Конденсированные производные бензимидазола – новый класс антитромбогенных средств

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность исследования. Ключевая роль в патогенезе ишемических нарушений в различных органах и системах человеческого организма отводится тромбообразованию [Суслина, 2006; Чазов, 2008; Мирзоян, 2009; Сушкевич,2009; Князева, 2009;]. Известные к настоящему времени данные позволяют, без сомнения, утверждать, что, используя антиагрегантные и другие средства при различных проявлениях активации тромбоцитарного звена гемостаза, можно существенно уменьшить риск развития сердечно-сосудистых осложнений [Макаров, 2006; Воронина, 2006; Maree, 2007; Andiolillo, 2010; Петров, 2010; Тюренков, 2011; Недогода, 2011]. Поэтому антиагрегантная терапия является краеугольной проблемой современной кардиологии. Данная терапия включает препараты с доказанным высоким уровнем активности, которые убедительно продемонстрировали в многоцентровых исследованиях способность снижать риск развития острого коронарного синдрома и острую коронарную смерть [Терещенко, 2008; Geraldo, 2010; Flieri, 2010]. Основу современной антитромбоцитарной терапии составляют ацетилсалициловая кислота-ингибитор циклооксигеназы тромбоцитов, тиенопиридины-блокаторы P2Y12 рецепторов (клопидогрел, тиклопидин) и блокаторы гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов для внутривенного применения (абциксимаб, эптифибатид, тирофибан), а также комбинация ацетилсалициловой кислоты с клопидогрелем [Чарная, 2009]. В настоящее время расширяются показания для применения антитромбоцитарных препаратов, уточняются сведения о специфичности их воздействия на отдельные стороны функции тромбоцитов. Однако необходимо отметить, что современные антиагрегантные средства не всегда отвечают требованиям, предъявляемым к ним в виду недостаточной эффективности и наличия большого количества побочных эффектов. Среди побочных эффектов особенно следует отметить способность антиагрегантов вызывать гастропатии, кровотечения, тромбоцитопеническую пурпуру [De Luca, 2009; Morini, 2010]. Другим фактором, ограничивающим применение антиагрегантных средств, является наличие у части больных резистентности к препаратам, характеризующейся отсутствием депрессии функции тромбоцитов и снижением антитромботического эффекта [ Santilli, 2009; Postula, 2010; Cattaneo 2011]. Поэтому поиск, изучение и создание новых антиагрегантных средств является актуальной задачей в решении проблемы предотвращения тромботических состояний.

Известно, что химический класс производных бензимидазола проявляет различные виды биологической активности и считается перспективным для разработки эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов [Спасов, 1997; Bandarage, 2009; Mуляр, 2009; Анисимова, 2010]. В исследованиях, проведенных ранее в Волгоградском государственном медицинском университете, установлена способность замещенных гетероциклических азотосодержащих систем подавлять агрегацию тромбоцитов, и накоплен опыт изучения соединений с антиагрегантной активностью [Спасов, 2006, 2009, 2010; Дудченко, 1997; Островский, 1999; Анисимова, 2009; Кучерявенко, 2005, 2010;]. Поэтому поиск потенциальных антитромбогенных средств среди производных бензимидазола является достаточно обоснованным.

Целью исследования явилось проведение направленного поиска, изучение эффективности и механизма антиагрегантного действия конденсированных производных бензимидазола, как нового класса антитромбогенных веществ.

Задачи исследования:

1. Разработать систему направленного поиска новых антиагрегантных соединений с использованием методов компьютерного прогноза.

2. Провести многоэтапный направленный поиск антиагрегантных веществ, среди замещенных производных гетероциклических азотсодержащих систем.

3. Провести анализ влияния типа ядра и заместителей, а также частотный анализ влияния физико-химических параметров на уровень антиагрегантной активности в перспективных классах конденсированных бензимидазолов.

4. Изучить влияние производных бензимидазола на тромбогенный потенциал крови крыс в норме и в условиях экспериментального сахарного диабета.

5. Провести углубленное изучение влияния активных соединений на рецепторные и пострецепторные механизмы регуляции активности тромбоцитов.

6. Виртуально изучить механизмы действия производных бензимидазола с использованием 3D-молекулярного моделирования методом сходства к препаратам-эталонам, а также с использованием докинга соединений-лидеров в сайты связывания биомишеней, отвечающих за антиагрегантную активность - кальмодулина, фосфодиэстеразы III типа, аденилатциклазы I типа и ТХА2-синтетазы.

7. Изучить фармакокинетику соединения РУ-254 при внутривенном введении.

8. Исследовать общетоксические свойства (острую и хроническую токсичность) соединения РУ-254 при внутривенном введении.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что антиагрегантная активность производных бензимидазола зависит от их физико-химических свойств (стерических, липофильных и электронных параметров изучаемых соединений). Найдены значимые признаки высокого уровня антиагрегантной активности для класса новых замещенных гетероциклических азотосодержащих систем с использованием методов in silico.

Впервые показана способность соединения РУ-891 эффективно снижать тромбогенный потенциал крови на интактных животных и при экспериментальном диабете. Установлено, что основой антиагрегантной активности вещества РУ-891 является блокирование P2Y12 рецепторов тромбоцитов и снижение уровня ТХА2.

Для соединений РУ-254 и РУ-185 впервые выявлено влияние на тромбогенный потенциал крови, связанный с ингибирующим влиянием на уровень образования ТХА2, в условиях целого организма.

Впервые с использованием 3D-молекулярного моделирования методом сходства к препаратам-эталонам, а также с использованием докинга проведен анализ особенностей взаимодействия соединений-лидеров с наиболее вероятными белками-мишенями, отвечающими за антиагрегантную активность - кальмодулином, фосфодиэстеразой III типа, аденилатциклазой I типа и ТХА2-синтетазой.

Научно-практическая значимость. В результате экспериментального поиска новых веществ, ингибирующих процесс агрегации тромбоцитов, среди азотосодержащих гетероциклических соединений была сформирована база данных соединений, изученных на предмет данного вида активности. Созданная система комбинированного поиска in silico новых антиагрегантных соединений позволила осуществить выявление веществ с антиагрегантной активностью с последующей перепроверкой наличия данного вида активности в эксперименте in vitro и in vivo. В результате использования данной программы удалось существенно снизить материальные, временные и финансовые затраты, необходимые для проведения экспериментальных исследований по поиску новых потенциальных антиагрегантных средств.

Выявлено новое оригинальное вещество РУ-891, проявляющее выраженные антиагрегантные свойства, связанные с поливалентным механизмом действия. Данные об антитромбогенных свойствах соединения РУ-254, выявленные в настоящей работе, явились основанием для включения в протокол клинических исследований данного вида активности, что получило дальнейшее подтверждение в рамках III фазы клинических испытаний данного соединения у больных сахарным диабетом II типа.

При составлении протоколов клинических исследований антиоксидантного соединения РУ-185 необходимо изучать показатели тромбогенного потенциала крови.

Проведены фармакокинетические и токсикологические исследования соединения РУ-254 при внутривенном введении.

Реализация результатов исследования. Данные об антиагрегантной активности соединений, анализ влияния типа ядра, заместителей и физико-химических параметров на уровень антиагрегантной активности в перспективных классах конденсированных бензимидазолов используется при синтезе новых соединений в НИИ Физической и Органической Химии Южного Федерального Университета (г. Ростов). В работе НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедры фармакологии ВолгГМУ используется новый комплексный подход к изучению антиагрегантной активности веществ. Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ, на кафедрах фармакологии Саратовского, Ставропольского и Ростовского медицинских университетов.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди изученных 14 классов конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола наиболее активные антиагрегантные соединения встречаются в рядах производных N1,N3-имидазола, и N9-2,3-дигидро-имидазо[1,2_a]-бензимидазола.

2. Соединения РУ-891, РУ-254 и РУ-185 по выраженности антиагрегантного действия in vitro, превосходят препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту (АСК) в 5,5, 2,7 и 2 раза соответственно, а в опытах in vivo в 8, 7,5 и 4,6 раза соответственно.

3. Антитромботическая активность соединения РУ-891, проявленная на экспериментальных моделях артериальных тромбозов, выше активности ацетилсалициловой кислоты (АСК) в 3 раза. Антидиабетогенное соединение РУ-254 по способности предотвращать образование тромбов превосходит препарат сравнения гликлазид в 2,4 раза, а антиоксидантное соединение РУ-185 - препарат мексидол в 3,1 раза.

4. Механизм антитромбогенного действия соединения РУ-891 определяется блокирующим влиянием на P2Y12 рецепторы тромбоцитов, снижением синтеза тромбоксана А2 (ТХА2) и уровня внутриклеточного кальция. Соединения РУ-254 и РУ-185 по механизму действия являются ингибиторами синтеза ТХА2.

5. Методический подход in silico, включающий информационные технологии компьютерного прогноза биологической активности химических соединений «PASS» и «Микрокосм», анализ сходства структур и докинг с целью поиска и изучения механизма действия новых антиагрегантных веществ, значительно оптимизирует проводимые исследования по выявлению новых потенциальных антитромботических средств в ряду конденсированных производных бензимидазола.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств: «Лекарства-человеку» Харьков, 2000, на I межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, Санкт-Петербург, 2001, на III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» Санкт-Петербург, 2007, на VII конференции «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику) Ярославль, 2009, на VII всероссийской конференции с молодежной научной школой, Уфа, 2009, на 56-й региональной научно-практической конференции «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области», Волгоград, 2010, на V диабетологическом конгрессе, Москва, 2010 , на II Международном Конгресс-Партнеринге и Выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», Москва, 2010, на XIV, XV, XVI, XVII, XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе 20 статей, из которых 18 - статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получено 3 положительных решения на патенты на изобретения.

1. Материалы и методы исследований

тромбообразование антиагрегантный бензимидазол

В качестве объектов исследования использованы новые химические соединения, которые были синтезированы в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета (Ростов-на-Дону) ведущим н.с., к. х. н. В.А. Анисимовой.

Было изучено 14 классов конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола: N9-имидазо[1,2_a]бензимидазолы (230 соединений); N9-2,3-дигидро-имидазо[1,2_a]бензимидазолы (32соединения); пиримидо[1,2_a] бензимидазолы (47 соединений); 2,3,4,10-тетрагидро-пурины (20 соединений); N1,N3-имидазолы (27 соединений); тиазоло[3,2-a]бензимидазолы (1 соединение); 1,2,3,4-тетрагидро-оксазоло[2,3-f]пурины (2 соединения); N1-бензимидазолы (40 соединений); N1-1,2,4-триазолы (8 соединений); N1-имидазо[1,2_a]бензимидазолы (60 соединений); N1-2,3-дигидро-имидазо[1,2-а] бензимидазолы (14 соединений); 1,2,4-триазоло[1,5_a]-бензимидазолы (3 соединения); пиразоло[1,5-a]бензимидазолы (8 соединений); пиролло [1,2-a]бензимидазолы (11 соединений).

Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов in vitro изучали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA) научно-производственной фирмы «Биола» (г. Москва), согласно методу Born G, в модификации Габбасова В.А. (1989). Для активации агрегации тромбоцитов использовали АДФ в конечной концентрации 5мкМ. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту (АСК).

Острая токсичность определялась на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 грамма при внутрибрюшинном введении. Величину токсикологического показателя - LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона. В качестве объективного показателя условной широты терапевтического действия использовался условный терапевтический индекс соединений, который определяли как отношение показателя LD50 к EC50.

Моделирование и степень внутрисосудистой агрегации тромбоцитов проводили и оценивали по методу, описанному J.F. Pinon (1984). Для оценки влияния соединений на внутрисосудистую агрегацию кровяных пластинок, вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг за 1,5 часа до наркоза животных. Индуктор агрегации АДФ вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг.

Исследования на моделях артериальных тромбозов, индуцированных аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) и воздействием анодного электрического тока на сонную артерию крыс осуществляли на наркотизированных нембуталом (50 мг/кг) животных спустя 2 часа после перорального введения препаратов согласно методу Kurz (1990) и Guglielmi G. et al (1991) соответственно. В качестве препаратов сравнения использовалась АСК, гликлазид и мексидол. Производные бензимидазола исследовались в изоэквимоляльных дозах АСК (20мг/кг). Для исследования влияния соединений на время образования тромба использовали ультразвуковой компьютеризированный аппарат «Минимакс-Доплер-К» (Санкт-Петербург) [Спасов, 2011].

Модель генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза на мышах была воспроизведена в соответствии с методикой [Di Minno, 1983]. В качестве тромботического агента использовали смесь растворов коллагена в дозе 0,5 мг/кг и адреналина в дозе 0,06 мг/кг. Вещества вводили перорально за 2 часа до моделирования тромбоза в изоэквимоляльных дозах АСК (20мг/кг). При морфологическом исследовании легких мышей оценивали наличие признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Гистологические препараты документировали цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) c использованием объектива х10, х40 и окуляра х10.

При изучении влияния веществ на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз для определения времени свертывания крови была использована модель «время кровотечения на мышах» [Gratacap, 2009]. По действию на данный параметр соединения были изучены в дозах равных ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Для изучения влияния производных бензимидазола на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз при экспериментальном патологии у крыс путем внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 150 мг/кг создавали экспериментальный сахарный диабет, согласно [Chougale, 2007]. Эксперименты проводили на животных с тяжелой формой сахарного диабета, у которых развивалась стойкая гипергликемия с содержанием глюкозы более 15 ммоль/л.

При изучении влияния соединений на агрегацию тромбоцитов и вязкость крови пероральное введение исследуемых соединений проводили ежедневно в течение недели до начала экспериментов, в дозах соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Препарат сравнения гликлазид и пентоксифиллин были изучены в дозе 10 мг/кг и 4 мг/кг.

Влияние препаратов на агрегацию тромбоцитов крыс с аллоксановым диабетом «ex vivo» проводили по методу Born G.(1962) в модификации Габбасова З.А. и др (1989).

Вязкость крови определялась при помощи вискозиметра ротационного типа-анализатора крови реологического (АКР-2) при шести скоростях сдвига (10с-1, 20с-1, 50c-1,100c-1, 200с-1, 300c-1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах [Добровольский, 1998]. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации эритроцитов (ИАЭ), рассчитываемому как отношение вязкости крови (ВК) при скорости сдвига 10с-1 к ВК при 300с-1 [Парфенов, 1994]. Вязкость крови определялась при стандартизированном гематокрите -40%.

Модель артериального тромбоза у крыс с экспериментальным диабетом, индуцированного электрическим током, была поставлена согласно методу Guglielmi G. et al. (1991). Производные бензимидазола были изучены в дозах ED50, полученных при исследовании веществ на данной модели у интактных животных.

Влияние производных бензимидазола на агрегацию тромбоцитов in vitro, изучали согласно методу Born G, в модификации Габбасова В.А.(1989). В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ и адреналин в конечной концентрации 5мкМ, коллаген - 4 мкг/мл, тромбин - 0,5 ед/мл, агонист тромбоксановых рецепторов - U46619 - 3 мкМ, арахидоновую кислоту - 50 мкМ, кальциевый ионофор - А-23187 - 3мкМ.

Влияние соединений в концентрации 1мкМ на пуриновые P2Y1 и P2Y12-рецепторы тромбоцитов изучали в безкальциевой и кальциевой среде, методом малоуглового светорассеяния [Сакаев, 2000]. Регистрацию проводили на приборе «Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», Россия). В качестве веществ сравнения использовали Reactive blue 2 (Basilen blue) и PPADS.

При изучении влияния производных бензимидазола на баланс «простациклин-ТХА2» в организме крыс, соединения вводились перорально за 2 часа до исследования в дозах, соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Антиагрегационную активность сосудистой стенки крыс ex vivo оценивали по методу D. E. MacIntyre (1978), в модификации В.П. Балуды (1980). Исследования по изучению воздействия соединений на синтез ТХА2 ex vivo проводили по методу J.B. Smith (1976). Измерения проводили на спектрофотометре АPEL PD-303 UV (Япония), при длине волны, равной 532 нм.

Определение изменений уровня внутриклеточного кальция проводили согласно методу, описанному Cho et al. (2006) в отмытых тромбоцитах кролика с использованием флуоресцентного зонда Fura-2/АМ на спектрофлуориметре Hitchi MPF - 400 (Япония) при длине волны возбуждения 340 nm и 380 nm и длине волны испускания 510 nm. В качестве препаратов сравнения были выбраны АСК и антагонист ионов кальция верапамил. В качестве стимулятора выхода интрацеллюлярного кальция их внутриклеточных депо был использован тромбин в концентрации 0,5 ед/мл. Расчет концентрации катионов кальция проводился с помощью уравнения Schaeffer and Blaustein (1989).

Уровень мембраносвязанного кальция в тромбоцитах, измеряли с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного зонда хлортетрациклина в концентрации 20 мкМ по методу, описанному Gasvell и Hutchison (1971). Действие соединений на потенциал-зависимые кальциевые каналы изучали на изолированных портальных венах крыс, используя метод гиперкалиевой контрактуры [Golenhofen, 1973].

Эксперименты по изучению влияния производных бензимидазола на коэффициент эндотелиальной дисфункции выполнены на интактных нелинейных крысах и крысах с аллоксановым диабетом по методу Покровского (2006 г.) в дозах, соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Для изучения основных параметров сердечно-сосудистой системы использовалась универсальная компьютерная многоканальная система обработки сигналов в реальном масштабе времени ВЕАТ (РКНПК РАМН, Москва, 2000).

Влияние производных бензимидазола на показатели коагулограммы крови крыс изучалось хронометрически, с помощью турбидиметрического гемокоагулометра «SOLAR» (модель CGL 2110, Белоруссия).

Изучение фармакокинетики проводили на белых нелинейных крысах самцах массой 200-250 г., которым в хвостовую вену вводили вещество РУ-254, растворенное в физиологическом растворе в дозе 25 мг/кг. Содержание вещества в биологических пробах определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «HEWLETT PACKARD» серии 1050. Для определения в пробах вещества использовали колонку Separon SGX С18 5 мкм (4100) фирмы «Элсико». Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 280 nm. Полученные экспериментальные данные анализировались модельно-независимым методом [Gibaldi, 1982].

Исследование острой и хронической токсичности соединения РУ-254 при внутривенном введении проводилось в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств [Арзамасцев, 2005].

Статистическая обработка данных, полученных при экспериментальных исследованиях, проводилась с помощью программы STATISTICA/w6.0 фирмы StatSoft, Inc. (США) с использованием критерия Манна-Уитни, в электронной таблице Excell 5.0, с использованием t-критерия Стьюдента при помощи пакета статистических программ программного обеспечения Microsoft Excell 2003, 2006. Обсчет результатов исследований по влиянию соединений на выживаемость мышей при моделировании генерализованного тромбоза, проводился с помощью точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных гистологических исследований проводили с использованием программы «Видео Тест Морфо-4. Площадь под фармакокинетической кривой (AUC) рассчитывали с помощью смешанного линейно-логарифмического метода статистических моментов [Пиотровский, 1986].

Анализ зависимости между биологической активностью и химической структурой производных бензимидазола проводился с применением методов теории распознавания образов [Горелик, 1984]. Для выявления QSAR-закономерностей использовались два метода: подструктурный анализ и частотный анализ физико-химических параметров соединений. Кластеризация осуществлялась двумя методами: вероятностным методом гистограмм и геометрическим методом расстояний [Мандель, 1988]. Показатели липофильности вычислялись с применением различных схем фрагментного приближения [Broto, 1984; Ghose, 1987; Viswanadhan, 1989]. Cтерические параметры рассчитывались с использованием классической аддитивной схемы в различных модификациях [Иоффе, 1983; Ghose, 1987; Viswanadhan, 1989].

Вычисление электронных характеристик проводили согласно методу AM1 [Dewar, 1985; Минкин, 1997], с предварительной оптимизацией конформации методом молекулярной механики MM2 [Буркерт, 1986; Кларк, 1990].

Компьютерный прогноз биологической активности новых производных бензимидазола осуществляли с использованием системы PASS [Филимонов, 2006] и информационной технологии «Микрокосм» [Васильев, 2005]. Расчеты были выполнены с помощью программы Pro 2006 (версия SAR-базы 2009 г.), разработанной в НИИ БМХ РАМН (Москва) и с помощью разработанного в ВолгГМУ оригинального программного комплекса ИТ «Микрокосм» (версия 5.1, 2009г.).

Прогноз биологической активности методом сходства к эталонам проведен на основе вычисления средних коэффициентов 2D- и 3D-сходства структуры изучаемого соединения к структурам специально выбранных препаратов сравнения с известным механизмом действия [Molecular Similarity ..., 1995]. В качестве препаратов-стандартов были выбраны ингибиторы кальмодулина (хлорпромазин гидрохлорид, кальмидазолиум хлорид, феноксибензамина гидрохлорид), ингибиторы ФДЭ цАМФ III типа (цилостазол, трапидил, пентоксифиллин, дипиридамол), ингибиторы ТХА2-синтетазы (дазоксибена гидрохлорид, ридогрел, мидазогрел) и стимуляторы аденилатциклазы (букладесин натрия, форскалин и вещество NKH 477 гидрохлорид). Расчеты выполнены с помощью программы HyperChem 7 (Evaluation Copy).

Докинг производных бензимидазола в сайты связывания различных белков - мишеней: кальмодулина, фосфодиэстеразы III типа, тромбоксансинтетазы А2 и аденилатциклазы выполнялся с использованием программного пакета AutoDock Vina 1.1.1 [AutoDock Vina, 2010] в комплекте с дополнительными инструментами AutoDock Tools и PyMol [Trott O, 2010] на имеющемся в ВолгГМУ 24-х ядерном вычислительном кластере общей производительностью 190 Гфлопс.

2. Результаты исследования и их обсуждение

Экспериментальный поиск веществ с антиагрегантной активностью in vitro был проведен среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, представленных 14 классами. На основании величины рассчитанного условного терапевтического индекса, из данной группы веществ было выбрано 11 наиболее активных соединений, превосходящих препарат сравнения АСК (табл. 1). В результате этого выявлено вещество под шифром РУ-891, проявляющее высокую антиагрегантную активность. По EC50 данное соединение превосходит АСК 5,5 раза, а по терапевтическому индексу в 10 раз.

Таблица 1. Влияние производных бензимидазола и АСК на АДФ-индуцированную (5мкМ) агрегацию тромбоцитов кролика in vitro - ЕС50, острая токсичность-LD50 (в/бр, мг/кг) и условный терапевтический индекс (УТИ) исследуемых веществ

Зависимость антиагрегантной активности производныз бензимидазола от их струтктуры и физико-химических свойств. С использованием подструктурного анализа среди экспериментально изученных веществ 14 различных классов азотосодержащих гетероциклических соединений были выявлены наиболее перспективные классы производных N9_2,3-дигидро-имидазо[1,2-a]бензимидазола и N1,N3-имидазола с высокими индексами значимости для поиска новых веществ с высокой антиагрегантой активностью (рис.1).

Анализ зависимости данного вида активности от характера заместителей, физико-химических свойств соединений этих двух классов позволил выявить радикалы, которые могут вносить значимый вклад в антиагрегантную активность. Так, в группе производных N9_2,3-дигидро-имидазо[1,2-a]бензимидазола вклад в наличие антиагрегантной активности могут вносить диаминоэтильный заместитель в положении R3, а также солевой остаток виде гидрохлорида. Антиагрегантная активность производных N1,N3-имидазола будет определяться наличием в положении R1 заместителей (4-хлорфенил)карбонилметил и (3,4-дихлорфенил)карбонилметил. Также, необходимо отметить существенное влияние на наличие высокой антиагрегантной активности электронных характеристик конденсированной гетероциклической системы, которая, возможно является одним из основных «фрагментов взаимодействия», что подтверждает перспективность классов N9-2,3-дигидро замещенных имидазо[1,2-a]бензимидазола и N1N3-замещенных имидазолов.

Рис. 1. Влияние типа ядра производных бензимидазола на высокий уровень антиагрегантной активности: Примечание: 1.N9-имидазо[1,2_a]бензимидазолы; 2.N9-2,3-дигидро-имидазо[1,2_a]бензимидазолы; 3. Пиримидо[1,2_a]бензимидазолы; 4.2,3,4,10-тетрагидро-пурины 5. N1,N3-имидазолы; 6. Тиазоло[3,2-a]бензимидазолы; 7. 1,2,3,4-тетрагидро-оксазоло[2,3-f]пурины; 8. N1-бензимидазолы; 9. N1-1,2,4-триазолы; 10. N1-имидазо[1,2_a]бензимидазолы; 11.N1-2,3-дигидро-имидазо[1,2-а] бензимидазолы; 12.1,2,4-триазоло[1,5_a]-бензимидазолы; 13. Пиразоло[1,5-a]бензимидазолы; 14. Пиролло [1,2-a]бензимидазолы

Антиагрегантная активность производных бензимидазола in vivo. По способности блокировать внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов in vivo выбранные соединения располагались в следующем порядке: РУ-891> РУ-670 > РУ-659 > РУ-254 > РУ-17 > РУ-1202 > РУ-487 > РУ-451 > РУ-295> РУ-502 > РУ-185 > АСК (табл. 2).

Наибольшую способность предотвращать внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов в дозе 50 мг/кг проявило соединение РУ-891, что подтверждает высокий антиагрегантный эффект данного вещества, полученный в опытах in vitro. Это позволило нам выбрать соединение РУ-891 для дальнейшего более углубленного изучения его антиагрегантной активности на различных моделях экспериментальной патологии и механизма действия, с учетом влияния на основные звенья патогенеза агрегации тромбоцитов.

Таблица 2. Влияние производных бензимидазола (50 мг/кг) и ацетилсалициловой кислоты (125 мг/кг) на внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов, индуцированную внутривенным введением АДФ (1 мг/кг), (М±m, n=5)

*- (р?0,001); **-(р?0,05) -данные статистически значимы по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни; n-число тестируемых животных.

Также, для углубленного изучения антиагрегантной активности были выбраны два соединения, проявляющие антитромбоцитарное действие in vitro и in vivo, однако, обладающие еще и другими видами активности, которые могут представлять практический интерес. Соединение РУ-254, с изученными в эксперименте и в клинике антидиабетогенными свойствами, по антиагрегантному действию in vitro превосходит препарат сравнения АСК в 2,7 раза, а по условному терапевтическому индексу в 2,6 раза. Соединение РУ-185 с исследованными антиоксидантными и ишемическими свойствами [Косолапов, 2005] по способности ингибировать процессы агрегации тромбоцитов in vitro превышает препарат сравнения в 2,2 раза, а по условному терапевтическому индексу в 2,1 раза.

На рисунке 2 приведены данные дозозависимой антиагрегантной активности соединений и препарата сравнения in vivo. При этом ED50 для соединения РУ-891 составила 24 мг/кг, что в 8 раз меньше ED50 АСК, которая была равна 192 мг/кг. ED50 вещества РУ-254 была сравнима с ED50 соединения РУ-891, а значение ED50 вещества РУ-185 было в 4 раза меньше, чем у препарата сравнения.

Таким образом, в результате изучения влияния веществ на процессы агрегации тромбоцитов in vitro и in vivo по выраженности антиагрегантного действия три выбранных соединения и препарат сравнения, можно расположить в следующем порядке: РУ-891>РУ-254>РУ-185>АСК.

Рис. 2. Влияние соединений РУ-254, РУ-185, РУ-891 и ацетилсалициловой кислоты на внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов крыс, индуцированную АДФ (1 мг/кг)

Изучение антитромбогенных свойств производных бензимидазола. Проведенный сравнительный анализ антитромбогенной активности выявил преимущество антитромботического действия соединения РУ-891 перед другими соединениями и АСК (рис. 3).

Рис. 3. Влияние соединений: A - РУ-891 и ацетилсалициловой кислоты,, Б - РУ-254, гликлазида и ацетилсалициловой кислоты, В - РУ-185, мексидола и ацетилсалициловой кислоты на время полной окклюзии сонной артерии на модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлоридом железа. По оси абсцисс - доза препаратов (мг/кг), по оси ординат - время наступления полной окклюзии сонной артерии (мин)

ЕD50 данного вещества было в 4,9 раза меньше ЕD50 АСК. Оценка антитромботического действия соединения РУ-254 выявила его преимущество перед гликлазидом и преимущество двух последних перед АСК. Соединение РУ-185 способное ингибировать перекисное окисление липидов также показало высокую антитромботическую активность, превосходящую препарат сравнения мексидол.

В результате изучения антитромботического действия соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 и препаратов сравнения на модели артериального тромбоза, индуцированного анодным током, было показано, что все изученные вещества проявили высокую активность (табл.3). По выраженности данного вида действия соединение РУ-891 превосходило АСК в 3,1 раза, РУ-254 превышало действие гликлазида в 2,5 раза, а вещество РУ-185 - действие мексидола в 3,1 раза.

Таблица 3. Антитромботическая активность соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 (ED50) и препаратов сравнения на модели тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного электрическим током, (М±m)

Данные статистически значимы по отношению к значениям, полученным в контроле * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р< 0,001 - критерий Манна-Уитни.

На фоне действия изученных веществ РУ-254, РУ-185, РУ-891 уменьшалась смертность белых мышей при системном коллаген-адреналиновом тромбозе, вызванном совместным введением тромботических агентов в хвостовую вену животных (табл.4). Наибольшую антитромботическую активность при данном виде экспериментального тромбоза проявили соединения РУ-891 и РУ-185. Выживаемость животных при их введении составила по 90% соответственно, что в 3 раза превышает эффект препарата сравнения АСК. Антитромботическая активность соединения РУ-254 была менее выраженной, однако превосходила известный антиагрегант в 2,3 раза.

Таблица 4. Влияние cоединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 в дозах, изоэквимоляльных дозе ацетилсалициловой кислоты, на выживаемость белых беспородных мышей на модели коллаген (0,5 мг/кг) - адреналинового (0,06 мг/кг) тромбоза, (М±m)

*-(р?0,05); ** - (р?0,01) данные статистически значимы по отношению к контролю, точный критерий Фишера,

#-(p<0,05)- данные статистически значимы по отношению к группе мышей, получавших ацетилсалициловую кислоту, точный критерий Фишера.

Наличие данного вида активности у изученных соединений, подтверждается проведенными гистологическими исследованиями органов животных (табл.5). В образцах легких контрольных животных при микроскопическом исследовании в

Таблица 5. Влияние соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 на изменение некоторых морфометрических параметров тромбов в сосудах легких мышей. (М±m, n=5)

*- (р?0,01); ** - (р?0,001) данные статистически значимы по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни; n -число тестируемых животных значительной части сосудов микроциркуляторного русла были обнаружены белые тромбы, адгезированные к сосудистой стенке и находящиеся в просвете сосуда.

Таким образом, высокая антитромботическая активность производных бензимидазола на различных моделях артериальных тромбозов, позволяет предположить, что в основе этого вида активности лежит угнетение процессов агрегации тромбоцитов, так как именно тромбоциты играют ключевую роль в инициации данных видов тромбозов.

При изучении влияния соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 на время кровотечения из хвостовой вены мышей, наблюдалось удлинение данного показателя. Однако по сравнению с АСК, время кровотечения под влиянием соединений изменялось не сильно относительно контроля, что позволяет предположить в будущем отсутствие или наличие слабовыраженных побочных эффектов в виде кровотечений (рис. 4).

Рис 4. Влияние соединений РУ-254, РУ-185 , РУ-891 и АСК на время кровотечения у мышей. * - данные статистически значимы по отношению к значениям, полученным в контроле, критерий Манна-Уитни (р<0,05); #- данные статистически значимы по отношению к значениям, полученным при изучении АСК, критерий Манна-Уитни (р<0,05)

Влияние на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз при экспериментальном диабете. Исходя из того, что важным составляющим микроангиопатии при сахарном диабете (СД) является дисфункция тромбоцитов [Ambrosi, 2006; Lopes, 2011] было изучено влияние производных бензимидазола на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз при экспериментальной аллоксановой интоксикации [Chougale, 2007].

В связи с тем, что при СД проводится длительная гипогликемическая терапия, оценку эффективности действия веществ и препарата сравнения на гемостаз проводили после семидневного внутрижелудочного введения животным с тяжелой формой аллоксановой интоксикации. Исследуемые вещества РУ-891 и РУ-185 после курсового введения практически не оказывали влияния на уровень глюкозы в крови. Соединение РУ-254 и гликлазид достоверно снижали количество глюкозы в крови на 29 и 27 % соответственно. В эксперименте при аллоксановой интоксикации наблюдалось статистически значимое повышение агрегации тромбоцитов по сравнению с интактными животными. Уменьшение данного показателя под влиянием cоединений РУ-254, РУ-185, РУ-891 и гликлазида у диабетных крыс было статистически значимым. При этом соединения РУ-891 и РУ-254 превосходили по своей активности препарат сравнения, а соединение РУ-185 незначительно уступало ему (рис.5).

Рис. 5. Действие соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 и гликлазида при курсовом пероральном введении на агрегацию тромбоцитов крыс с экспериментальным диабетом ex vivo в дозах равных ED50 , полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов

*- р<0,05 - данные статистически значимы относительно агрегации крыс с экспериментальным диабетом, критерий Манна-Уитни.

# - р<0,05- статистическая значимость относительно интактных животных, критерий Манна-Уитни.

В области сосудистого дефекта нарушается геометрия потока крови с явлениями турбулентности, которые являются одним из основных гидродинамических факторов сосудистого тромбоза [Плотников, 2005]. Эти процессы могут усиливаться на фоне синдрома повышенной вязкости, который наблюдается при СД. Оценивая, влияние исследуемых веществ на ВК у крыс с аллоксановым диабетом, было выявлено статистически значимое снижение этого показателя у всех препаратов при различных скоростях сдвига, превосходящее препарат сравнения пентоксифиллин. Следует отметить, что наибольшее действие изучаемые вещества оказывали при низкосдвиговых значениях ВК. Наибольшую активность в данном случае проявило соединение РУ-891. Активность исследуемых веществ в отношении влияния на ВК при высоких скоростях сдвига оказалась ниже у всей группы препаратов.

Индекс агрегации эритроцитов больных животных составил 2,31 (рис.6), что на 33% больше данного показателя у интактных животных. Изученные соединения уменьшали значения индекса агрегации эритроцитов. Так, вещество РУ-891 снижало данный показатель на 31,6% а соединения РУ-254 и РУ-185 на 28,5% и 26,4% соответственно. Препарат сравнения пентоксифиллин уменьшал индекс агрегации эритроцитов больных животных на 10,4%.

Рис. 6. Влияние соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 и пентоксифиллина на индекс агрегации эритроцитов крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом

*-р<0,05 - данные статистически значимы относительно индекса агрегации эритроцитов крыс с экспериментальным диабетом.

Нарушения гемостаза при СД обусловливают ускоренное прогрессирование атеросклероза, что сопровождается риском возникновения тромбозов [Arikawa, 2006]. Поэтому, нами была изучена антитромботическая активность соединений на модели артериального тромбоза, вызванного повреждением стенки артерий электрическим током при экспериментальном СД. В результате данного исследования установлена высокая антитромботическая активность производных бензимидазола (рис.7). Наибольшую способность пролонгировать время образования тромба проявили гипогликемическое соединение РУ-254 и гликлазид, что связано со способностью данных соединений не только устранять глюкозотоксичность, но и оказывать ингибирующее влияние на процессы агрегации тромбоцитов.

Рис. 7. Влияние соединений РУ-891, РУ-254, РУ-185 и гликлазида при курсовом введении на время наступления полной окклюзии сонной артерии крыс с аллоксановой интоксикацией на модели экспериментального тромбоза, индуцированного электрическим током

*- р<0,05 - данные статистически значимы относительно времени наступления окклюзии сонной артерии у группы контрольных крыс с экспериментальным диабетом.

Таким образом, установленная способность производных бензимидазола улучшать состояние тромбогенного потенциала крови при СД имеет значение для создания на их основе новых лекарственных средств, для лечения и предупреждения развития осложнений при СД II типа.

Изучение механизма действия. Важным аспектом создания лекарственных препаратов является изучение их механизма действия, так как в будущем это предполагает наличие у них побочных эффектов и токсического действия.

Анализ предполагаемых механизмов действия с помощью методов in silico. В системе PASS для соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 были получены значения прогнозных показателей 79 видов биологической активности, релевантных антиагрегантной. С учетом полученных значений можно предположить, что механизм антиагрегантной активности соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 может реализовываться через ингибирование цГМФ- и цАМФ-зависимой фосфодиэстеразы. Вместе с тем, для соединений РУ-891 и РУ-254 прогнозируется маловыраженная активность в отношении ингибирования кальмодулина и кальций-кальмодулин-зависимой протеинкиназы.

Прогноз уровня фармакологической активности соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 в ИТ «Микрокосм» также показал наличие или отсутствие некоторых возможных механизмов антиагрегантного действия изученных соединений.

По результатам данного вида прогноза, вещество РУ-891, вероятно, будет проявлять высокую антиагрегантную и кальций-блокирующую активности, так как имеет три положительных оценки по консервативной, нормальной и рисковой стратегиям прогноза в отношении данных видов действия. Механизм антиагрегантной активности вещества РУ-254, согласно результатам прогноза в ИТ «Микрокосм», возможно, не должен быть связан с кальций-блокирующим и антикальмодулиновым действием. Соединение РУ-185 предположительно должно проявлять высокую активность в отношении ингибирования кальмодулина, а также умеренную антиагрегантное и кальций-блокирующее действие. Согласно ранее проведенным исследованиям по изучению соединений РУ-254 и РУ-185 на активность ФДЭ цАМФ [Cибирякова, 1995] было показано, что вещество РУ-254 не оказывает ингибирующего действия ни на базовую активность ФДЭ, ни на активность ФДЭ цАМФ, зависимую от белка-кальмодулина. Соединение РУ-185 проявляет выраженную блокирующую активность в отношении кальмодулин-зависимой ФДЭ цАМФ, не оказывая влияние на ее базовую активность.

Экспериментальное изучение механизма действия производных бензимидазола. Сложность проблемы избирательной фармакологической регуляции активности тромбоцитов заключается в том, что на их мембране экспрессированы рецепторы к различным агонистам агрегации. На начальном этапе изучения механизма действия производных бензимидазола было исследовано, не являются ли данные соединения конкурентными антагонистами индукторов агрегации тромбоцитов.

Величины антиагрегантной активности изученных соединений в отношении индукторов агрегации тромбоцитов, вызванной АДФ, адреналином, коллагеном, арахидоновой кислотой, U46619, тромбином и А23187, выраженные в EC50 представлены в таблице 6.

Таблица 6. Влияние соединений РУ-254, РУ-185 и РУ-891 на агрегацию тромбоцитов кролика, вызванную различными индукторами.

Соединение РУ-891 выраженно блокировало агрегацию тромбоцитов, вызванную всеми изученными индукторами, однако наибольшую активность вещество проявило в отношении активации тромбоцитов, вызванной адреналином и кальциевым ионофором (А23187), что, с учетом механизма возникновения данных активаций, может указывать на способность соединения РУ-891 снижать уровень кальция в тромбоцитах. Гипогликемическое соединение РУ-254 также блокировало агрегацию тромбоцитов, вызванную различными индукторами, проявив наибольшую ингибирующую способность в отношении активации красных кровяных пластинок, вызванной арахидоновой кислотой и кальциевым ионофором. Низкая активность данного вещества в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином дает возможность предположить, что механизм его антиагрегантного действия вероятно не будет реализовываться через снижение активации фосфолипазы С и угнетения образования инозитол-1,4,5-трифосфата. Антиоксидантное вещество РУ-185 проявило ингибирующую активность в отношении всех изученных индукторов. Блокирование агрегации тромбоцитов, вызванной агонистом тромбоксаноых рецепторов U 46619, соединениями РУ-891 и РУ-185 может указывать на снижение уровня ТХА2. Относительно высокие концентрации веществ, необходимые для проявления их антиагрегантого эффекта в отношении изученных индукторов агрегации тромбоцитов, подтверждают, что первичным местом воздействия данных соединений не являются мембранные рецепторные системы данных агонистов.

Ключевую роль в агрегации тромбоцитов играет Р2Y12 рецептор тромбоцитов [Nawarskas,2011]. При изучении влияния соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 в концентрации 1 мкМ на данный подтип рецепторов методом малоуглового рассеяния, соединение РУ-891 ингибировало агрегацию тромбоцитов, вызванную активацией P2Y12 рецепторов на 98%, тогда как вещество-стандарт PPADS на 21,1%. Эффект соединений РУ-254 и РУ-185 оказался статистически незначимым относительно вещества сравнения. Выраженная способность соединения РУ-891 блокировать процесс агрегации тромбоцитов, вызванной активацией P2Y12 рецепторов, предполагает возможное его влияние на активацию аденилатциклазного пути (рис. 8).

Рис. 8. Влияние изученных соединений в концентрации 1 мкМ на степень агрегации тромбоцитов кролика в кальциевой среде, индуцированной 200 нМ АДФ

р?0,001-данные статистически значимы по отношению к веществу сравнения, критерий Манна-Уитни.

Перспективным направлением в изучении механизма действия соединений с антиагрегантной активностью является воздействие на баланс между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты - простациклином (ПГI2) и ТХА2. В результате проведенных исследований было показано, что стенка аорты крыс образует и высвобождает в инкубируемую среду сильный антиагрегационный фактор по действию, подобный простациклину. Внутривенное введение адреналина снижает антиагрегационную активность стенки аорты, что ведет к повышению тромбогенного потенциала крови и увеличивает риск возникновения тромбоза. Хорошо известно, что ацетилсалициловая кислота уменьшает синтез эндотелием простациклина [Лупанов, 2009]. В отличие от нее, производные бензимидазола не оказывают влияния на образование простациклино-подобной субстанции стенкой аорты у интактных животных и восстанавливают ее антиагрегационную функцию, сниженную адреналином (рис.9).

ТХА2 является мощным проагрегантом и вазоконстриктором. Доказательством повышения синтеза ТХА2 в тромбоцитах является обнаружение в них значительного количества малонового диальдегида (МДА) (Smith,1976). В результате данной серии исследований было показано, что соединения РУ-891, РУ-254 и РУ-185 при внутрижелудочном введении крысам достоверно снижали уровень МДА в тромбоцитах, стимулированных тромбином, превосходя по своей активности ацетилсалициловую кислоту (рис.10).

Рис. 9 Влияние соединений РУ-891, РУ-254 и РУ-185 на антиагрегационную активность сосудистой стенки, сниженную адреналином (M±m)

*- p<0,05 - данные статистически значимы по отношению к результатам, полученным в контроле; _ - p<0,05 данные статистически значимы по отношению к показателю агрегации тромбоцитов крыс индуцированных адреналином, критерий Манна-Уитни.

Биохимические процессы, происходящие при активации, а в дальнейшем при агрегации красных кровяных пластинок, вызванные различными химическими и биологическими стимуляторами, отличаются по механизмам действия.

Рис. 10 Влияние соединений РУ-254, РУ-185, РУ-891 и ацетилсалициловой кислоты (АСК) на изменение уровня малонового диальдегида (МДА) в тромбоцитах крыс в процессе агрегации, индуцированной тромбином

Примечание: исход - содержание МДА в интактных тромбоцитах; тромбин - уровень МДА после стимуляции тромбоцитов тромбином

* -p<0,01 -данные статистически значимы относительно исхода (контроль)

**-p<0,01 -данные статистически значимы относительно, агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином, критерий Манна-Уитни.

Однако действие всех этих стимуляторов сводится к одному: повышению уровня кальция в цитоплазме тромбоцитов [Colomer, 2010]. Поэтому можно полагать о том, что ионам Са2+ принадлежит ключевая роль в регуляции функциональной активности тромбоцитов, при этом особо важное значение имеют внутриклеточные ресурсы Са2+ [Harper, 2009]. C целью уточнения некоторых механизмов антиагрегантного действия производных бензимидазола, было исследовано их влияние на уровень внутриклеточного и мембраносвязанного Са2+ с использования флуоресцентных зондов. Для того, чтобы определить, является ли действительно действие изученных соединений на прирост цитоплазматической концентрации Са2+, индуцированный тромбином, результатом ингибирования входа и мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо, эксперименты с использованием флуоресцентных зондов были выполнены в два этапа как в присутствии, так и в отсутствие физиологических концентраций Са2+ . Прирост флуоресценции Fura-2/АМ, индуцированный тромбином, в присутствии внеклеточного Са2+ отражает суммарный прирост внутриклеточного Са2+ за счет входа в клетку и мобилизации из внутренних источников. В то же время увеличение флуоресценции Fura-2/АМ, индуцированное тромбином в отсутствие внеклеточного Са2+, отражает высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо.

Производные бензимидазола и верапамил статистически значимо снижали концентрацию внутриклеточного кальция в тромбоцитах в присутствии его физиологических концентраций. Наибольшую активность проявило соединение РУ-891 (рис.11).