Морфофункциональные особенности кровеносных сосудов потомков курящих родителей

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

УДК: 616.1-091-053.1-092.9-02:613.84-055.52(043.3)

14.03.04 - патологическая физиология

Диссертация

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ ПОТОМКОВ КУРЯЩИХ РОДИТЕЛЕЙ

Харьков-2016

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Влияние табакокурения на развитие сердечно-сосудистой патологии

1.2 Влияние курения на течение беременности и плод

1.3 Влияние курения родителей на сердечно-сосудистую систему потомства

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1 Приготовление гомогенатов стенок сосудов

2.2 Определение содержания эндотелина-1 и эластина

2.3 Метод определения коллагена в стенке сосудов

2.4 Метод определения NO-синтазной активности

2.5 Флюориметрический метод определения нитрозотиолов

2.6 Метод определения содержания АТФ в тканях

2.7 Определение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови

2.8 Определение содержания диеновых конъюгатов (гидроперекисей липидов) в сыворотке крови

2.9 Скрининг-метод определения молекул средней массы

2.10 Определение АТФ-азной активности миозина

2.11 Определение активности креатинфосфокиназы в гомогенатах сосудов

2.12 Гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследование

2.13 Иммуногистохимическое исследование

2.14 Анкетирование студентов

2.15 Статистическая обработка результатов

РАЗДЕЛ 3. ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КРОВИ И В СТЕНКЕ КРУПНЫХ СОСУДОВ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТАБАКОКУРЕНИЯ РОДИТЕЛЕЙ

3.1 Уровень интоксикации организма новорожденных крысят в эксперименте

3.2 Биохимические показатели функции эндотелия у новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей

3.3 Показатели энергетического обмена и АТФ-азная активность миозина в крупных сосудах новорожденных крысят

3.4 Содержание коллагена и эластина в ткани стенки крупных сосудов новорожденных крысят

3.5 Содержание коллагена и эластина в ткани стенки крупных сосудов двухмесячных крысят

РАЗДЕЛ 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ АОРТЫ И СОСУДОВ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА У НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ - ПОТОМКОВ РОДИТЕЛЕЙ-«КУРИЛЬЩИКОВ»

РАЗДЕЛ 5. РЕЗУЛЬТАТЫ АНКЕТИРОВАНИЯ МОЛОДЫХ ЛЮДЕЙ -ПОТОМКОВ КУРЯЩИХ РОДИТЕЛЕЙ

РАЗДЕЛ 6. АНАЛИЗ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Табакокурение занимает особое место среди вредных привычек, так как в отличие от алкоголя и наркотиков - «открытых убийц» человеческого организма, действие табачного дыма на начальных этапах употребления практически не заметно. Вероятно, этот свойство табакокурения среди других факторов, стимулирующих формирование и закрепление привычки, приводит к широкой распространенности курения. Согласно статистическим данным научных исследований, в условиях мегаполиса (г. Харьков) курит около 50% взрослых мужчин и 20% взрослых женщин [3].

Негативное действие табакокурения у активных курильщиков на организм в целом и кровеносные сосуды в частности подтверждено известными научными исследованиями [41; 48; 93] и медицинской практикой. Что касается возможного отрицательного влияния табакокурения на плод и дальнейшее здоровье ребенка, то исследования, в основном, проводятся по изучению эффектов материнского курения на плод. Доказано, что у беременных компоненты табачного дыма проникают через плаценту [124], кожу и желудочно-кишечный тракт плода из амниотической жидкости [80]. Выявлено, что выкуривание одной сигареты беременной женщиной сопровождается спазмом маточных сосудов продолжительностью 20-30 мин., что приводит к ослаблению маточно-плацентарного кровотока [30]. Осложнения при родах у курящих матерей диагностируются в 2 раза чаще, а послеродовая смертность новорожденных детей у курящих женщин на треть выше, чем у некурящих. Риск внезапной смерти новорожденных по вине курящих матерей возрастает на 52% [87]. В эксперименте на крысах показано, что курение матери является одним из этиологических факторов задержки внутриутробного развития, сопровождается уменьшением абсолютной и относительной массы сердца плода [20].

В отдельных работах изучается состояние сосудов у детей разного возраста, рожденных курящими матерями. Обнаружено, что табакокурение матерей приводит к развитию эндотелиальной дисфункции у детей, значительному снижению продукции вазодилататора - оксида азота [37]. Последние данные, полученные голландскими врачами при ультразвуковом исследовании сонных артерий 5-летних детей, чьи родители курили в течение внутриутробного периода, показали утолщение их стенки и уменьшение диаметра просвета [71].

Таким образом, проблема влияния табакокурения родителей на морфофункциональное состояние и развитие кровеносных сосудов у потомства мало изучена, в научной литературе имеются лишь единичные сведения.

Связь работы с научными программами, планами, темами

Диссертационное исследование было выполнено в соответствии с комплексным планом научных исследований Харьковского национального медицинского университета МЗ Украины и является составной частью общей темы научно-исследовательской работы кафедры патологической физиологии: «Патогенез повреждающего действия на организм негативных факторов в современных условиях» (номер государственной регистрации 0115U000991).

Цель исследования - выяснение отдельных звеньев механизма влияния табакокурения родителей на морфофункциональное состояние кровеносных сосудов потомков на основании выявления изменений их метаболизма и структуры.

Задачи:

1. В эксперименте на крысах получить потомков при моделировании табакокурения матери, отца и обоих родителей, определить уровень интоксикации организма новорожденных крыс-потомков родителей-«курильщиков» и изучить биохимические показатели, характеризующие функции эндотелия.

2. На экспериментальном материале установить соотношение коллаген / эластин и особенности метаболизма гладкомышечных клеток в ткани стенки аорты и бедренной артерии потомков родителей-«курильщиков».

3. Оценить микроскопические особенности аорты потомков родителей- «курильщиков».

4. Оценить микроскопические особенности капиллярного русла в коре почек (капиллярные клубочки) и в коре больших полушарий головного мозга потомков родителей- «курильщиков».

5. Провести анкетирование молодых людей по выяснению оценки ими своего здоровья при табакокурении родителей.

6.Объяснить механизм внутриутробного формирования морфофункциональных изменений кровеносних сосудов потомков при табакокурении матери, отца или обоих родителей.

Объект исследования - влияние табакокурения на организм.

Предмет исследования - морфофункциональное состояние кровеносных сосудов потомков при табакокурении родителей.

Методы исследования - моделирование на животных патологического воздействия табачного дыма, биохимические (спектрофотометрические, спектрофлюориметрические, иммуноферментные), морфологические (гистологические, морфометрические, гистохимические, иммуногистохимические) методы, анкетирование, статистические методы (вариационный и альтернативный анализы).

Научная новизна полученных результатов

Впервые осуществлено углубленное изучение метаболических и морфофункциональных изменений ткани стенки аорты у потомков курящих родителей с комплексным использованием биохимических и морфологических методов исследований. Сформулирована гипотеза, объясняющая механизм внутриутробного утолщения стенки аорты и увеличения ее жесткости (с увеличением значений соотношения коллаген/эластин) и снижением активности СаІ+-активируемой АТФ-азы миозина.

Выявлено внутриутробное формирование дисфункции эндотелия у потомков курящих матерей, отцов, обоих курящих родителей, т.к. соотношение эндотелин-1/S-нитрозотиолы изменяется у всех потмков разных групп, но в разной степени. Приведены доказательства снижения устойчивости эндотелия к действию повреждающих факторов и впервые выявлена зависимость развития капиллярной сети новорожденных потомков от табакокурения матери, отца, обоих родителей.

Впервые проведенное биохимическое исследование аорты и бедренных артерий двухмесячных крыс-потомков «курящих» родителей и анкетирование молодых людей - студентов харьковского вуза - подтверждает точку зрения о том, что внутриутробно сформировавшиеся особенности сосудистой системы из-за табакокурения родителей сохраняются в течение дальнейшего онтогенеза и приводят к учащению появления жалоб на головную боль, слабость, снижение работоспособности и к развитию заболеваний, связанных с сосудами, уже в молодом возрасте.

Впервые использована иммуногистохимическая реакция на фактор Виллебранда для оценки степени развития капиллярной сеты и степени сохранности эндотелия.

Практическое значение полученных результатов

Полученные результаты могут быть использованы не только в учебном процессе высшей медицинской школы, но и как экспериментальная база для разработки методов постнатальной коррекции внутриутробно развившейся у потомков курящих родителей дисфункции эндотелия и сформировавшейся излишней жесткости стенки артерий. Использованный в работе иммуногистохимический метод оценкки функционального состояния эндотнлия сосудов микроциркуляторного русла может быть примененен в клинических лабораториях, в патофизиологических отделах НИИ, медэкспертами, докторантами и аспирантами при выполнении НИР.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедрах патологической анатомии и патологической физиологии Сумского государственного университета, педиатрии и неонатологии №1, педиатрии №2, биологической химии Харьковского национального медицинского университета, фармакотерапии и патофизиологии Харьковского национального фармацевтического университета, патологической анатомии с секционным курсом Одесского национального медицинского университета, патологической физиологии Буковинского государственного медицинского университета; в лечебный процесс отделения острых заболеваний сосудов института общей и неотложной хирургии им. В.Т. Зайцева Национальной академии наук Украины.

Личное участие соискателя

Автором определены цель и задачи исследования, проведен патентно-информационный поиск, анализ данных литературы, выполнены и написаны все разделы диссертационной работы. Самостоятельно проведено морфометрическое исследование сосудов крыс-потомков при табакокурении родителей, проанализированы результаты биохимических исследований и результаты анкетирования студентов. Диссертантом самостоятельно осуществлена публикация результатов исследования в журналах, представлены все результаты исследований на научных съездах и конференциях. В работах, выполненных в соавторстве, реализованы научные идеи соискателя.

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации были представлены на научной конференции «Проблемы и перспективы развития современной медицины» (Гомель, Белоруссия, 2013), на VI национальном конгрессе патофизиологов Украины с международным участием «От экспериментальных исследований к клинической патофизиологии» (Ялта, 2012), на 8-й научно-практической конференции с международным участием «Современная кардиология и кардиохирургия - путь от проблем к решению» (Судак, 2013), ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Достижения и перспективы экспериментальной и клинической эндокринологии» (тринадцатые Данилевские чтения), (Харьков, 2014), на научной конференции «Медицина третьего тысячелетия» (Харьков, 2013), на научной конференции молодых ученых и студентов (Тернополь, 2013), «Актуальные вопросы теоретической и практической медицины» (Сумы, 2014). Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы патоморфологии и патофизиологии» (Запорожье, 2015), VII Национальный конгрес патофизиологов Украины «Патофізіологія і фармація: шляхи інтеграції» (Харьков, 2016).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных трудов. Из них 6 статей изданы в рекомендованных ВАК Украины научных профессиональных журналах, 1 статья - в зарубежном сборнике научных трудов медицинского направления (Республика Беларусь), 1 статья - в зарубежном научном журнале (РФ), 6 тезисов материалов научных конференций.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованных литературных источников. Работа изложена на 134 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 22 таблицами. Список литературы представлен на 18 страницах, он состоит из 153 литературных источников, в том числе 49 - кириллицей и 104 - латиницей.

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Влияние табакокурения на развитие сердечно-сосудистой патологии

Кардиоваскулярная патология занимает одно из первых мест среди причин заболеваемости, инвалидизации и смертности во многих странах мира, в том числе и в Украине. Часто выявляют комбинацию следующих факторов, способствующих развитию и прогрессированию таких заболеваний как ишемическая болезнь сердца (ИБС), цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ), заболевания периферических сосудов: курение, избыточная масса тела, артериальная гипертензия (АГ), поражение почек, гиперхолестеринемия. Среди населения Украины доля лиц, не имеющих ни одного фактора кардиоваскулярного риска, составляет лишь 15,3%, у 33,9% отмечают 1 фактор риска, у 28,2% - 2 фактора, 22,6% - ?3 факторов [24].

Курение является фактором риска для развития сердечно-сосудистых заболеваний [76]. Активное курение во взрослом возрасте сопровождается утолщением комплекса интима-медиа сонной артерии, являющегося показателем риска сердечно-сосудистых заболеваний [58]. В ряде исследований продемонстрировано, что утолщение комплекса интима-медиа сонной артерии и снижение ее эластичности обнаруживается и в подростковом, и в молодом возрасте у активных и пассивных курильщиков и носит дозозависимый характер [94; 121; 127; 96; 107].

По данным Кваши Е. А. и соавт. [22] среди курящих мужчин в 2 раза чаще возникает стенокардия, повышается риск коронарной смерти, особенно в молодом возрасте, несмертельный инфаркт миокарда у курящих мужчин в возрасте 30-49 лет возникает в 5 раз, в 50-59 лет - в 3 раза, а в 60-79 лет - в 2 раза чаще, чем у некурильщиков. Примерно 80-90% всех летальных исходов ИБС у мужчин в возрасте до 45 лет связаны с курением, причем в Украине курение является опосредованной причиной каждого 5-го случая смерти лиц старше 35 лет, а в целом смертность от сердечно-сосудистых заболеваний среди курильщиков в 2 раза выше, чем среди тех, кто не курит. У курящих женщин, которые являются еще более чувствительными к этому фактору риска, частота кардиоваскулярных осложнений возрастает до 6 раз, а при применении курящими женщинами пероральных контрацептивных средств риск развития мозгового инсульта в 20 раз выше, чем у некурящих. По данным Cheng Y-J., Liu Z., Yao F-J. et al. [67] у курящих женщин чаще также возникает варикоз, эктазии и тромбозы - как проявление тяжелого поражения вен нижних конечностей.

Установлено, что при одном вдыхании табачного дыма в организм человека попадает 1015 свободных радикалов и около 4700 различных химических соединений, большинство из которых вызывают как мгновенное негативное влияние, так и отсроченные патологические эффекты в здоровом организме [143, 151]. Кваша Е. А. [21]; Кваша Е. А. и соавт. [22] указывают, что мгновенное влияние обусловлено прямой никотининдуцированной вазоконстрикцией и повышением уровня адреналина в крови, что приводит к повышению частоты сердечных сокращений на 30%, артериального давления на 5-10 мм рт. ст., увеличению свертываемости крови, ухудшению кровотока и микроциркуляции, что, в свою очередь, сопровождается снижением температуры верхних и нижних конечностей. Никотин влияет на разные уровни центральной нервной системы, вегетативные ее образования, в связи с чем нарушаются сосудистый тонус и способность адаптации сосудов к другим факторам. Никотин может действовать и локально, например, освобождая норэпинефрин из хромаффинной ткани вблизи кровеносных сосудов и вызывая тем самым их констрикцию, или воздействовать непосредственно на гладкие мышцы сосудов. Экспериментально доказано, что большие дозы никотина могут вызывать в стенках артерий и артериол дегенеративные изменения, относящиеся к аноксическому типу [32].

Отсроченные медицинские эффекты, которые способствуют развитию сердечно-сосудистых заболеваний, связаны с угарным газом и окислительными газами. Доказано, что не только СО и окислительные газы, но и практически все компоненты табачного дыма в той или иной степени способны вмешиваться в обмен веществ и вызывать гиперлипидемию и способствовать развитию дисметаболического синдрома [18].

Данные аутопсийных исследований показали, что активное курение в молодом возрасте способствует формированию в аорте и коронарных артериях сердца жировых пятен и полосок, с последующим образованием атеросклеротических фиброзных бляшек [55]. У молодых взрослых курильщиков отмечается утолщение и повышение жесткости стенок центральных и периферических артерий. [104; 121].

Длительное воздействие табачного дыма ухудшает состояние артерий не только активных, но и пассивных курильщиков [63; 65; 149]. Celermajer DS et al. [65] в своей работе показали, что пассивное курение у подростков и молодых взрослых сопровождается развитием выраженной дозозависимой эндотелиальной дисфункции. Otsuka R et al. [122] рассматривая последствия краткосрочного пассивного курения на функцию эндотелия коронарных сосудов, обнаружили, что 30 минут пассивного воздействия дыма у некурящих привело к ухудшению скорости потока коронарного резерва, причем аналогичные изменения наблюдали и у курильщиков.

Воздействие табачного дыма повышает риск развития ишемической болезни сердца [86; 148] и одним из механизмов множественных сердечно-сосудистых эффектов пассивного курения является эндотелиальная дисфункция [54].

Согласно исследованиям Siason G. et al. [133] усиление оксидативного стресса, повышение адгезии моноцитов и восприимчивость липопротеидов низкой плотности к окислению, выявляемые при курении, обусловливают развитие эндотелиальной дисфункции со снижением содержание оксида азота (NO), необходимого для поддержания кровеносных сосудов в состоянии дилатации и обеспечения неадгезивности эндотелия по отношению к форменным элементам крови. Роль NO в поддержании сосудистого гомеостаза сводится к регуляции сосудистого тонуса, пролиферации и апоптоза, а также регуляции оксидантных процессов. Кроме того, NO присущи ангиопротекторные свойства [13; 15]. NO также ответственен за противовоспалительные эффекты, такие как ингибирование экспрессии молекул клеточной адгезии ICAM-1 (intercellular adhesion molecules-1 - молекулы межклеточной адгезии 1-го типа), VCAM-1 (vascular cellular adhesion molecules-1 - молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа) и тканевого фактора; ингибирование высвобождения хемокинов, таких как МСР-1 (monocytechemoattractant protein-1 - моноцитарный хемотаксический фактор-1). Вдобавок, NO блокирует агрегацию тромбоцитов и оказывает фибринолитический эффект [66].

Нарушение синтеза или функционирования NO в сосудистой системе - важный патогенетический фактор таких заболеваний, как артериальная гипертензия, атеросклероз и диабетическая ангиопатия [59]. Эндотелиальная дисфункция, особенно снижение биодоступности оксида азота эндотелия, является ключевым событием в начале атеросклероза, появляясь задолго до образования структурных атеросклеротических изменений [128]. Оксид азота высвобождается из эндотелиальных клеток в ответ на увеличение напряжения сдвига и некоторые фармакологические раздражители [64]. Оксид азота может функционировать в качестве эндогенного антиатерогенной молекулы путем поддержания низкого артериального тонуса в покое, ингибирования лейкоцит-эндотелиального взаимодействия, ослабления агрегации тромбоцитов и ингибирования пролиферации клеток гладких мышц [64; 69]. Осложнениями, связанными с дефицитом этого соединения, также являются острый инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, атеротромбоз, тромботическая микроангиопатия, тромбоэмболические цереброваскулярные заболевания, преэклампсия [13].

Вместе с тем, курение - потенциально обратимый фактор риска; его прекращение снижает риск развития первого инфаркта миокарда приблизительно на 65%, повторного - на 30%. Принятие в ряде стран законов, запрещающих курение в общественных местах, в течение относительно короткого времени привело к существенному снижению количества острого инфаркта миокарда, например, в 4 регионах Италии всего за 12 месяцев этот показатель снизился на 23% (оценка случайных эффектов - 0,77 (95% доверительный интервал - 0,74-0,82) [105].

1.2 Влияние курения на течение беременности и плод

Хотя негативные последствия курения на течение беременности и на развитие плода хорошо известны, распространенность курения во время беременности по-прежнему высока. Распространенность курения среди беременных в западных странах составляет от 10% до 25% [85; 89]. Курение в период беременности вызывает не только повышение частоты осложнений беременности и внутриутробной смерти плода, риска выкидышей и уменьшение массы тела новорожденных, повышает риск его внезапной смерти, но и сказывается на здоровье ребенка на протяжении первых 7-9 лет жизни, проявляясь отставанием в психическом (развитие дефицита внимания, поведенческие расстройства) и физическом развитии [43; 95; 103].

Nakamoto T. с соавт. [118] на основании результатов эксперимента, проведенного на беременных крысах, вдыхавших сигаретный дым, указывают, что экстракт сигаретного дыма непосредственно повышает чувствительность сократительной активности миометрия в ответ на окситоцин посредством увеличения экспрессии окситоцина-мРНК рецептора, что стимулирует сокращения матки во время беременности, обусловливая развитие невынашивания беременности и повышая риск преждевременных родов.

Данные исследования, проведенного Zdravkovic T. с соавт. [152], показывают, что у беременных наблюдается дозозависимое подавление экспрессии цитотрофобластом L-селектина и его TRA-1-81-реактивных углеводных лигандов, обеспечивающих адгезивные свойства групп клеток, осуществляющих прикрепление плодовой части плаценты к стенке матки, что, по мнению авторов, является одной из причин затруднения наступления беременности и невынашивания ее у курящих женщин.

Xiao D. с соавт. [150], изучая в эксперименте прямые эффекты никотина на сократимость маточной артерии во время беременности, получили данные, свидетельствующие о том, что под воздействием никотина уменьшается эндотелий-зависимая релаксация и увеличивается сократимость маточной артерии, что может быть одним из факторов развития маточно-плацентарной недостаточности и гипотрофии плода.

Результаты исследования Erickson A.C., Arbour L.T. [74] показали, что у женщин, выкуривающих 1-4 сигареты в сутки, риск рождения ребенка с недостаточной массой тела был повышен на 46%, 5-9 сигарет в сутки -- на 92%, >10 сигарет -- в 2,7 раза. Этот же показатель для внутриутробной задержки развития составил 19; 48 и 114% соответственно.

В основе механизма гипотрофии плода у курящих матерей лежит хроническое и острое усиление скорости кровотока в различных сосудистых бассейнах плода, что связано с большей резистентностью сосудов, а также маточных артерий [51; 97; 106]. Повышение резистентности сосудов с последующим снижением кровотока, несмотря на увеличение его скорости, влияет на доставку плоду кислорода и питательных веществ, что обусловливает ограничение рост плода у курящих матерей. Ряд исследований эндотелий-зависимой вазодилатации у небеременных женщин позволяет предположить, что сокращение производства оксида азота, обладающего сосудорасширяющим действием, играет важную роль для снижения кровотока, вызванного курением [63; 64; 65].

NO вырабатывается эндотелиальным внутриклеточным ферментом эндотелиальной NO синтазой (eNOS) при превращении L-аргинина в L-цитруллин. Так как NO выполняет также другие гомеостатические функции у плода, нарушение вазодилатации не может быть единственным механизмом ограничения роста плода у курильщицы. Некоторые исследования показывают, что дефицит NO не связан с ограничением внутриутробного роста плода. Например, у женщин с задержкой внутриутробного развития плода, наблюдается более низкая NO-зависимая поток-опосредованная дилатация и более высокий уровень в плазме асимметричного диметиларгинина, ингибитора еNOS, который конкурирует с L-аргинином, чем у женщин с нормальной беременностью [132]. Кроме того, по сравнению с нормальной беременностью при внутриутробной задержке развития плода отмечается снижение экспрессии еNOS в пупочной артерии и низкая активность еNOS в ворсинах плацентарной ткани [116; 130]. В исследовании Andersen MR et al. [52] было обнаружено снижение активности и концентрации еNOS в пуповинной вене плодов курящих матерей по сравнению с некурящими.

Последствия для плода курения матери зависят не только от дозы, но и триместра беременности, в котором она курила. Согласно исследованиям Jaddoe V. W., Troe E. J. et al. [90], McCowan L. M. et al. [111] курение женщины только во время первого триместра беременности не приводит к увеличению рисков неонатальных осложнений у потомства. Однако, имеются данные, что материнское курение как в первом, так и во втором триместре может повлиять на рост периферических тканей и скелета плода [91; 115]. Некоторые исследования показывают, что никотин уже в первом триместре беременности напрямую влияет на пролиферацию и дифференцировку нервных клеток, тем самым тормозя развитие медиаторных систем плода [75].

В исследовании Taal H., Geelhoed J. J. M. et al. [141] показано, что продолжение курения во время беременности влияет на развитие почек плода, причем выраженность изменений почек зависит от количества сигарет, выкуриваемых беременной. Курение менее пяти сигарет в день сопровождалось увеличением общего объема почек плода, в то время как курение большего количества сигарет приводило к уменьшению объема почек потомства.

В ряде экспериментальных работ указывается на тератогенное и эмбриотоксическое действие никотина и окиси углерода [131; 153]. Другие компоненты сигаретного дыма, в том числе добавки, также оказывают тератогенное или эмбриотоксическое действие на животных, но их влияние на плод человека в значительной степени неизвестны [129].

Вместе с тем, последствия курения матери могут носить неодинаково выраженный характер у потомков, что объясняется, по-видимому, генетической предрасположенностью к тем или иным заболеваниям. Генетические и экологические факторы могут взаимодействовать, что приводит к изменению развития пластичности и эпигенетическим модификациям с аномальной фенотипической экспрессией генетической информации без изменений в нуклеотидной последовательности ДНК. Так в последние годы появились исследования, свидетельствующие о том, что воздействие табачного дыма может вызвать эпигенетические изменения у эмбриона. Это один из механизмов, который обеспечивает в неблагоприятных условиях плода повышение риска заболевания в более позднем возрасте. Курение во время беременности вызывает изменения в метилировании ДНК у плода. Исследование метилирования ДНК в клетках буккального эпителия продемонстрировали значительные изменения у детей с внутриутробным воздействием дыма [60]. Еще одно исследование подтвердило связь между пренатальным воздействием дыма и изменениями метилирования. Был сделан вывод, что существует обратная зависимость доза-ответ между метилированием ДНК и содержанием котинина в сыворотке пуповинной крови [82].

Кроме того, согласно исследованиям Stroud L.R., Papandonatos G.D., Shenassa E. et al. [137] курение в период беременности повышает риск возникновения никотиновой зависимости у будущего ребенка в дальнейшей жизни, что, по мнению авторов, объясняется пренатальным воздействием материнских гормонов стресса, причем данная ассоциация справедлива только в отношении девочек. Авторы предполагают, что ключевую роль в этом играют половые различия в гормональной регуляции плаценты, что приводит к изменению адаптационных механизмов.

1.3 Влияние курения родителей на сердечно-сосудистую систему потомства

В настоящее время в медицинской литературе появился ряд работ, посвященных изучению связи между курением матери во время беременности и послеродового периода и долгосрочными проблемами со здоровьем у потомства, в частности, развитием сердечно-сосудистых заболеваний.

В работе Taylor L. с соавт. [142] указывается, что у детей, рожденных от матерей, куривших во время беременности, в постнатальном периоде обнаружен ряд факторов, способствующих развитию заболеваний сердечно-сосудистой системы в дальнейшем онтогенезе. К ним авторы относят классические факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний (индекс массы тела, липидный профиль, кровяное давление), эндотелиальную дисфункцию (сниженная биодоступность NO, снижение активности еNOS), структурные изменения сосудов (утолщение комплекса интима-медиа), изменения тонуса симпатической и парасимпатической систем (гиперреактивное состояние при рождении, уменьшение частоты сердечных сокращений, снижение реакции на стресс в детском возрасте).

Jaddoe V. W. с соавт. [91] с 1975 по 1993 год и в 2002 году у 350 людей (на начало исследования в возрасте 5-19 лет) ежегодно измеряли уровень общего холестерина, липопротеидов высокой плотности и липопротеидов низкой плотности и обнаружили, что у потомства курящих во время беременности женщин наблюдается выраженная гиперлипидемия, повышение годового роста общего уровня холестерина и тенденция к формированию неблагоприятного липидного профиля по сравнению с потомством от некурящих матерей.

Oken E. с соавт. [119], исследуя вопрос о наличии связи между курением беременных и ожирением, а также уровнем артериального давления у их 3-летних детей, обнаружили, что увеличение индекса массы тела у потомства наблюдалось лишь у женщин, бросивших курить в начале беременности, а у не куривших или бросивших курить до наступления беременности дети имели нормальный вес. В тоже время у бывших курильщиц и женщин, бросивших курить в ранние сроки беременности, у детей наблюдалось повышенное артериальное давление.

Timmermans S. H. с соавт. [144] в своем исследовании показали, что у курящих матерей избыточный вес у детей развивается с возрастом. Начиная при рождении с более низкого веса, дети догоняют его в первый год жизни и к школьному возрасту отличаются избыточной массой тела. Аналогичные результаты получены Mшller S. E. с соавт. [114], однако в их исследовании показано, что перинатальное курение матери увеличивает риск развития избыточного веса у ребенка в возрасте 7 лет независимо от массы тела при рождении, причем более высокое отношение шансов ожирения наблюдалось при курении матери как во время беременности, так и в ранней постнатальной жизни детей.

Durmus B. et al. [72] продемонстрировали, что дети матерей, которые курят только в первом триместре беременность, не имеют риска избыточного веса. Авторы предположили, что вторая половина беременности является критическим периодом для развития постнатального ожирения. В этом же исследовании было показано, что отцовское курение не было связано с ожирением у потомства, что может объясняться отсутствием прямых внутриматочных эффектов.

В ряде исследований [57; 61; 81; 101; 125; 141; 147] показана связь курения матери во время беременности с повышенным систолическим и диастолическим артериальным давлением у потомства, однако их результаты носят противоречивый характер, что объясняется, по-видимому, различиями в структуре исследований, в экспозиции и оценке результатов, определении потенциальных помех. Только в некоторых из этих исследований оценивали зависимость взаимосвязь дозы курения матери с уровнем артериального давления у детей. В исследовании Wen X et al. [147] показано, что в когорте родившихся в 1960-х годах влияние курения матери на систолическое артериальное давление потомства в возрасте 7 лет было сильнее у детей сильно куривших матерей (>20 сигарет в день), чем у менее интенсивно куривших матерей. Brion et al. [61] получили аналогичные данные об эффекте материнского и отцовского курения во время беременности на уровень систолического АД потомства, предполагая, что у обследованных детей. кроме курения родителей, имеется общность экологических и генетических факторов.

Вместе с тем, в исследовании Hogberg et al. [88] приведены данные о том, что систолическое и диастолическое АД у детей, чьи матери курили во время беременности, были выше по сравнению с братьями и сестрами, рожденными из более ранней или более поздней беременности, во время которой матери не курили. Это, по мнению авторов, говорит о том, что повышение уровня АД у потомства курящих матерей обусловлено непосредственно внутриутробными механизмами. Связь между курением во время беременности и повышенным артериальным давлением у детей может быть обусловлена увеличением периферического сосудистого сопротивления, что приводит к снижению кровотока и доставки кислорода. Pichler G. et al. [123], обследуя небольшое количество детей, выяснили, что в первый постнатальный день действительно наблюдается меньшая оксигенация тканей у детей, подвергшихся влиянию курения в период внутриутробного развития.

Различия сердечно-сосудистых исходов, как и кровяное давление, частично генетически детерминированы [139]. Кроме того, курение матери во время беременности само по себе также частично определяется генетически, как было продемонстрировано Agrawal A. et al. [50]. Гены могут взаимодействовать с факторами окружающей среды, например, такими как табачный дым, и во время беременности влиять на развитие сердечно-сосудистой системы потомства. В частности, Lampl M. et al. [100] неоднократно измеряя объем сердца 34 плодов курящих матерей обнаружили уменьшение сердечного роста. В исследовании Tyrrell J. et al. [145] было показано, что генетическая вариация в кластере никотиновых рецепторов изменяет влияние курения матери в период беременности на массу тела новорожденных потомков.

В своем исследовании Taal H. R. et al. [141] обнаружили взаимосвязь отношения доза-эффект материнского курения с повышением диастолическим АД, что может быть связано, по мнению авторов, с воздействием курения на периферическое сосудистое сопротивление, которое в первую очередь влияет на диастолическое АД. Geelhoed J. J. et al. [78] обнаружили, что курение матери во время беременности ассоциировано с повышением фетально-плацентарного артериального сопротивления в третьем триместре беременности. Авторы подчеркивают, что хотя наблюдаемые различия в кровяном давлении были маленькими, они могут прослеживаться от детства к взрослой жизни и быть актуальны на популяционном уровне. Так Power C. et al. [125] показали, что курение матери во время беременности ассоциировалось с более высоким кровяным давлением у взрослых потомков в возрасте 45 лет.

Наряду с кардиоваскулярными рисками для детей в раннем постнатальном периоде, курение беременных оказывает воздействие на состояние тонуса симпатической и парасимпатической систем, регулирующих работу сердечно-сосудистой системы плодов. В работе Cohen G. с соавт. [68] показано, что курение матери во время беременности обусловливает у потомства развитие нарушений симпатической и парасимпатической регуляции с перепрограммированием вегетативных механизмов контроля артериального давления. Гиперреактивность вегетативной нервной системы приводит к аномальному контролю артериального давления, в результате чего развиваются различия сосудистой физиология у детей раннего постнатального возраста, подвергшихся воздействию табачного дыма и детьми контрольной группы.

Эти результаты согласуются с проведенным ранее исследованием Browne C. A. с соавт. [59], которое продемонстрировало гиперреактивность вегетативной функции в первые дни жизни у младенцев, внутриутробно подвергавшихся воздействию табачного дыма. Viskari-Lahdeoja и др. [146] также обнаружили изменение вегетативного ответа при боковых движениях у детей в возрасте 10-16 недель в виде снижения подъема частоты сердечных сокращений и артериального давления по сравнению с контрольной группой. По данным иследования Slykerman R. F. с соавт. [136] у детей, рожденные от матерей, которые курили во время беременности, в возрасте 12 месяцев в 2 раза чаще наблюдались признаки задержки неврологического развития. Вместе с тем, Cohen G. с соавт. [68] подчеркивают, что дети, принимавшие участие в исследованиях, подвергаются воздействию табачного дыма не только во время беременности, но и во время первого года жизни, что делает трудноразличимым определение являются ли обнаруженные изменения вегетативной системы следствием долгосрочного перепрограммирования из-за предыдущего опыта в утробе матери, или они отражают продолжающееся воздействие табака.

Курение беременной обеспечивает негативное воздействие никотина, окиси углерода, свободных радикалов и других токсинов, содержащиеся в табачном дыме, на систему мать-плацента-плод. Это воздействие включает морфофункциональные изменения плаценты, нарушения пуповинного кровообращения, прямое воздействие на фетальное кровообращение, в том числе сатурацию гемоглобина, прямое воздействие на клетки сосудистой стенки плода [51; 53; 79; 134].

Воздействие на плод токсических веществ, содержащихся в табачном дыму, который вдыхают матери, могут обусловливать возникновение сосудистого ущерба на ранних этапах жизни потомства. Никотин проникает через плаценту, причем его уровень у новорожденных зависит от уровня курения матерей [56], вызывает сужение кровеносных сосудов, что приводит к уменьшению плацентарного кровотока и снижению уровня кислорода у плода [99], обусловливая недостаточную гемодинамическую стимуляцию развития плацентарной и фетальной сосудистых систем, что в дальнейшем онтогенезе может сопровождаться повышением артериального давления и другими сердечно-сосудистыми изменениями [77; 135].

Содержащиеся в табачном дыму другие токсины, такие как оксид углерода и кадмий, также могут приводить к снижению плацентарного и плодового кровотока, нарушению сердечно-сосудистой адаптации [101; 131]. Оксид углерода быстро всасывается в кровь, где он связывается с гемоглобином и образует карбоксигемоглобин, что вызывает хроническую гипоксию плода, которая, по данным Sartiani L et al. [131], оказывает отрицательное воздействие на формирование и созревание сердечно-сосудистой системы.

Кроме того, хроническая гипоксия, вызванная поступлением в кровь оксида углерода, обусловливает уменьшение продукции оксида азота эндотелием сосудов плода [52; 78]. В исследовании Kallio K. et al. [96] у 11-летних детей курящих матерей обнаружена гипофункция эндотелия, которая играет важную роль в развитии раннего атеросклероза. Кроме того, среди механизмов развития эндотелиальной дисфункции большое значение придается индукции системного воспаления. В ряде исследований доказано прямое проатерогенное действие С-реактивного белка, способного нарушать функцию эндотелия, и документировано повышение его уровня в сыворотке крови у потомства при пассивном курении [70; 92; 110]. По данным Raitakari O. T. et al. [126] дисфункция эндотелия, связанная с пассивным курением, может быть только частично обратима после прекращения его воздействия.

Кадмий, как известно, способен накапливаться в плаценте и ингибировать активность 11в-гидроксистероиддегидрогеназы типа 2 в клетках трофобласта. Снижение активности этого фермента, необходимого для метаболизма кортизола, может привести к торможению роста плода и сосудистой дисадаптации [117].

Как было сказано выше, курение беременной сопровождается низким весом новорожденных, что является одним из факторов сердечно-сосудистого риска в последующей жизни. Martyn C. N., Greenwald S. E. [109] обнаружили у маловесных плодов снижение синтеза эластина в стенках аорты и крупных артерий, что, по мнению исследователей, может привести к постоянным изменениям в механических свойствах этих сосудов с повышением их резистентности и сопровождаться повышенным артериальным давлением и гипертрофией левого желудочка, которые являются факторами риска для развития сердечно-сосудистых заболеваний и внезапной смерти [84].

Koklu E. et al. [98], проводя ультразвуковое исследование аорты 40 новорожденных с внутриутробной задержки роста, обнаружили, что максимальная и средняя толщина комплекса интима-медиа аорты у них были значительно выше (0,58±0,06; 0,52±0,03 мм, соответственно), чем в контрольной группе (0,44±0,05, 0,40±0,03 мм, р<0,0001, р<0,0001 соответственно), а тем более при сопоставлении с массой тела при рождении (максимальная толщина комплекса интима-медиа: 0,23±0,03 мм/кг против 0,12±0,02 мм/кг, р <0,0001; средняя толщина комплекса интима-медиа: 0,21±0,02 мм/кг против 0,11±0,01 мм/кг, р <0,0001).

В исследовании Oren A. et al. [120] показано, что в молодом возрасте утолщение комплекса интима-медиа наблюдается у тех, кто родился с внутриутробной задержкой развития, а в послеродовом периоде имел избыточный вес, что также наблюдается у потомства курящих женщин.

Geelhoed J. J. с соавт. [78], проводя ультразвуковое исследование установили, что у беременных, куривших ? 5 сигарет в день в третьем триместре наблюдалось повышение резистентности маточных артерий, а также пуповинной и средних мозговых артерий плода, уменьшением фетальных потока крови и диаметра восходящей части аорты. В постнатальном периоде у этих детей в двухлетнем возрасте были обнаружены признаки сердечной дисфункции.

Geerts C. C. с соавт. [80] проводя ультразвуковое исследование толщины и эластичности сонных артерий 259 детей в возрасте 4 недель, а затем в возрасте 5-ти лет, матери которых ежедневно курили, будучи беременными, установили, что артерии этих детей в возрасте 5-ти лет были значительно толще и жестче, чем у детей, чьи матери не курили. Наибольшая толщина артерий была у детей, у которых курили оба родителя. А вот у детей, чьи матери не курили в период беременности, но вернулись к данной привычке после рождения детей, артерии толще не становились. Специалисты также утверждают, что существует четкая корреляция между количеством выкуренных беременной сигарет в течение дня и развитием неблагоприятных сосудистых изменений у детей. Обнаруженные у детей изменения сосудистой стенки, по мнению исследователей, могут в дальнейшей жизни повышать риск развития у них сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, более выраженные изменения сосудов у детей обнаруживались при курении обоих родителей.

Данные аутопсийных наблюдений детей, умерших от синдрома внезапной детской смерти, показывают, что воздействие табачного дыма во время беременности приводит к структурным изменениям стенки дыхательных путей и атерогенным изменениям коронарных артерий потомства [73; 110; 112].

Matturri L. et al. [110] проводя патогистологическое исследование эпикардиальных коронарных артерий 36 новорожденных, умерших от синдрома внезапной детской смерти, в 67% случаев обнаружили ранние мультифокальные атеросклеротические поражения, варьировавшие от очаговых бляшек с умеренным утолщением интимы и мышечного слоя до формирующихся мягких бляшек, суживающих просвет сосуда. Авторами отмечена значительная корреляция между ранними атеросклеротическими поражениями и такими факторами риска как курение родителей и искусственное вскармливание, причем поражение сосудов носило более выраженный и диффузный характер при сочетании обоих атерогенных факторов.

Milei J. et al. [112] при гистологическом и иммуногистохимическом исследовании коронарных артерий мертворожденных и новорожденных, погибших от синдрома внезапной детской смерти, обнаружили у 10 из 12 плодов, и у 15 из 16 новорожденных курящих матерей мультифокальные атеросклеротические изменения в диапазоне от умеренного утолщения мышечного слоя и интимы сосудов в пренатальном периоде до мягких бляшек у детей с проникновением гладких мышечных клеток в субэндотелиальный слой. Иммуногистохимически в гладкомышечных клетках медии наблюдалась активация гена c-fos, некоторые миоциты находились в состоянии апоптоза. Авторы предполагают, что сверхэкспрессия c-fos может стимулировать пролиферацию этих клеток, что подтверждается наличием гладкомышечных миоцитов с позитивной реакцией ядерного антигена пролиферирующих клеток. Аналогичные изменения артерий детей некурящих матерей авторы наблюдали только в пяти случаях (у двух из 10 плодов и трех из 20 детей) (р<0,001).

В экпериментальном исследовании Gunes T. et al. [83] оценивалось гистологическое строение аорты новорожденного и 45-дневного потомства крыс, получавших никотин во время беременности и лактации. Авторами обнаружены преатеросклеротические изменения аорты, что выражалось достоверным утолщением комплекса интима-медиа в исследуемых группах по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, возвращаясь к вышеизложенному, следует отметить, что воздействие табачного дыма во внутриутробном периоде приводит к сердечно-сосудистой реконструкции у детей в начале жизни с вероятностью развития заболеваний сердечно-сосудистой системы в дальнейшем онтогенезе, что обусловливает необходимость комплексного изучения кровеносных сосудов потомства при табакокурении родителей.

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперимент взяты молодые половозрелые (3мес.) крысы линии Вистар, содержащиеся в стандартных условиях вивария. Сформированы «семейные пары»: 1) «курили» только самки-матери; 2) «курили» только самцы-отцы; 3) «курили» самцы и самки, т.е. оба родителя; 4) контрольная группа крыс - интактные. Моделирование табакокурения осуществляли с использованием специальной камеры, достаточной по объему для свободного перемещения, в которой распределялся табачный дым Ѕ тлеющей сигареты одной из марок украинского производителя. «Курящие» животные выдерживались в камере на протяжении 15 минут ежедневно в течение 1 месяца до зачатия (самцы и самки) и на протяжении беременности самок. Эта модель табакокурения используется довольно часто, имеет охранный документ (приоритетная справка № 3991837 от 13.12.1985 г.Держкомвинахід), позволяет получить потомство.

Животные контрольной группы помещались в аналогичную камеру без дыма на аналогичное время. Из новорожденных крысят сформированы гр. К (интактные), гр. М (потомки «курящих» матерей), гр. О (потомки «курящих» отцов), и гр. МО (оба родителя «курили»).

Оказалось, самым многочисленным пометом был помет в К группе - 10,5 особей, самым малочисленным - в М группе - 5,4 особей, большим, чем в М группе, но меньшим, чем в группе интактних, - в МО группе - 7,8 особей. Распределение потомков по полу при табакокурении животных-матерей или обоих родителей имеет особенность в виде доминирование потомков женского пола (м:ж = 0,8:1) по сравнению с К группой и О группой (1,1: 1).

Количество крысят, взятых в исследование, и их пол в каждой группе указаны в табл. 2.

Таблица 2.1 Количество новорожденных крысят и их пол

Группы крыс	Самцы	Самки	Всего
Гр. К	17	18	35
Гр. М	18	17	35
Гр. О	19	16	35
Гр. МО	18	17	35

Часть новорожденных крысят (по 5 самцов и самок в каждой группе) була оставлена для продолжения эксперимента до 2-х месячного возраста потомков.

Новорожденные и 2-х месячные крысы-потомки были выведены из эксперимента путем декапитации.

Содержание животных и манипуляции с ними проводили в соответствии с положениями Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), Устава Украинской ассоциации по биоэтике, нормы CLP (1992) и типового положения по вопросам этики, регламентированного приказом МОЗ Украины от 23 сентября 2009г., №690.

Биохимические исследования

Для биохимических исследований осуществляли забор крови, выделяли грудной отдел аорты и фрагмент проксимального участка бедренной артерии.

2.1 Приготовление гомогенатов стенок сосудов

Сосуды после извлечения перфузировали охлажденным физиологическим раствором, замораживали в жидком азоте, измельчали до порошкообразного состояния, гомогенизировали в 0,2М трис-CHl буфере (рH 7,4) на холоде. Приготовленный гомогенат использовали в биохимических исследованиях.

2.2 Определение содержания эндотелина-1 и эластина

В сыворотке крови и гомогенатах сосудов определяли содержание эндотелина-1 иммуноферментным методом с помощью наборов реагентов фирмы DRG (Германия). Содержание эластина в гомогенатах сосудов определяли иммуноферментным методом с помощью наборов реагентов фирмы Bender med system (Австрия).

2.3 Метод определения коллагена в стенке сосудов

Содержание коллагена в стенках сосудов определяли по оксипролину методом, описанным Т. В. Замаревой [17], который является модификацией метода Stegemaun. Принцип метода. Оксипролин окисляется 7% водным раствором хлорамина Т на ацетат - цитратном буфере (рН 6,0) до соединения, близкого по строению к пирролу, которое конденсируется с реактивом Эрлиха (пара-диметиламинобензальдегид) с образованием продукта, окрашенного в красный цвет. Интенсивность окраски определяют на спектрофотометре при длине волны 558 нм. Количество оксипролина в пробах рассчитывают по калибровочной кривой, полученной на основании разведений стандартного раствора оксипролина.

Коллагеновые белки экстрагировали из тканей, подвергали гидролизу в стеклянных запаянных ампулах в 6N растворе соляной кислоты в течение 8 часов при 100 єС. Гидролизаты белков упаривали в фарфоровых чашках на водяной бане и дважды промывали дмстиллированной водой для удаления остатков HCl, Сухой остаток растворяли в точном объеме воды. 0,2мл раствора использовали для определения количества оксипролина. По содержанию оксипролина в пробе рассчитывали концентрацию коллагена.[136а].

2.4 Метод определения NO-синтазной активности

NO-синтазную активность в сыворотке крови и гомогенатах сосудов определяли спектрофотометрическим методом по приросту концентрации нитритов и нитратов в реакционной смеси, содержащей 50мМ КН2РО4 (рН 7,0), 1 мМ MgCl2, 1мМ НАДФН2 и 2мМ CaCl2 ((для измерения активности эндотелиальной NO-синтазы) или 4мМ ЭДТА (для связывания эндогенного кальция при измерении активности индуцибельной NO-синтазы) втечение 15 минут при температуре 37єС. Принцип метода. NO-синтаза катализирует превращение L-аргинина в цитрулин и оксид азота (NO), NO -нестабильная молекула, которая превращается в нитрит и нитрат. Содержание нитритов и нитратов определяют по методу L. Green с помощью реактива Гриса. Содержание нитритов пропорционально активности NO-синтаз.