Динамика показателей иммунитета у пациенток с местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Динамика показателей иммунитета у пациенток с местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

14.01.12 - онкология

кандидата медицинских наук

Батурина Ирина Леонидовна

Челябинск, 2010

Работа выполнена в НИИ иммунологии и на кафедре онкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Телешева Лариса Федоровна

доктор медицинских наук, профессор Жаров Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Аклеев Александр Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Гамза Валерий Николаевич

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УроРАН, г. Екатеринбург

Защита состоится «21» декабря 2010 г. в ___на заседании диссертационного совета Д 208.117 03 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "____" __________________2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Тешевская Наталья Викторовна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время, несмотря на современные методы диагностики и эффективность применяемых методов лечения, отмечается существенный рост показателей запущенных форм рака шейки матки (РШМ) [Кандакова, Е.Ю., 2001; Максимов С. Я., Гусейнов К. А., 2004; Квеладзе, В.В., 2005; Жаров А.В., 2006]. В Челябинской области в 2008 г. заболеваемость местнораспространенными формами рака шейки матки (МРШМ) составила 50,2% от общей заболеваемости РШМ [Бехтерева С.А, Важенин А.В., Яйцев С.В, 2009; Кравченко Г.Р., 2010]. Средний возраст заболевших в РФ составляет 30-39 лет. Настораживает рост заболеваемости МРШМ у женщин молодого возраста - до 29 лет, ежегодный прирост которой составляет 2,1% [Чиссов В.И., 2009]. С 1997 по 2006 год рост смертности от рака шейки матки среди женщин в возрасте 20-25 лет составил 70%, а в возрастной группе 30-34 года - почти 30%. По данным международной федерации акушеров и гинекологов около 25% молодых женщин умирают от прогрессирования заболевания на первом году жизни, по Челябинской области - 21,9% [Кравченко Г.Р.,2010]. Основным этиологическим агентом в генезе РШМ является папилломавирусная инфекция, которая обнаруживается у 80-100% пациенток данной патологии [Сухих Г.Т., 1997; Аполихина И. А., 2002; Кулаков В. И., 2004; Кисина В.И., Кубанов А.А., 2005; Прилепская В.Н., 2007; Роговская С.И., 2008; Bais A.G., 2005; Manickam A., 2007; Patel S., 2009].

На сегодняшний день, согласно данным мировой литературы известно, что выбор тактики лечения рака шейки матки определяется следующими прогностическими факторами [Давыдов М.И., Наумов М.М., Чернецова Л.Ф., 2003, Квеладзе В.В., 2005] : возраст пациенток, стадия заболевания, локализация и размер опухоли, степень и особенности ее распространения, морфологическое строение и степень дифференцировки опухоли.

Исследования последних лет показали, что вышеперечисленные факторы не обладают 100% специфичностью [Бохман Я.В., 1989; Важенин А.В., Жаров А.В., Шимоткина И.Г., 2010]. Существующие в настоящее время инструментальные методы исследования не имеют должной разрешающей способности для оценки ранних изменений опухолевой ткани в процессе проведения специальной терапии, которые еще до возникновения рецидива заболевания, свидетельствуют о прогрессировании туморогенного процесса и неэффективности применяемых методов лечения [Берзина С.Л, 2002; Ашрафян Л.А, 2007; Швец Н. Л., Чазова Н. А., Берщанская А. М, 2008]. Это делает актуальным поиск новых критериев прогноза течения опухолевого заболевания и мониторинга проводимой специальной терапии у больных МРШМ.

На сегодняшний день доказано, что иммунная система способна распознавать злокачественные клетки и реагировать на такое распознавание активацией с последующими каскадами иммунных реакций. Установлено, что развитие неопластического процесса возникает на фоне снижения иммунной реактивности организма, а иммуносупрессивный эффект, который оказывает развивающаяся опухоль, усиливает иммунодефицитное состояние макроорганизма, способствуя прогрессированию опухолевого процесса [Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П. и др., 2008]. Несмотря на то, что, в настоящее время, система противоопухолевого иммунитета изучена достаточно хорошо, остается мало изученным состояние системного и местного иммунитета у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ.

Для оценки распространенности опухолевого процесса и динамики его течения при мониторинге проводимой терапии в настоящее время используется уровень онкомаркера SCCА сыворотки крови (антиген плоскоклеточной карциномы) [Дубовецкая О.Б., 2005; Олешикова О.И, 2006; Koch, T., Makrantonakis, P., 1999; Ogino, I., 2006; Yogava T., Klyono T., 2009]. Многими авторами предполагается, что SCCА, принимает участие в иммунологических реакциях организма при неопластическом процессе [Fontana, X., 1991; Sanchez-de-Cos-Escuin, J., 1996; Borras, G.,1999; Cataltepe S., 2002; Yogava T., Klyono T., 2009]. Однако, на сегодняшний день в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные о взаимосвязи SCCА с показателями системного и местного иммунитета.

Таким образом, рост запущенности РШМ, молодой возраст заболевших, низкая специфичность существующих прогностических факторов, недостаточная изученность состояния системного и местного иммунитета и уровня онкомаркера SCCA у пациенток МРШМ, ассоциированного с ВПЧ и определило актуальность настоящего исследования.

Цель работы. Разработка иммунологических критериев прогноза течения и мониторинга проводимой специальной терапии на основании изучения показателей системного и местного иммунитета в динамике, их взаимосвязи с онкомаркером SCCA у пациенток местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека.

Задачи исследования:

1. Изучить иммунологические показатели периферической крови у пациенток с положительной и отрицательной динамикой течения местнораспространенного рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека.

2. Изучить иммунологические показатели цервикальной слизи у больных с положительной и отрицательной динамикой течения местнораспространенного рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека.

3. Определить уровень онкомаркера SCCА, провести анализ взаимосвязей SCCА с показателями системного и местного иммунитета у пациенток с местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека.

4. Разработать математические модели прогноза течения опухолевого заболевания и неэффективности проводимой специальной терапии у пациенток с местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека.

Научная новизна. Впервые был проведен сравнительный анализ показателей системного и местного иммунитета репродуктивного тракта с оценкой уровня содержания онкомаркера, в зависимости от динамики течения опухолевого процесса, у женщин с МРШМ, ассоциированного с вирусом папилломы человека (ВПЧ) до лечения, через 6 и 12 месяцев после лечения. Установлено, что при одинаковом уровне SССА как до лечения, так и через 6 месяцев после лечения у пациенток МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, независимо от динамики течения опухолевого процесса, показатели иммунитета имели однонаправленные изменения, отражающие положительную и отрицательную динамику течения заболевания.

Впервые определены диагностически важные иммунологические маркеры, которые позволили разработать критерии неблагоприятного прогноза течения заболевания и неизлеченности при мониторинге проводимой специальной терапии у больных МРШМ, ассоциированного с ВПЧ. Иммунологическими маркерами неблагоприятного прогноза течения опухолевого заболевания у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, до лечения являются: сниженние количества CD8+ лимфоцитов, уровня TNF-a, повышение CD10+ и CD11в+ позитивных клеток, уровня IL-10, Ig G в периферической крови и повышение общего количества лейкоцитов при увеличении абсолютной жизнеспособности нейтрофилов, снижение активности индуцированного НСТ-тееста, уровня sIgА, IgM, IL-2, TNF-б при одновременном повышении содержания IL-4, IL-10, IFN-а в цервикальной слизи.

Иммунологическими критериями неизлеченности местнораспространенных форм рака шейки матки, ассоциированного с ВПЧ являются: повышение количества полиморфноядерных нейтрофилов при снижении абсолютного количества лимфоцитов, NK-клеток (CD16+), уровня IL-2, IFNб и повышение IL-4, IL-10 в периферической крови и повышение уровня IFN-б, IL-4, IL-10 при снижении концентрации sIgА, IgА, IgG в цервикальной слизи.

Доказана взаимосвязь онкомаркера SССА с показателями иммунитета при развитии МРШМ, ассоциированного с ВПЧ.

На основании данных, полученных в ходе иммунологического исследования, при помощи дискриминантного анализа были разработаны математические модели прогноза течения опухолевого заболевания и неизлеченности при мониторинге проводимой специальной терапии у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ.

Теоретическое и практическое и значение. Полученные данные расширяют представление о роли иммунной системы в вирусиндуцированном канцерогенезе РШМ и подтверждают участие SССА в иммунологических реакциях организма при МРШМ.

Выявленные при динамическом исследовании изменения иммунологических показателей системного и местного иммунитета, их взаимосвязь с уровнем онкомаркера SССА у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, позволили разработать иммунологические прогностические критерии течения заболевания и критерии неизлеченности при мониторинге проводимой специальной терапии.

Реализация результатов исследования. Полученные результаты внедрены в клиническую лабораторную диагностику НИИ иммунологии и в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава в практику гинекологического отделения №5 и II радиологического отделения ГЛПУ Челябинском окружном клиническом онкологическом диспансере г. Челябинска.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на 1-ом Российско-Чешском медицинском форуме (Челябинск, 2006), на научно-практической конференции «Репродуктивное женское здоровье. ВПЧ инфекция» (Челябинск, 2007), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на Российской научно-практической конференции «Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ» (Челябинск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 15 печатных работ, 7 из которых входят в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Изложена на 174 страницах машинописного текста. Работа содержит 27 таблиц. Указатель литературы содержит 200 источников, включающих 94 отечественных и 106 зарубежных источников.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Для осуществления поставленной цели в НИИ иммунологии и на кафедре онкологии Челябинской государственной медицинской академии и Челябинском окружном клиническом онкологическом диспансере (ЧОКОД) г. Челябинска за период 2006-2009г. проведено комплексное обследование 80 пациенток с МРШМ -- IIb, IIIa, IIIb стадии (Т2N0M0, Т2N1M0, Т3N0M0, Т3N1M0) в возрасте от 20 до 49 лет. Диагноз МРШМ, был выставлен врачами-онкогинекологами ЧОКОД на основании клинических, гистологических и инструментальных методов исследования.

Критерии включения в исследование: возраст до 49 лет, наличие ПВИ, одинаково повышенный уровень онкомаркера SCCA в сыворотке крови до лечения. Критерии исключения: хламидийная инфекция, хирургическое лечение.

Анализ следующих прогностических факторов: возраст, распределение по стадиям, гистологическое строение, форма роста, особенностям местного распространения опухоли показал что:

1. Исследуемые группы были репрезентативны по таким прогностическим факторам как стадия заболевания, гистологическое строение, форма роста, особенности местного распространения опухоли, за исключением возраста.

2. 37,4% группы пациенток МРШМ с отрицательной динамикой течения заболевания от проведенного лечения составляли молодые женщины в возрасте 30-39 лет.

3. 77,5% исследуемых пациенток МРШМ независимо от динамики течения опухолевого процесса имели плоскоклеточный неороговевающий гистологический тип опухоли; в 62,5% смешанную форму роста; в 82,5% влагалищно - параметральный вариант распространения опухоли.

Определение ДНК ВПЧ молекулярно-биологическим методом (ПЦР) установило, что у всех пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ в 92,5% диагностировалась моноинфекция ВПЧ 16 типа.

Всем пациенткам был проведен одинаковый курс химио-лучевого лечения, который включал 2 курса неоадьювантной полихимиотерапии (НАПХТ) и лучевую терапию (дистанционная гамма терапия (ДГТ) и внутриполостная гамма терапия (ВПГТ)).

НАПХТ проводилась по схеме LFP , которая включала: GeeNU 80 мг/м² / ломустин - в 1 день перорально; 5-фторурацил по 350 мг/м² - со 2 по 6 дни внутривенно капельно; Цисплатин 100 мг/м² - на 7 день с водной нагрузкой до 2 литров жидкости внутривенно капельно и премедикацией седативными, противорвотными и гормональными препаратами. Интервал между введениями 3-4 недели.

Затем проводилось традиционное лучевое лечение по расщепленному курсу. Дистанционный этап расщепленного курса проводили с двух противолежащих полей 16 х 17-20 см., на аппарате «Луч-1». Разовая очаговая доза (РОД) в точках В - 2 Гр, суммарная 20 Гр. Затем продолжали облучение на аппарате «РОКУС-АМ», в режиме двуосевой ротации с углом качания 180 градусов и расстоянием между осями 6 см до суммарной дозы 30 Гр. в точках В. Применение на первом этапе лучевого лечения только дистанционного облучения, способствует уменьшению воспалительного компонента, сопровождающего опухолевый процесс. В опухоли наступают дистрофические изменения, уменьшается ее объем, что создает более благоприятные условия для последующей внутриполостной терапии. После локализации процесса проводилась ВПГТ на шланговом аппарате «Агат-В2» с активностью источников СО⁶⁰ в диапазоне 6,8-13,5 ГБк. Разовая поглощенная доза в точке А составляла 5 Гр, суммарная 50-55 Гр, а в точках В составляла 11- 14 Гр при ритме облучения 2-3 раза в неделю.

Динамику течения РШМ после проведения НАПХТ оценивал врач онкогинеколог-радиолог, на основании: клинических данных, гинекологического осмотра в зеркалах в совокупности с бимануальным и трансректальным обследованием, УЗИ, ТРУЗИ, импульсной допплерографией. В качестве критерия эффективности лечения обязательно учитывалось изменение объема шейки матки, инфильтрация параметральной клетчатки бимануально и по данным УЗИ. Оценка эффективности терапии оценивалась по следующим градациям ВОЗ:

- полная регрессия - полное исчезновение всех поражений

- частичная регрессия - уменьшение объема шейки матки на 50% и более при отсутствии прогрессирования других очагов,

- стабилизация - уменьшение объема шейки матки менее 50% при отсутствии новых очагов поражений или увеличение не более чем на 25%,

- прогрессирование - большее или равное 25% увеличение размеров шейки матки или появление новых поражений.

Для решения поставленных задач все пациентки с МРШМ ретроспективно, через 12 месяцев после окончания специального лечения, были разделены на 2 группы больных: группа А (n=40) с положительной и группа В (n=40) с отрицательной динамикой течения заболевания. В каждой группе больных анализ состояния иммунной системы и уровня онкомаркера SCCА проводился 3-х кратно через условные временные периоды - до лечения (А1, В1), через 6 (А2, В2) и 12 месяцев (А3, В3) после окончания специального лечения. Изучение иммунологических показателей у пациенток МРШМ внутри каждой группы (А, В) как на этапе до лечения, так и через 6 и 12 месяцев после проведенной специальной терапии проводили для определения критериев неизлеченности, а сравнительный анализ иммунологических показателей у больных МРШМ в зависимости от динамики течения заболевания на разных сроках лечения - для определения иммунологических маркеров неблагоприятного прогноза течения опухолевого процесса.

Оценка системного иммунитета включала: определение в периферической крови абсолютного количества лейкоцитов, лейкоцитарную формулу. Содержание различных субпопуляций лимфоцитов определяли по методике иммунофенотипирования в модификации Сибиряка С. В. и соавт. (1997) с использованием моноклональных антител серии ИКО (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва): анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD10, анти-CD11в, анти-CD16, анти-CD20, анти-CD25, анти-CD34, анти-CD56, анти-CD95, анти-CD HLA-DR. Для изучения функциональной активности нейтрофилов периферической крови определяли: лизосомальную акивность [Фрейдлин И.С., 1984], фагоцитарную активность на модели поглощения частиц полистерольного латекса [Фрейдлин И.С., 1976], кислородзависимый метаболизм с помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста [Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979]. Определение ЦИК (Гашкова В. И. др., 1978). Концентрации иммуноглобулинов класса А, М, G в сыворотке крови оценивали по методике Manchini G. еt al (1965) в модификации Тихомирова А.А. (1977). Исследование гемолитической активности комплемента проводилось методом молекулярного титрования [Красильников А.П., 1984; Резникова Л.С., 1967]. Уровень онкомаркера SCCА и цитокинов в сыворотке крови определяли методом твердофазного ИФА на аппарате «Adaltis Italia», (WBProc., Personal LAB, Италия).

Оценка местного иммунитета репродуктивного тракта женщин включала определение в цервикальной слизи общего количества лейкоцитов, относительной и абсолютной жизнеспособности, функциональную активность нейтрофилов [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю.,2008] Концентрации иммуноглобулинов IgA, sIgA, IgM, IgG и содержание цитокинов определяли методом твердофазного ИФА.

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета прикладных программ “Statistica for Windows 6.0” с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при p ? 0,05, по непараметрическим критериям Mann-Whitney, Wald-Wolfowitz (Гублер Е.В., 1973; Гланц С., 1999; Боровиков В.И., 2001). Представленные цифровые данные были округлены до 2-го десятичного знака. Для оценки достоверности частоты встречаемости признака использовалось значения хи-кватрат (чІ) по методу Пирсона. Определение взаимосвязей SCCA с показателями иммунитета проводили с помощью корреляционного анализа по Spearmаn. Для построения диагностической модели использовали пошаговый дискриминантный анализ.

Результаты исследования. Первой задачей нашего исследования стало изучение показателей системного иммунитета и локальной защиты урогенитального тракта у пациенток МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, до лечения, через 6 и 12 месяцев после лечения. Следует уточнить, что изучение иммунологических показателей проводили у пациенток МРШМ внутри каждой группы (А, В) как на этапе до лечения, так и через 6 и 12 месяцев после проведенной терапии для определения критериев неизлеченности.

Исследование показателей системного иммунитета в динамике у пациенток МРШМ с положительным терапевтическим эффектом от проведенного лечения установило однонаправленный характер изменений нейтрофилов как через 6, так и через 12 месяцев после лечения, который выражался в постепенном снижении количества нейтрофильных гранулоцитов при повышении их функциональной активности. В настоящее время известно, что нейтрофильные гранулоциты первыми вступают в контакт с трансформированными клетками и участвуют в развитии противоопухолевого иммунного ответа [Мальцева В.Н., 2007].

Изучение субпопуляционного состава лимфоцитов в динамике у пациенток МРШМ с положительным терапевтическим эффектом показало, что через 6 месяцев после лечения происходит увеличение CD4+ и CD8+ лимфоцитов, снижение CD10+ позитивных клеток, при отсутствии существенных изменений количества лимфоцитов в периферической крови. Существенно, что через 12 месяцев после окончания специальной терапии показатели субпопуляционного состава лимфоцитов претерпевали более значимые изменения, которые выражались в повышении лимфоцитарного пула клеток и практически всех кластеров дифференцировки (CD3+,CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ , CD25+, СD95+, HLA-DR+ лимфоцитов) при снижении CD11в+ позитивных клеток (табл. 1).

При сравнительном анализе в динамике факторов гуморального иммунитета периферической крови отмечалось повышение IgМ при одновременном снижении ЦИК как через 6 месяцев, так и через 12 месяцев после лечения (табл. 2). Единственным иммуноглобулином, оказывающим противоопухолевое действие, является Ig М. Это связано с тем, что запускается комплемент - зависимый цитолиз при взаимодействии данного иммуноглобулина с антигенными детерминантами опухоли [Сапрыкина О.А., 1994; Тузанкина И.А., Кузнецова Ю.Н., Герасимова Н.М.,2007].

Изменения со стороны клеточного звена иммунитета находят своё отражение и подтверждаются сдвигами в цитокиновом профиле периферической крови. При динамическом изучении уровней цитокинов в сыворотке крови у женщин МРШМ с положительным терапевтическим эффектом от проведенного лечения выявлено, снижение уровня IL-4 и повышение уровня IL-2 как через 6, так и через 12 месяцев после проведения специальной терапии. Установленный через 6 месяцев повышенный уровень IL-10 и INFг относительно данных показателей больных до лечения снижался через 12 месяцев после окончания терапии. Существенно, что уровень TNF-a через 12 месяцев после лечения был выше относительно изучаемого показателя через 6 месяцев, но ниже чем у больных до лечения. Концентрация INFб в ходе проводимой терапии постепенно нарастала и была достоверно выше через 12 месяцев после проведения специальной терапии, относительно изучаемого цитокина у больных как через 6 месяцев после лечения, так и до лечения (табл. 3).

Учитывая вышеизложенное, у пациенток МРШМ с положительной динамикой течения опухолевого процесса, через 6 месяцев после лечения, регистрировалось нарушение Th1/Th2 цитокинового профиля, с преобладанием Th1 типа иммунного ответа. Полученные результаты не противоречат литературным данным последних лет. Доказано, что цитокиновый профиль больных МРШМ не представлен только Th2 типом иммунного ответа, как считалось ранее [Annemieke de Jong, Jeanette M., Mariёtte I.E. et al, 2005]. С нашей точки зрения, повышение уровня цитокинов Th1 типа иммунного ответа в данной подгруппе пациенток связано с прекращением опухолевой прогрессии, что отражает снижение CD10+ лимфоцитов, которое произошло через 6 месяцев после окончания специального лечения и в дальнейшем не претерпевало изменений в зависимости от сроков лечения.

Таким образом, оценить эффективность проведенной терапии у пациенток с МРШМ можно уже через 6 месяцев после лечения, на основании следующих изменений показателей системного иммунитета: увеличение Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов, IFNг, IL-2, Ig М сыворотки крови при одновременном снижении нейтрофильных гранулоцитов, CD10+ позитивных клеток, ЦИК, IL-4.

Для характеристики механизмов локальной иммунной защиты репродуктивного тракта женщин при МРШМ были изучены показатели функциональной активности нейтрофилов, концентрация иммуноглобулинов и цитокиновый профиль цервикальной слизи.

При изучении иммунологических показателей цервикальной слизи в динамике у женщин МРШМ с положительным терапевтическим эффектом через 6 месяцев после проведенного лечения регистрировалось снижение общего количества лейкоцитов, активности фагоцитарных реакций нейтрофилов, содержания Ig А, IL-4, IL-10, IFN-а и повышение IgM, IFN-г, TNF-б по сравнению с пациентками до лечения (табл. 4; 5). Примечательно, что уровни sIg А, Ig G оставались практически неизменными и не претерпевали достоверных отклонений как через 6, так и через 12 месяцев после проведенного лечения. Полученные результаты свидетельствуют об активации факторов местного иммунитета уже через 6 месяцев после лечения, что, по-видимому, связано с положительным эффектом от проведенного противоопухолевого лечения [Куперт А.Ф., 1983; Yonekura M.L., 1988]. Через 12 месяцев после лечения показатели локального иммунитета претерпевали более существенные изменения, которые выражались в снижении общего количества лейкоцитов, абсолютной и относительной жизнеспособности нейтрофилов, лизосомальной активности нейтрофилов (ЛАН), спонтанного и индуцированного НСТ-теста, IL-4, IL-10, IFN-а при повышении функционального резерва нейтрофилов (ФРН), активности фагоцитоза нейтрофилов, общего Ig А, IL-2, TNF-б, IFN-г по сравнению с изучаемыми показателями больных как через 6 месяцев после лечения, так и до лечения.

Таким образом, оценить эффективность проведенной терапии у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, можно уже через 6 месяцев после лечения на основании следующих изменений показателей местного иммунитета: снижение общего количества лейкоцитов, IL-4, IL-10 и IFN-а и повышение IFN-г, TNF-б в цервикальной слизи.

Следующим этапом нашего исследования стало изучение иммунологических показателей периферической крови у больных МРШМ с отрицательным терапевтическим эффектом, до лечения, через 6 и 12 месяцев после окончания специального лечения.

При динамическом наблюдении пациенток МРШМ с отрицательным терапевтическим эффектом было установлено, что изменения показателей форменных элементов сыворотки крови в динамике характеризовались прогрессивным увеличением палочкоядерных нейтрофилов и постепенным повышением абсолютного количества нейтрофилов, тогда как показатели функциональной активности нейтрофилов как через 6, так и через 12 месяцев после лечения достоверно значимых различий не имели. Снижение абсолютного количества лимфоцитов определялось уже через 6 месяцев после проведенной терапии и не претерпевало существенных отклонений через 12 месяцев после лечения. В настоящее время известно, что повышение нейтрофильных гранулоцитов при снижении лимфоцитарного пула является плохим прогностическим фактором, указывающим на прогрессирование неопластического процесса [Мальцева В.Н., 2007]. Считается, что коэффициент соотношения числа нейтрофилов и лимфоцитов превышающий значение 5 связан с худшим прогнозом [Walsh S.R., Cook E.J., Goulder F. et al., 2005; Cho H., Hur H.W., Kim S.W. et al., 2009; Kishi Y., Kopetz S., Chun Y.S. et al., 2009]. Увеличение уровня циркулирующих в крови нейтрофилов коррелирует с усилением метастатического потенциала опухоли, так как в этом случае их большее количество инфильтрирует опухоль [Welch et al., 1989], а снижение абсолютного числа лимфоцитов, указывает на истощение резерва основного звена противоопухолевой защиты.

Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов у пациенток с отрицательным терапевтическим эффектом показал существенное повышение СD10+ и СD11в+ позитивных клеток через 12 месяцев после лечения, несмотря на незначительное снижение данных показателей через 6 месяцев после проводимой терапии. Известно, что увеличение количества CD10+ лимфоцитов отражает раковый потенциал трансформированных клеток, а повышение CD11в+ лимфоцитов свидетельствует об увеличении опухолевых масс и повышенной угрозе метастазирования [Прокопьева О.Б., 2003; Гадецкая, Н.А, Рожкова, Е.Б., 2005; Algarra, I., 2004].Также нами установлено снижение количества СD16+ лимфоцитов, которое через 12 месяцев после лечения не претерпевало существенных отклонений. Несмотря на тенденцию к росту СD 20+ лимфоцитов в ходе проводимой терапии, через 12 месяцев количество В-лимфоцитов снижалось относительно данного показателя через 6 месяцев (табл. 1).

Показатели гуморального звена иммунитета у пациенток МРШМ с отрицательным терапевтическим эффектом не претерпевали существенных изменений в динамике (таблица 2). Установленный факт согласуется с данными мировой литературы о том, что активность гуморального звена иммунитета длительное время остается нормальной и не зависит от степени опухолевой прогрессии. Напротив, на более поздних стадиях нормальная активность гуморального иммунитета оказывается фактором опухолевой прогрессии и препятствует деструкции опухолевых клеток [Гранов А.М., Молчанов О.Е., 2008; Dranoff G., 2004].

При изучении цитокинового профиля периферической крови в динамике наблюдалось снижение IL-2, INFб при повышении IL-4, IL-10 как через 6 месяцев, так и через 12 месяцев после лечения. Примечательно, что уровень TNFa и INFг достоверно снижались только через 12 месяцев после лечения относительно их уровней как через 6 месяцев после лечения, так и до лечения (табл. 3). Таким образом, у пациенток МРШМ с отрицательной динамикой течения опухолевого процесса через 6 месяцев после лечения регистрировалось нарушение Th1/Th2 цитокинового профиля, с преобладанием Th2 типа иммунного ответа. По-видимому, повышение уровня цитокинов Th2 типа иммунного ответа в данной группе пациенток отражает прогрессирование злокачественного процесса, которое произошло через 6 месяцев после окончания специального лечения, связанное с неэффективностью проводимой терапии.

Таким образом, повышение количества палочкоядерных нейтрофилов, IL-4, IL-10 и снижение абсолютного количества лимфоцитов, CD16+ позитивных клеток, уровня IL-2, IFNб сыворотки крови у больных МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, уже через 6 месяцев после окончания курса лечения свидетельствует о неэффективности проводимой специальной терапии. иммунологический местнораспространенный рак матка

При динамическом исследовании показателей локального иммунитета репродуктивного тракта в группе женщин МРШМ с отрицательным терапевтическим эффектом через 6 месяцев после окончания специального лечения достоверных отличий в показателях функциональной активности нейтрофилов по сравнению с подгруппой до лечения найдено не было. Тогда как, гуморальное звено местного иммунитета характеризовалось снижением уровня общего IgА, sIgА, IgG и повышением содержания IgM цервикальной слизи по сравнению с пациентками до лечения (табл. 4). В цитокиновом профиле регистрировалось повышение IL-4, IL-10, IFNб по сравнению с больными до лечения (табл. 5).

Через 12 месяцев после лечения показатели местного иммунитета выражались следующими изменениями: повышением общего количества лейкоцитов слизи, абсолютной и относительной жизнеспособности нейтрофилов цервикальной слизи при угнетении их функциональной активности. Показатели гуморального звена местного иммунитета характеризовались однонаправленным прогрессивным снижением sIgА, IgА, IgG цервикальной слизи.

В цитокиновом профиле через 12 месяцев после проведенного лечения установлено прогрессирующее повышение IL-4, IL-10 и снижение IFNг, TNFб по сравнению с уровнем данных цитокинов у больных как 6 месяцев после лечения, так и до лечения. Содержание IFNб не претерпевало существенных изменений через 12 месяцев после проведенной терапии и соответствовало уровню изучаемого цитокина подгруппы больных через 6 месяцев после окончания специального лечения. На сегодняшний день установлено, что при истощении продукции TNFб клетками моноцитарно-фагоцитарной системы возникает прогрессирующее усиление кровотока, обеспечивающее усиление оксигенации, трофики и роста опухоли с последующим развитием процессов метастазирования. Тогда как, стабильное нарастание уровня IL-4 и интерферонов способствует опухолевой прогрессии [Глухова Т.Н., Салов И.А., Турлупова Т.И., 2010].

В настоящее время доказано, что повышение IL-4, IL-10, определяющие развитие Тh2 тип иммунного ответа, являеюся неблагоприятным прогностическим фактором течения МРШМ, свидетельствующим о прогрессировании мультистадийного процесса канцерогенеза [Bais AG, Beckmann I, Lindemans J. Et al, 2005].

Таким образом, повышение уровня IFNб, IL-4, IL-10 при сниженном уровне sIgА, IgА, IgG цервикальной слизи уже через 6 месяцев после окончания специального лечения, может свидетельствовать о прогрессировании неопластического процесса, при котором очаг поражения интенсивно инфильтрируют нейтрофилы цервикальной слизи, рекрутируемые из периферической крови, что, по-видимому связано с неэффективностью применяемой терапии.

Для решения следующей задачи нашего исследования мы провели сравнительный анализ иммунологических показателей у больных МРШМ в зависимости от динамики течения заболевания на разных сроках после окончания лечения - для определения иммунологических маркеров неблагоприятного прогноза течения опухолевого процесса.

Межгрупповой сравнительный анализ показал однонаправленные изменения отдельных показателей периферической крови в динамике у пациенток МРШМ с отрицательным терапевтическим эффектом: снижение Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и TNFб, повышение CD10+, CD11в + позитивных клеток, IgG и IL-10. Существенно, что при динамическом изучении состояния системного иммунитета отмечалось большее количество показателей вовлеченных в мультистадийный процесс канцерогенеза при прогрессировании опухолевого заболевания. Сравнительный анализ иммунологических показателей цервикальной слизи также выявил однонаправленный характер изменений большинства показателей во всех временных интервалах после окончания специального лечения: повышение общего количества лейкоцитов при увеличении абсолютной жизнеспособности нейтрофилов цервикальной слизи, снижение активности индуцированного НСТ-теста, уровня sIgА, IgM, IL-2, TNFб при одновременном повышении содержания IL-4, IL-10, IFNа цервикальной слизи (табл. 4, 5). Вовлечение практически всех показателей локальной защиты репродуктивного тракта у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ, в неопластический процесс при его прогрессировании, по- нашему мнению, связано с местной локализацией очага поражения.

Таблица 1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у пациенток с МРШМ в динамике (М ± m)

Таблица 2. Содержание гуморальных факторов периферической крови у пациенток с МРШМ в динамике (М ± m)

Примечания к таблицам 1-6; р?0,05- достоверные различия

р_{А1-А2 -} при сравнении показателей подгруппы А2 от подгруппы А1.

р_{А2-А3 -} при сравнении показателей подгруппы А3 от подгруппы А2.

р_{А1-А3 -} при сравнении показателей подгруппы А3 от подгруппы А1.

р_{В1-В2 -} при сравнении показателей подгруппы В2 от подгруппы В1.

р_В2-В3- при сравнении показателей подгруппы В3 от подгруппы В2.

р_{В1-В3 -} при сравнении показателей подгруппы В3 от подгруппы В1.

р_{А1-В1 -} при сравнении показателей подгруппы В1 от подгруппы А1.

р_{А2-В2 -} при сравнении показателей подгруппы В2 от подгруппы А2.

р_{А3-В3 -} при сравнении показателей подгруппы В3 от подгруппы А3.

Таблица 3. Уровень цитокинов сыворотки крови у пациенток с МРШМ в динамике (М ± m)

Таблица 4. Показатели гуморальных факторов иммунитета цервикальной слизи у пациенток МРШМ в динамике (М ± m)

Таблица 5. Уровень цитокинов цервикальной слизи у пациенток с МРШМ в динамике (М ± m).

Для изучения корреляционных взаимосвязей SCCA с иммунологическими показателями периферической крови и цервикальной слизи у пациенток с МРШМ, ассоциированного с ВПЧ был исследован его уровень в сыворотке крови до лечения и в динамике течения заболевания.

Таблица 6. Уровень онкомаркера SCCA в сыворотке крови у пациенток с МРШМ (М±m)

У больных с положительным терапевтическим эффектом от проведенного лечения в динамике установлено его постепенное снижение, более значимое через 12 месяцев после лечения.

У пациенток с отрицательным терапевтическим эффектом в динамике уровень SCCA не претерпевал существенных изменений и через 12 месяцев после лечения достоверно не отличался от значений как через 6 месяцев после окончания лечения, так и до лечения.

При межгрупповом сравнительном анализе уровень SCCA как до лечения, так и через 6 месяцев был одинаковым независимо от динамики течения процесса. Тогда как, через 12 месяцев после лечения содержание SCCA у больных с отрицательной динамикой течения опухолевого процесса повышалось по сравнению с уровнем изучаемого онкомаркера у пациенток с положительным терапевтическим эффектом от проведенного лечения.

При анализе взаимосвязей SCCA с иммунологическими показателями периферической крови и цервикальной слизи регистрировались корреляционные связи онкомаркера с отдельными показателями как системного, так и местного иммунитета, причем их образование, исчезновение и характер зависели от динамики течения заболевания. Так, у пациенток с положительной динамикой течения заболевания регистрировалось 3 прямые взаимосвязи между SCCA и следующими показателями периферической крови: относительным количеством нейтрофилов, CD10+ лимфоцитами и TNFб. Через 6 месяцев после окончания специальной терапии сохранялось количество взаимосвязей, но изменялся их характер, за исключением прямой связи SCCA с относительным количеством нейтрофилов. В цервикальной слизи корреляционные взаимосвязи отсутствовали. Таким образом, постепенное снижение уровня онкомаркера сопровождалось сохранением количества корреляционных взаимосвязей в системном иммунитете и их отсутствием в локальном иммунитете репродуктивного тракта женщины, связанное с регрессом первичной опухоли и положительным эффектом от проведенного специального лечения.