокируется в присутствии ингибитора TLR9 - хлорокина.
Совокупность вышеизложенных фактов позволяет предположить, что фрагменты ТОрДНК воздействуют на клетки не только через TLR9. Несомненно, существуют еще какие-то рецепторы для ДНК, через которые реализуется стимулирующее действие фрагментов ТОрДНК на лимфоциты. В последние годы в литературе появилось несколько работ, в которых высказывается такое же предположение [Yasuda et al., 2005; McCoy et al., 2004; Cortez-Gonzalez et al., 2006].
Схема на рис.9 объединяет наши данные и данные литературы относительно возможных путей сигнализации при взаимодействии клеток с внДНК. О природе не-TLR9-рецепторов для внДНК пока известно очень мало. Предполагается, что это могут быть белки, аналогичные RIG-1 (retinoic acid inducible gene 1), который принимает участие в связывании вирусной РНК. Наши данные указывают на то, что эти неизвестные рецепторы, как и TLR9, расположены в эндосомах. Их активация сопровождается увеличением синтеза рРНК и мРНК TLR9 в клетке. Наличие нескольких типов рецепторов для связывания внДНК может иметь значение для эффективной деградации избыточных количеств внДНК крови.
Рис.8. Регуляция клеточного ответа на интенсификацию процессов гибели клеток в организме при длительном воздействии небольших доз повреждающих агентов.
Радиация индуцирует гибель клеток организма. Фрагменты хроматина погибших клеток появляются в крови, где гидролизуются до более коротких фрагментов эндонуклеазами. Рибосомный повтор относительно устойчив к фрагментации, циркулирует в виде более длинных фрагментов и медленнее элиминируется. Происходит постепенное увеличение концентрации ТОрДНК в крови, при этом общая концентрация внДНК может существенно не изменяться или снижаться. При достижении определенной концентрации ТОрДНК взаимодействует, как минимум, с двумя типами рецепторов в эндосомах: известные рецепторы TLR9 и, пока неописанные, рецепторы Х. Результатом взаимодействия является ответ клеток организма, который включает временное снижение уровня апоптоза, увеличение активности клеточных эндонуклеаз, дополнительную экспрессию рецепторов, опознающих CpG-ДНК, и проводников сигнала (Myd88). Кроме того, активируется синтез антител к CpG-ДНК. Негативным результатом накопления ТОрДНК и других CpG-ДНК в крови является синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО
