1.3.2 NGS-технологии

Начиная с 2005 года, секвенирование ДНК следующего поколения (next-generation sequencing, NGS) стало широкодоступным, так как стоимость секвенирования ДНК снизилась на несколько порядков по отношению к секвенированию по Сенгеру. Разработка методов сочетания целевых захватов и массового параллелизма секвенирования ДНК стала мощным новым подходом к идентификации генов, которые лежат в основе Менделевских нарушений, в то время как традиционные подходы не работают.

Один из видов секвенирования следующего поколения является экзомное секвенирование (whole exome sequencing, WES) -- стратегия секвенирования всех белок-кодирующих генов в геноме (то есть экзома), предполагающая выбор только тех участков ДНК, которые кодируют белки (экзонов) и их последующее секвенирование с использованием любой платформы высокопроизводительного секвенирования ДНК. У человека насчитывается около 180 000 экзонов, что составляет примерно 1 % от размера генома, или приблизительно 30 миллионов пар нуклеотидов, однако мутации в этой части генома могут иметь значительно более тяжелые последствия, чем в оставшихся 99 % (Ng et al. 2009). Основное преимущество экзомного секвенирования заключается в том, что оно позволяет проводить массовый скрининг генов и обнаруживать мутации в белок-кодирующих последовательностях, ассоциированные с заболеваниями, но при этом быстрее и дешевле, чем полногеномное секвенирование.

Одно из первых исследований с применением WES в изучении этиологии нейродегенеративных заболеваний было опубликовано группой американских ученых в 2010 году (Johnson et al. 2010). Используя экзомное секвенирование, эти исследования показали, что в 2% случаев, мутации в гене VCP в значительной степени способствуют развитию семейной формы бокового амиотрофического склероза (БАС). Это открытие расширило клинический и патологический фенотип мутаций в гене VCP при БАС.

WES позволяет поставить определенные генетические диагнозы и определить причинно-следственные связи развития нейродегенеративных заболеваний. Одним из примеров этого является открытие того, что рецессивные мутации в гене WDR62 являются причиной широкого спектра церебральных кортикальных расстройств. Данное исследование было проведено в узком кругу родственников и не поддавалось традиционным методам идентификации генов (Bilguvar et al. 2010).

Развитие новых технологий секвенирования с переходом к параллельному секвенированию открывает новые возможности в анализе как известных генов семейной формы БП с выявлением ранее не описанных патогенетически значимых мутаций, так и в поиске новых генов семейных форм заболевания. Впервые эти возможности NGS-технологий были продемонстрированы в 2011 г., когда при экзомном секвенировании белок- кодирующей области генома человека в семьях с аутосомно-доминантно наследуемой БП была выявлена миссенс-мутация p.D620N в гене VPS35, кодирующем одну из субъединиц ретромерного комплекса (Vilarino-Guell et al. 2011). Дисфункция этого белка приводит к нарушению круговорота мембрано-связанных белков, что может приводить к развитию характерных для БП фенотипических проявлений через нарушение функционирования сигнального пути Wnt (Deng et al. 2013).

За последние несколько лет с использованием современных высокопроизводительных NGS-технологий, таких как полногеномное и экзомное секвенирование, было выявлено семь новых генов, вовлеченых в патогенез БП (таблица 3): DNAJC13, CHCHD2, DNAJC6, SYNJ1, ATP6AP2,

RAB39B, VPS35. Ген DNAJC13 участвует в регуляции эндосомальной мембранной трубки и регулирует динамику SNX1 на эндосомальной мембране (Freeman et al. 2014). Ген CHCHD2 связан с обменом митохондриальных белков и метаболизмом белков (Funayama et al. 2015). Ген DNAJC6 кодирует семейство белков DNAJ / HSP40, которые регулируют активность молекулярных шаперонов, стимулируя АТФазную активность (Olgiati et al. 2016).

Ген SYNJ1 кодирует фосфонозитид фосфотазу, который регулирует уровень фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата в мембране. Таким образом, экспрессия этого фермента может влиять на синаптическую передачу и мембранный транспорт. Для этого гена были найдены множественные варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы (Winkler et al. 2014).

Ген ATP6AP2 кодирует интегральный трансмембранный доменный белок, который участвует в ряде процессов, таких как внутриклеточный гомеостаз pH, система ренин-ангиотензин и передача сигналов WNT (Korvatska et al. 2013). Ген RAB39B кодирует семейство белков Rab. Белки Rab представляют собой небольшие ГТФазы, которые участвуют в везикулярном транспорте (Wilson et al. 2014). Точная локализация и функция гена RAB39B неизвестна, но белок, как полагают, играет определенную роль в формировании и поддержании синапса (Vanmarsenille et al. 2014).

Однако только для одного из этих генов - гена VPS35, на данный момент имеются многочисленные исследования (более пятнадцати), показывающие, что мутации в нем хоть и встречаются редко, но приводят к развитию БП в различных этнических группах (Spatola and Wider 2014).

Таблица 3. Список генов, связанных с БП, выявленных с помощью NGS

Примечание. АР - аутосомно-рецессивная форма, АД - аутосомно-доминантная форма, ХР - X-сцепленное рецессивное наследование, ХД - X-сцепленное доминантное наследование

На данный момент продолжается активный поиск генов, ассоциированных с БП, с использованием WES. В недавней работе 2017 года автор с коллегами (Jansen et al. 2017) показали большой успех экзомного секвенирования в идентификации генов, повышающих риск развития семейной формы БП. Чтобы обнаружить редкие варианты восприимчивости к БП, WES проводили для 1148 пациентов с БП и 503 неврологически здоровых испытуемых. Впоследствии было подтверждено отношение выявленных генов-кандидатов к БП при помощи параллельной РНК- интерференции (RNAi) в культуре клеток человека, на модели дрозофилы и нематоды C. elegans.

Были идентифицированы 27 генов, имеющие гомозиготные или гетерозиготные замены, которые влекут за собой развитие БП. Воспроизведение и подтверждение результатов осложнено потенциальной гетерогенностью и крайней низкой частотой встречаемости выявленных аллелей. При помощи RNAi были выявлены 15 генов, вызывающие митохондриальные дисфункции в нейрональных культурах человека, а также 4 гена-кандидата, мутации в которых связаны с повышенным накоплением б-синуклеина, что в свою очередь вызывает нейродегенерацию у дрозофилы. На основе дополнительных анализов на выборке, состоявшей из здоровых лиц, выявлены 5 функционально подтвержденных генов-GPATCH2L, UHRF1BP1L, PTPRH, ARSB, и VPS13C. Отсюда следует что, интеграция генетического анализа человека и функциональных исследований позволила выявить несколько генов-кандидатов БП для дальнейших исследований.

Таким образом, WES представляет собой мощную экспериментальную стратегию для широкого применения в будущих исследованиях по изучению этиологии и патогенеза болезни Паркинсона, а также других нарушений со сложной генетической этиологией.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Биоинформатический анализ данных NGS

Был проведен биоинформатический анализ данных полученных в результате полноэкзомного секвенирования ДНК 48 пациентов с болезнью Паркинсона с предполагаемым аутосомно-доминантным характером наследованием. Первичные данные содержали большой по объему материал: не менее 37 миллионов п.н. экзонных последовательностей в каждом из 48 образцов ДНК (при этом в каждом случае было проанализировано 214405 экзонов генома человека). После проведения выравнивания всех полученных ридов в программе «Genome Studio» (Illumina, США) итоговая консенсусная последовательность ДНК для каждого индивидуума сохранялась в формате .bam, после чего для ее последующего анализа использовался пакет программ «SNP and Variation Suite» версии 7.4 («Golden Helix», США). При этом в ДНК анализируемого индивидуума выявлялись все отличия от консенсусной последовательности генома человека, полученной в рамках проекта «1000 геномов», и эти отличия сохранялись в виде файла в формате .vcf. Далее для поиска ассоциированных с патогенезом болезни Паркинсона генетических вариантов проводился скрининг всех выявленных отличий от консенсусной последовательности генома человека путем последовательного сканирования выявленных вариантов по различным базам данных по полиморфизмам генома человека.

Были проанализированы следующие базы данных: проект «1000 геномов», база данных проекта по секвенированию экзома ESP, и база данных dbSNP. Для дальнейшего анализа отбирали варианты, которые не встречаются в этих базах данных или являются крайне редкими (частота встречаемости варианта в известных базах данных не превышает 1%). В среднем для каждого образца ДНК было выявлено от 500 до 2500 гетерозиготных вариантов с частой встречаемости менее 1%. Далее выявленные варианты проходили функциональную аннотацию при помощи биоинформатических программ, предсказывающие, влияет ли замена на функцию белка или нет.

2.2 Функциональная оценка полученных данных

Далее был проведен анализ на определение возможной функциональной роли выявленных новых и редких гетерозиготных вариантов с использованием биоинформатических программ.

Выявленные варианты проходили функциональную аннотацию, при которой выделялись два типа потенциально функционально значимых вариантов: миссенс-мутации, нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания. Эти варианты охарактеризованы по локализации в геноме (в соответствии с 37 релизом базы данных генома человека), номеру в базе данных однонуклеотидных полиморфизмов (dbSNP129), гену, в котором произошла миссенс-замена, типу и локализации аминокислотной замены, и возможном влиянии этой замены на функциональную активность белка. Эта характеристика проводится с использованием алгоритмов, рассматривающих различные аспекты влияния аминокислотных замен на структуру и функцию белка - SIFT, Polyphen-2, FATHMM, MutationAssessor, MutationTaster, PROVEAN, MOTIF, MetaSVM, MetaLR, Likelihood radio test(LRT).

В таблице 4 представлены биоинформатические ресурсы, которые были использованы для сужения круга кандидатных вариантов, оценивающие патогенность анализируемых вариантов на основе структурно- функциональных изменений(Polyphen-2 HVAR и Polyphen-2 HDIV), анализа гомологии последовательностей(SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, FATHMM, LRT) и оценки консервативности и структурно-функциональных свойств мРНК и белка (MutationTaster), а также 2 комплексные программы (MetaLR и MetaSVM).

Таблица 4. Основные биоинформатические программы

SIFT анализирует запрашиваемую последовательность и использует выравнивание для прогнозирования «плохой» замены для каждой позиции запрашиваемой последовательности. SIFT является многоступенчатой процедурой, при которой (1) происходит поиск подобных последовательностей генов, (2) выбираются тесно связанные последовательности, которые могут иметь схожую белковую функцию, (3) получает выравнивание этих выбранных последовательностей, и (4) вычисляет, используя специальную формулу, нормированные вероятности для всех возможных замен выравнивания. Позиции с нормированными вероятностями менее 0,05, по прогнозам, будут вредными (deleterious), тем больше или равна 0,05, по прогнозам, будут приемлемыми (tolerated).

MutationTaster отображает автоматические прогнозы известных нейтральных полиморфизмов из проекта «1000 геномов» и известных мутаций от NCBI ClinVar. Сравнение MutationTaster с другими программами проводилось без рассмотрения автоматически отображаемых прогнозов, который сами по себе правильные - или, по крайней мере, совпадают. Использовались актуальные предсказания, сделанные с помощью классификатора и отображаемые в вероятностном значении. (Автоматический прогноз с вероятностью ниже 0,5 означает, что MutationTaster2 сделал бы иной прогноз, если бы прогноз для данного варианта не был бы уже известен).

Значение вероятности, вероятность прогноза, т.е. значение, близкое к 1, указывает на высокую «безопасность» предсказания. Результаты показывают, что неправильные предсказания, как правило, не отражаются низкими значениями вероятностей, но скорее были вызваны полиморфизмами или патогенными изменениями, которые имели характеристики другого случая, например SNP, которые высоко консервативны, разрушают функции белка или являются патогенными мутациями, которые появляются, не имея никакого влияния на белок / ген вообще. Если замена является "истинным" SNP (что подтверждается существованием каждого из трех генотипов АА, АВ, ВВ в базе данных HapMap или наличием более 4 гомозиготных образцов в базе «1000 геномов»), оно автоматически оценивается как полиморфизм. Замены, приводящие к появлению преждевременного стоп-кодона и нонсенс- опосредованному распаду мРНК (НОР), автоматически расцениваются как патогенные (disease causing).

PolyPhen-2 оценивает вероятность патогенности мутации по классификатору Байеса и оценивает количество ложноположительных результатов (вероятность того, что мутация классифицируется как вредная, когда на самом деле не патогенна) и истинноположительных (вероятность того, что мутация классифицируется как вредная, когда на самом деле является патогенной). Мутация также оценивается качественно и может быть отнесена к доброкачественной (benign) или возможно патогенной (possibly damaging и probably damaging).

PROVEAN осуществляет кластеризацию с показателем 75% глобальной идентичности последовательностей. Лучшие 30 групп близкородственных последовательностей образуют опорную последовательность, которая будет использоваться для генерации прогноза.

Счет/оценка выравнивания дельта вычисляется для каждой опорной последовательности. Баллы затем усредняются внутри и между кластерами, чтобы сформировать окончательный счет PROVEAN. Если PROVEAN балл равен или ниже предварительно заданного порогового значения (например, - 2.5), вариант белка, согласно прогнозам, имеет "вредный(deleterious)" эффект. Если PROVEAN оценка выше порогового значения, то прогнозируемый вариант имеет "нейтральный(neutral)" эффект.

MOTIF ищет сохраненные области в запрашиваемой последовательности и консенсусных последовательностях, которые были получены из по меньшей мере двух последовательностей. После того, как сохраненные области в запрашиваемой последовательности были идентифицированы с помощью MOTIF, эти области извлекаются из последовательностей, выровненных по PSI-BLAST.

FATHMM предсказывает функциональные эффекты миссенс-мутаций, объединяя сохраненные последовательности в скрытых марковских моделях (HMM), представляющие собой выравненные гомологичные последовательности и консервативные белковые домены, с «весами патогенности», представляющими общую толерантность белка / домена к мутациям.

MutationAssessor представляет собой базу данных и систему оценки для прогнозирования функционального воздействия мутаций в транслированных белках при раковых заболеваниях человека. Он предоставляет данные из других баз данных, таких как COSMIC, UniProt и Pfam, а также свой собственный «функциональный балл воздействия» на мутацию, основанную на эволюционном сохранении последовательности белка, содержащей мутацию.

MetaSVM и MetaLR разработаны на основе 9 программ: SIFT, PolyPhen-2 HDIV, PolyPhen-2 HVAR, GERP++, MutationTaster, Mutation Assessor, FATHMM, LRT, SiPhy, PhyloP. Вероятность патогенности мутации оценивается по радиальной базисной функции методом опорных векторов. В вычислительном алгоритме используется нелинейный классификатор, в основе которого лежит переход от скалярных произведений к произвольным ядрам, так называемый kernel trick, позволяющий строить нелинейные разделители.

После того как каждому гетерозиготному варианту была присвоена оценка вероятности патогенной мутации, гетерозиготные варианты, которые имели не менее 3 «плохих» предсказаний, были включены в дальнейший анализ. Остальные варианты были исключены.

2.3 Анализ «нейродегенеративных панелей»

На этом этапе был проведен анализ так называемых «панелей нейродегенеративных заболеваний». Нейродегенеративные диагностические панели, основанные на технологиях NGS используются для диагностики широкого спектра социально значимых наследственных дегенеративных заболеваний мозга. Панельный скрининг случаев нейродегенеративных заболеваний позволяет выявить и подтвердить ряд мутаций в различных генах. На основании двух панелей нейродегенеративных заболеваний был составлен список генов (Таблица 5), мутации в которых могут приводить к развитию нейродегенеративных заболеваний и проведен поиск вариантов в данных генах среди всех выявленных SNV.

Таблица 5. Список генов, идентифицированных для нейродегенеративных заболений

Комплексная генетическая структура нейродегенеративных заболеваний в российской популяции до настоящего времени не определена. Особенностью этой группы заболеваний является высокая генетическая гетерогенность с фенотипической вариабельностью при одном и том же генетическом дефекте, что не позволяет однозначно связать фенотип и генотип и создает определенные трудности в выборе тактики лечения. Идея использования нейродегенеративных панелей состоит в том, что гетерозиготное носительство мутаций (1 аллель заменен) в данных генах может быть ассоциировано с повышенным риском развития БП, а значит мутации в гетерозиготном состоянии в генах нейродегенеративных панелей могут быть связаны с большой вероятностью проявления фенотипических признаков БП.

2.4 Верификация отдельных вариантов с помощью секвенирования по Сенгеру

Анализ генов на наличие точковых мутаций проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием по Сенгеру.

Праймеры для проведения ПЦР подбирали с помощью программы NCBI primer blast и нуклеотидных последовательностей генов ANK2, GBA, GIGYF2, POLG, L2HGDH, PSEN1. Последовательности специфичных праймеров представлены в таблице 6.

Таблица 6. Последовательности специфичных праймеров

ПЦР проводилась в ламинарном боксе с ультрафиолетовой лампой. Объем реакционной смеси составлял 30 мкл: 1 мкл (10 пмоль) раствора прямого праймера, 1 мкл (10 пмоль) раствора обратного праймера, 3 мкл ПЦР буфера (10х) («Синтол», Россия), 1,5 мкл 25 ммоль раствора MgCl2, 200 мкМ каждого дНТФ, 1 единица активности Taq ДНК-полимеразы («Синтол», Россия), 5 мкл образца ДНК (0,02 нг/мкл) и 15,3 мкл воды, предварительно прошедшую УФ-стерилизацию в кросслинкере («Biometra», Германия).

Далее пробирки переносят в амплификатор TRIO («Biometra», Германия). Амплификацию проводят в автоматическом режиме по заданной программе: 95 °C -- 10 мин, (95 °C -- 60 с, 55 °C -- 25 с, 72 °C -- 30 с) -- 34 циклов. Анализ продуктов амплификации осуществлялся методом электрофореза в 2% агарозном геле, предварительно окрашенным бромистым этидием для визуализации молекул днк и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.

Секвенирование по Сенгеру проводилось как в прямом, так и в обратном направлении на анализаторе ДНК ABI 3730. Последовательности были проанализированы с использованием программного обеспечения Sequence Scanner Software v.1.0 и AlignX® для Vector NTI.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Фильтрация и функциональная оценка исходных данных

Был проведен биоинформатический анализ данных полученных в результате полноэкзомного секвенирования ДНК 48 пациентов с болезнью Паркинсона с предполагаемым аутосомно-доминантным характером наследования. Для исследования ассоциированных с патогенезом болезни Паркинсона генетических вариантов проводился скрининг всех выявленных отличий от консенсусной последовательности генома человека путем последовательного сканирования выявленных вариантов по различным базам данных по полиморфизмам генома человека. Первичные данные содержали большой по объему материал: не менее 37 миллионов п.н. экзонных последовательностей в каждом из 48 образцов ДНК (при этом в каждом случае было проанализировано 214405 экзонов генома человека).

После проведения выравнивания всех полученных ридов в программе «Genome Studio» (Illumina, США) итоговая консенсусная последовательность ДНК для каждого индивидуума сохранялась в формате. bam, после чего для ее последующего анализа использовался пакет программ «SNP and Variation Suite» версии 7.4 («Golden Helix», США). При этом в ДНК анализируемого индивидуума выявлялись все отличия от консенсусной последовательности генома человека, полученной в рамках проекта «1000 геномов», и эти отличия сохранялись в виде файла в формате .vcf. Далее для поиска ассоциированных с патогенезом болезни Паркинсона генетических вариантов проводился скрининг всех выявленных отличий от консенсусной последовательности генома человека путем последовательного сканирования выявленных вариантов по различным базам данных по полиморфизмам генома человека.

Для дальнейшего анализа отбирали варианты, которые не встречаются в этих базах данных или являются крайне редкими (частота встречаемости варианта в известных базах данных не превышает 1%). Результаты подобного отбора представлены в таблице 7.

Таблица 7. Этапы анализа гетерозиготных вариантов по базам данных геномов

В среднем для каждого образца ДНК было выявлено от 500 до 2500 гетерозиготных вариантов с частой встречаемости менее 1%.

Далее выявленные варианты проходили функциональную аннотацию, при которой выделялись два типа потенциально функционально значимых вариантов: миссенс-мутации, нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания. Эти варианты охарактеризованы по локализации в геноме (в соответствии с 37 релизом базы данных генома человека), номеру в базе данных однонуклеотидных полиморфизмов (dbSNP129), гену, в котором произошла миссенс-замена, типу и локализации аминокислотной замены, и возможном влиянии этой замены на функциональную активность белка. Эта характеристика проводится с использованием алгоритмов, рассматривающих различные аспекты влияния аминокислотных замен на структуру и функцию белка - SIFT, Polyphen-2, FATHMM, MutationAssessor, MutationTaster, PROVEAN, MOTIF, MetaSVM, MetaLR, Likelihood radio test(LRT).

С помощью данных программ каждому варианту была присвоена функциональная оценка и показано, влияет ли замена на функцию белка или нет, основываясь на гомологии последовательности и физических свойств аминокислот. Каждая мутация оценивалась качественно и относилась к доброкачественной (benign, tolerated, predicted non-functional, polymorphism) или возможно патогенной (possibly damaging, probably damaging, deleterious, disease causing, predicted functional (medium,high)). Фрагмент данных представлен в таблице 8.

Таблица 8. Функциональная оценка выявленных гетерозиготных вариантов

Примечание: зеленым цветом выделены нейтральные варианты, красным отмечены потенциально патогенные варианты

После того как каждому гетерозиготному варианту была присвоена оценка вероятности патогенной мутации, гетерозиготные варианты которые имели не менее 3 «плохих» предсказаний были включены в дальнейший анализ. Остальные варианты были исключены.

3.2 Поиск и анализ потенциально патогенетически значимых вариантов в генах моногенных форм болезни Паркинсона

Мы сосредоточили свое внимание на полиморфных вариантах, расположенных в ключевых генах болезни Паркинсона: SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, LRRK2, ATP13A2, VSP35, MAPT и GBA. В результате

полиморфные варианты были выявлены в трех генах: PARK2, LRRK2, и GBA у 13 больных (27%). Результаты проведенного анализа представлены в таблице 9.

Таблица 9. Ранее описанные выявленные полиморфные варианты в ключевых генах моногенных форм болезни Паркинсона

Анализ гена PARK2 выявил два ранее описанных полиморфных варианта p.Ala82Glu, p.Arg275Trp. Эти варианты были обнаружены как в случае семейных больных в гетерозиготном состоянии, так и в контрольной выборке. При этом вариант p.Arg275Trp встречался у больных, и у контрольной выборки почти с одинаковой частотой (3,1% против 3,4%) и был обнаружен у двух больных в сочетании с другими мутациями в гене паркина. Случаи с изменением дозы гена имели более ранний возраст начала развития болезни (50% случаев в возрасте меньше или равно 45 лет) по сравнению с пациентами без мутаций в гене PARK2 (10%, р = 0,00002) (Pankratz et al. 2009). Гетерозиготный вариант p.Ala82Glu в гене PARK2 чаще встречался у пациентов с БП по сравнению со здоровыми (4,00% против 1,81%), но разница не была значительной (p = 0,13). Средний возраст начала развития заболевания был значительно ниже у пациентов с гомозиготными или смешанными гетерозиготными мутациями, чем у пациентов с гетерозиготными мутациями (средняя разница составила 11 лет, p = 0,03). Не было значимой разницы в среднем возрасте начала заболевания у гетерозиготных пациентов по сравнению с пациентами без мутации в гене PARK2 (средняя разница составила 2 года, p = 0,54) (Brooks et al. 2009).

Эти данные подтверждают более высокий риск развития БП у пациентов с патогенными гетерозиготными мутациями в гене PARK2 по сравнению со здоровым контролем, но влияние этих мутаций не достигло значимости в когорте из 250 пациентов с БП и 276 здоровых лиц (Brooks et al. 2009).

Больше всего полиморфных вариантов было обнаружено в гене LRRK2 - было выявлено три ранее описанных варианта p.Glu334Lys, p.Arg1514Gln, p.Ala419Val. Вариант p.Glu334Lys был выявлен у трех больных в N- области LRRK2, где ранее никаких патогенных замен не выявлено (Nichols et al. 2007). Вариант p.Ala419Val выявлен при помощи секвенирования всех кодирующих экзонов LRRK2 310 бельгийских пациентах с БП, но не был идентифицирован как патогенный вариант (Nuytemans et al. 2009).

Все выявленные в гене LRRK2 варианты присутствовали с одинаковой частотой у пациентов с БП и в контрольных группах и поэтому интерпретировались как не связанные с болезнью полиморфизмы и не относятся к мутациям с доказанной патогенетической значимостью (Nichols et al. 2007;(Nuytemans et al. 2009;(Pankratz et al. 2009).

В гене GBA были выявлены два ранее описанных полиморфных варианта p.Asp140His и p.Thr408Met. Вариант p.Asp140His был выявлен всего один раз в семье болезнью Гоше в сочетании с двумя другими аминокислотными заменами ((c.535G>C (p.Asp140His) + c.10936G>A (p.Glu326Lys) и c.586A>C (p.Lys157Gln)). Второй вариант p.Thr408Met был выявлен у 2 пациентов с болезнью Гоше и отнесен авторами, как вариант, который по имеющимся на данный момент данным не является клинически и патогенетически значимым (Velayati et al. 2011).

Таким образом, ни один из выявленных полиморфных вариантов в ключевых генах, связанных с патогенезом БП, не имеет стопроцентно доказанную патогенетическую значимость, а значит ни один пациент не может быть исключен из дальнейшего анализа.

3.3 Поиск и анализ генов в нейродегенеративных панелях

Далее был проведен анализ так называемых «панелей нейродегенеративных заболеваний». Нейродегенеративные диагностические панели используются для диагностики широкого спектра социально значимых наследственных дегенеративных заболеваний мозга. Панельный скрининг случаев нейродегенеративных заболеваний позволяет выявить и подтвердить последующие мутации в различных генах, а также выявить те варианты, которые могут вносить вклад в риск развития БП.

В результате проведенного анализа полиморфные варианты были выявлены в 11 генах у 17 больных (35,4 %). Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10. Список генов, вовлеченных в патогенез нейроденегеративных заболеваний

Больше всего полиморфных вариантов было обнаружено в генах GIGYF2 и SYNE1. Так, в гене GIGYF2 было идентифицировано три полиморфных варианта p.Asp371Glu, Arg958Gln и Arg961Gln. Только один из этих вариантов, p.Asp371Glu, был ранее выявлен в гетерозиготном состоянии при анализе больных БП с использованием метода GWAS.

Несмотря на низкую частоту встречаемости в базе данных ExAC (0,07%), данный вариант не достиг при анализе необходимого уровня значимости (p<5e-8) и был отнесен авторами к полиморфизмам, не имеющим патогенетической значимости в испанской когорте (Bandres-Ciga et al. 2016). Два других варианта в гене GIGYF2 ранее не были описаны.

В гене SYNE1 также были обнаружены три варианта. Это ранее выявленные Arg8110Cys, Leu3050Val. Leu5624Phe найден впервые. Ранее выявленные варианты были найдены у пациентов со идиопатической поздней мозжечковой атаксией.

Однако, результаты исследования показали, что ни один из выявленных вариантов не относится к мутациям с доказанной патогенетической значимостью (Keogh et al. 2015).

В гене POLG были выявлены два ранее описанных патогенетически значимых варианта: p.Pro587Leu и p.Thr251Ile. Вариант p.Pro587Leu был выявлен всего один раз в семье с аутосомно-рецессивной формой прогрессивной внешней офтальмоплегии с признаками митохондриальной нейро-желудочно-кишечной энцефалопатии в сочетании с уже известной заменой Thr251Ile ((c.1760GC>T (p.Pro587Leu) + c.752C>T (p.Thr251Ile)), которые оба присутствовали в цис-положении на втором аллеле (Van Goethem et al. 2003). Для первого варианта нет сведений о его клинической и патогенетической значимости, в то время как второй вариант был также выявлен у семей с прогрессивной внешней офтальмоплегией из Италии (Lamantea et al. 2002).

Все большее число работ по исследованиям мутаций в гене POLG публикуется, что связано с широким спектром клинических фенотипов заболеваний, некоторые мутации наследуется по аутосомно - рецессивному типу, другие по аутосомно - доминантному типу наследования (DeBalsi et al. 2017).

В генах ABCA1, ATM, CCDC88C, COL4A1, COL6A3, DYNC1H1, INPP5E и MPO нами были выявлены либо ранее не описанные полиморфные варианты, либо такие варианты, для которых в настоящее время нет однозначных данных относительно их клинической или патогенетической значимости.

Также нами была проведена верификация всех SNV при помощи секвенирования по Сенгеру. Было подтверждено наличие всех вариантов, выделенных на основании полученных полноэкзомных последовательностей, в геноме соответствующих пациентов с БП.

Таким образом, нами было выявлено 11 генов, полиморфные варианты в которых могут быть ассоциированы с развитием БП. При этом только для одного гена, GIGYF2, ранее была показана связь с заболеванием. Полученные нами данные могут представлять особый интерес для расширения спектра мутаций, полиморфизмов и генов, которые могут быть вовлечены в патогенез БП, а также более глубокого понимания механизмов патогенеза данного заболевания.

Выводы

1. При помощи технологии полноэкзомного NGS секвенирования были проанализированы 48 неродственных пациентов с предполагаемой аутосомно-доминантной семейной формой БП и было выявлено 198285 гетерозиготных вариантов.

2. Был проведен анализ отобранных вариантов на их патогенетическую значимость и было выявлено 5798 потенциально патогенетических вариантов.

3. Анализ вариантов в генах моногенных форм болезни Паркинсона позволил выявить 7 полиморфных вариантов, представляющих собой факторы риска развития заболевания.

4. Было проведено сравнение потенциально патогенетически значимых вариантов с генами из «нейродегенеративных панелей», которое позволило выявить 11 генов-кандидатов БП.

Заключение

На данный момент NGS секвенирование является самой современной техникой секвенирования человеческого генома для идентификации значимых мутаций, вовлеченных в патогенез болезни Паркинсона. В нашем исследовании был разработан алгоритм анализа первичных данных, который позволяет исключить ложноположительные варианты. Преимущество данного метода заключается в успешном исключении недостоверных результатов по разработанным критериям отбора.

Также нами были выявлены 11 генов, полиморфные варианты в которых могут быть ассоциированы с развитием БП.

Полученные результаты могут быть применены в преимплантационной генетической диагностике моногенных заболеваний, неонатальном скрининге для детей первого года жизни с целью своевременного выявления наследственных заболеваний. Применение полученных данных может обеспечивать своевременную диагностику еще до проявления признаков заболевания, что позволяет назначить эффективную профилактику и лечение на ранних этапах, а также избежать тяжелых осложнений в будущем. Внедрение полученных результатов в системы диагностики открывает новые возможности в максимально ранней диагностике и лечении наследственных заболеваний.

Список литературы

1. M. J. Bamshad, S. B. Ng, A. W. Bigham, H. K. Tabor, M. J. Emond, and J. Shendure, 'Exome Sequencing as a Tool for Mendelian Disease Gene Discovery', Nat Rev Genet. - 2011. - № 12. - C. 745-55.

2. J. Jankovic, J. Beach, and C. Contant, 'Tremor and Longevity in Relatives of Patients with Parkinson's Disease, Essential Tremor, and Control Subjects', Neurology. - 1995. - № 45. - C. 645-8.

3. A. Elbaz, and C. Tranchant, 'Epidemiologic Studies of Environmental Exposures in Parkinson's Disease', Journal of the neurological sciences. - 2007. - № 262. - C. 37-44.

4. E. L. Thacker, H. Chen, A. V. Patel, M. L. McCullough, M. J. Thun, M. A. Schwarzschild, and A. Ascherio, 'Recreational Physical Activity and Risk of Parkinson's Disease', Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. - 2008. - № 23. - C. 69-74.

5. J. K. Findley, K. B. Sanders, and J. E. Groves, 'The Role of Psychiatry in the Management of Acute Trauma Surgery Patients', Primary care companion to the Journal of clinical psychiatry. - 2003. - № 5. - C. 195-200.

Размещено на Allbest.ur