Химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской области

Рис. 5. Суточная динамика концентраций ГК в сыворотке крови крыс-самцов после однократного введения в дозе 100 мг/кг при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения

Из полученных результатов (рис. 5) видно, что существуют значительные различия в суточных профилях концентраций ГК сыворотке крови животных в зависимости от способа введения:

1. Наблюдается практически 10-кратное различие в максимальных уровнях концентрации Cmax ГК в сыворотке крови животных при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении (0,04 мкг/мл и 0,46 мкг/мл соответственно).

2. Время достижения максимальной концентрации Tmax при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении различается в три раза (2,0 и 6,0 часов соответственно).

3. В данных условиях эксперимента, при внутрижелудочном введении спустя 4,0 часа после введения, ГК не определяются в сыворотке крови, вследствие крайне низкой концентрации. В тоже время, при внутрибрюшинном введении ГК обнаруживаются в сыворотке крови и через 24,0 часа после последнего введения.

С полученными результатами согласуются наши экспериментальные данные о более выраженных токсических свойствах ГК и способности их к кумуляции при внутрибрюшинном введении, что на наш взгляд, может быть обусловлено значительно более длительной циркуляцией ГК в системном кровотоке по сравнению с пероральным введением. Различия в суточных профилях концентраций ГК могут указывать на весьма выраженный эффект «первичного прохождения через печень» при их пероральном введении. По-видимому, в случае внутрибрюшинного введения в брюшной полости создается «депо», из которого ГК, медленно всасываясь, попадают в системный кровоток, не подвергаясь предварительной биотрансформации в печени. Это обуславливает более длительную (более 24 часов) циркуляцию ГК в крови животных, по сравнению с внутрижелудочным введением. При этом, полученные значения Tmax, указывают на то, что ГК при внесосудистых способах введения (как при внутрижелудочном, так и при внутрибрюшинном) довольно медленно всасываются, что вероятно связанно с большими размерами их молекул. С другой стороны, медленное всасывание, существенное влияние «эффекта первичного прохождения через печень» обуславливает значительно менее длительную циркуляцию в крови и невозможность кумуляции ГК при внутрижелудочном способе введения. Вероятно, в данном случае нельзя исключать и возможность потери части невсосавшихся ГК за счет естественной перистальтики кишечника.

Исследование цитопротективных свойств ГК торфа. Анализ литературных данных показывает, что ГК, как правило, проявляют наиболее выраженную биологическую активность в условиях экспериментальных моделей связанных с повреждающим воздействием экстремальных факторов различной природы. Мы провели экспериментальную оценку цитопротективных свойств ГК в условиях острого токсического ССl4-гепатита и различных гипоксических состояний.

Оценка гепатопротективных свойств ГК. Известно, что развитие многих заболеваний обусловлено активацией свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Исходя из этих представлений, мы исследовали влияние ГК как потенциальных антиоксидантов на развитие острого токсического CCl4-гепатита, в патогенезе которого существенная роль принадлежит перекисному окислению липидов (ПОЛ). Исследуемые ГК обладают выраженной гепатопротекторной активностью при остром CCl4-гепатите (табл. 11).

Таблица 11. Влияние введения ГК и Карсила на биохимические показатели сыворотки крови и на содержание малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени крыс-самцов при CCl4-гепатите (?±?х; n=10)

Примечание: * - различия достоверны для группы CCl4-гепатит по сравнению с группой интактных животных, при р?0,05; **для групп животных получавших ГКТ или Карсил - по сравнению с группой CCl4-гепатит, при р?0,05; n - количество животных в группах

Судя по полученным экспериментальным данным, их внутрижелудочное введение в диапазоне доз 25-100 мг/кг препятствует повреждающему действию тетрахлорметана на функционально-метаболические и морфологические показатели печени крыс: существенно снижается интенсивность процессов липопероксидации и разрушения мембран гепатоцитов, выраженность цитолитического синдрома, улучшается экскреторная функция печени, не развиваются фиброзные изменения в печени экспериментальных животных (табл. 11).

Наиболее выраженные гепатозащитные свойства ГК, превосходящие аналогичное действие препарата сравнения Карсила наблюдаются в дозе 100 мг/кг. Исходя из выраженного снижения концентрации малонового диальдегида в гомогенате печени и в сыворотке крови экспериментальных животных, получавших ГК - их гепатозащитное действие может быть обусловлено выраженными антиоксидантными свойствами (табл. 11).

Исследование антигипоксической активности ГК. Наличие антиоксидантных и хелатирующих свойств у исследуемых ГК указывает на их потенциальные антигипоксические свойства (Лукьянова Л.Д., 1997; Козин В.М., 2005; Кашицкий Э.С., 1999). Это побудило нас оценить их антигипоксическую активность на моделях гистотоксической (тканевой) гипоксии и гипобарической гипоксической гипоксии (гипоксии объема), а также на окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии.

Исследование влияния ГК на выживаемость животных при различных гипоксических состояниях. Судя по полученным нами данным, ГК в условиях гипобарической гипоксической гипоксии в дозах 25-100 мг/кг обладают выраженным антигипоксическим действием - на 38-50 % увеличивая продолжительность жизни мышей (табл. 12) и снижая летальность от гипоксии на 24-36 % соответственно.

Таблица 12. Влияние 5-кратного внутрижелудочного введения ГК на продолжительность жизни мышей в условиях гипобарической гипоксической гипоксии, (?±?х)

Примечание: * - достоверное различие (р0,05) по сравнению с контролем; ** - достоверное различие (р0,05) по сравнению с гуминовыми кислотами 25 мг/кг.

Аналогичные результаты были получены на модели гистотоксической тканевой гипоксии - ГК в диапазоне доз 25-100 мг/кг в условиях гистотоксической гипоксии проявляют антигипоксическое действие, на 72,6 % увеличивая продолжительность жизни мышей (табл. 13).

Таблица 13. Влияние 5-кратного внутрижелудочного введения ГК на продолжительность жизни мышей в условиях гистотоксической гипоксии, (?±?х)

Примечание: * - достоверное различие (р0,05) по сравнению с контролем; ** - достоверное различие (р0,05) по сравнению с гуминовыми кислотами 25 мг/кг

Исследование влияния ГК на окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях гипоксии. Согласно литературным данным, гипоксическое воздействие сопровождается усилением процессов ПОЛ и разобщением окислительного фосфорилирования в митохондриях (МХ) в результате свободнорадикального повреждения клеток (Зозуля Ю.А., 2000). Исходя из этого, с целью выявления возможных механизмов антигипоксического действия ГК мы провели исследование влияния их профилактического курсового введения (100 мг/кг) на окислительное фосфорилирование в митохондриях головного мозга и печени на фоне гипоксического воздействия в сравнении с антиоксидантом и антигипоксантом дигидрокверцетином в условиях гипоксии средней степени тяжести - на модели нормобарической гиперкапнической гипоксии у мышей (табл. 14-17).

В данных условиях эксперимента гипоксия приводила к возрастанию скоростей поглощения кислорода МХ головного мозга мышей при окислении эндогенных субстратов, а также к снижению величин СД, ДК и АДФ/О, по сравнению с митохондриями интактных животных (табл. 14). Подобная закономерность наблюдалась также и при утилизации МХ головного мозга экзогенных субстратов - сукцината (ЯК) и смеси малат-глутамат (МГ). При этом, наиболее выраженные нарушения, деэнергизация МХ проявлялись при окислении органеллами НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата), что также сопровождалось снижением метаболического контроля дыхания органелл. На это указывает повышение скоростей контролируемого окисления субстратов (V4п, V4о) в значительно большей степени, чем фосфорилирующего (V3), снижение величин СД, ДК и существенное снижение эффективности окислительного фосфорилирования - коэффициента АДФ/О.

Таблица 14. Функциональное состояние митохондрий головного мозга интактных мышей и мышей в условиях гипоксии (?±?х, n = 6)

В МХ печени мышей гипоксическое воздействие вызывало изменения, сходные с таковыми в ткани головного мозга (табл. 15). Так, при окислении эндогенных субстратов наблюдалось увеличение скоростей дыхания (V4п, V3 V4о) и уменьшение коэффициентов СД, ДК, АДФ/О относительно показателей группы интактных животных (табл. 15). Это прямо указывает о разобщение окислительного фосфорилирования на фоне гипоксии. Окисление сукцината сопровождалось увеличением скоростей поглощения кислорода МХ печени, уменьшением коэффициентов СД и АДФ/О, что также свидетельствует о снижении эффективности окислительного фосфорилирования.

Таблица 15. Функциональное состояние митохондрий печени интактных мышей и мышей в условиях гипоксии (?±?х, n = 6)

Примечание: *p<0,05 по сравнению с контролем; ? - среднее значение, ?X - стандартное отклонение

Таблица 16. Влияние гуминовых кислот и дигидрокверцетина на функциональное состояние митохондрий головного мозга мышей при гипоксии (?±?х, n = 6)

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что ГК обладают выраженными антигипоксическим действием на модели нормобарической гиперкапнической гипоксии, нормализуя при профилактическом введении активность сукцинат- и НАД-зависимых процессов энергопродукции в головном мозге и печени мышей и предотвращая разобщение окислительного фосфорилирования (табл. 14, 15).

Таблица 17. Влияние гуминовых кислот и дигидрокверцетина на функциональное состояние митохондрий печени мышей при гипоксии (?±?х, n = 6)

Примечание: #p<0,05 по сравнению с гипоксией; +p<0,05 по сравнению с группой, получавшей ГК

Антигипоксическое действие ГК не уступает эффектам у эталонного антигипоксанта дигидрокверцетина в головном мозге и превосходит таковое в печени (табл. 16, 17). Выявленная под действием ГК нормализация окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга и печени, вероятно, обусловлена протекторными свойствами ГК, предотвращающих свободнорадикальное повреждение клеток и органелл в условиях гипоксии.

1. Исследуемые торфа по ботаническому составу относятся к пяти видам: сосново-сфагново-пушицевому, осоковому, травяно-моховому, травяному, древесно-травяному. Химический состав исследуемых торфов зависит от их ботанической природы и представлен гуминовыми веществами (до 50%), полифенолами, липидами, сахарами, лигнином.

2. Низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное» является перспективным источником гуминовых кислот, исходя из наибольшего их удельного содержания, а так же особенностей их химической структуры - меньшей степени бензоидности и конденсированности макромолекулы, высокой доли алифатических фрагментов, активных кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов), азота и концентрации парамагнитных центров.

3. На основе выявленных особенностей химической структуры гуминовых кислот разработаны методы их стандартизации, определены показатели их подлинности и качества, и составлен проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

4. Нативные гуминовые кислоты низинного древесно-травяного торфа месторождения «Клюквенное» при внутрижелудочном введении мышам и крысам являются малотоксичными веществами и относятся к III и IV классам опасности соответственно. При внутрибрюшинном введении токсичность гуминовых кислот значительно повышается. При внутрибрюшинном введении летальных доз гуминовых кислот крысам смерть наступает от острой сердечной недостаточности, возникающей в результате ишемической дистрофии миокарда.

5. Исследуемые гуминовые кислоты обладают выраженной гепатозащитной активностью в условиях острого CCl4-гепатита. Их предварительное внутрижелудочное введение препятствует повреждающему действию тетрахлорметана на функционально-метаболические и морфологические показатели печени крыс.

6. Гуминовые кислоты обладают выраженным антигипоксическим действием - увеличивая срок жизни животных и снижая летальность в условиях гистотоксической и гипобарической гипоксической гипоксии при профилактическом внутрижелудочном введении мышам. В условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии гуминовые кислоты предотвращают разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях, нормализуя активность сукцинат- и НАД-зависимых процессов энергопродукции в митохондриях головном мозга и печени мышей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гостищева М.В. Сравнительный анализ методов определения фракционно-группового состава органического вещества торфа // Материалы третьей научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2004. С. 170-177.

2. Федько И.В., Гостищева М.В., Писниченко Е.О. Химико-фармакологическое исследование гуминовых комплексов торфов Западной Сибири // Сборник научных трудов «Информационные системы мониторинга окружающей среды». Томск. 2004. С. 54-58.

3. Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова Р.Р. Медицинские аспекты использования биологически активных гуминовых кислот // Химия растительного сырья. 2005. № 1. С. 49-52.

4. Федько И.В., Гостищева М.В. Исследование антиоксидантной активности гуминовых комплексов торфа // Сборник статей по материалам VI конгресса молодых учёных и специалистов «Науки о человеке». Томск. 2005. С. 101-102.

5. Федько И.В., Гостищева М.В. Исследование специфических веществ торфов // Сборник статей по материалам Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации». Новосибирск. 2005. С. 420-421.

6. Гостищева М.В., Кузьменко О.А. Характеристика некоторых видов торфа Томской области // Материалы четвёртой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2005. С. 151-156.

7. Завацкая Е.С., Гостищева М.В., Горчаков Л.В. Создание базы данных по физико-химическим свойствам гуминовых кислот // Материалы четвёртой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2005. С. 193-196.

8. Гостищева М.В., Федько И.В. Изучение свойств гуминовых кислот разных видов торфа Томской области // Весцi нацыянальнай акадэмii навук Беларусi. Серыя хiмiчных навук. 2006. № 5. С. 38-40.

9. Гостищева М.В., Инишева Л.И., Федько И.В. Исследование химических и биологических свойств гуминовых кислот торфов различного происхождения // Сборник статей по материалам международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». Минск. 2006. С. 181-184.

10. Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова Р.Р. Фармацевтическая оценка свойств гуминовых веществ торфов, полученных различными способами // Сборник статей по материалам международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». Минск. 2006. С. 249-251.

11. Gostishcheva M.V., Inisheva L I., Fedko I.V. Research of Biological Activity Humic Acids of Peats // 13th Meeting of the International Humic Substances Society «Humic Substances - Linking Structure to Functions». Karlsruhe, Germany. 2006. P. 445-448.

12. Гостищева М.В. Характеристика химических и биологических свойств различных фракций гуминовых кислот торфов и сапропелей // Материалы пятой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2006. С. 168-175.

13. Гостищева М.В., Федько И.В., Солдаткина М.А. Антиоксидантная активность гуминовых кислот торфов Западной Сибири // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», Москва. 2006. С. 88-89.

14. Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова Р.Р., Зиганшин А.У. К вопросу о химическом составе пелоидов Томской области // Вестник Башкирского университета. 2007. №1. С.32-33.

15. Гостищева М.В., Федько И.В., Исматова Р.Р., Щеголихина А.И. Сравнительная оценка молекулярных параметров гуминовых кислот торфа различных типов // Башкирский химический журнал. 2007. №2. С.48-56.

16. Гостищева М.В. Сравнительная характеристика гуминовых кислот торфов Томской области // Известия Томского политехнического университета. 2007. № 2. Том 310. С. 163-166.

17. Гостищева М.В., Федько И.В., Исматова Р.Р. Сравнительное изучение химического состава и биологической активности торфа в зависимости от степени его разложения // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С 127-130.

18. Гостищева М.В., Белоусов М.В., Исматова Р.Р., Васильев К.Ю., Дмитрук С.Е., Юсубов М.С. Изучение химико-токсикологических свойств гуминовых кислот низинного торфа Томской области // Башкирский химический журнал. 2008. Том 15. № 2. С. 19-24.