Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями
Разработка эффективных систем регистрации мутаций в генах и анализ их частот встречаемости. Изучение алгоритма молекулярно-генетического диагностики распространенных ферментопатий из группы аутосомно-рецессивных поясно-конечностной мышечной дистрофии.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 02.08.2018 |
| Размер файла | 1008,6 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН
На правах рукописи
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями
03.02.07 -- генетика
Рыжкова Оксана Петровна
Москва - 2011
Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН
Научный руководитель - кандидат медицинских наук, Щагина Ольга Анатольевна
Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор, Дадали Елена Леонидовна
Официальные оппоненты
доктор медицинских наук, профессор, Петрин Александр Николаевич
доктор медицинских наук, профессор, Иллариошкин Сергей Николаевич
Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита состоится «07» марта 2011г. в 14 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,1)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.
Автореферат разослан 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.
Характеристика работы
Актуальность темы
Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа клинически полиморфных и генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов. Частота всех ПКМД колеблется в различных популяциях от 5 до 70 больных на 1 млн. населения (Дадали Е.Л., Щагина О.А, 2010). К настоящему времени описано 20 генетических вариантов ПКМД, которые подразделяются в зависимости от типа наследования на две подгруппы: ПКМД 1 типа с аутосомно - доминантным и ПКМД 2 типа - с аутосомно-рецессивным типом наследования. Большая часть выявленных случаев ПКМД (до 85%) наследуется по аутосомно-рецессивному типу (Ginjaard H.B., 2000). К настоящему времени практически все гены, ответственные за возникновение ПКМД, идентифицированы и определены белковые продукты их экспрессии. Установлено, что большинство этих продуктов являются частью саркомеры или сарколеммы мышечного волокна и, взаимодействуя друг с другом, формируют белковую цепь, обеспечивающую процесс сокращения и расслабления мышечного волокна (Vainzof М., 2008). Наряду с этим существует ряд белков, выполняющих роль ферментов, активирующих и синхронизирующих функции структурных белков в процессе мышечного сокращения и сигнальной трансдукции. На сегодня известно два основных фермента мышечного волокна: кальпаин 3 типа, мутации в котором приводят к возникновению ПКМД 2А типа, и фукутин-связанный белок, мутации в котором приводят к ПКМД2I типа (Tidball J.G. & Spencer M.J, 2000), (Esapa C.T., 2002).
Показано, что в большинстве европейских популяций наиболее распространенным генетическим вариантом ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования является 2A тип (OMIM: 253600), обусловленный мутациями в гене кальпаина 3 (CAPN3), на долю которого приходится от 30% до 40% всех случаев этой группы заболеваний (Canki-Klain N., 2004; Cobo A.M., 2004; Duno M., 2008). Вторым по частоте генетическим вариантом является ПКМД2I типа, обусловленная мутациями в гене FKRP который составляет от 6% до 38% аутосомно-рецессивных ПКМД в разных популяциях. Наиболее часто этот вариант ПКМД диагностируется в странах северной Европы (Hanisch F., 2005). Таким образом, по данным литературы в Европе на долю двух указанных ферментопатий приходится до 50% всех ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.
Вследствие того, что белковые продукты генов, мутации в которых приводят к развитию аутосомно-рецессивных ПКМД, участвуют в одном патогенетическом процессе, клинические проявления всех генетических вариантов этой группы заболеваний характеризуется значительным сходством, что затрудняет их дифференциальную диагностику и снижает эффективность медико-генетического консультирования (Дадали Е.Л., 2004). Возникают трудности в установлении типа наследования заболевания в изолированных случаях, расчетах повторного риска рождения больного ребенка и планировании профилактические мероприятия в отягощенных семьях. Все это обуславливает необходимость создания алгоритма дифференциальной диагностики ПКМД с использованием молекулярно-генетических методов. Наличие такого алгоритма позволит определить очередность исследования мутаций в тех или иных генах, ответственных за развитие различных вариантов ПКМД, что существенно снизит экономические затраты при использовании дорогостоящих методов ДНК анализа. В основу такого алгоритма могут быть положены различия в частотах встречаемости отдельных генетических вариантов ПКМД и особенности их клинических проявлений. Проведение таких исследований наиболее целесообразно начинать с клинико-генетического анализа наиболее распространенных аутосомно-рецессивных вариантов ПКМД, к которым, по данным литературы, относятся две ферментопатии - ПКМД2А и 2I типов.
Однако до настоящего момента в РФ не проводилось исследований, направленных на определение вклада этих ферментопатий в общий спектр заболеваний с клинической картиной ПКМД и не анализировались особенности их клинических проявлений.
Цель исследования
Клинико-генетический анализ двух наследственных ферментопатий из группы ПКМД 2А и 2I типов и разработка алгоритмов их молекулярно-генетической диагностики на основании обследования выборки больных, проживающих на территории РФ.
Задачи исследования
1. Определение частоты встречаемости ПКМД 2А и 2I, обусловленных мутациями в генах CAPN3, FKRP в выборке больных, проживающих на территории РФ.
2. Разработка эффективных систем регистрации мутаций в CAPN3, FKRP генах и проведение анализа их спектра и частот встречаемости.
3. Анализ частот встречаемости основных клинических симптомов характерных для различных вариантов ферментопатий, обусловленных мутациями в генах CAPN3 и FKRP.
4. На основании полученных результатов и анализа литературных данных разработать алгоритм молекулярно-генетического диагностики распространенных ферментопатий из группы аутосомно-рецессивных ПКМД.
Научная новизна
Впервые в выборке больных с ПКМД, проживающих на территории РФ проведен анализ спектра и частот встречаемости мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за возникновение двух ферментопатий из группы мышечных дистрофий - ПКМД 2А и 2I типов. Установлен вклад мутаций этих генов в структуру заболеваемости ПКМД с АР типом наследования. Выявлено наличие «горячих» экзонов и мажорных мутаций в гене CAPN3 и FKRP и разработана система их регистрации. Впервые, на основании анализа гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель, определены причины распространенности частых мутаций и проведена оценка возраста возникновения мутации с.550delA, на долю которой приходится 49% всех мутаций в гене CAPN3 у российских больных с ПКМД 2А типом. На основании полученных оценок распространенности и особенности клинических проявлений двух ферментопатий из группы ПКМД, разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики распространенных ферментопатий у больных с ПКМД.
Практическая значимость
Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики распространенных генетических вариантов аутосомно-рецессивных ферментопатий с фенотипом ПКМД. Созданы эффективные диагностические системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за возникновение ПКМД 2А и 2I типов, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.
Положения, выносимые на защиту
1. На долю ПКМД 2А типа, обусловленой мутациями в гене CAPN3 и ПКМД 2I типа, обусловленой мутациями в гене FKRP приходится 43% и 9% всех изолированных ПКМД соответственно.
2. В выборке российских больных с ПКМД 2А типа выявлены две мажорные мутации гене в CAPN3 - с.550delA и с. 598-612del15, которые обнаружены в 35% случаев (23% мутантных аллелей). Показано, что причиной высокой частоты мутации с.550delA является эффект основателя. Возраст мутации составляет 1700±500 лет.
3. Основной причиной возникновения ПКМД2I у больных, проживающих на территории РФ, является мутация Leu276Ile в гене FKRP.
4. Не выявлены статистически достоверные отличия по частотам основных неврологических симптомов в группах больных с мутациями генов CAPN3 и FKRP, что свидетельствует о невозможности их разграничения только на клиническом уровне.
5. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой ПКМД и эффективные системы диагностики частых мутаций в генах CAPN3 и FKRP, ответственных за их возникновение.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференции European Human Genetics Conference 2010, на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009, на конференции European Human Genetics Conference 2009.
Личный вклад автора в проведение исследования
Автором проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично принимал участие в планировании экспериментов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, проводил поиск мутаций, генотипирование контрольной выборки на неописанные ранее точечные замены, анализ гаплотипов хромосом с частыми мутациями в генах CAPN3 и FKRP. Автором разработана система диагностики 2 частых мутаций гена CAPN3, разработан алгоритм молекулярно-генетического анализа больных изолированной ПКМД из РФ. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 8 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.
Внедрение результатов работы
Результаты диссертационной работы по анализу генетического и фенотипического разнообразия распространенных ферментопатий в группе ПКМД были внедрены в практику медико-генетического консультирования при МГНЦ РАМН.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение собственных исследований, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 89 источников: 1 отечественный и 88 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 20 рисунками.
Содержание работы
Материалы исследования
Для исследования использовали образцы геномной ДНК 75 неродственных больных в возрасте от 4 до 36 лет (30 мужчин и 45 женщин), с диагнозом поясно-конечностная мышечная дистрофия и 14 их клинически здоровых родственников, живущих в разных регионах РФ. Шесть пациентов имели подтвержденный аутосомно-рецессивный тип наследования (семейные случаи), остальные случаи заболевания были спорадическими. Диагноз ПКМД верифицирован врачами-генетиками Медико-генетического научного центра РАМН, а так же Воронежской медико-генетической консультации.
Контрольную выборку составили 100 образцов (200 хромосом) полученных от неродственных индивидов различных регионов РФ. Кроме того, в качестве группы сравнения для расчета возраста мутации использованы образцы ДНК членов 24 ядерных семей (96 хромосом) из различных регионов РФ
Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom TM из образцов периферической крови.
Исследование генов CAPN3 и FKRP проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификацию необходимых фрагментов геномной ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Все фрагменты были секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы Chromas.
При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом мультиплексной пробзависимой лигазной реакции.
При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене CAPN3 выбраны 7 микросателлитных маркеров с высокой гетерозиготностью, расположенных в области размером 5791 т.п.н. (3,22 сМ) вокруг гена CAPN3, 4 из которых расположены в сторону центромеры от гена и 3 - в сторону теломеры. При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене FKRP выбрано четыре микросателлитных маркера с высокой гетерозиготностью, расположенных в интервале 1980 т.п.н. (2,58 сМ) вокруг гена FKRP, два из которых расположены в сторону центромеры от гена и два в сторону теломеры. Так же для построения гаплотипа использованы внутригенные маркеры (FKRP 3' GT - двухнуклеотидный повтор в 3' области гена и полиморфизм c.135C>T (rs2287717)). Для каждого из маркеров были выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении.
При сравнении частот аллелей в хромосомах с мутацией и в популяционных хромосомах использован 2 тест для двупольной таблицы, а так же точный критерий Фишера для случаев, когда критерий 2 неприменим при малом числе наблюдений.
Для оценки неравновесности по сцеплению использовали oценку = (PD - PN)/(1 - PN), где - мера неравновесности сцепления, PD - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, PN - частота этого же аллеля среди нормальных хромосом (Bengtsson B.O., 1981), c доверительным интервалом, предложенным Diaz G.A. с соавт. (2000).
Для определения возраста частой мутации гена CAPN3 с.550delA применяли один из подходов, основанных на понятии «генетических часов» (Labuda D., 1997), и оценивающий количество поколений g (Rish N., 1995) с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени.
Результаты и обсуждение
Молекулярно-генетический анализ
В результате проведенного исследования выборки больных с изолированной поясно-конечностной мышечной дистрофией с отсутствием вертикального типа наследования оценена доля генетических вариантов, обусловленных мутациями генов, кодирующих ферменты, функционирующие в мышечном волокне и участвующих в процессе мышечного сокращения и сигнальной трансдукции. Показано, что на долю мутаций гена CAPN3, ответственного за возникновение ПКМД2А типа приходится 43,2% случаев заболевания, мутации гена FKRP являются причиной ПКМД в 9,5%случаев.
Полученные результаты соответствуют литературным данным о частотах встречаемости данных генетическиз вариантов.
Молекулярно-генетический анализ ПКМД2A типа
В гене CAPN3, мутации которого ответственны за развитие ПКМД2A типа обнаружены 24 различные мутации на 61 хромосоме у 32 больных. 19 мутаций описаны ранее, а пять идентифицированы впервые. Полученные результаты суммированы в табл. 1.
Таблица 1. Спектр выявленных мутаций гена CAPN3
|
№ экзона / интрона |
Мутация |
Кол-во хромосом |
Ссылки |
||
|
нуклеотид |
аминокислота |
||||
|
1 |
c.107delG |
p.Gly36ValfsX21 |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
1 |
с.145С>T |
p.Arg49Cys |
1 |
Groen E.J. et al., 2007 |
|
|
2 |
с.319G>A |
p.Glu107Lys |
1 |
Richard I. et al., 1999 |
|
|
4 |
c.550delA |
p.Thr184ArgfsX36 |
30 |
Richard I. et al., 1999 |
|
|
4 |
c.598_612del |
p. Phe200_Leu204del |
4 |
Todorova A. et al., 2005 |
|
|
5 |
c.649G>A |
p.Glu217Lys |
3 |
Pollitt C. et al., 2001 |
|
|
7 |
с.1002delC |
p.His334GlnfsX11 |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
8 |
c.1063C>T |
p.Arg355Trp |
1 |
Krahn M. et al., 2006 |
|
|
8 |
c.1079G>A |
p.Trp360X |
1 |
Krahn M. et al., 2006 |
|
|
8 |
c.1106G>A |
p.Trp369X |
1 |
Todorova A. et al., 2005 |
|
|
8 |
c.1043delG |
p.Gly348ValfsX4 |
1 |
Todorova A. et al., 2005 |
|
|
8 |
с.1113T>A |
p.Asp371Glu |
1 |
Richard I. et al., 1999 |
|
|
9 |
c.1128G>A |
p.Trp376X |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
10 |
c.1250C>T |
p.Thr417Met |
1 |
Krahn M. et al., 2006 |
|
|
10 |
c.1333G>A |
p.Gly445Arg |
1 |
Guglieri M. et al., 2008 |
|
|
11 |
c.1465C>T |
p.Arg489Trp |
1 |
Urtasun M. et al., 1998 |
|
|
11 |
c.1471A>T |
p.Lys491X |
1 |
Richard I. et al., 1999 |
|
|
13 |
c.1558_1559delCT |
p.Leu520AlafsX56 |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
14 |
с.1746-20С>T |
Сайт сплайсинга |
2 |
Krahn M. et al., 2006 |
|
|
16 |
с.1914+10С>T |
Сайт сплайсинга |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
17 |
с.1981delA |
p.Ile661X |
1 |
Richard I. et al., 1999 |
|
|
21 |
c.2207_2208delCA |
p.Thr736ArgfsX28 |
2 |
Piluso G. et al., 2005 |
|
|
21 |
c.2243G>A |
p.Arg748Gln |
1 |
Richard I et al., 1999 |
|
|
22 |
c.2306G>A |
p.Arg769Gln |
2 |
Richard I. et al., 1995 |
|
|
Всего |
24 |
61 |
Все впервые выявленные мутации обнаружены у единичных больных. Три мутации c.107delG, с.1002delC, c.1558_1559delCT являются делециями, приводящими к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. Одна из мутаций - c.1128G>A - является нонсенс-мутацией. Неописанная ранее замена цитозина на тимин в интроне 16 (с.1915+10С>T) является, мутацией сайта сплайсинга.
Мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии идентифицированы у 29 больных, у 3 больных выявлена всего одна мутация в гетерозиготном состоянии. Однако, наличие характерной клинической картины у пациентов, позволяет сделать предположение, что причиной развития заболевания являются именно мутации в гене CAPN3. Можно так же предположить, что вторая мутация находится в регуляторных областях гена, на данный момент не доступных исследованию, или является протяженной делецией, не затрагивающей участок гена гомологичный тому, где мутация была выявлена.
Выявлены «горячие» экзоны гена CAPN3, мутации в которых встречаются достоверно чаще, чем в других - 1, 4, 5, 8, 10, 11, 20, 22 экзоны. В экзонах 3, 6, 12, 15, 18, 19, 20, 23, 24 мутаций не обнаружено, однако, по литературным данным, мутации в данных экзонах встречаются и, вероятнее всего, они не выявлены в связи с малым размером выборки ( рис. 1).
Рис. 1. Распределение выявленных мутаций по экзонам гена CAPN3.
Примечание: В квадратах, условно обозначающих экзоны, цифрами обозначено количество выявленных мутаций в данном экзоне. Если одна и та же мутация встречается более 1 раза, она помечена цифрой в графическом ее изображении.
На «горячие» экзоны приходится 53 из 61 хромосом с мутацией, что составляет 86,9%. При молекулярно-генетической диагностике данных экзонов обнаруживается хотя бы одна из «мутантных» хромосом у всех больных ПКМД2А. Информативность анализа «горячих» экзонов в данном исследовании составляет 43,2% от всей выборки. (табл.2)
Обнаружены две частые мутации, встретившиеся на 4 и более хромосомах. Одна их них, мутация с.598_612del, встретилась у 4 больных с изолированной ПКМД, что составило 5,4%, на 4 хромосомах (2,7%). Среди больных ПКМД2А данная мутация обнаружена в 12,5% случаев (6,3% хромосом с мутацией). Другой частой мутацией в гене CAPN3 является мутация c.550delA, которая обнаружена у 23 из 74 больных, что составляет 31,1%, на 30 хромосомах (20,3%). Среди 32 больных с установленным диагнозом ПКМД2А мутация с.550delA встретилась хотя бы в одном аллеле у 23 больных, то есть у 71.9% больных ПКМД2A, при этом в данной группе она встретилась на 46,9% хромосом (табл.2)
Таблица 2. Результаты анализа гена CAPN3.
|
всего |
«горячие экзоны» гена CAPN3 |
мутация с.550delA |
мутация с.598_612del |
2 частые мутации гена СAPN3 |
||
|
Кол-во пациентов |
32 |
32 |
23 |
4 |
26 |
|
|
Кол-во хромосом |
61 |
34 |
30 |
4 |
34 |
Для выявления двух частых мутаций, характерных для больных из РФ, обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81,2% случаев среди всех больных ПКМД2А (55,7% хромосом с мутациями), был разработан быстрый, дешевый и эффективный метода их диагностики, основанный на ПДАФ-анализе. (рис. 2).
В работах европейских авторов (Германии, Чехии, Хорватии, Болгарии и Италии) так же имеются описания мутации с.598_612del, другими авторами данная мутация не упоминается. Из этого можно сделать предположение, что причиной распространения данной мутации в указанном регионе является эффект основателя.
Мутация с.550delA встречается среди больных во всем мире, однако, по литературным данным, она особенно часто встречается в странах Восточной Европы, таких как Болгария, Хорватия, Украина, что может говорить об эффекте основателя как о причине распространения мутации в этом регионе, а так же о довольно большом возрасте мутации.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рис. 2. Система идентификации двух частых мутаций гена CAPN3, с.550delA и c.598_612del методом ПДАФ - анализа
Чтобы установить природу высокой частоты мутации с.550delA у российских больных, проведен анализ частот встречаемости аллелей 7 микросаттелитных маркеров, лежащих вблизи гена CAPN3, на хромосомах с мутацией и без мутации. Из табл. 3 видно, что полное неравновесие по сцеплению не обнаружено ни по одному маркеру. Неравновесие по сцеплению наблюдается по шести из семи исследованных маркеров D15S994 - D15S968 - D15S514 - D15S779 - D15S780 - D15S778.
Таблица 3. Аллельные частоты (%) микросаттелитных маркеров из области гена CAPN3 на хромосомах с мутацией c.550delA и популяционной выборке жителей РФ.
|
Маркер |
D15S994 |
D15S968 |
D15S514 |
D15S779 |
D15S780 |
D15S778 |
D15D659 |
||||||||
|
Mb |
38.370 |
38.433 |
39.998 |
40.201 |
40.977 |
43.834 |
44.161 |
||||||||
|
cM |
40.25 |
40.25 |
43.47 |
||||||||||||
|
зд. |
бол. |
зд. |
бол. |
зд |
бол. |
зд. |
бол. |
зд. |
бол. |
зд. |
бол. |
зд. |
бол. |
||
|
Кол-во хромосом |
166 |
23 |
166 |
23 |
96 |
23 |
96 |
23 |
96 |
23 |
96 |
23 |
166 |
23 |
|
|
аллель |
|||||||||||||||
|
-1 |
6,2 |
8,7 |
|||||||||||||
|
0 |
3,1 |
||||||||||||||
|
1 |
2,1 |
13,9 |
8,7 |
1,0 |
3,1 |
3,1 |
3,0 |
||||||||
|
2 |
1,0 |
11,4 |
13,0 |
31,2 |
56,5 |
30,2 |
4,3 |
2,1 |
24,1 |
4,3 |
|||||
|
3 |
9,4 |
18,7 |
4,3 |
37,5 |
17,4 |
10,4 |
24,0 |
4,3 |
15,6 |
87,0 |
22,3 |
17,4 |
|||
|
4 |
41,7 |
78,3 |
5,4 |
4,2 |
13,0 |
4,3 |
36,5 |
91,3 |
19,8 |
8,7 |
5,4 |
8,7 |
|||
|
5 |
15,6 |
4,3 |
37,3 |
65,2 |
5,2 |
4,3 |
14,6 |
5,2 |
34,4 |
3,6 |
8,7 |
||||
|
6 |
3,1 |
4,3 |
10,2 |
1,0 |
2,1 |
1,0 |
16,7 |
16,3 |
17,4 |
||||||
|
7 |
14,6 |
13,0 |
1,8 |
5,2 |
2,1 |
8,3 |
4,3 |
16,3 |
30,4 |
||||||
|
8 |
10,4 |
8,7 |
3,1 |
4,8 |
13,0 |
||||||||||
|
9 |
2,1 |
4,2 |
41,7 |
91,3 |
4,2 |
4,3 |
|||||||||
|
10 |
1,2 |
19,8 |
|||||||||||||
|
11 |
4,2 |
3,1 |
4,3 |
Примечание: Частоты аллелей с наибольшей неравновесностью по сцеплению выделены цветом; зд. - здоровые; бол. - больные.
Определены значения неравновесия по сцеплению для каждого аллеля всех исследованных маркеров, также применен точный критерий Фишера для оценки достоверности ассоциации данного аллеля маркера с локусом ПКМД2А (табл. 4).
Таблица 4. Ассоциация и неравновесие по сцеплению аллелей маркеров с локусом ПКМД2A
|
Маркер |
Mb |
cM |
аллель |
р |
95% ДИ |
|
|
D15S994 |
38.370 |
40.25 |
4 |
0.023 |
0,63+/-0,30 |
|
|
D15S698 |
38.433 |
40.25 |
5 |
0.023 |
0,44+/-0,32 |
|
|
D15S514 |
39.998 |
2 |
0.023 |
0,37+/-0,31 |
||
|
D15S779 |
40.201 |
9 |
<0.001 |
0,85+/-0,20 |
||
|
CAPN3 |
40.467 |
m |
||||
|
D15S780 |
40.977 |
4 |
<0.001 |
0,87+/-0,16 |
||
|
D15S778 |
43.834 |
3 |
<0.001 |
0,85+/-0,17 |
||
|
D15S659 |
44.161 |
43.47 |
7 |
0.08 |
0,17+/-0,24 |
Примечание: р - вероятность для одностороннего варианта точного критерия Фишера; - мера неравновесности сцепления аллелей полиморфных маркеров с локусом заболевания, ДИ - доверительный интервал
При построении гаплотипа основателя выбирались аллели характеризующиеся максимальной неравновесностью сцепления с локусом заболевания по сравнению с другими аллелями маркеров должны и имеющие большее накопление в хромосомах с мутацией по сравнению с другими аллелями. Поэтому, при определении предкового аллеля учитывали наибольшее положительное значение и наименьшее р среди всех аллелей данного маркера. Результаты представлены в табл. 5.
Таблица 5. Гаплотипы хромосом с мутацией с.550delA.
|
Маркер |
D15S994 |
D15S968 |
D15S514 |
D15S779 |
CAPN3 |
D15S780 |
D15S778 |
D15D659 |
|
|
Mb |
38.370 |
38.433 |
39.998 |
40.201 |
40.467 |
40.977 |
43.834 |
44.161 |
|
|
cM № ДНК |
40.25 |
40.25 |
43.47 |
||||||
|
13 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
7 |
|
|
63 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
7 |
|
|
30 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
7 |
|
|
61 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
3 |
3 |
7 |
|
|
77 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
2 |
|
|
8 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
8 |
|
|
78 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
3 |
|
|
75 |
4 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
8 |
|
|
8 |
5 |
5 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
3 |
|
|
44 |
4 |
2 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
4 |
|
|
44 |
4 |
2 |
2 |
9 |
m |
4 |
3 |
4 |
|
|
42 |
4 |
1 |
4 |
9 |
m |
4 |
3 |
7 |
|
|
42 |
4 |
5 |
4 |
9 |
m |
4 |
3 |
7 |
|
|
13 |
4 |
5 |
3 |
9 |
m |
4 |
3 |
8 |
|
|
12 |
7 |
8 |
3 |
9 |
m |
4 |
3 |
6 |
|
|
6205 |
4 |
5 |
-1 |
9 |
m |
4 |
3 |
5 |
|
|
23 |
7 |
3 |
5 |
9 |
m |
4 |
3 |
6 |
|
|
78 |
4 |
5 |
3 |
9 |
m |
4 |
3 |
3 |
|
|
75 |
6 |
5 |
4 |
9 |
m |
4 |
3 |
3 |
|
|
63 |
4 |
5 |
-1 |
9 |
m |
4 |
7 |
6 |
|
|
30 |
4 |
1 |
2 |
9 |
m |
3 |
4 |
5 |
|
|
61 |
4 |
8 |
3 |
4 |
m |
4 |
4 |
6 |
|
|
34 |
7 |
2 |
2 |
11 |
m |
2 |
3 |
7 |
Примечание: Красным цветом выделена сохраненная часть гаплотипа основателя: синим цветом обозначены мутантные аллели
Таким образом, наиболее вероятным представляется следующий гаплотип основателя: D15S994 - D15S968 - D15S514 - D15S779 - D15S780 - D15S778 : 4-5-2-9-4-3.
По маркерам D15S514, D15S779, D15S780 и D15S778 гаплотип большинства хромосом с мутацией в выборке российских больных идентичен гаплотипам большинства хромосом с мутацией с.550delA, исследованными европейскими авторами. Данный факт говорит в пользу предположения, что распространение мутации происходило от общего основателя, так же это подтверждается частотой встречаемости мутации и ее концентрацией в странах Восточной Европы.
При расчете возраста мутации использованы значения неравновесия по сцеплению для маркеров D15S994 и D15S968 для аллелей, у которых наблюдалась достоверная ассоциация с локусом CAPN3 и мера неравновесности сцепления аллеля данного маркера с заболеванием лежала в пределах 0,20-0,80 (табл. 6).
Таблица 6. Число поколений, прошедших с момента распространения мутации.
|
Маркер |
Mb |
cM |
аллель |
р |
g |
Кол-во лет |
|
|
D15S994 |
38.370 |
40.25 |
4 |
0.023 |
38.62 |
1160 |
|
|
D15S698 |
38.433 |
40.25 |
5 |
0.023 |
72.17 |
2160 |
|
|
Среднее значение |
55.4+/- 16.8 |
1660+/-500 |
Среднее значение числа поколений существования мутации в популяции составило 55,4 со стандартным отклонением 16,8. Средняя продолжительность одного поколения принималась равной 30 годам, соответственно время, за которое была накоплена мутация составляет около 1660 +/- 500 лет, учитывая, что средний год рождения больных 1980, период начала распространения мутации соответствует 340 году н.э., что соответствует историческим сведениям о великом переселении народов происходившем в 4 - 7 веках нашей эры на территории Европы.
Молекулярно-генетический анализ ПКМД2I типа
При исследовании всей кодирующей последовательности гена FKRP, обнаружено 5 различных мутаций на 12 хромосомах, две из которых с.341C>G и c.826C>A были описаны ранее, а три мутации - c.229C>T, с.265C>T, с.1078G>C идентифицированы впервые (табл. 7).
Мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии идентифицированы у пяти больных, у двух больных выявлена всего одна, описанная ранее, мутация с.341C>G (p.Ala114Gly) в гетерозиготном состоянии. Однако, наличие характерной клинической картины у данных пациентов, позволяет сделать предположение, что причиной развития заболевания являются мутации именно в гене FKRP. Можно так же предположить, что вторая мутация находится в регуляторных областях гена, на данный момент не доступных исследованию, или является протяженной делецией, не затрагивающей участок гена гомологичный тому, где мутация была выявлена.
Таблица 7. Спектр выявленных мутаций гена FKRP
|
Мутация |
Кол-во хромосом |
Ссылки нуклеотид |
||
|
нуклеотид |
аминокислота |
|||
|
c.229C>T |
p.Gln77X |
2 |
Впервые обнаружена |
|
|
с.265C>T |
p.Pro89Ser |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
с.341C>G |
p.Ala114Gly |
2 |
Driss A. et al., 2003 |
|
|
c.826C>A |
p.Leu276Ile |
6 |
Walter M.C. et al., 2004 |
|
|
с.1078G>C |
p.Asp360His |
1 |
Впервые обнаружена |
|
|
Всего |
5 |
12 |
Обнаружена частая мутация c.826C>A (p.Leu276Ile), встретившаяся на 6 хромосомах, то есть на 50% всех «мутантных» хромосом, обнаруженных у больных ПКМД2I типа. Чтобы установить природу высокой частоты мутации c.826C>A у российских больных проведен анализ гаплотипов всех 6 хромосом с данной мутацией, используя микросаттелитные маркеры, лежащие вблизи гена FKRP. Характеристики гаплотипов хромосом с мутацией c.826C>A представлены в табл. 8.
Таблица 8. Гаплотипы хромосом с мутацией с.826C>A.
|
Маркер |
D19S219 |
D19S412 |
FKRP 3' GT |
c.135C>T rs2287717 |
Mutation |
SLC1A5 3271 |
D19S606 |
|
|
Mb |
50.685 |
51.702 |
51.953 |
51.953 |
51.969 |
52.665 |
||
cM№ ДНK |
70.14 |
70.14 |
72.72 |
|||||
|
87 |
7 |
11 |
3 |
T |
M |
1 |
7 |
|
|
87 |
7 |
11 |
3 |
T |
M |
1 |
7 |
|
|
6928 |
7 |
11 |
3 |
T |
M |
1 |
7 |
|
|
6928 |
7 |
11 |
3 |
T |
M |
1 |
4 |
|
|
62 |
8 |
1 |
3 |
T |
M |
1 |
7 |
|
|
47 |
7 |
1 |
3 |
T |
M |
1 |
7 |
Примечание: Красным цветом выделена сохраненная часть гаплотипа основателя
На всех хромосомах, несущих мутацию, обнаружен общий гаплотип по маркерам FKRP 3' GT - FKRP c.135C>T - Mutation - SLC1A5: 3-Т-М-1, где M- мутация c.826C>A. На трех хромосомах, несущих мутацию, обнаружен общий гаплотип по всем маркерам. Из полученных результатов можно сделать вывод, что причиной распространенности мутации c.826C>A является эффект основателя.
Статистический анализ сходства клинической картины групп пациентов с различными типами ПКМД
Учитывая значительное сходство симптомов ПКМД 2А и 2I типов, а также в группе больных с изолированными ПКМД, у которых не выявлено мутаций в генах CALP3 и FKRP было необходимо попытаться выделить ядро клинических признаков на основе проведения статистического анализа. Для решения этой задачи для каждого больного была составлена карта фенотипа, в которую входило 37 качественных клинических признаков и один количественный - уровень активности креатинфосфокиназы в плазме крови. В качестве исходных материалов для оценки клинических критериев ПКМД использовались результаты клинических исследований пациентов с тремя типами ПКМД, объединенные в группы, именуемые как: группа 0 (N=31) - пациенты, у которых не было найдено мутаций, группа К (N=26) - пациенты с мутациями в гене CAPN3, группа Ф (N=6) - пациенты с мутациями в гене FKRP. Значения в скобках конкретизируют число пациентов в исследуемых группах.
Фенотипические различия между исследуемыми группами иллюстрирует рис. 3. В идеальном случае, когда исследуемые группы демонстрируют выраженную клиническую специфику, доверительные шары образуют в пространстве признаков не перекрывающиеся области. Чем выше степень фенотипического сходства исследуемых групп, тем более глубоким будет перекрывание доверительных шаров. Как следует из рис. 2 анализируемые группы обнаруживают достаточно глубокое перекрывание областей, характеризующих вариабельность клинического фенотипа образующих их пациентов. Это обстоятельство указывает на близость клинической манифестации исследуемых типов ПКМД. В то же время для каждого из типов ПКМД существуют фрагменты областей, неперекрываее областями, соответствующими всем другим типам ПКМД, что указывает на наличие отдельных симптомов и признаков, обладающих дифференцирующими способностями.
Рис. 3. Проекции доверительных шаров, отражающих вариабельность фенотипов пациентов различных групп
С целью выделения этих наиболее информативных симптомов и признаков был проведен анализ частот встречаемости каждого из анализируемых симптомов для каждой из исследуемых групп пациентов. Результаты приведены в табл. 11. Там же приведены результаты попарных сопоставлений частот встречаемости признаков в отдельных группах. Сопоставление частот проводилось стандартным методом сравнения выборочных долей. Результаты сопоставления представленя величинами значимостей (р). Сраниваемые группы статистически достоверно различаются частотой манифестиации некоторого признака, если рассчитанный уровень значимости не превышает уровня р 0.05. Полученные результаты представлены в табл. 9.
Таблица 9. Частота встречаемости признаков среди пациентов с различными типами ПКМД
|
№ |
Наименование признака |
Частота ( f,%) |
Значимость (p) |
|||||
|
Гр. 0 |
Гр. К |
Гр. Ф |
Гр. 0Гр. К |
Гр. 0Гр. Ф |
Гр. КГр. Ф |
|||
|
1 |
Возраст дебюта до 5 лет |
53.57 |
3.23 |
50.00 |
<0.01 |
0.87 |
<0.01 |
|
|
2 |
Возраст дебюта 6-10 лет |
7.14 |
29.03 |
16.67 |
0.04 |
0.46 |
0.54 |
|
|
3 |
Возраст дебюта 11-20 лет |
32.14 |
58.06 |
0.00 |
0.06 |
0.11 |
0.01 |
|
|
4 |
Возраст дебюта старше 20 лет |
7.14 |
9.68 |
33.33 |
0.71 |
0.08 |
0.13 |
|
|
5 |
"Крыловидные лопатки" |
25.00 |
67.74 |
0.00 |
<0.01 |
0.18 |
<0.01 |
|
|
6 |
Симптом дряблых предплечий |
10.71 |
54.84 |
0.00 |
<0.01 |
0.41 |
0.02 |
|
|
7 |
"Осиная " талия |
7.14 |
3.23 |
0.00 |
0.49 |
0.50 |
0.66 |
|
|
8 |
Изменение походки по типу утиной |
57.14 |
61.29 |
100.00 |
0.76 |
0.05 |
0.07 |
|
|
9 |
Степпаж |
0.00 |
6.45 |
0.00 |
0.18 |
- |
0.53 |
|
|
10 |
Трудности подъема по лестнице |
85.71 |
93.55 |
100.00 |
0.31 |
0.33 |
0.54 |
|
|
11 |
Приемы Говерса |
89.29 |
93.55 |
100.00 |
0.59 |
0.41 |
0.54 |
|
|
12 |
Нарушение ходьбы на пятках |
25.00 |
80.65 |
33.33 |
<0.01 |
0.69 |
0.02 |
|
|
13 |
Нарушение ходьбы на носках |
3.57 |
6.45 |
0.00 |
0.62 |
0.64 |
0.53 |
|
|
14 |
Гипотрофия мышц голеней |
32.14 |
32.26 |
0.00 |
0.98 |
0.11 |
0.11 |
|
|
15 |
Гипотрофия мышц предплечий |
32.14 |
22.58 |
0.00 |
0.41 |
0.11 |
0.20 |
|
|
16 |
Гипотрофия мышц плечевого пояса |
89.29 |
100.00 |
83.33 |
0.06 |
0.68 |
0.03 |
|
|
17 |
Гипотрофия мышц тазового пояса |
89.29 |
100.00 |
83.33 |
0.06 |
0.68 |
0.03 |
|
|
18 |
Гипотрофия мышц лица |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
- |
- |
- |
|
|
19 |
Отсутствие/снижение ахилловых рефлексов |
75.00 |
83.87 |
100.00 |
0.39 |
0.18 |
0.29 |
|
|
20 |
Отсутствие/снижение коленных рефлексов |
92.86 |
93.55 |
100.00 |
0.76 |
0.50 |
0.53 |
|
|
21 |
Отсутствие/снижение рефлекса двуглавой мышцы |
67.86 |
83.87 |
83.33 |
0.16 |
0.47 |
0.97 |
|
|
22 |
Отсутствие/снижение рефлекса карпо-радиального |
64.29 |
64.52 |
83.33 |
0.98 |
038 |
0.39 |
|
|
23 |
Снижение силы в дистальных отделах нижних конечностей |
21.43 |
48.39 |
16.67 |
0.04 |
0.79 |
0.17 |
|
|
24 |
Снижение силы в дистальных отделах верхних конечностей |
21.43 |
32.26 |
16.67 |
0.33 |
0.79 |
0.47 |
|
|
25 |
Снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей |
75.00 |
100.00 |
83.33 |
<0.01 |
0.68 |
0.03 |
|
|
26 |
Снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей |
75.00 |
100.00 |
83.33 |
<0.01 |
0.68 |
0.03 |
|
|
27 |
Деформация стоп |
0.00 |
12.90 |
0.00 |
0.05 |
- |
0.36 |
|
|
28 |
Деформация кистей |
0.00 |
3.23 |
0.00 |
0.34 |
- |
0.66 |
|
|
29 |
Контрактуры крупных уставов |
50.00 |
64.52 |
33.33 |
0.28 |
0.45 |
0.16 |
|
|
30 |
Контрактуры мелких суставов |
3.57 |
3.23 |
0.00 |
0.93 |
0.64 |
0.66 |
|
|
31 |
Поясничный гиперлордоз |
28.57 |
45.16 |
16.67 |
0.19 |
0.55 |
0.21 |
|
|
32 |
Сколиоз |
0.00 |
25.81 |
0.00 |
<0.01 |
- |
0.17 |
|
|
33 |
Кардиопатия |
21.43 |
25.81 |
0.00 |
0.68 |
0.22 |
0.17 |
|
|
34 |
Интенционный тремор кистей |
3.57 |
0.00 |
0.00 |
0.29 |
0.64 |
- |
|
|
35 |
Диффузная мышечная гипотония |
39.29 |
54.84 |
50.00 |
0.24 |
0.63 |
0.83 |
|
|
36 |
Псевдогипертрофии икроножных мышц |
10.71 |
29.03 |
50.00 |
0.08 |
0.03 |
0.32 |
|
|
37 |
Асимметрия поражения |
3.57 |
6.45 |
0.00 |
0.62 |
0.64 |
0.53 |
При сравнении групп больных с ПКМД2А типа и больных, у которых не обнаружено мутаций в двух исследованных генах (группы К и О), статистически достоверно (на уровне значимости р 0.05) получены различия по частоте встречаемости следующих признаков: «крыловидные лопатки», симптом дряблых предплечий, нарушение ходьбы на пятках, снижение силы в дистальных отделах нижних конечностей; снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей; снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей. Доля пациентов, у которых наблюдается данный признак, в группе ПКМД2А типа достоверно превышает их долю в группе больных с неидентифицированными мутациями. Кроме того, в группе больных с ПКМД 2А типа обнаружены деформации стоп и кистей, а также сколиоз в грудо-поясничном отделе позвоночника, которые встречались в 12,9%, 3,29% и 25,81% соответственно и не были выявлены у больных с ПКМД не уточненного типа, что может свидетельствовать о большей тяжести и генерализации процесса. При сравнительном анализе возраста дебюта заболевания показано, что доля пациентов, у которых признаки заболевания отмечается до 10 летнего возраста в группе К достоверно превышает их долю в группе 0.
Анализ полученных данных для группы Ф не проводился в связи с ее малым размером. мутация ген ферментопатия дистрофия
Сравнение исследуемых групп по значениям КФК, измеряемым в количественной шкале, проводилось с использование непараметрического критерия Краскела-Уоллиса для анализа множественных различий (табл. 10)
Данные приведенные в табл. 10 указывают на то, что исследуемые группы не обнаруживают статистически достоверных (на уровне значимости р 0.05) различий по значениям КФК. Однако полученный результат не указывает на объективное отсутствие различий между группами по значениям КФК, он в большей степени обусловлен ограниченностью объемов выборочных данных, привлекаемых для анализа.
Табл. 10. Анализ различий между исследуемыми группами пациентов по значениям КФК
|
Средние значения КФК |
Статистика Краскела-Уоллиса |
Уровень значимости |
|||
|
Группа 0 |
Группа К |
Группа Ф |
|||
|
2633.41044.2 |
3577.21067.4 |
5328.53654.6 |
3.77 |
0.15 |
Алгоритм диагностики ферментопатий у больных с клиникой ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования
На основании результатов клинико-молекулярнo-генетического анализа проведенного в группе российских больных с ПКМД разработан алгоритм их диагностики, позволяющий оптимизировать затраты на дорогостоящие методы ДНК анализа и уменьшить продолжительность диагностического этапа медико-генетического консультирования. Учитывая отсутствие значимых клинических признаков, дифференцирующих ПКМД2А и 2I типа, в основу предложенного алгоритма положены частоты встречаемости двух проанализированных генетических вариантов, наличие мажорных мутаций и «горячих» экзонов генов CAPN3 и FKRP.
В первую очередь необходимо исследовать две частые мутации в гене CAPN3, если мутации не обнаружены или одна из мутаций обнаружена в гетерозиготном состоянии, следует исследовать «горячие» экзоны гена CAPN3. Если после данного исследования не будет найдено мутаций в исследуемых экзонах гена CAPN3, то для установления генетического варианта, следует исследовать ген FKRP и только затем проводить секвенирование остальных экзонов гена CAPN3. Это обусловлено тем, что эффективность исследования мутаций в не «горячих» экзонах в группе больных ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования составляет менее 4%, тогда как эффективность диагностики мутаций в гене FKRP составляет около 9,5%. Предложенный алгоритм молекулярно-генетической диагностики схематически представлен на рис. 4.
Рис. 4. Алгоритм исследования ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.
Выводы
1. Установлен вклад мутаций генов CAPN3 и FKRP, обуславливающих развитие ферментопатий, в структуру изолированных ПКМД в РФ. В выборке из 74 больных мутации гена CAPN3 явились причиной заболевания у 32 пациентов (43%). У семи пациентов (9%) выявлены мутации гена FKRP.
2. В гене CAPN3 обнаружены «горячие» экзоны, информативность диагностики которых составляет 100%. Обнаружены две частые мутации: с.550delA, c.598_612del, информативность диагностики которых составляет более 81%, среди больных ПКМД2А типа. Разработаны эффективные методы диагностики «горячих» экзонов гена CAPN3 - методом прямого автоматического секвенирования, двух частых мутаций - методом ПДАФ-анализа
3. В гене FKRP обнаружена частая мутация с.826С>A, выявленная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии у четырех из семи больных ПКМД2I типа на 50% хромосом с данной мутацией. Показано, что для анализа мутаций при ПКМД2I типа эффективен метод прямого автоматического секвенирования.
4. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.550delA гена CAPN3, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя. Время распространения мутации составляет 1700±500 лет. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.826С>A гена FKRP, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя.
5. Проведен сравнительный анализ частот встречаемости 36 клинических симптомов в трех группах больных с ПКМД2А, ПКМД2I типов и неустановленной формой заболевания. Показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию этих генетических вариантов только на клиническом уровне.
6. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой изолированной ПКМД, определяющий последовательность анализа мутаций генов CAPN3 и FKRP. Предложенный алгоритм позволит значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики ПКМД в РФ.
Список публикаций по теме диссертационной работы
1. Рыжкова О.П., Дадали Е.Л., Щагина О.А., Поляков А.В., Молекулярно-генетическое исследование российских больных с наиболее частыми поясно-конечностными мышечными дистрофиями / Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2010. - Т., прил. к №5. - С. 155.
2. Ryzhkova O. P., Dadali E. L., Scagina O. A., Rudenskaya G. E., Polyakov A. V., The age of mutation c.550delA in CAPN3 gene / European Human Genetics Conference 2010, June 12 - 15, 2010, Gothenburg, Sweden //European J. of Hum.Gen. - 2010. - V.18, supp.1. - P.132.
3. Рыжкова О.П., Причина распространенности мутации c.550delA в РФ // Медицинская генетика. - 2009. - Т. 8, № 12. - С. 36-37.
4. Ryzhkova, G. Rudenskaya, E. Dadaly, O. Schagina, A. Polyakov; CAPN3 mutations in Russian patients with limb-girdle muscular dystrophy, type 2A // European journal of human genetics - 2009 - P16.46
5. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е., Федотов В.П., Поляков А.В. Клинико-генетическая характеристика кальпаинопатий у российских больных // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн. - 2010. - Вып. 14. - С. 83-91.
6. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Руденская Г.Е. , Федотов В.П., Поляков А.В. Особенности клинических проявлений поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии типа 2А у российских больных // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2010. - №4. - С. 79-83
7. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Тибуркова Т.Б., Рыжкова О.П., Иванова Е.А., Поляков А.В. Особенности клинических проявлений и алгоритмы молекулярно-генетической диагностики генетически гетерогенных вариантов наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А.Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн. - 2010. - Вып. 14. - С. 174-183.
8. Рыжкова О.П., Билева Д.С., Дадали Е.Л., Щагина О.А., Шаркова И.В, Поляков А.В. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. - 2011. - Т.10, № 1. - С. 15-21.
Список использованных сокращений
АД - аутосомно-доминантный
АР - аутосомно-рецессивный
ВМД - врожденная мышечная дистрофия
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
МГНЦ РАМН - Медико-Генетический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук
ПКМД - поясно-конечностная мышечная дистрофия
ПМД - прогрессирующая мышечная дистрофия
ПЦР - полимеразная цепная реакция
сМ - сантиморганида
CAPN3 - ген белка кальпаина 3
FKRP - ген фукутин-связанного белка
MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NCBI - National Center for Biotechnology Information
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Методы диагностики туберкулеза легких. Роль метода полимеразно-цепной реакции в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания. Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала.
дипломная работа [532,6 K], добавлен 28.05.2013Сущность генетического обследования, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики. Программы выявления гомозигот. Содержание первичной и вторичной профилактики наследственной патологии. Причины возникновения мутаций в клетках.
презентация [477,1 K], добавлен 27.11.2012Роль метода полимеразно-цепной реакции в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания. Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.
дипломная работа [1,3 M], добавлен 13.06.2013Визначення можливостей використання мутацій в генах та мітохондріальній ДНК у якості молекулярно-генетичних маркерів ризику виникнення раку молочної залози у осіб різних вікових груп з Ірану і України, аналогічні рівні зростання частоти захворюваності.
автореферат [43,0 K], добавлен 29.03.2009Сущность, значение и области применения молекулярно-генетических методов исследования. Специфика метода полимеразной цепной реакции. Блот-гибридизация по Саузерну. Картирование генов и идентификация хромосомных аберраций с помощью "FISH"-метода.
презентация [971,4 K], добавлен 07.12.2014Пренатальная диагностика наследственных болезней. Основные проблемы молекулярной ПГД. Характеристика ПЦР единственной клетки. Преимущественная амплификация одного аллеля. Стратегии ПЦР, применяемые в ПГД. Анализ сцепления (косвенная ДНК-диагностика).
курсовая работа [33,3 K], добавлен 24.10.2010Понятие, общая характеристика, эпидемиология, этиология, патогенез, клиническая классификация, клиника, диагностика, лечение и профилактика прогрессирующих мышечных дистрофий. Сущность миодистрофии Дюшенна, генотерапевтические подходы к ее лечению.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 04.04.2010Эпидемиология, этиология, патогенез и диагностика прогрессирующих мышечных дистрофий. Патоморфологические изменения при данном заболевании. Псевдогипертрофическая злокачественная миодистрофия Дюшенна. Миодистрофия Дрейфуса-Хогана и Роттауфа-Мортье.
презентация [653,0 K], добавлен 29.04.2015Рассмотрение строения ДНК. Изучение природы генетического кода. Описание триплетности, специфичности, вырожденности, линейности записи информации, универсальности, колинеарности гена и продукта. Организация генетического материала в хромосомах человека.
реферат [887,0 K], добавлен 16.02.2015Причины, способные вызвать повреждение, его характер и степень. Понятие и морфологическая сущность дистрофий, непосредственные причины их развития. Механизм повреждений и общая характеристика паренхиматозной, гидропической, роговой, жировой дистрофии.
лекция [41,6 K], добавлен 24.05.2009
