NGS-технологии в изучении генетических факторов болезни Паркинсона

Размещено на http://www.allbest.ru/

NGS-технологии в изучении генетических факторов болезни Паркинсона

Список сокращений

АД ? аутосомно-доминантная форма болезни Паркинсона АР ? аутосомно-рецессивная форма болезни Паркинсона БП ? болезнь Паркинсона

ДА ? дофамин

ДА-ергическая система - дофаминергическая система ДА-ергический нейрон - дофаминергический нейрон ДА-нейрон - дофаминергический нейрон

МАО-В - моноаминоксидаза типа B ПЦР - полимеразная цепная реакция RNAi ?РНК-интерференция

ЦНС - центральная нервная система

БАС ? боковой амиотрофический склероз

NGS - next-generation sequencing, секвенирование следующего поколения SNP ? single-nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм ДОФА ? L-Диоксифенилаланин

GWAS ? genome-wide association studies, полногеномный поиск ассоциаций WES ? whole exome sequencing ,экзомное секвенирование

HMM ? hidden Markov's models, скрытые марковские модели ExAC ? Exome Aggregation Consortium , база данных по экзомам SNVs ? single nucleotide variants, однонуклеотидные варианты

SVS - SNP&Variation Suite, вариации однонуклеотидных полиморфизмов

Введение

генетический паркинсон секвенирование ассоциативный

В настоящее время большое внимание уделяется изучению нейродегенеративных заболеваний. Нарушения в работе головного мозга и ЦНС становятся в современное время настоящей эпидемией, так как все большее количество людей из-за городского ритма жизни, экологической обстановки, нездорового образа жизни страдает от болезней нервной системы. К числу таких нейродегенеративных заболеваний относится болезнь Паркинсона. Болезнь Паркинсона входит в число наиболее частых нейродегенеративных заболеваний у пожилых людей. Оно поражает примерно 1% лиц 65 лет и старше и 0,4% лиц старше 40 лет. Средний возраст начала заболевания около 60 лет, но иногда болезнь может начинаться и в детском или подростковом возрасте.

Болезнь Паркинсона -- хроническое нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся прогрессирующим разрушением и гибелью дофаминовых нейронов в ЦНС. Относится к дегенеративным заболеваниям экстрапирамидной моторной системы. Вызвано прогрессирующим разрушением и гибелью нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин, -- прежде всего в чёрной субстанции, а также и в других отделах центральной нервной системы.

Недостаточная выработка дофамина ведет к активирующему влиянию базальных ганглиев на кору головного мозга.

В настоящее время известно, что важную роль в развитии болезни Паркинсона играют генетические факторы. На это, в первую очередь, указывает наличие семейных форм. Считается, что семейная форма заболевания составляет (по разным данным) от 10 до 20% от всех случаев болезни Паркинсона.

Основная часть случаев болезни Паркинсона носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды.

В настоящее время в геноме человека выявлено большое количество генов, так или иначе вовлеченных в патогенез данной патологии. Однако только для семи генов (SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, LRRK2, ATP13A2, VSP35) точно определен характер наследования и выявлены мутации, приводящие к развитию моногенных форм болезни Паркинсона. Для трех генов (SNCA, LRRK2 и MAPT) выявлены полиморфизмы, значительно повышающие риск развития спорадической формы заболевания во многих популяциях мира. Для одного гена - гена GBA, выявлены мутации с неполной пенетрантностью, приводящие к развитию болезни Паркинсона, однако его точная роль в патогенезе заболевания еще достоверно не определена. Этиология паркинсонизма до настоящего времени остаётся не полностью выясненной, несмотря на очевидный прогресс, достигнутый в изучении молекулярно-генетических факторов и механизмов патогенеза БП. Семейный анамнез болезни Паркинсона выявляется клиницистами примерно в пятнадцати процентах случаев, однако, гены, отвечающие за развитие этой патологии, ещё не идентифицированы.

Одним из подходов к поиску механизмов, связанных с развитием патологии, является внедрение и использование высокопроизводительного секвенирования. Основное преимущество такого секвенирования заключается в том, что оно позволяет проводить массовый скрининг генов и обнаруживать мутации в белок-кодирующих последовательностях, ассоциированные с заболеваниями. Развитие новых технологий секвенирования открывает новые возможности в анализе как известных генов семейной формы БП с выявлением ранее не описанных патогенетически значимых мутаций, так и в поиске новых генов семейных форм заболевания. За последние несколько лет с использованием современных высокопроизводительных технологий, таких как полногеномное и экзомное секвенирование, было выявлено семь новых генов, вовлеченых в патогенез БП: DNAJC13, CHCHD2, DNAJC6, SYNJ1, ATP6AP2, RAB39B, VPS35.

Таким образом, высокопроизводительное секвенирование является мощным новым подходом к идентификации генов, лежащих в основе болезни Паркинсона, а также представляет собой мощную экспериментальную стратегию для широкого применения в будущих исследованиях по изучению этиологии и патогенеза болезни Паркинсона, в то время как традиционные подходы не работают. Однако известно, что WES выявляет до 20 тысяч однонуклеотидных вариантов (Single nucleotide variants, SNVs) в одном анализируемом образце (Bamshad et al. 2011), что приводит к появлению огромного числа кандидатных вариантов и необходимости разработать стратегию для отбора узкого круга потенциально патогенных вариантов. На данный момент существует большое количество программ, оценивающих патогенность выявляемых вариантов по различным критериям, но пока ни одна из них не является до конца совершенной.

В связи с этим целью данной работы является анализ 48 неродственных пациентов с предполагаемой аутосомно-доминантной семейной формой БП с применением технологии WES и разработка алгоритма для анализа данных и отбора потенциально патогенетически значимых вариантов с использованием имеющихся биоинформатических ресурсов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Биоинформатический анализ данных NGS. Первичный отбор потенциально патогенетически значимых вариантов для дальнейшего анализа.

2. Анализ полиморфных вариантов по функциональным прогнозам с использованием специальных биоинформатических ресурсов. Дополнительный отбор потенциально патогенетических вариантов для дальнейшего анализа.

3. Анализ всех генов, содержащих выявленные варианты, на наличие в «нейродегенеративных панелях».

4. Верификация выявленных вариантов с помощью секвенирования по Сенгеру.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Краткая характеристика болезни Паркинсона

1.1.1 Эпидемиология болезни Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое нейродегенеративное заболевание, проявляющееся преимущественно двигательными нарушениями в виде ригидности мышц, гипокинезии, тремора покоя и постуральной неустойчивости, а также когнитивными, вегетативными и другими расстройствами.

В зависимости от этиологии выделяют (Jankovic et al. 1995):

1. Первичный (идиопатический) паркинсонизм: БП и ювенильный паркинсонизм. В данных случаях синдром паркинсонизма является доминирующим в клинической картине вплоть до развернутых стадий.

2. Вторичный (симптоматический) паркинсонизм возникает вследствие поражения мозга определенным этиологическим фактором. Соответственно выделяют лекарственный паркинсонизм, токсический, посттравматический, сосудистый, постэнцефалический, постгипоксический и др.

3. Паркинсонизм при других нейродегенеративных заболеваниях: прогрессирующий надъядерный паралич, мультисистемная атрофия, болезнь диффузных телец Леви, кортикобазальная дегенерация, спиноцеребеллярные дегенерации, болезнь Гентингтона, нейроакантоцитоз, дистония- паркинсонизм и др.

В среднем, на долю БП приходится порядка 70-80% случаев паркинсонизма. БП встречается во всех странах мира и во всех этнических и социальных группах. Распространненость БП в целом составляет от 120 до 180% случаев на 100 000 населения, заболеваемость 10-20 случаев на 100 000 населения в год. Показатели заболеваемости и распространенности увеличиваются с возрастом. Распространенность среди лиц старше 60 лет составляет 1%, среди лиц старше 80 лет - 4% (Elbaz and Tranchant 2007). Заболеваемость среди лиц старше 70 лет достигает 55 на 100 000 населения в год, а среди лиц старше 85 лет 220-304 на 100 000 населения. Распространенность БП варьирует в разных странах: от 31 в Ливии до 348 в Индии на 100 000 населения. В настоящее время в мире проживает более 6 млн больных БП. В связи с тенденцией к постарению населения предполагается, что численность больных к 2030 году удвоится (Thacker et al. 2008).

БП приводит как к выраженным неврологическим нарушениям, так и к значительному снижению социальной активности и качества жизни больных. К настоящему времени проведен ряд исследований, в которых оценивался экономический ущерб от БП для государства, общества и пациента в разных странах. Исследования экономических характеристик БП показали, что затраты, связанные с БП, огромны. В странах Западной Европы прямые затраты, т.е. расходы, связанные с оказанием медицинской помощи, составляют от 4500 € до 13 000€ в год, а ежегодные непрямые затраты, обусловленные утратой трудоспособности больных составляют от 5 000 € до 80 000 € на одного пациента (Findley et al. 2003), (Gasser 2009). В России прямые расходы составили 1770 €, а непрямые - 860 € за 6 месяцев по результатам фармакоэкономического исследования «стоимость болезни» (Katunina et al. 2009).

Клиническая картина при болезни Паркинсона/

БП является нейродегенеративным заболеванием, имеет неуклонно прогрессирующее течение и обусловлена гибелью, в первую очередь, дофаминергических нейронов (ДА-ергических нейронов) в базальных ядрах, черной субстанции и покрышке головного мозга. При этом в стриатуме наблюдается снижение уровня дофамина (ДА) (Nussbaum and Polymeropoulos 1997).

Установлено, что характерные для БП двигательные признаки возникают при гибели примерно 50-60% ДА-ергических нейронов в черной субстанции и снижении ДА в стриатуме на 70-80% (Fowler 2007;(Cookson et al. 2008). К двигательным симптомам, на основе которых ставится диагноз БП, относятся: тремор в состоянии покоя, снижение двигательной активности (гипокинезия), нарушение координации движений после сна (постуральная неустойчивость) и ригидность скелетных мышц лица и рук (пластический гипертонус). Данные симптомы проявляются асимметрично, начиная с одной половины тела, и с прогрессированием заболевания распространяются на другую половину (Weintraub et al. 2008).

Также показано, что кроме ДА-ергических нейронов страдают нейроны серотонинергической, норадренергической и ацетилхолинергической систем (Lee and Liu 2008). Их гибель приводит к появлению немоторных симптомов. Так, у пациентов с БП наблюдается нарушение сна, депрессия, снижение внимания, работоспособности, памяти, аспонтанность и замедленность мыслительных процессов, на последних стадиях наблюдается деменция (Aarsland et al. 2003). На поздних стадиях могут развиваться обсессивно-компульсивный синдром, а также галлюцинации и иллюзии. Кроме того, у пациентов развиваются вегетативные нарушения, к которым относятся запоры и снижение обоняния, появляющиеся еще до развития двигательных симптомов, а также слюнотечение, дисфагия, импотенция, недержание мочи, трофические нарушения кожи, пароксизмы тахикардии, ноющие боли в мышцах (Muller et al. 2002).

Таким образом, БП является сложным системным заболеванием и обусловлена не столько поражениями одной нейромедиаторной системы, хотя, не подлежит сомнению преобладание нарушений в ДА-ергической системе, а, в большей степени, дисбалансом медиаторов и смещением равновесия между различными медиаторными системами. Так, изменение концентрации ДА приводит к нарушениям метаболизма других нейромедиаторов (серотонина, глутамина, норадреналина и ацетилхолина). Подобный дисбаланс приводит к дезорганизации деятельности мозга в целом. Кроме того, установлено, что нейродегенеративным процессам подвержена не только ЦНС, но и вегетативная нервная система. БП затрагивает практически все органы и системы человека, что обуславливает гетерогенную клиническую картину проявлений данного заболевания. В целом, все эти нарушения приводят к сложной клинической картине, наблюдаемой при БП.

1.2 Генетические факторы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона

В настоящее время роль генетических факторов в развитии БП не подлежит сомнениям. На это указывают как близнецовые исследования, так и анализ семей с БП. Так, близнецовые исследования выявили высокий уровень конкордантности по степени нарушения функционирования нигростриатной системы, как у дизиготных, так и у монозиготных близнецов (Piccini et al. 1999). Было выявлено, что риск развития данной патологии у родственников пациентов со спорадической формой БП увеличивается в несколько раз при сходном генетическом фоне и образе жизни (Pankratz and Foroud 2004). Выделяют семейную и спорадическую формы БП. Наследование заболевания может происходить, как по так и по аутосомно-рецессивному (АР), аутосомно-доминантному (АД) типу. К настоящему времени считается, что семейная форма заболевания составляет по разным данным от 10 до 20% от всех случаев БП (Coppede 2012;(Lesage and Brice 2012). Однако у большинства больных развитие заболевания носит спорадический характер и обусловлено сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды.

В настоящее время в геноме человека идентифицирован ряд локусов, а также выявлено большое количество генов-кандидатов, которые связаны с патогенезом БП (Lesage and Brice 2009). Для семи генов (SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, LRRK2, ATP13A2, VSP35) точно определен характер наследования и выявлены мутации, приводящие к развитию моногенных форм БП. Для трех генов (SNCA, LRRK2 и MAPT) выявлены полиморфизмы, значительно повышающие риск развития спорадической формы заболевания во многих популяциях мира. Для одного гена - гена GBA, выявлены мутации с неполной пенетрантностью, приводящие к развитию БП, однако его точная роль в патогенезе заболевания еще точно не определена. Предполагается, что этот ген может относиться к генам АД формы БП (таблица 1).

Таблица 1. Ключевые гены, идентифицированные для болезни Паркинсона

АР - аутосомно-рецессивная форма БП, АД - аутосомно-доминантная форма БП, ТМ-точковые мутации, РП - рисковые полиморфизмы

Гены аутосомно-доминантной формы болезни Паркинсона.

Ген б-синуклеина, SNCA. Исторически первым выявленном геном, ассоциированным с семейной формой БП, был ген б-синуклеина (SNCA), картированный на хромосоме 4q21. Данный ген был выявлен в семье итало- американского происхождения с аутосомно-доминантной формой БП (M. H. Polymeropoulos et al. 1996). В гене SNCA была обнаружена обуславливающая развитие заболевания миссенс-мутация А53T. Эта же мутация была найдена в семье из Греции (M. H. Polymeropoulos et al. 1997). Позже в этом гене были обнаружены еще две мутации - А30P в семье из Германии (Kruger, Kuhn, Muller, Woitalla, et al. 1998) и E46K в испанской семье (J. J. Zarranz et al. 2004). Но в целом точковые мутации в гене SNCA являются крайне редкими, и анализ большого числа больных со спорадической и семейной формой БП указывает на то, что они не играют важной роли в патогенезе БП (Pastor et al. 2001). В российской популяции не было выявлено точковых мутаций в гене SNCA (E. I. Rogaev et al. 2008).

На данный момент известно, что важную роль в развитии БП могут играть мутации, связанные с изменением дозы гена SNCA. Выявлены трипликации и дупликации геномного региона, содержащего ген SNCA, в семьях с АД формой БП. Размер мультипликаций варьирует от 0,4 до 6,37 Мб, захватывая от 1 до 33 генов (Ibanez et al. 2009). Предполагают, что причиной возникновения таких мутаций является неравный кроссинговер по LINE-повторам, встречающимся на протяжении мультиплицируемой области. Частота больных с трипликациями и дупликациями гена SNCA в исследованных популяциях при семейной форме БП колеблется от полного отсутствия в популяциях из Португалии, Германии и США до 2,7% в Корее, и в среднем составляет ~1,4%. При спорадической форме БП частота больных с трипликациями и дупликациями гена SNCA варьирует также от полного их отсутствия в японской, американской и португальской популяциях и до 1% в Европе и Северной Африке, и в среднем составляет ~0,3% (Lesage and Brice 2009). Анализ американо-шведской семьи выявил больных как с дупликацией, так и с трипликацией гена SNCA. Причем дупликация была обнаружена в шведской семье, а трипликация - в американской (Farrer et al. 2004). В российской популяции также был проведен анализ данного типа мутаций в гене SNCA у семейных больных БП с АД формой наследования БП. По всей видимости, мутации такого типа краейне редки в нашей популяции, и можно предположить, что трипликации и дупликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез АД формы БП у больных из России. В связи с этим дальнейший анализ мультипликаций гена SNCA при спорадической форме БП у больных из России не представляется целесообразным (Semenova et al. 2009).

Интересно заметить, что клиническая картина заболевания зависит не от протяженности мультиплицируемой области, а от количества копий гена SNCA (Ibanez et al. 2009). Больные с дупликациями в гетерозиготном состоянии (в целом три копии гена SNCA на ядро) по клиническим проявлениям похожи на спорадических больных БП, т.е. заболевание начинает развиваться в позднем возрасте и медленно прогрессирует. С увеличением числа копий гена SNCA до четырех (при дупликациях в гомозиготном состоянии и трипликациях в гетерозиготном состоянии) заболевание принимает более тяжелую форму, а именно - болезнь начинает развиваться в раннем возрасте, быстро прогрессирует, обладает выраженной деменцией и часто сопровождается вегетативной дистонией (Ibanez et al. 2009).

Ген SNCA кодирует белок б-синуклеин, который в нативном состоянии является нескладчатым белком, содержит 140 аминокислотных остатков и состоит из трех функциональных участков: N-концевого участка, имеющего амфипатический б-спиральный домен, гидрофобной центральной области, содержащей домен с не в-амилоидным компонентом (NAC-домен), и кислой С-концевой области.

Хорошо известно, что протофибриллы б-синуклеина являются базисным компонентом телец Леви при БП. Это указывает на значительную роль процессов агрегации б-синуклеина в патогенезе заболевания (Fortin et al. 2004). Такого рода накопление б-синуклеина может быть связано с изменением дозы гена б-синуклеина и повышением уровня его экспрессии (что происходит при трипликациях и дупликациях области гена SNCA) или с изменением процессов протеолитической деградации мутантных форм б- синуклеина.

На данный момент считается, что б-синуклеин является молекулярным шапероном и регулирует белок-белковые и белок-липидные взаимодействия (Yavich et al. 2004), а также он является пресинаптическим белком и играет значительную роль в синаптическом везикулярном транспорте (Sudhof and Rizo 2011).

Ген дардарина, LRRK2. Локус PARK8 и ген LRRK2 были выявлены в семьях с аутосомно-доминантной формой БП с поздним началом развития (Paisan-Ruiz, Jain, Evans, Gilks, et al. 2004;(Zimprich, Biskup, Leitner, Lichtner, et al. 2004;(Funayama et al. 2002).

На данный момент в гене LRRK2 выявлено большое количество миссенс мутаций и несколько точковых замен, приводящих к нарушению сплайсинга. Мутации в этом гене являются наиболее частой причиной развития АД типа БП и могут вносить существенный вклад в этиологию как семейных, так и спорадических форм заболевания (Berg et al. 2005). При этом патогенетическая значимость для семейных форм БП подтверждена только для семи мутаций (N1437H, I2012T, R1441C/G/H, G2019S Y1699C, S1761R и I2020T)/

Наиболее часто встречающейся мутацией не только в гене LRRK2, но среди всех точковых мутаций, описанных для БП, является мутация G2019S, находящаяся в 41 экзоне гена LRRK2. Её частота в популяциях европейского происхождения доходит до 4,6% у больных спорадической формой БП и 11,5% у больных семейным паркинсонизмом, у евреев ашкеназов ее частота доходит до 13,3% у спорадических больных и 29,7% у больных с семейной формой БП, а у арабов Северной Африки - 40,8% у спорадических больных, 37,0% у больных с семейной формой БП (Ozelius et al. 2006;(Lesage et al. 2006). В то же время эта мутация очень редко встречается у монголоидов (Tan et al. 2005). В российской популяции данная мутация выявлена как у больных из семей с АД формой БП (с частотой 13,0%), так и у больных спорадической формой БП (частота - 0,6%) (Xie et al. 2011).

Ген LRRK2 кодирует белок дардарина или киназы 2 с лейцин богатыми повторами и обладает многофункциональной киназной активностью (West et al. 2005). На данный момент известно, что дардарин может принимать участие в контроле за обменом синаптических везикул, росте и ветвлении аксонов и функционировании аппарата Гольджи, митохондрий и лизосом (MacLeod et al. 2006).

Ген VSP35 стал первым геном, который был выявлен с помощью полноэкзомного секвенирования. Он относится к группе генов, кодирующих вакуолярные белки сортировки (Edgar and Polak 2000). В 2011 году двумя независимыми исследовательскими группами была идентифицирована мутация D620N (1858G>A) в гене VPS35, и была установлена ее строгая ассоциация с БП в двух семьях с аутосомно-доминантной формой БП из Австрии и Швейцарии (Trinh and Farrer 2013;(Diao et al. 2012). В настоящее время в гене VPS35 выявлено еще несколько вариантов P316S, R524W, M607V, H599R, I560T, которые могут быть сцеплены с БП, но патогенетическую значимость которых еще предстоит доказать (Deng et al. 2013).

Белок VPS35, кодируемый этим геном, является субъединицей ретромерного комплекса, играющего существенную роль в ретроградном транспорте различных трансмембранных белков из эндосом к аппарату Гольджи или к мембранам (Bonifacino and Hurley 2008). Результаты исследований позволяют нам предполагать, что мутации в гене VPS35 могут блокировать активность ретромерного комплекса, который необходим обеспечению рециркуляции белков Wnt сигнального пути (Port et al. 2008). Нарушение Wnt сигнального пути может приводить к гибели ДА-ергических нейронов среднего мозга и развитию БП (L'Episcopo et al. 2011). Также, предполагается, что нарушение функционирования ретромерного комплекса может приводить к нарушению рециркуляции транспортера двухвалентного железа DMT1 и накоплению железа в нейронах, что также может вызывать развитие нейродегенеративных процессов (Dusek et al. 2012).

Ген MAPT (tau-ген) - ген тау-белка, расположенный в сегменте 17q21.1 на 17-й хромосоме (Neve et al. 1986). Тау-белок принадлежит к группе белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP). Альтернативный сплайсинг гена MAPT создает в организме человека шесть известных изоформ белка (Goedert et al. 1989). Белок часто встречается в нейронах центральной нервной системы (ЦНС), и редко -- в других местах, однако слабо экспрессируется в олигодендроцитах и астроцитах ЦНС (Shin et al. 1991). Избыточно фосфорилированный тау- белок ведет к образованию нейрофибриллярных клубков, прекращая стабилизировать микротрубочки. Было показано, что нейрофибриллярные клубки состоят в целом из конгломератов гиперфосфорилированной полной формы тау-белка, а также из фрагментов тау-белка (Novak et al. 1993). В гене MAPT обнаружены мутации, приводящие к развитию атипичной формы БП (Edwards et al. 2010). Обнаружено также несколько гаплотипов в промоторной области этого гена, влияющие на его транскрипционную активность. Для одного гаплотипа H1, установлено наличие четкой ассоциации с риском развития БП (Kalinderi et al. 2011).

Гены аутосомно-рецессивной формы болезни Паркинсона.

Ген паркина, PARK2. В настоящее время известно, что мутации в гене PARK2 являются наиболее частой причиной развития АР формы БП. Мутации в гене PARK2 могут вносить существенный вклад в этиологию как семейных, так и спорадических форм заболевания (Oliveira et al. 2003). На данный момент описано более 100 семей с аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом, в которых причиной развития БП являются различные мутации в гене PARK2. В гене PARK2 на сегодняшний день выявлено более 170 различных мутаций (Nuytemans et al. 2010). При этом более 50% мутаций являются мутации с изменением копийности одного или нескольких экзонов (делеции, трипликации и дупликации), а также обнаружены миссенс мутации (выявлено более 50 аминокислотных замен) (Evans et al. 2009). Для российской популяции было показано, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 вносят значительный вклад в развитие спорадической формы БП. Установлено, что у людей, имеющих дупликации и делеции, риск развития заболевания повышен в 8,53 раза (95%ДИ=1,14- 63,52; p=0,0095). Вероятность развития спорадической формы БП в раннем возрасте у людей с мутациями с изменением копийности экзонов гена PARK2, возрастает в 13,95 раза (95%ДИ=1,85-105,96; р=0,0004) (Lund et al. 2004).

Ген PARK2 кодирует белок паркин, являющийся E3 убиквитин лигазой. Функция паркина заключается в переносе убиквитина с убиквитин- конъюгирующих ферментов на специфичные субстраты, которыми являются синфилин-1, -синуклеин, паркин и ряд других (Shimura et al. 2000). Паркин катализирует убиквитинирование поврежденных белков, которые затем подвергаются протеасомной деградации. Поэтому, недостаточность паркина может служить причиной нарушения процессов убиквитинирования и накоплению в клетке белков, являющихся субстратами паркина, а это, в свою очередь, может вести к смерти нейронов. Также, установлено, что паркин играет значимую роль в процессах митофагии (Ding and Yin 2012). Паркин убиквитинирует митохондриальные белки, тем самым метя поврежденную митохондрию, которая в дальнейшем сливается с лизосомой, где подвергается деградации (Youle and Narendra 2011). Имеются также данные о том, что паркин может выступать как комплексный нейропротекторный белок при целом ряде токсичных поражений, являющихся критичными для выживаемости ДА-ергических нейронов (Cookson 2005).

Ген PINK1. Локус PARK6 и ген PINK1 были картированы в трех семьях с БП европейского происхождения. В гене PINK1 на данный момент выявлено более 50 миссенс замен, а также различные точковые мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания и усеченным вариантам белка (Tan and Skipper 2007). Установлено что компаудная гетерозиготность и гомозиготность по этим мутациям приводит к развитию различных форм БП с широким фенотипическим спектром (Hatano et al. 2004).

Ген PINK1 кодирует белок PINK1, киназу 1, индуцируемую гомологами фосфатаз и тензином, локализованную больше всего в митохондриях. Ген PINK1 плохо растворим с чем и связанно его склонность к агрегации, которая, по-видимому, объясняет наличие этого белка в 10% телец Леви при спорадической форме БП (Gandhi et al. 2006).

На данный момент считается, что PINK1 может выступать как митохондриальная киназа и защищать нейроны от окислительного стресса (Valente et al. 2004). Кроме того, установлено, что PINK1 играет существенную роль в процессах митофагии. При этом белок накапливается в поврежденных митохондриях и способствует перемещению паркина из цитоплазмы в поврежденную митохондрию (Youle and Narendra 2011).

Таким образом, можно предположить, что дефекты в гене PINK1, а также в PARK2 могут повлечь нарушение нормальных процессов митофагии и развитие процессов нейродегенерации.

Ген DJ-1, PARK7. На данный момент в гене PARK7 выявлены как гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации, так и экзонные делеции и трипликации. Все описанные мутации приводят к развитию редких форм аутосомно-рецессивной БП с ранним началом развития заболевания (Bonifati, Rizzu, van Baren, Schaap, et al. 2003).

Белок DJ-1, кодируемый геном PARK7, защищает клетки от окислительного стресса, удаляя перекисные соединения путем самоокисления. Также, имеются сведения о том, что DJ-1 может быть вовлечен в регуляцию процессов апоптоза и вести себя как окислительно- восстановительный шаперон, ингибирующий агрегацию -синуклеина. Имеются данные о том, что DJ-1 способен связываться с паркином во время окислительного стресса (Mandemakers et al. 2007).

Ген АТР13А2. В гене АТР13А2 были обнаружены мутации в двух независимых семьях с синдромом Kufor-Rakeb (Ramirez et al. 2006;(Emelyanov et al. 2012). Данный синдром является атипичной формой рецессивно наследуемого леводопа-чувствительного паркинсонизма с очень ранним началом развития (от 11 до 16 лет) заболевания. У больных отмечается быстрое прогрессирование заболевания, нарушение пирамидального тракта, деменция, а также атрофия бледного шара (Spatola and Wider 2014).

Ген ATP13A2 кодирует нейрональную лизосомальную мембранную АТФазу Р-типа (ATP13A2). Точная физиологическая роль этой АТФазы остается пока неизвестной. В настоящее время накоплено много данных о том, что у больных с мутациями в гене ATP13A2 отмечается нарушение функционирования лизосом, связанное с нарушением кислотности органеллы и нарушением деградации специфичных для лизосом белков нестабильностью мембраны, что в свою очередь приводит к накоплению б- синуклеина и гибели нейронов (Ramirez et al. 2006;(Dehay et al. 2013).

Гены, ассоциированные с повышенным риском развития БП.

Ген GBA. Традиционно считалось, что мутации в гене GBA приводят к развитию болезни Гоше, АР заболевания, относящегося к группе лизосомальных болезней накопления. Однако начиная с середины 1990-х годов, когда впервые были описаны характерные признаки для паркинсонизма у пациентов с классической болезнью Гоше (Neudorfer et al. 1996) начинается активное изучение роли гена GBA в патогенезе БП. Среди спорадических больных БП обнаружено большое число гетерозиготных носителей патогенетически значимых вариантов гена GBA. Высокая частота таких мутаций у больных БП говорит о том, что наличие мутаций в гене GBA может значительно повышать риск развития заболевания (Emelyanov et al. 2012). В настоящее время имеются данные о более чем 100 различных вариантах гена GBA, ассоциированных с риском развития БП. Причем среди них есть как «мягкие» варианты R496H и N370S, которые приводят к незначительному снижению активности фермента и которые повышают риск развития БП только в два раза, так и «тяжелые» варианты 84GG, D409H, IVS2+1, L444P, V394L, которые приводят к резкому снижению количества бета-глюкоцереброзидазы (Gan-Or et al.). «Тяжелые» варианты повышают риск развития патологии более чем в 13 раз и фактически являются патогенетически значимыми мутациями с низкой пенетрантностью (Gan-Or et al. 2008). Анализ больных БП из России выявил две гетерозиготные мутации L444P и N370S в гене GBA с общей частотой встречаемости 2,7%, которые повышают риск развития заболевания более чем в шести раз (Emelyanov et al. 2012).

Ген GBA кодирует бета-глюкоцереброзидазу (GBA) - лизосомальный фермент, катализирующий расщепление глюкозилцерамида до церамида и глюкозы. В исследования in vitro и in vivo было показано, что снижение активности бета-глюкоцереброзидазы приводит к нарушению функционирования лизосом, это приводит к накоплению аномального б- синуклена и образованию токсичных олигомеров. В свою очередь б- синукленовые олигомеры мешают нормальному трафику GBA от эндоплазматического ретикулума к лизосоме, которое приводит к усилению лизосомной дисфункции. Следственно, наблюдается обратная положительная связь между лизосомной дисфункцией и накоплением аномального б-синуклена. По имеющимся данным можно предположить, что снижение активности GBA может играть важную роль в развитии процессов нейродегенерации (Swan and Saunders-Pullman 2013).

Генетические факторы, принимающие участие в развитии спорадической формы болезни Паркинсона.

Изучение моногенных форм БП позволило выделить наиболее основные возможные патогенетические механизмы, которые могут быть также связаны с развитием спорадической формы БП. Прежде всего, к ним относятся нарушение дифференцировки дофаминергических нейронов, убиквитин-зависимой протеасомной деградации белков, митохондриальная дисфункция и окислительный стресс, нарушение нормального функционирования синапса.

В основном у больных развитие БП носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды. Поэтому возникает вопрос о том, какой вклад вносят в патогенез спорадической формы БП гены семейных форм заболевания и других генетических факторов.

Анализ генов моногенных форм БП, белки которых участвуют в протеасомной деградации белков, показал, что все они могут быть вовлечены в патогенез спорадической формы БП. Так, в гене б-синуклеина идентифицировано несколько ассоциированных со спорадической формой БП интронных однонуклеотидных полиморфизмов и динуклеотидный полиморфизм в промоторной области. На основании этих данных предполагают, что эти полиморфизмы могут влиять на транскрипционную активность гена и стабильность мРНК (Brighina et al. 2008). Для другого гена, гена паркина, было установлено, что гомозиготность, или компаундная гетерозиготность по мутациям в этом гене приводит к развитию заболевания у 5-10% больных со спорадической БП с ранним (до 50 лет) началом развития заболевания. Интересно отметить что, даже в гетерозиготном состоянии мутация в гене PARK2 может приводить к развитию заболевания или повышать чувствительность организма к действию факторов внешней среды (West et al. 2002). На последней стадии процессов деградации белков значимую роль играют убиквитин-гидролазы, которые высвобождают свободный убиквитин из комплекса с белком. Одним из таких ферментов является убиквитин-карбоксигидролаза UCHL1, мутации в гене которого ведут к развитию семейной формы БП. Однако возможно, что полиморфизм этого гена может влиять на риск развития спорадической формы БП. Так, к настоящему времени обнаружена ассоциация между риском развития БП и частым полиморфизмом S18Y, расположенным в кодирующей области гена UCHL1, и было установлено, что вариант 18Y снижает риск развития заболевания (Maraganore et al. 1999). В патогенезе БП также могут играть роль белки-мишени паркина, к которым относится синфилин-1. Как и б- синуклеин, он входит в состав телец Леви. В гене синфилина-1 идентифицирована мутация R621С у спорадических больных БП с поздним началом развития. Однако нельзя исключить, что мутация R621С является редким нормальным полиморфизмом и не связана с развитием БП (Marx and Bucher 2003). Кроме вышеперечисленных белков, в процессах убиквитин- зависимого протеолиза могут участвовать и другие ферменты, которые также могут быть вовлечены в патогенез БП. Так, кроме убиквитина в протеасомной деградации участвуют убиквитин-подобные белки NEDD8 и SUMO-1. Первый из них выявляется в тельцах Леви, тогда как белок SUMO- 1 играет немаловажную роль в модификации белка DJ-1 (Im et al. 2016). Эти сведения позволяют рассматривать гены этих белков как возможные кандидатные гены БП.

Роль нарушения процессов дифференцировки дофаминергических нейронов при БП подтверждается выявлением мутаций в гене транскрипционного фактора Nurr1 при одной из семейных форм БП. Ген Nurr1 кодирует транскрипционный фактор, который необходим для дифференцировки постмитотических дофаминергических нейронов и контролирует экспрессию генов, белковые продукты которых связаны с синтезом и хранением дофамина, а именно - тирозингидроксилазы (ТН), везикулярного транспортера моноаминов (VMAT2) транспортера дофамина (DAT), декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC) (Chinta and Andersen 2005). Свой вклад в патогенез спорадической формы БП могут также вносить и другие транскрипционные факторы, которые необходимы для дифференцировки дофаминергических нейронов, такие как транскрипционные факторы Lmx1b и Pitx. На данный момент в гене одного из них - фактора Pitex3, специфический для дофаминергических нейронов вентральной и вентромедиальной части черной субстанции, выявлены два полиморфизма, расположенные в первом интроне и в непосредственной близости от 5'-конца гена Pitx3, которые ассоциированны со спорадической формой БП (Bergman et al. 2008). Также, в дифференцировке и поддержании нормального функционирования дофаминергических нейронов важную роль играют нейротрофический фактор мозгового происхождения (BDNF), трансформирующий фактор роста б ? TGF-б, нейротрофический фактор глиального происхождения (GDNF). Известно, что GDNF и BDNF влияют на обмен дофамина в черной субстанции. Однако только для одного из этих белков - BDNF, регулирующий экспрессию D3 рецептора дофамина на нейронах стриатума, был обнаружен полиморфизм V66M в гене BDNF, ассоциированный прежде со спорадической БП в японской популяции (Toda et al. 2003). Анализ этого полиморфного варианта и других полиморфизмов в гене BDNF в европейских популяциях не выявил ассоциаций с БП (Xiromerisiou et al. 2007).

Снижение синтеза АТФ митохондриями может приводить к развитию БП по двум механизмам - через повышение уровня свободных радикалов в клетке в условиях дисфункции электрон-транспортной цепи митохондрий и через снижение уровня АТФ-зависимой протеасомной деградации белков. В свой черед, повышение уровня свободных радикалов приводит к снижению активности протеасомного комплекса (Hoglinger et al. 2003). Значимая роль в патогенезе БП доказывается ранее описанными мутациями в гене белка DJ-1 при семейных формах заболевания. Белок DJ-1 играет роль протектора оксидантного стресса и защищает клетки от их повреждения свободными радикалами.

О возможной роли митоходриальной дисфункции в патогенезе БП говорит снижение активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий в стриатуме и черной субстанции больных (Hattori et al. 1991), а также выявление нескольких семей с БП, наследуемой по материнской линии (Wooten et al. 1997). Об этом свидетельствует описанная в работе (van der Walt et al. 2003) ассоциация между риском развития спорадической БП и митохондриальными митотипами. В ней показано, что у европейцев с митотипами J риск развития патологии значительно ниже, чем у носителей самого частого в Европе митотипа Н. Другим ассоциированным с развитием БП вариантом митохондриальной ДНК является полиморфизм 10398G, влияющий на активность NADH-дегидрогеназы 3. Еще одним подтверждением роли митохондриального генома в БП являются эксперименты по получению цитоплазматических гибридов из митохондрий черной субстанции и клеток нейробластомы больных паркинсонизмом. В таких гибридах обнаружено образование включений, напоминающих по своей морфологии и составу тельца Леви (Trimmer et al. 2004). Нарушение обмена железа может быть следствием повышения уровня свободных радикалов. В черной субстанции больных БП содержание железа повышено, причем наблюдается сдвиг соотношения между ионами трехвалентного и двухвалентного железа в сторону более окисленной формы (Sofic et al. 1988). Свободные ионы железа приводят к образованию перекисных соединений и супероксид-аниона и индуцируют аутоокисление дофамина с образованием изохолина. Также показано, что повышение уровня железа стимулирует процесс образования агрегатов б-синуклеина (Hashimoto et al. 1999).

Поддержание гомеостаза железа связано с рядом функциональных систем, таких как система транспорта железа в плазме крови (лактоферрин и трансферрин), система обмена (фратаксин и церулоплазмин), система транспорта и хранения железа в клетке (ферритин, рецептор трансферина, HFE-белок) и обратного транспорта (гемоксигеназа 1 и церулоплазмин) железа в клетке. Гены, кодирующие белки вышеперечисленных систем, могут рассматриваться как кандидатные гены БП. За последние годы была выявлена ассоциация некоторых из них с развитием заболевания (Borie et al. 2002).

Однако весь спектр возможных путей этиопатогенеза данной формы БП перечисленными выше механизмами не исчерпывается. Наблюдаемая при БП симптоматика возникает в результате снижения синтеза дофамина в стриатуме и черной субстанции и уменьшения его концентрации в стриатуме. Одной из причин этого может быть нарушение функционирования системы обмена дофамина - его синтеза, синаптического выброса, транспорта и рецепции.

При синтезе дофамина скорость процесса лимитируется реакцией превращения тирозина в ДОФА, катализируемой ферментом тирозингидроксилазой (TH). В связи с этим ген TH можно рассматривать как один из вероятных кандидатных генов БП. Однако до сих пор не выявлено каких либо ассоциаций между развитием заболевания и полиморфными вариантами гена TH. С другой стороны, большую роль в патогенезе БП играют белки, которые регулируют активность (б-синуклеин) и транскрипцию гена (Nurr1) тирозингидроксилазы. В связи с этим можно предположить, что значимое место в развитии БП может иметь нарушение синтеза кофактора тирозингидроксилазы - тетрагидробиоптерина (ВН4). В отдельных случаях мутации в гене гуанозин 5-трифосфат (ГТФ) циклогидролазы (GCH1), первого фермента цикла биосинтеза ВН4, приводит к развитию паркинсон-подобного фенотипа. Ген фермента SRR, катализирующий последний этап биосинтеза ВН14, идентифицирован в области локуса PARK3, и не исключено, что именно мутации в этом гене ответственны за PARK3-форму БП (Karamohamed et al. 2003).

Уровень дофамина в клетке также зависит от скорости его деградации и под действием моноаминоксидазы В (МАО-В), и активности дофамин-в- гидролазы, которые используют дофамин при синтезе норадреналина. Для всех генов этих ферментов обнаружены ассоциации различных полиморфных вариантов с развитием БП (Healy et al. 2004).

Кроме того, не исключена роль в развитии БП системы обратного транспорта дофамина и рецепторов дофамина. Наиболее заметно при БП изменяется экспрессия рецепторов дофамина D3, уровень которого снижается на 40-45% в области прилежащего ядра и покрышке, и D4, уровень которого в покрышке возрастает на 15% (Ryoo et al. 1998). Однако на данный момент нет убедительных данных о наличии ассоциации между генами рецепторов дофамина и БП.

Также имеются данные о том, что развитие БП может быть связано с токсическим действием различных ксенобиотиков. В связи с этим особую роль в патогенезе заболевания могут играть ферменты системы детоксикации. Проводится активное изучение как ферментов первой стадии этого процесса, при которой происходит активация ксенобиотиков, в первую очередь белков суперсемейства цитохрома Р450 (CYP2D6, CYP2E1), так и ферментов второй стадии, заключающейся в детоксикации экзогенных и эндогенных токсинов, - глутатион-S-трансфераз (GSTM1, GSTT1, GSTP1) и N-ацетилтрансферазы (NAT2). Однако на данный момент не выяснено, могут ли ферменты первой стадии детоксикации играть какую-либо роль в развитии БП (Riedl et al. 1998). Более интересные сведения получены при изучении ферментов второй стадии. Так, для аллельных вариантов гена GSTP1 (A113V ,I104V) установлено наличие ассоциации с развитием БП (Kelada et al. 2003), в то время как для «нулевых» аллельных вариантов генов GSTM1, GSTT1 не обнаружено какой-либо связи с развитием заболевания.

1.3 Полногеномные исследования при болезни Паркинсона

1.3.1 Использование современных технологий полногеномного ассоциативного анализа (GWAS) при болезни Паркинсона

Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) -- направление биологических (как правило, биомедицинских) исследований, связанных с исследованием ассоциаций между геномными вариантами и фенотипическими признаками.

Основная цель полногеномного поиска ассоциаций заключается в идентификации генетических факторов риска, чтобы дать обоснованный прогноз о предрасположенности к заболеванию, а также выявления биологических основ восприимчивости к болезни для разработки новых стратегий профилактики и лечения. (Bush and Moore 2012)

В исследованиях такого типа обычно сравнивают геномы группы больных людей с геномами контрольной группы, включающей в себя аналогичных по возрасту, полу и другим признакам здоровых людей. Материалом для исследования являются образцы ДНК каждого участника исследования. Если удается выявить варианты геномов (точнее, совокупность аллелей), которые значимо чаще встречаются у людей с данным заболеванием, то говорят, что такой вариант связан, или ассоциирован, с болезнью. В отличие от методов, которые проверяют один или несколько конкретных участков генома, полногеномный поиск ассоциаций использует полную последовательность ДНК.

В основе поиска полногеномных ассоциаций, как правило, лежит сравнение геномов двух групп людей: носителей исследуемого фенотипа (заболевания) и контрольной группы. Для всех индивидуумов производится генотипирование для большинства известных однонуклеотидных полиморфизмов (single-nucleotide polymorphism, SNP). Далее, для каждого SNP проверяется, насколько значимы различия в распределении частот аллелей между исследуемой и контрольной группой. Альтернативой делению на две группы в полногеномных исследованиях является количественный анализ фенотипа, например, рост, концентрация биомаркера или экспрессия гена. Кроме того, могут быть использованы данные о пенетрантности исследуемых аллелей.

В настоящее время проведено более трех десятков полногеномных исследований ассоциаций для БП (Spatola and Wider 2014;(Hamza et al. 2010;(Saad et al. 2011;(Simon-Sanchez et al. 2011;(Tan et al. 2010). Необходимо заметить, что ассоциации, полученные в первых исследованиях (работы Д.Н. Maрагано и др., Т.Г. Лесник и др., Х.С. Фанг и др.) не были воспроизведены в других более поздних работах (Allen and Satten 2009;(Evangelou et al. 2011;(Sharma et al. 2009). Это может быть связано с тем, что сведения, полученные в первых работах, не являются достоверными, согласно позднее появившемуся критерию достоверности для полногеномных ассоциативных исследований. Так как при полногеномном анализе ассоциаций проводится одновременный анализ большого числа SNP, обычный уровень достоверности (р<0,05) приводит к появлению большого количества ложноположительных ассоциаций. Было вычислено новое значение достоверности, которое учитывает одновременный анализ 1 миллиона SNP, путем введения поправки на многократное тестирование (аналог поправки Бонферрони). В настоящий момент считается, что отдельный SNP может считаться ассоциированным с развитием заболевания при p<5·10-8 (Dudbridge and Gusnanto 2008).

Большое количество работ по полногенномному анализу ассоциаций позволило провести также метаанализ данных, полученных в различных полногеномных исследованиях ассоциаций при БП (Табл. 2).

Таблица 2.Гены, выявленные при полногеномных исследованиях при болезни Паркинсона

Суммируя данные по проведенным на сегодняшний день полногеномным ассоциативным исследованиям, можно сделать вывод, что только для двух генов ? SNCA и MAPT ? выявлены строгие ассоциации с БП практически во всех исследованиях. Для генов BST1, HLA-DRA, LRRK2, GAK- DGKQ и локуса PARK16 были выявлены ассоциации лишь в ряде работ и не были подтверждены большинством исследователей (Trinh and Farrer 2013).

Основной причиной таких различий в получаемых результатах при проведении полногеномных ассоциативных исследований является необходимость использования очень больших по размеру выборок больных. В результате в GWAS исследованиях используются гетерогенные выборки - как клинически, так и этнически. Кроме того, ассоциации отдельных SNP с БП могут быть специфичны для разных популяций (Sharma et al. 2009).

На данный момент начаты работы по верификации данных, полученных при полногеномном анализе ассоциаций в европейских популяциях. Проведен анализ SNP в гене WNT3 (rs415430), расположенном рядом с геном MAPT, и отобранного по результатам полногеномных исследований ассоциаций (Simon-Sanchez et al. 2009). Однако ассоциация данного полиморфизма с риском развития БП в российской популяции не была обнаружена (Filatova et al. 2011).