Химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской области

Betula nana (5); Carex lasiocarpa (15); Carex rostrata (10); Eriophorum polystachyon (5); Menyanthes trifoliate (10); Equisetum sp. (10); Sphagnum centrale (10); Drepanocladus sendtneri (20)

Низинный тип Травяно-моховый вид

Большое Васюганское болото, участок «Осоково-сфагновая топь», l=230-250см, R=45%, А=10,4%.

Pinus sylvestris (5); Betula nana (5); Carex lasiocarpa (20); Carex omskiana (5); Menyanthes trifoliate (5); Equisetum sp. (30); Sphagnum sect.cuspidata (5); Sphagnum centrale (5); Drepanocladus sendtneri (10)

Низинный тип Травяной вид

Торфяной месторождение «Клюквенное», l=10-50см, R=25%, А=8,1%.

Carex lasiocarpa (10); Carex cespitosa (5); Carex omskiana (15); Menyanthes trifoliate (25); Equisetum fluviatile (10); Sphagnum centrale (5); Древесина кустарников (30)

Низинный тип Древесно-травяной вид

Примечание: l, см - глубина образца; R, % - степень разложения торфа; А, % - зольность торфа

Исследуемые торфа относятся к трём типам - верховой, переходный и низинный, и согласно процентным соотношением растительных остатков, представлены пятью различными видами: сосново-сфагново-пушицевым, осоковым, травяно-моховым, травяным и древесно-травяным.

Из результатов анализа группового состава органического вещества (табл. 3) пяти видов торфа следует, что все отклонения в содержании основных групп связаны с ботаническим составом, наиболее представительной в количественном отношении является группа ГК, содержание которой во всех торфах максимально.

Таблица 3

Групповой состав органического вещества исследуемых торфов (%, ОВ)

Примечание: ОВ - органическое вещество, СВ - сухое вещество, ГК - гуминовые кислоты, ФК - фульвокислоты, ВРВ+ЛГВ - водорастворимые и легкогидролизуемые вещества, ТГВ - трудногидролизуемые вещества (целлюлоза), НГВ - негидролизуемые вещества (лигнин), R, % - степень разложения торфа

Методами фитохимического анализа (табл. 4) доказано присутствие таких групп БАВ как флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, антраценпроизводные, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды. Не обнаружены сапонины и алкалоиды.

лекарственный гуминовый кислота торф

Таблица 4. Общий фитохимический анализ исследуемых торфов

Примечание: «+» - данная группа веществ присутствует в исследуемом сырье, «-» - данная группа веществ отсутствует в исследуемом сырье

Результаты количественного содержания (табл. 5) в торфах веществ фенольной природы показали, что фенольные соединения представлены в основном флавоноидами. Остальные группы (фенолкарбоновые кислоты и кумарины) во всех образцах торфа показаны незначительным содержанием, и количественно практически не различаются между собой.

Таблица 5

Количественное содержание веществ фенольной природы в торфах

Таким образом, результаты изучения состава торфов различных типов и ботанической принадлежности показывают, что все они имеют одинаковый набор БАВ. Различия наблюдаются лишь в количественных соотношениях, и в целом между пятью видами торфа они незначительны. Из всех БАВ, присутствующих в торфах, наибольшее содержание отмечено для ГК, максимальное количество которых содержится в низинном древесно-травяном виде торфе с месторождения «Клюквенное». Таким образом, ГК в силу своего высокого удельного содержания, являются наиболее представительной группой веществ для дальнейшего изучения.

Химическую структуру ГК исследовали современными физико-химическими методами.

Согласно результатам элементного анализа (табл. 6), ГК древесно-травяного торфа имеют существенные отличия от ГК других исследуемых объектов. Так, от ГК переходного и верхового торфов, они отличаются более высоким содержанием кислорода, более низкой долей углерода при практически одинаковом количестве водорода, что может свидетельствовать о большем содержании активных кислых групп (гидроксильных, карбоксильных), амидных и аминогрупп в молекулах ГК этого вида торфа. От двух других низинных торфов они отличаются меньшей степенью ароматичности и конденсированности молекулы, что может свидетельствовать о большем вкладе алифатических структур в строение молекулы данных ГК. Весьма существенным и важным отличием ГК древесно-травяного торфа является также самое высокое содержание азота.

Таблица 6. Элементный состав и атомное отношение в гуминовых кислотах торфов

Абсорбционные спектры ГК в УФ области (рис. 1) выглядят как пологие кривые, имеют сплошное поглощение в интервале 220 - 800 нм, резко возрастающее в коротковолновую сторону.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. УФ-спектры гуминовых кислот исследуемых торфов (1 -верхового сосново-пушицевого; 2 - переходного осокового; 3 - низинного травяно-мохового; 4 - низинного травяного; 5 - низинного древесно-травяного).

Все спектры имеют одинаковую форму и характеризуются двумя максимумами в УФ-области при длинах волн: 245 нм (обусловленным фенольными, карбоксильными группами, полиеновыми цепями) и 295 нм (свидетельствующим о наличии циклических, ароматических и гетероароматических структурных единиц, относящихся к производным бифенила, кумарина, хромона, ксантона, хинона.

Исходя из характера УФ-спектров также можно предположить наличие в структуре ГК ката-конденсированных и периконденсированных ароматических систем, типа «аценов», «фенов», пиренов, периленов и т.д.

Оптические свойства ГК (табл. 7) являются важным диагностическим показателем при их исследовании. Судя по данным электронной спектроскопии, более высокую оптическую плотность при 465 нм имеют ГК низинных травяного и травяно-мохового, а также верхового торфов, что может свидетельствовать о более высокой степени ароматичности их молекул, по сравнению с ГК других видов торфа.

Таблица 7

Оптические свойства гуминовых кислот исследуемых торфов

Сравнивая полученные результаты с данными ранее описанного элементного анализа можно отметить, что для ГК, имеющих наиболее высокие значения оптической плотности () характерны самые высокие атомные отношения С/Н. Как и показано выше, это может свидетельствовать об относительном увеличении содержания полисопряженных связей в молекулах ГК и повышении их ароматичности. Падение оптической плотности () и увеличение значения коэффициентов цветности у ГК древесно-травяного торфа указывает на уменьшение размеров систем полисопряжения в их макромолекуле.

Самое высокое значение коэффициента цветности ГК древесно-травяного торфа, судя по результатам элементного анализа и оптических свойств, может быть связано, прежде всего, с максимальным содержанием кислорода и азота, наряду с низким содержанием углерода в макромолекуле этих ГК.

Полученные ИК-спектры ГК исследуемых торфов (рис. 2) имеют высокую степень подобия - основные характеристические для ГК максимумы поглощения обнаруживаются во всех образцах, это указывает на близость их химической структуры.

Максимальная интенсивность полос поглощения в спектрах ГК отмечена для: гидроксильных, карбонильных, карбоксильных групп, алифатических и ароматических фрагментов.

Рис. 2. ИК-спектры гуминовых кислот:1- низинного древесно-травяного; 2- низинного травяного; 3- низинного травяно-мохового; 4- переходного осокового; 5- верхового сосново-пушицевого видов торфа

Также дана количественная оценка (табл. 8) содержания функциональных групп по данным ИК-спектроскопии на основании отношений оптических плотностей полос поглощения кислородсодержащих групп к оптическим плотностям, соответствующим ароматическим полисопряженным системам и алифатическим заместителям.

Таблица 8. Соотношение оптических плотностей полос поглощения при определенных длинах волн по данным ИК-спектроскопии

Примечание: А - оптическая плотность

Результаты показали, что молекулы ГК верхового и переходного торфов имеют различия в содержании карбоксильных групп, в сравнении с низинными торфами, содержащими наибольшее количество карбоксильных групп, максимальное количество которых отмечено для ГК древесно-травяного торфа. И, наоборот, в молекулах ГК верхового и переходного торфов в сравнении с ГК низинных - наблюдается большее содержание гидроксильных групп, исключение составляет один вид низинного торфа - древесно-травяной, в котором их содержание высокое, что также подтверждается данными функционального анализа (табл. 9).

В целом можно отметить, что ГК древесно-травяного торфа имеют весьма значительные отличия от других торфов и представляют собой соединения с высокой долей алифатических фрагментов и возможно меньшей степенью бензоидности, а также с высоким содержанием активных кислых групп (карбоксильных, гидроксильных).

Таблица 9

Функциональный состав гуминовых кислот исследуемых торфов

Анализ формы ЭПР спектров исследуемых ГК показал, что все они представляют собой относительно симметричную синглетную линию с фактором их спектроскопического расщепления близким к g-фактору свободного электрона, обусловленную ароматическими структурами полисопряжения. Параметры сигналов ЭПР различных ГК принципиально не отличаются между собой, что также свидетельствует о подобии строения их конденсированных ароматических ядер (табл. 10).

Таблица 10. Параметры ЭПР-спектроскопии гуминовых кислот торфов

По интенсивности сигнала (Iабс) можно отметить, что наибольшее содержание парамагнитных центров (ПМЦ) характерно для ГК низинных древесно-травяного и травяного, а также переходного торфов, далее по убыванию идут верховой и низинный травяно-моховый торфа. Самый высокий парамагнетизм (ПМЦ=2,6) ГК древесно-травяного торфа, вероятно, обусловлен высоким удельным содержанием карбоксильных групп и фенольных гидроксилов, принадлежащих непосредственно ароматическим кольцам. Полученные результаты хорошо согласуются с данными ИК-спектроскопии и функционального анализа.

Протонный анализ (рис. 3) показал, что спектры всех ГК выглядят одинаково сложно, сигналы протонов имеют уширенную форму, и на спектре можно выделить три основных области:

· первая область от 0.5 м.д. до 2.5 м.д. можно отнести к сигналам алифатических протонов (-СН3, -СН2-, -СН).

· вторая область от 2.5 м.д. до 4.0 м.д. можно отнести к сигналам протонов атомов углерода, связанных с гетероатомами (RО-СН2-, R2N-СН2-, где R=H, Alk, углеводы).

· третья область от 6.5 м.д. до 8.0 м.д. являются областью химических сдвигов ароматических протонов.

Интегрирование сигналов в различных областях полученного спектра позволило оценить распределение протонов по важнейшим фрагментам ГК: первая область алифатических цепей ? 56%, вторая область углеводов - ? 25% и третья область ароматических протонов ? 19%.

Рис. 3. ПМР - спектр гуминовых кислот низинного древесно-травяного торфа

В спектрах ЯМР 13С (рис. 4) выделены более узкие области:

· сигналы в области 10.00-43.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С в Салкил.;

· сигналы в области 50.00-60.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С в СН3-О-Cалкил., CH3-O-Ar, СН3-О-C=О;

· сигналы в области 62.00 - 80.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С моно-, ди- и полигидроксильным (углеводным) фрагментам ГК;

· сигналы области 90.00-110.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С ацетальным или кетальным углеводным фрагментам полисахаридной цепи ГК;

· сигналы в области 112.00-160.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С в ароматических фрагментах ГК;

· сигналы в области 170.00-180.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С в -СООН, -СOOR, -CONH2.

Как видно из спектра ЯМР13С (рис. 4) интенсивность метоксильных (-О-СН3) и метилонатных (СН3-О-С=О) групп высокое. Распределение углерода по важнейшим фрагментам ГК составляют следующие значения: алифатический С - 32,8 %; углеводный С - 21,8 %; ароматический С - 32,2 % и карбонильный С - 13,2 %.

Рис. 4. ЯМР - спектр гуминовых кислот низинного древесно-травяного торфа

На основе химического исследования ГК низинного древесно-травяного вида торфа нами проведена их стандартизация, определены показатели подлинности и качества (соответствие коэффициентам экстинкции (1 см 0,001 % растворы ГК должны соответствовать: при длине волны 465 нм - 0,020±0,002, при длине волны 650 нм - 0,0041±0,0004, коэффициент цветности (465/650) должен соответствовать 4,88±0,05); совпадение спектров в УФ-, ИК-областях и молекулярно-массового распределения, а также, содержание углерода в ГК (не более 47,0 %) и азота (не менее 3,8 %); молекулярная масса должна составлять 1000-1200 кДа). Полученные показатели внесены в проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

Таким образом, результаты исследования химической структуры ГК различных видов торфа выявили ряд индивидуальных особенностей строения их макромолекул, на основании чего был определён низинный древесно-травяном торф как наиболее перспективный источник ГК для дальнейших исследований. Высокое удельное содержание ГК в данном виде торфа, высокая концентрация парамагнитных центров, наибольшее содержание азота и кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов) в структуре его ГК, а так же низкая степень бензоидности и конденсированности их макромолекулы позволяют предположить у ГК низинного древесно-травяного торфа более высокую степень тропности их молекул к биологическим структурам клеток (рецепторам, активным группам ферментов и т.д.), и, соответственно, более выраженные фармакологические эффекты. В связи с этим, исследования биологической активности проведены с данными ГК.

Исследование острой токсичности ГК. Средняя летальная доза (ЛД50) исследуемого препарата ГК при внутрижелудочном введении мышам составила 4658,40 мг/кг. При внутрижелудочном введении исследуемого препарата крысам в аналогичном диапазоне доз не наблюдали гибели животных и картины острого отравления в течение двух недель наблюдения, что возможно связано с более медленным всасыванием ГК в желудочно-кишечном тракте крыс. Таким образом, исследуемые ГК при внутрижелудочном введении мышам и крысам являются малотоксичными и относятся к III или IV классам опасности соответственно. При внутрибрюшинном введении лабораторным животным ГК проявляют более выраженные токсические свойства: ЛД50 исследуемого препарата ГК при внутрибрюшинном введении мышам составила 532,89 мг/кг, а при внутрибрюшинном ведении крысам величина ЛД50 исследованного препарата составила 480,12 мг/кг.

Патоморфологическое исследование погибших животных. Для установления причин летальности и выявления возможных органов-мишеней, поражаемых при остром токсическом воздействии, проводили патоморфологическое исследование трупов крыс, погибших при внутрибрюшинном введении заведомо летальных доз препарата ГК. Судя по результатам патологанатомического исследования гибель лабораторных животных (крыс) при введении летальных доз ГК наступала от острой сердечной недостаточности, возникающей в результате ишемической дистрофии миокарда.

Исследование кардиотоксического действия ГК. Судя по результатам патоморфологического исследования, одной из причин летальности при внутрибрюшинном введении ГК может быть их прямое кардиотоксическое действие. Мы провели регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ) и определение порога фибрилляции желудочков (ПФЖ) у крыс-самцов после внутрибрюшинного введения ГК в заведомо летальной дозе (480,00 мг/кг).

Однократное внутрибрюшинное введение ГК вызывает значительно снижение ПФЖ (в 1,8 раза) в сравнении с интактными животными. В тоже время, наблюдалось достоверное укорочение (в 2,8 раза) комплекса QRS в сравнении с интактными животными. Судя по полученным результатам, однократная инъекция ГК в летальной дозе (480,0 мг/кг) индуцирует снижение электрической стабильности сердца, о чём наглядно говорит падение ПФЖ и снижение величины комплекса QRS. Подобное снижение электрической стабильности сердца может быть причиной внезапной сердечной смерти подопытных животных.

Исследование влияния ГК на реологические свойства крови. Другим возможным механизмом острого нарушения гемодинамики под влиянием ГК может быть их негативное влияние на реологические свойства крови. Мы исследовали влияние ГК на реологические свойства крови фотометрическим вибрационным методом. Судя по полученным результатам, ГК in vitro вызывают существенное (в 2,26 раза) в сравнении с показателями интактной пробы увеличение показателя индекса обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ). Это может приводить к значительному увеличению вязкости крови, усиленному тромбообразованию, нарушению кровоснабжения миокарда и обусловливать негативное кардиотропное воздействие препарата ГК в летальных дозах.

Таким образом, острое нарушение гемодинамики и последующая гибель животных могут быть обусловлены одновременно, как снижением электрической стабильности сердца, так и негативным влиянием ГК на реологические свойства крови.

Исследование динамики концентраций ГК в сыворотке крови крыс. Нами была изучена динамика концентраций ГК в сыворотке крови крыс при обоих способах введения. Для исследования суточного профиля концентраций ГК вводили крысам однократно (внутрижелудочно или внутрибрюшинно) в дозе 100 мг/кг (рис. 5).