Изучение специфических и токсикологических свойств сульфапорина

Суммируя вышесказанное, можно выделить следующие вероятные механизмы атерогенного действия гомоцистеина:

- прямое повреждение клеток эндотелия;

- повышение содержания продуктов перикесного окисления липопротеинов;

- повышение тромбоксанзависимой агрегации тромбоцитов;

- ингибирование экспрессии тромбомодулиан и активации С-протеина;

- повышение связывания липопротеинов с фибрином;

- ускорение пролиферации гладкомышечных клеток;

- инактивация оксида азота.

Остается открытым вопрос, является ли гипергомоцистеинемия самостоятельным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний или повышение уровня гомоцистеина является следствием других состояний, предрасполагающих к развитию ССЗ. Необходимо решить вопрос о целесообразности и способах коррекции этого состояния.

Механизм развития атеросклеротического поражения сосудов при гипергомоцистеинемии остается до конца не ясным. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что продукты аутоокисления гомоцистеина, протекающего с образованием активных форм кислорода, индуцируют формирование атеросклеротической бляшки путем повреждения эндотелия, нарушения целостности сосудистой стенки и стимуляции пролиферации гладкомышечных клеток медии [85].

Воздействие гипергомоцистеинемии на формирование атеросклероза, как правило, осуществляется совместно с другими, в том числе и более значимыми, факторами риска (гиперлипидемия, курение, АГ). Имеются сообщения о том, что в ряде случаев назначение антигиперлипидемических препаратов приводит к увеличению концентрации плазменного гомоцистеина. У пациентов с гиперхолестеринемией лечение фенофибратом приводило к повышению концентрации гомоцистеина в плазме крови в среднем на 46% [75].

Таким образом, воздействие, направленные на устранение одних факторов риска, могут приводить к усилению воздействия других.

1.3 Производные хитозана в качестве гиполипидемических средств

Главной особенностью современной фармакотерапии атеросклероза является борьба с факторами риска, дислипидемией и тромбозом [70]. Лечение обычно начинают с назначения гиполипидемических средств (ГЛС), которые по механизму действия делятся на несколько групп:

1) препараты, тормозящие всасывание холестерина в кишечнике: секвестранты желчных кислот, ситостерин, гуарем.

2) препараты, препятствующие образованию атерогенных липопротеидов: производные фибровой кислоты, никотиновая кислота, вастатины (статины), пробукол.

3) физиологические корректоры липидного обмена, содержащие эссенциальные фосфолипиды и ненасыщенные жирные кислоты: эссенциале, липостабил.

Хитозан - природный полисахарид (пищевое волокно), получаемый из панциря красноногого краба.

Долгое время пищевые волокна считались ненужным балластом, от которого старались освободить продукты питания для повышения их пищевой ценности. Сегодня ученые доказали, что дефицит пищвых волокон является фактором риска возникновения таких заболеваний, как ожирение, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, аппендицит, желчекаменная болезнь, хронические запоры, варикозное расширение вен, тромбоз вен низних конечностей и раковые заболевания.

Обогащение рациона питания хитозаном восстанавливает биологическое равновесие путем очищения организма и регуляции обменных процессов.

Хитозан снижает уровень холестерина в крови, насыщает сердечную мышцу энергией, укрепляет стенки кровеносных сосудов, снимает неприятные ощущения в области сердца. Хитозан связывает и выводит из организма излишки желчных кислот, соли тяжелых металлов, радионуклиды, токсичные вещества, а также хитозан усиливает внутрикишечный синтез витаминов В₁, В₂, В₃, РР и фолиевой кислоты.

Внутри организма хитин разлагается на шесть низкомолекулярных глюкозоминов, поэтому он может подавлять раковые клетки. Хитозан подавляет токсин раковых клеток, оживляет лимфатические клетки, способные уничтожить раковые клетки. Хитозан препятствует перемещению клеток, пораженных раком.

Механизм действия наиболее активной растворимой части хитозана. При приеме внутрь, в отличие от большинства видов растительной клетчатки, под воздействием пищеварительных ферментов активная часть Хитозана расщепляется и всасывается в виде низкомолекулярных соединений. В организме человека хитозан оказывает следующее действие:

1. В процессе жизнедеятельности раковых клеток вокруг них создается более кислая среда, что препятствует активности клеток иммунной системы по идентификации и уничтожению измененных раковых клеток. Препарат подавляет размножение раковых клеток путем регуляции pH среды тканей организма в сторону слабощелочной - при которой активность Т-лимфоцитов наибольшая.

2. Препятствует метастазированию раковых клеток.

3. Адсорбирует недоокисленные продукты обмена злокачественных клеток, что является одной из составляющих раковой интоксикации.

4. Снижает артериальное давление путем регуляции уровня холестерина придотвращения развития атеросклероза.

5. Снижает уровень сахара в крови у больных с избыточным весом, то есть дейсвует как профилактическое средство при риске развития сахарного диабета.

6. Улучшает микроциркуляцию тканей, во-первых, действуя как чистильшик сосудов, во-вторых, снимая спазм в мельчайших капиллярах.

7. Повышает функциональную активность иммунной системы за счет активизации лимфоцитов.

8. Адсорбирует и выводит из организма соли тяжелых металлов, минеральные удобрения, химические красители, радионуклиды, лекарственные метаболиты и прочее.

9. Активизирует дренажные функции на уровне межклеточного пространства и лимфатической системы.

СОСТАВ: хитин - 15%, хитозан - 85%. Имеет высокую степень очистки - 85%. Имеет высокую степень очистки - 85%. В упаковке 100 капсул.

ДЕЙСТВИЕ: по свойствам похож на человеческий фибрин, при приеме внутрь часть вещества всасывается в кровь в виде низкомолекулярных соединений, другая часть превращается в гелеобразную массу, действуя как мощный сорбент. Всосавшаяся часть подавляет раковые клетки, регулируя pH, подавляет раковую интоксикацию, препятствует метастазированию, блокирует так называемые коньюгационные молекулы, с помощью которых происходит метастазирование; соединяется с желчной кислотой (с помощью которой происходит всасывание холестерина), выводит ее и неизменный холестерин с каловыми массами. Будучи положительно заряжен, препятствует усвоению любых жиров, имеющих отрицательный заряд, снижает кровяное давление, соединяясь с ионом хлора из поваренной соли, выводит его препятствуя образованию ангиотензина - вещества, вызывающего резкий спазм сосудов; снижает уровень сахара в моче, улучшает микроциркуляцию тканей, адсорбирует и выводит соли тяжелых металлов. Нормализует артериальное давление.

Уникальные свойства хитина и хитозана привлекают внимание большого числа специалистов самых разных специальностей. Роль полимеров в нашей жизни является общепризнанной, и все области их применения в быту, промышленном производстве, науке, медицине, культуре трудно даже просто перечислить. Если до XX века человеком использовались полимеры природного происхождения - крахмал, целлюлоза (дерево, хлопок, лен), природные полиамиды (шелк), природные полимерные смолы на основе изопрена - каучук, гуттаперча, то развитие химии органического синтеза в XX веке привело к появлению в различных областях деятельности человека огромного разнообразия полимеров синтетического происхождения - пластмасс, синтетических волокон и т.п. Происшедший технологический прорыв не только кардинально изменил нашу жизнь, но и породил массу проблем, связанных с охраной здоровья человека и защитой окружающей среды.

Поэтому закономерным является большой интерес науки и промышленности к поиску и использованию полимеров природного происхождения, таких как хитин и хитозан. Эти полимеры обладают рядом интереснейших свойств, высокой биологической активностью и совместимостью с тканями человека, животных и растений, не загрязняют окружающую среду, поскольку полностью разрушаются ферментами микроорганизмов, могут широко применяться в проведении природоохранных мероприятий.

В настоящее время известно более 70 направлений использования хитина и хитозана в различных отраслях промышленности, наиболее важными из которых во всем мире признаны: медицина - в качестве средства борьбы с ожирением, связывания и выведения из организма холестерина, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, производства хирургических нитей, искусственной кожи, лекарственных форм антисклеротического, антикоагулянтного и антиартрозного действия, диагностики и лечения злокачественных опухолей и язвы желудка; пищевая промышленность - в качестве загустителя и структурообразователя для продуктов диетического питания.

История создания и применения хитозана

Полимеры этой группы заинтересовали ученых-химиков почти 200 лет назад. Хитин был открыт в 1811 году (H. Braconnot, A. Odier), а хитозан в 1859 году (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 году (F. Hoppe-Seyler). В первой половине XX века к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности, к нему имели отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fischer (1903) cинтезировал глюкозамин, P. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Haworth (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина.
Биологически активные свойства хитина и его производного - хитозана - начали изучаться в 1940-50 годах. В Советском Союзе эти исследования проводились учреждениями Министерства обороны и имели закрытый характер. Последнее было связано со способностью хитозана эффективно связывать радиоактивные изотопы и тяжелые металлы, поэтому хитозан исследовался прежде всего как эффективный радиопротектор и детоксикант, а также исследовались возможности применения его для дезактивации объектов, подвергавшихся радиоактивному заражению.

Новый всплеск интереса к производным хитина и, в частности, хитозану произошел в 70-е годы, когда результаты исследований этих соединений начали появляться в открытой печати. Проведенные во всем мире исследования показали уникальные сорбционные свойства хитозана. Обнаружилось отсутствие выраженной субстратной специфичности этого вещества, что означает примерно одинаковую способность связывать как гидрофильные, так и гидрофобные соединения. Кроме того, у хитозана были обнаружены ионообменные, хелатообразующие и комплексообразующие свойства. В дальнейших исследованиях была показана антибактериальная, антивирусная и иммуностимулирующая активность. Комплексные формы хитозана также проявляют высокие антиоксидантные свойства, что нашло свое применение в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, в лечении механической и ожоговой травмы.

О большом интересе к проблемам изучения этих биополимеров, технологии их получения и использования свидетельствуют восемь международных конференций по хитину и хитозану, проведенных за последние 27 лет: США (1977), Япония (1982), Италия (1985), Норвегия (1988), США (1991), Польша (1994), Франция (1997).

В России за прошедшие годы хитину и хитозану были посвящены семь конференций: Владивосток (1983), Мурманск (1987), Москва (1991, 1995, 1999 и 2001), Санкт-Петербург 2003, из которых две последних имели статус международных. Весной 2000 года было создано Российское Хитиновое Общество, объединившее более 50 региональных отделений. Все это говорит о нарастающем интересе к хитину и хитозану не только химиков, но и специалистов самого разного профиля - медиков, биологов, микробиологов и биотехнологов.

Химическое строение и свойства хитина и хитозана

Хитин является главным компонентом панцирей ракообразных и насекомых. По химической структуре он относится к полисахаридам, мономером хитина является N-ацетил-1,4-в-D-глюкопиранозамин.

При деацетилировании хитина получается хитозан. По химической структуре хитозан является сополимером D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. В зависимости от эффективности реакции деацетилирования получаются хитозаны с различной степенью деацетилирования . Степень деацетилирования показывает процентное содержание D-глюкозамина в молекуле хитозана, т.е. если речь идет о хитозане со степенью деацетилирования 85%, то это означает, что в молекуле хитозана в среднем содержится 85% D-глюкозаминовых остатков и 15% N-ацетил-D-глюкозаминовых остатков.

Химические свойства хитозана связаны с его химической структурой. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле хитозана определяет его свойство связывать ионы водорода и приобретать избыточный положительный заряд, поэтому хитозан является прекрасным катионитом. Кроме того, свободные аминогруппы определяют хелатообразующие и комплексообразующие свойства хитозана. Сказанное объясняет способность хитозана связывать и прочно удерживать ионы металлов (в частности радиоактивных изотопов и токсичных элементов) за счет разнообразных химических и электростатических взаимодействий.

Большое количество водородных связей, которые способен образовать хитозан, определяют его способность связывать большое количество органических водорастворимых веществ, в том числе бактериальные токсины и токсины, образующиеся в толстом кишечнике в процессе пищеварения.

С другой стороны, обилие водородных связей между молекулами хитозана приводит к его плохой растворимости в воде, поскольку связи между молекулами хитозана более прочные, чем между молекулами хитозана и молекулами воды. Вместе с тем, хитозан набухает и растворяется в органических кислотах - уксусной, лимонной, щавелевой, янтарной, причем при набухании он способен прочно удерживать в своей структуре растворитель, а также растворенные и взвешенные в нем вещества. Хитозан также способен связывать предельные углеводороды, жиры и жирорастворимые соединения за счет гидрофобных взаимодействий и сетчатой структуры, что сближает его по сорбционным механизмам с циклодекстринами.

Расщепление хитина и хитозана до N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина происходит под действием микробных ферментов - хитиназ и хитобиаз, поэтому они полностью биологически разрушаемы и не загрязняют окружающую среду.

Таким образом, хитозан является универсальным сорбентом, способным связывать огромный спектр веществ органической и неорганической природы, что определяет широчайшие возможности его применения в жизни человека.

Несмотря на огромную литературу о связи сорбционных свойств хитозана с его химической структурой, нельзя сказать, что исследования в области химии хитина/хитозана близки к завершению. Постоянно открываемые новые свойства этого вещества, в частности, обнаруженная биологическая активность еще не получила должного объяснения с точки зрения химической структуры. Имеющиеся данные, что характер биологической активности хитозана зависит от его молекулярного веса и степени деацетилирования, нуждаются в дальнейшей проверке и изучении. Этот обзор является тем более актуальным, что выяснение связи химического строения и биологической активности позволит создавать вещества, сохраняющие известные свойства хитозана и обладающие новыми полезными качествами.

В отечественной литературе есть информация о синтезе четвертичных аммониевых соединений хитозана с применением органических оснований, и исследования, посвященные свойствам полученных соединений Для синтеза применялись перегнанные сухие метил- и этилиодид. Йодистоводородную кислоту, образующуюся во время реакции, связывали органическими основаниями: пиридином, 2,4-лутидином, 2,4,6-коллидином и триэтиламином. Полученное соединение выделяли из реакционной смеси фильтрованием, отмывали метанолом, сушили.

Было установлено, что рКа хитозана 6.30. Был сделан вывод, что повышение степени N-алкилирования будет наблюдаться при использовании оснований с рКа > 6.30. Опыты показали, что наиболее глубоко реакция идет в присутствии триэтиламина, рКа которого гораздо выше, чем у хитозана. Установлено, что N-триметил- и N-триэтилхитозаны являются полиэлектролитами и их основность увеличивается с ростом степени замещения [48].

В настоящее время для коррекции нарушений в иммунной системе при различных патологиях (инфекционные болезни, злокачественные новообразования, соматические, хирургические и др. заболевания) применяются вещества растительного происхождения или полученные синтетическим путем. Ранее экспериментально на различных моделях вторичных иммунодефицитов (острый и хронический токсический гепатит, опухоленосительство, лучевая болезнь, гемолитическая анемия и др.) были изучены биологические свойства веществ, выделенных из лимфоидных и лимфоидных органов разных видов животных и птиц, таких как овца, черепаха, верблюд, цыплята. Изучено их действие на иммунную и кроветворную систему на органном и клеточном уровнях.

Большой научный и практический интерес представляет изучение полисахаридных соединений, выделенных из хитина различных видов организмов. В настоящее время химически охарактеризован ряд полисахаридов, полученных из хитина куколок тутового шелкопряда[ 54] месте с тем в литературе практически отсутствуют сведения, касающиеся изучения действия природных полисахаридов, в частности хитозана и его комплексов с микроэлементами, на иммунную систему при вторичных иммунодефицитных состояниях различной этиологии. Важным аспектом исследований является сравнительное изучение в эксперименте иммунотропных свойств металлосодержащих комплексов хитозана при опухоленосительстве, острых патологиях печени, гемолитической анемии, лучевой болезни. Решение этих вопросов позволит в перспективе разработать новые малотоксичные высокоэффективные иммуномодулирующие лекарственные препараты, как для лечения, так и для профилактики различных иммунодефицитных состояний [66].

Сульфат хитозана (СХ) проявляет выраженную антикоагулянтную активность и может быть использован в качестве, заменителя природного антикоагулянта крови гепарина, дорогостоящего и дефицитного продукта, извлекаемого, главным образом, из слизистых оболочек и других органов животных. Однако широко применяемый антикоагулянт прямого действия, нефракционированный гепарин обладает рядом побочных нежелательных эффектов, таких как остеопорозы, тромбоцитопении, геморрагические осложнения и т.д. В настоящее время в мировой практике паоказано, что низкомолекулярные гепарины и гепариноиды имеют ряд преимущество перед инфракционированным гепарином.

Как отмечалось выше, СХ, обладая антикоагулянтной активностью, имеет перед гепарином преимущество не только в меньшей стоимости, но и в возможности направленного изменения его строения и свойств в процессе синтеза.Принципиально получение низкомолекулярного СХ может быть осуществлено разными путями: испошльзованием в качестве исходного сырья низкомолекулярного хитозана, снижением молекулярной массы препарата в ходе синтеза, деполимеризации и фракционированием получаемого продукта [58].

Современные медикаментозные средства борьбы с таким распространенным заболеванием, как гиперхолестеринемия, вызывающим нарушение деятельности сердечно-сосудистой, эндокринной и других систем организма человека, предусматривают использование либо лекарственных препаратов, либо энтеросорбентов - биологически активных добавок к пище.

Действие первых, например ингибиторы липаз Ксеникала, основано на нарушении естественного цикла переваривания пищи и усвоения липидов, действие вторых - на сорбции ТГ и (или) отдельных классов липидов ЖКТ человека. Очевидно первый путь наиболее опасен для здоровья человека.

Полисахарид хитин и особенно его дезацитилированная производная - хитозан зарекомендовали себя как наиболее перспективные энтеросорбенты из класса природных пищевых волокон, так как они не только сорбируют липиды, но и реагируют липидный обмен, снижая уровень ХС в крови, выводят из организма ионы тяжелых и переходных металлов и радионуклеидов, повышают иммунитет [52].

На основе хитина и хитозана были созданы целые серии БАД к пище, обладающие липотропным действием.

Хитозан обладает на порядок более высокими сорбционными свойствами в отношении ионов металлов, ТГ и жирных кислот, чем хитин. Однако из-за растворимости хитозана в желудке не исключена опасность проникновения его низкомолекулярной фракции через стенки ЖКТ в кровоток. Кроме этого, установлено его отрицательное действие на естественную микрофлору кишечника [47] и способность снижать кислотность желудка, что нежелательно для людей с пониженной и нормальной кислотностью.

Многими исследователями показано, что хитин содержащие материалы существенно превосходят по эффективности связывания липидов (5-10 раз) в другие полисахариды, понижают уровень ЛПНП и ТГ и увеличивают концентрацию ЛПВП в крови [25].

Таким образом, хитозан является универсальным сорбентом, способным связывать огромный спектр веществ органической и неорганической природы, что определяет широчайшие возможности его применения в жизни человека. Хитозан, растворимый в кислых растворах, имеет широкие возможности для применения в различных отраслях народного хозяйства и, в частности, в медицине.

В литературе имеются единичные сведения о низкой токсичности Сульфопарина и его использование в медицине в эксперименте на лабораторных животных. Однако нет сведений о характере и выраженности повреждающего действия Сульфопарина на организм экспериментальных животных и оценки его безопасности.



Глава 2. Материал и методы исследования

2.1 Объекты исследования

Объект исследований - Сульфопарин препарат, предназначенный для использования в качестве противосклеротического средства. Разработано лекарственное соредство Сульфопарин в Институте химии и физики полимеров АНРУз. Для этой цели в работе были использован сульфат хитозана - рабочее название препарата «Сульфапорин», полученный реакцией сульфатирования хитозана в среде хлорсульфоновой кислоты. Образование сульфата хитозана установлено по данным элементного анализа, степень сульфатирования определена методом кондуктометрического титрования. ИК-спектроскопическими исследованиями и рентгеноструктурным анализом установлена структура сульфапорина [8].

специфическое гиполипидемическое действие двух концентраций сульфата хитозана (препарат 1 - 500 МЕ/кг и препарат 2 - 1000 МЕ/кг) было исследовано на модели экспериментального атеросклероза. Исследования проведены на 46 кроликах породы Шиншилла весом 2,5-3,0 кг. Модель гиперхолестеринемии воспроизведена внутрижелудочным введением холестерина в растительном масле ежедневно в течение 3 месяцев по 200 мг/кг массы тела. Через 3 месяца от начала эксперимента кролики были разделены на 4 группы: 1 группа - контрольная (8 кроликов), которым продолжали вводить холестерин в подсолнечном масле; 2 группа (сравнение) - 8 кроликов, которым после создания гиперхолестеринемии каждый день в течение 2 месяцев вводили по 100 мг/кг гиполипидемический препарат гемфибразил; 3 и 4 группы - по 8 кроликов, которые после создания гиперхолестеринемии получали по 0,25 мл/кг препарат-1 и -2. Липидный спектр сыворотки крови исследовали на 90 и 150 сутки от начала эксперимента.

Токсикологические исследования проведены на различных видах лабораторных животных обоего пола: на 80 белых мышах, 212 белых крысах, и 27 кроликах.

2.2 Методы исследований

Определение общего холестерина, проводили на анализаторе фирмы «Human» (Германия) с использованием специальных наборов и программ. Содержание ХС в ЛПВП определяли в надосадке после осаждения ХС ЛПНП и ЛПОНП гепарином в присутствие ионов Mn²⁺ [9]. Содержание холестерина, входящего в состав ЛПНП и ЛПОНП, рассчитывали по формуле А.И. Климова [10].

Острую внутрижелудочную токсичность препарата изучали на 60 белых мышах обоего пола с массой тела 18-22 г. Животных разделили на 6 групп по 10 особей в группе. Животным 5 опытных групп натощак вводили водный раствор препарата в желудок при помощи шприца с металлическим зондом (игла с тупым концом) в дозах: 1000; 1500; 2000; 2500; 3000 мг/кг массы тела. Большие дозы препарата вводили в два приема с интервалом в 1 час. Животные находились под ежечасным наблюдением в течение первого дня эксперимента в лабораторных условиях и в дальнейшем в динамике в течение 2-3 недель. Учитывали внешний вид и поведение животных, состояние шерстяного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к пище, подвижность, ритм и частоту дыхания. Обращали внимание на время возникновения и характер интоксикации, оценивали её тяжесть, обратимость, определяли срок гибели животных. На основании полученных данных при помощи статистической обработки методом В.Б. Прозоровского вычисляли величины ЛД₅₀ [1,2,3,7]

При оценке токсичности препарата учитывалась максимально-переносимая и абсолютно-смертельная дозы. Расчет ошибки ЛД₅₀ проведен по одному из наиболее распространенных методов, предложенных Миллером и Тейтнером, определением ЛД₄, ЛД₈ и ЛД₁₆. Разность между этими дозами равна величине двух средних квадратичных ошибок.

Шестая группа животных служила контролем. Все экспериментальные животные содержались в одинаковых условиях вивария на сбалансированном рационе питания по содержанию белков, жиров и углеводов со свободным доступом к воде и пище.

Изучение кожно-резорбтивного действия препарата «Сульфопарин» проводили на 6 белых крысах с массой тела 140-160 грамм, которых фиксировали в специальных станках, хвосты животных погружали в пробирки с исследуемым препаратом на 2/3 длины хвоста. Пробирки помещали в водяную баню с температурой 28-30° С. Время экспозиции 4 часа. После окончания эксперимента кожу хвостов обмывали теплой водой с мылом. За животными проводили наблюдение в течении 3-х недель.

Исследования однократного местно-раздражающего действия препарата «Сульфопарин» проводилось на 6 белых крысах с массой тела 130-145 грамм, которым на выстриженный участок кожи размером 2x2 см наносили препарат в виде раствора. Животных фиксировали в течение 4-х часов. Реакция кожи регистрировалась по окончании экспозиции через 1 и 16 часов после аппликации.

Исследования многократного местно-раздражающего действия препарата «Сульфопарин» на кожу проводились на 10 белых крысах с массой тела 130-140 грамм, которым на выстриженный участок кожи размером 2x2 см наносили препарат в виде раствора ежедневно 1 раз в сутки в течении 20 дней. Животных фиксировали в течение 4-х часов. Реакция кожи регистрировалась по окончании экспозиции через 1 и 16 часов после аппликации.^ Другие 20 белых крыс служили контролем. Критериями токсичности служили: поведение животных, выживаемость, время наступления смертельных исходов, появление симптомов интоксикации, местные изменения на коже Эмбриотоксичность и терратогенность Сульфопарина была изучена на 300 белых беспородных крысах самках. Исследование влияния Сульфопарина на репродуктивную функцию крыс проведено на 30 самцах и 60 самках массой 160-180 г

Полученные результаты исследований подвергали статистической обработки. Использовались методы вариационной статистики с расчетом средней арифметической изучаемого показателя (М), среднего квадратического отклонения, стандартой ошибки среднего (т), относительных величин (%); статистическая значимость, полученных измерений, при сравнении средних величин определяли по критерию Стьюдента (I) с вычислением вероятности ошибки (Р) при проверке нормальности распределения (по критерию эксцесса) и равенства генеральгных дисперсий (Р - критерий Фишера). За статистически значимые изменения принимали уровень достоверности Р < 0,05.



3. Результаты собственных исследований

3.1 Экспериментальное обоснование эффективности применения производных хитозана в лечении гиперхолестеринемий

Проведенные эксперименты показали, что 3-х месячное экзогенное введение подопытным животным холестерина сопровождалось серьезными сдвигами в изучаемых показателях липидного обмена (табл. 3.1). Так, содержание общего ХС в сыворотке крови достоверно увеличивалось в 1,55 раза. Поскольку одним из ведущих факторов риска развития атеросклероза является не только повышение уровня холестерина, а прежде всего, атерогенный сдвиг в липопротеидном спектре крови, поэтому в эксперименте исследовались изменения содержания ХС в ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП. Экзогенное введение холестерина кроликам в течение 90 дней привело к увеличению содержания холестерина в ЛПОНП в 2,06 раза (Р<0,001), в ЛПНП - в 2,09 (Р<0,001) раза, в то время как ХС в ЛПВП снизился в 1,85 (Р<0,01) раза. Полученные результаты показывают, что экспериментальная гиперхолестеринемия характеризуется изменением содержания ОХС и нарушением содержания холестерина в липопротеиновом спектре крови.

В настоящее время есть все основания считать ЛПВП антиатерогенной. Уменьшение количества ЛПВП является фактором, способствующим развитию атеросклероза. Наряду с этим увеличение содержания ХС в ЛПНП способствует развитию атеросклероза. Единой теории, объясняющей антиатерогенное действие ЛПВП или их предшественников, нет. Однако твердо установлено, что низкое содержание ЛПВП отражает состояние, способствующее развитию атеросклероза, и наоборот, высокий их уровень - состояние, препятствующее развитию атеросклероза и ИБС. Наиболее опасна для организма ситуация, когда высокий уровень ЛПНП или ЛПОНП сочетается с низким содержанием ЛПВП [9]. Ключевым в атеросклеротическом воспалении считается снижение рецепторного поглощения клетками ЛПНП из-за блокады, уменьшения числа рецепторов и других причин. Его прямые следствия - накопление в крови и тканях, прежде всего в стенке артериальных сосудов ЛПНП с дефицитом в клетках эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот. Многочисленные клинические и популяционные исследования подтвердили, что, активируя синтез ХС в клетках, повышается уровень ХС в липопротеинах крови и интерстициальной среде.

Таблица. Влияние гиполипидемических препаратов на некоторые показатели липидного спектра сыворотки крови кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией (М±m)

Группы	Общий холестерин, ммоль/л	ХС ЛПВП, ммоль/л	ХС ЛПНП, ммоль/л	ХС ЛПОНП, ммоль/л
Интактная	4,82±0,07	1,68±0,06	2,71±0,16	0,33±0,02
Контрольная	7,49±0,25а	0,91±0,09 а	5,67±0,17 а	0,68±0,05 а
Гемфибразил	5,53±0,17 а,б	1,57±0,12 б	4,16±0,13 а,б	0,47±0,02 а,б,
Сульфапорин-500	4,28±0,11а,б,в	1,36±0,11 б,в	3,44±0,22 а,б,в	0,32±0,01 б,в
Сульфапорин-1000	3,27±0,21а,б,в,г	1,75±0,04 б,г	2,59±0,13 б,в,г	0,27±0,02 б,в

Примечание:

а - различия от интактной группы, б - от контрольной,

в - от группы гемфибразила,

г - от сульфапорина-500 достоверны, Р<0,05.

Коррекция экспериментальной гиперхолестеринемии в течение 2 месяцев гиполипидемическими препаратами оказала позитивное влияние на показатели липидного обмена. Содержание общего ХС достоверно снижается в 1,35 (Р<0,05); 1,75 (Р<0,01) и 2,29 раза (Р<0,001), соответственно в группах, получавших гемфибразил, сульфапорин-500 и сульфапорин-1000, по сравнению с контрольной группой. При этом уровень ХС ЛПНП снизился в 1,36 (Р<0,05); 1,65 (Р<0,05) и 2,19 (Р<0,01) раза, соответственно группам. Содержание ХС в ЛПОНП также снизилось в 1,45 (Р<0,05); в 2,13 (Р<0,01) и 2,52 раза (Р<0,001), а ХС в ЛПВП возрос в 1,72 раза (Р<0,05), а при введении сульфапорина-500 и сульфапорина-1000 это повышение составило в 1,49 (Р<0,05) и 1,92 раза (Р<0,01), соответственно, по сравнению с животными контрольной группы.

Однако гемфибразил оказывал более слабое позитивное влияние на липопротеидный спектр сыворотки крови. Полученные нами данные перекликаются с литературными, в которых показано, что механизм действия фибратов связан увеличением активности рецепторов, захватывающих ЛПНП, однако оно проявляется слабо. С другой стороны, фибраты снижают активность ГМГ-СоА-редуктазы и тем самым тормозят синтез ХС в печени лишь при длительном применении. Препарат эффективен при низком ХС ЛПВП, повышенном ХС ЛПНП и гипертриглицеридемии (IIВ, IV, V типы дислипопротеинемии) без признаков коронарной болезни. Из побочных действий наиболее выраженным является поражение мышечной системы, образование холестериновых камней.

При введении сульфапорина в различных концентрациях по сравнению с гемфибразилом статистически достоверно снизился уровень ХС в ЛПОНП и ЛПНП, соответственно повысился уровень ХС в ЛПВП, приближаясь к нормативным величинам, что свидетельствует о более высоком гипохолестеринемическом действии препарата. Хитозан обладает биосовместимостью с живыми тканями (не вызывает аллергических реакций и отторжения); биодеградируемостью (разлагается под действием ферментов); биоинертностью (не токсичен, легко выводится из организма); бактериостатичностью (тормозит рост и размножение бактерий) [11]. Благодаря своей уникальной поликатионитной фибриллярной структуре, хитозан обладает хорошей адгезией; способностью поглощать холестериновый комплекс низкой плотности. В настоящее время накоплен обширный материал по исследованию хитина, хитозана и их производных, в частности, особый интерес представляет водорастворимое производное хитозана - сульфат хитозана, который может использоваться для получения биологически активных соединений, обладающих антикоагулянтным, антисклеротическим и противовирусным действием, а также повышенной способностью специфично связывать ЛПНП из крови.

Таким образом, на основание полученных данных можно сказать, что в отличие от гемфибразила, сульфапорин обладает выраженным гипохолестеринемические действием на модели гиперхолестеринемии. Его гипохолестеринемические свойства зависят от концентрации и превосходят фибратов. Сульфапорин достоверно снижает высокий уровень холестерина в липопротеидах низкой и очень низкой плотности, повышает низкие его значения в липопротеидах высокой плотности у кроликов с гиперхолестеринемией.

3.2 Результаты исследования острой и хронической токсичности сульфапорина

Проведенный эксперимент показал, что у животных 1-ой группы после введения водной раствор препарата в дозе 1000 мг/кг массы тела животных изменений в поведении и функциональном состоянии не наблюдалось. Однако, с увеличением дозы животные становились вялыми, малоподвижными, живо реагировали на внешние раздражители: громкий звук, стук по столу, раздражение хвоста. Аппетит у животных нарушался, некоторые из них отказывались от пищи, вид животных становился неопрятный, шерсть взъерошенной. Гибель животных наступала от остановки дыхания. На таблице 3.2 представлена зависимость сроков гибели животных от вводимой дозы препарата «Сульфопарина».



Таблица 3.2. Зависимость сроков гибели белых мышей от вводимой дозы препарата Сульфопарина

Доза препарата, в мг/кг м.т.	Количество животных в группе	Сроки гибели	Всего погибло	Процент гибели
		В течение 1-х суток	В течение 3-х суток	В последующие дни
1000	10	0	0	0	0	0
1500	10	0	1	1	2	20
2000	10	0	3	1	4	40
2500	10	1	4	1	6	60
3000	10	2	7	1	10	100

Определены максимально-переносимая доза препарата на уровне 1000 мг/кг м.т. и абсолютно-смертельная доза - на уровне 3000 мг/кг. Параметры острой токсичности препарата «Сульфопарин» при однократном внутрижелудочном введении белым мышам представлены в таблице 5.3.

Таблица 5.3. Параметры острой токсичности препарата «Сульфопарин» при однократном внутрижелудочном введении белым мышам, мг/кг.

Наименование вида животных	ЛД16	ЛД50	ЛД84
Белые мыши	1450	2150(2425,4-1874,6)	2800

Средне-смертельная доза (ЛД₅₀) препарата «Сульфопарин» - 2150 (2425,4-1874,6) мг/кг. Следовательно, по классификации лекарственных средств по токсичности препарат «Сульфопарин» относится к малотоксичным веществам (IV класс) [1,2,3].

Оценивая токсичность лекарственных соединений нельзя полностью полагаться на данные острых опытов, так как установлено, что вещества малотоксичные при разовом введении могут оказаться высоко опасными при повторном воздействии на организм. Хроническое отравление возможно в случае материальной или функциональной кумуляции веществ в организме [1,2]. Изучение кумулятивных свойств Сульфопарина было проведено по Лиму, позволяющее оценить не только кумуляцию, но и привыкание. Опыты были проведены на 10 мышах обоего пола массой тела - 18-20г. Продолжительность эксперимента 28 дней.

Препарат вводили внутрижелудочно по следующей схеме (табл.3.4).

Таблица 3.4. Схема введения препарата «Сулььфопарин»

Дни введения	Число животных	Доля от ЛД50	ЛД50 = 2150мг/кг
1-4	0/10	0,1	215,0
5-8	0/10	0,15	322,5
9-12	0/10	0,22	473,0
13-16	0/10	0,34	731,0
17-20	0/10	0,50	1075,0
21-24	1/10	0,75	1612,5
25-28	3/10	1,15	2472

К_к = ЛД_50п / ЛД₅₀₁

где К_к - коэффициент кумуляции, ЛД_50п- средняя смертельная доза при п - кратном введении, ЛД₅₀- средняя смертельная доза при однократном введении. Установлено, что К_к> 1 - привыкание; К_к< 1 -кумуляция. Следовательно, Сульфопарин не обладает кумулятивным действием.

Параметры хронической токсикометрии Сульфопарина ранее не были изучены, что и послужило основанием для проведения исследований. Токсикологические исследования Сульфопарина проводили на 80 белых крысах с массой тела 110-120 грамм, которые внутрижелуд очно ежедневно в течение 3-х месяцев получали водные растворы препарата. Животные были разбиты на 4 группы по 20 животных в группе.

1-ая группа животных получала Сульфопарин в дозе 500 мг/кг; 2-ая группа получала Сульфопарин в дозе 100,0 мг/кг; 3-ья группа получала Сульфопарина в дозе 25 мг/кг; 4-ая группа служила контролем.

Показателями токсичности служили: поведение животных, выживаемость, время наступления смертельных исходов, появление симптомов интоксикации, динамика массы тела, содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови, активность щелочной фосфатазы, АСТ и АЛТ, каталазы. Исследования показателей проводили после завершения эксперимента.

Содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови исследовали классическим, общепринятым; активность ферментов щелочной фосфатазы, АСТ, АЛТ в сыворотке крови - биотестами фирмы Лахема (Чехия).

Исследования физиологических и биохимических показателей проводили после завершения эксперимента.

За время эксперимента общее состояние опытных животных не нарушалось, симптомов интоксикации не выявлено, гибели животных не было. На коже местных изменений не обнаруживалось, мест очагового облысения и язв не отмечалось. Животные были опрятны, шерстяной покров гладкий, блестящий, корм охотно поедали, активны, адекватно реагировали на внешние раздражители.

Как видно из данных, представленных в таблице 5.5, статистически достоверных отставаний прироста массы тела у всех опытных животных по сравнению с контрольными животными - не установлено.

Изучена динамика содержания гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови, которая не выявила статистически значимых различий у животных опытной группы по сравнению с контрольными данными (табл. 5.6).

Таблица 5.5. Динамика массы тела белых крыс при внутрижелудочном многократном введении в течение 3 -х месяцев Сульфопарина в различных дозах, г.

Наименование групп животных	Стат. показатели	Время исследований (месяцы)
		Фон	1	2	3	Восст. период
Контроль	М±м	140±4,1	148±4,3	157±4,2	165±7,6	173±7,9
Сульфопарин, Доза 500 мг/кг	М±мР	142±6,6 >0,05	151±Ю,1 >0,05	159±7,8 >0,05	164±6,1 >0,05	171±6,5 >0,05
Сульфопарин, Доза 1 00 мг/кг	М±мР	141±9,9 >0,05	149±12,2 >0,05	155±4,8 >0,05	167±5,8 >0,05	170±7,2 >0,05
Сульфопарин, доза 25,0 мг/кг	М±мР	143±7,9 >0,05	147±5,6 >0,05	158±7,2 >0,05	163±4,9 >0,05	174±7,4 >0,05

Таблица 5.6. Содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови белых крыс после внутрижелудочного введения в течение 3-х месяцев Сульфопарина

Наименование групп Животных	Статист, показатели	Гематологические показатели
		Содержание гемоглобина, г/л	Содержание эритроцитов, г/л	Содержание лейкоцитов, г/л
Контроль	М±м	127,0 ±5,8	4,90±0,19	8,09±0,3
Сульфопарин, доза 500 мг/кг	М±мР	130,0 ±5,5 >0,05	4,87 ± 0,25 >0,05	8,16±0,31 >0,05
Сульфопарин, доза 100 мг/кг	М±мР	129,0 ±3,6 >0,05	4,85 ± 0,44 >0,05	8,17±0,17 >0,05
Сульфопарин, Доза 25,0 мг/кг	М±мР	131,0±9,1 >0,05	4,82 ± 0,4 >0,05	8,14±0,32 >0,05

Данные изучения биохимических показателей сыворотки крови опытных и контрольных животных представлены в таблице 5.7.



Таблица 5.7. Биохимические показатели сыворотки крови белых крыс после внутрижелудочного введения в течение 3 -х месяцев Сульфопарина

Наименование групп животных	Стат. показатели	Биохимические показатели
		Активность щелочной	Активность АСТ, ммоль/л.ч	Активность АЛТ,	Активность каталазы, Мкат/л
		фосфата-зы, моль/л.ч		ммоль/л.ч
Контроль	М±м	0,37±0,01	0,31±0,02	0,23±0,025	23,01±2,14
Сульфопарин, доза 500 мг/кг	М±мР	0,34±0,01 >0,05	0,33±0,04 >0,05	0,21±0,019 >0,05	20,05±1,36 >0,05
Сульфопарин, доза 1 00 мг/кг	М±мР	0,35±0,01 >0,05	0,35±0,06 >0,05	0,19±0,017 >0,05	22,04±1,49 >0,05
Сульфопарин, доза 25,0 мг/кг	М±мР	0,38±0,02 >0,05	0,30±0,04 >0,05	0,22±0,013 >0,05	21,04±1,16 >0,05

Полученные данные, у опытных животных по изучению активности ферментов щелочной фосфатазы, АСТ, АЛТ и каталазы в крови не отличались от контрольных значений. Из данных, представленных в таблице 5.7, видно, что статистически достоверные различия в активности изученных ферментов в крови опытных крыс по сравнению с контрольными результатами, не установлены.

Анализ функционального состояния почек крыс через 3 месяца после в/ж введения Сульфопарина в дозах 500,0 мг/кг массы тела, 100,0 мг/кг массы тела и 25,0 мг/кг массы тела показал, что диурез опытных крыс не отличался статистически от контрольных крыс. Состояние азотистого обмена, критерием которого служит содержание мочевины в крови, не имело отклонений от контроля. Сахар и белок в моче как в опытной, так и контрольной группы отсутствовали в течении всего эксперимента. Кислотность мочи во всех изученных группах не изменилась в течении всего опыта и её кислотность (рН) составила 7,0 (табл. 5.8).

Таблица 5.8. Некоторые показатели функции почек у подопытных и контрольных крыс, через 3 месяца после в/ж введения Сульфопарина в дозах 500,0 мг/кг, 100,0 мг/кг и 25,0 мг/кг массы тела

Группы животных	Доза препарата мг/кг	Диурез через 4 часа, %	Мочевина крови, ммоль/л
1 .Контроль	0	91±1,6	4,6±0,13
2. Сульфопарин	500,0	90±1,3 Р>0,05	4,7±0,12 Р>0,05
3. Сульфопарин	100,0	89±1,88 Р>0,05	4,8±0,13 Р>0,05
4. Сульфопарин	25,0	89±1,45 Р>0,05	4,5±0,31 Р>0,05

Примечание: Р>0,05 по отношению к контролю

Патологических изменений в содержании осадков мочи не обнаружено. Получаемые результаты позволяют сделать вывод и том, что препарат не оказывает токсического действия на функции почек.

Таким образом, установлено, что Сульфпарин не обладает токсическим эффектом во всех изученных дозах.

Общий осмотр тел животных белых крыс после внутрижелудочного введения в течение 3-х месяцев Сульфопарина показал отсутствие макроскопически распознаваемых отклонений по сравнению с животными контрольной группы. Все животные имели правильное телосложение, опрятный вид, блестящий шерстяной покров, очагов облысения или язв не обнаружено. Видимые слизистые оболочки влажные, бледно-розового цвета, блестящие и гладкие на вид. Масса внутренних органов белых крыс при макроскопическом патологоанатомическом исследовании при вскрытии животных после окончания эксперимента показало, что изменений у опытных животных не выявлено (табл. 5.9).

Таблица 5.9. Масса внутренних органов белых крыс после внутрижелудочного введения втечение 3 -х месяцев Сульфопарина, г.

Наименование групп животных	Печень	Почки	Селезенка	Сердце	Головной мозг	Легкие
Контроль	46,78	7,50	4,81	4,35	10,02	12,1
Сульфопарин, доза 500 мг/кг	46,75	7,44	4,90	4,31	10,23	12,3
Сульфопарин, доза 100 мг/кг	46,70	7,48	4,94	4,32	10,20	12,4
Сульфопарин, доза 25,0 мг/кг	46,79	7,46	4,92	4,36	10,21	12,6

Таким образом, проведенный комплекс токсикологических, физиологических и биохимических исследований позволяет сделать вывод о том, что хроническое внутрижелудочное воздействие Сульфопарина в дозах 500,0 мг/кг, 100,0 мг/кг и 25,0 мг/кг массы тела не вызывают интоксикации и не оказывают негативного воздействия на организм экспериментальных животных.



3.3 Результаты аллергологических и сенсибилизирующих свойств сульфапорина

При нанесении на кожу препарата «Сульфопарин» преследовалась цель выяснить, обладает ли вещество кожно-резорбтивным, местно-раздражающим действием приодно- и многократном воздействии.

Оценка кожно-резорбтивного действия препарата «Сульфопарин» Результаты проведенных исследований на белых крысах показали, что за время наблюдения в течении 3-х недель симптомов интоксикации у опытных животных и их гибели не выявлено. Животные оставались активными, охотно поедали корм, адекватно реагировали на внешние раздражители. Следовательно, препарат «Сульфопарин» токсичным кожно-резорбтивным действием не обладает.

Оценка однократного и многократного местно-раздражающего действия препарата «Сульфопарин» на кожу. При одно- и многократном нанесении на кожу белых крыс на выстриженный участок препарата «Сульфопарин» установлено, что вещество не вызывает раздражения кожных покровов, симптомов интоксикации и гибели животных не отмечено.

Таким образом, определено, что препарат «Сульфопарин» местно-раздражающим действием не обладает.

Оценка однократного местно-раздражающего действия препарата «Сульфопарин» на слизистые оболочки глаз. В конъюнктивальный мешок левого глаза 3-х кроликов однократно вносили 2 капли раствора препарата «Сульфопарин». Правый глаз служил контролем. При внесении оттягивали внутренний угол конъюнктивального мешка глаза, закапывали препарат, а затем в течение 1 минуты прижимали слезноносовой канал. Наблюдение проводили в течении 7 дней. За весь период наблюдения раздражения не выявлено. Состояние век, склеры, роговицы и ширина зрачка опытного левого глаза не отличались от правого контрольного.

Следовательно, препарат не обладает раздражающим действием на слизистые оболочки глаз.

Исследование сенсибилизирующих свойств препарата Сульфопарина. Конъюнктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случаев даже позволяет выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах.

Опыт был поставлены на 10 кроликах, массой 2,5-3,0 кг, которым в левый глаз закапывали 0,01 и 0,1% раствор препарата, во второй глаз (контрольный)вводили 1 каплю физиологического раствора. Реакцию учитывали через 15 минут (быстрая реакция) и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) и оценивали по следующей шкале(в баллах) [4]:

1 - легкое покраснение слезного протока;

2 - покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;

3 - покраснение всей конъюнктивы и склеры.

Кроме того, учитывали степень гиперемии, отечность, лакримацию. Результаты наблюдений показали, что Сульфопарин ни через 15 минут, ни через 24 и 48 часов не вызывает даже легкого покраснения.

На основании этого можно сделать заключение, что препарат Сульфопарин в 0,1% и 0,01% концентрациях не обладает раздражающим действием.

Анафилактический шок. В опыт было взято 30 морских свинок массой 220±20 г. По 6 в каждой группе (5 групп). Морским свинкам вводили препарат Сульфопарин внутримышечно в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг.

Сенсибилизацию проводили по следующей схеме: первая инъекция подкожно; две последующие - внутримышечно, через день в область бедра. Разрешающая инъекция - внутривенно на 21 день после сенсибилизирующей инъекции (2мг/кг и 20 мкг/кг).

После разрешающей инъекции наблюдение вели на протяжении 30 минут. Его тяжесть оценивали в индексах по шкале W.О.Weigll.

Выраженность анафилаксии после внутривенного введения препарата Сульфопарин соотносилась с результатами, зафиксированными в группе морских свинок, подготовленных к шоку (3 группа). 100%-я гибель животных в данной группе наступила в результате подкожного введения 0,1 мл лошадиной сыворотки за 3 недели до разрешающей дозе 0,3 мл (положительный контроль, 3-я группа).

Одновременно разрешающую дозу испытуемого вещества вводили животным, которым вместо сенсибилизирующих инъекций препарата был введен соответствующий объем физиологического раствора - отрицательный контроль(4-я и 5-я группа).

В течении периода эксперимента и после введения разрешающей дозы в опытных группах и группах «отрицательного» контроля изменений в весе, температуре, а также поведении не обнаружено. Препарат Сульфопарин в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг не вызывает анафилактического шока.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа - ГЗТ. В опыт было взято 24 морских свинок массой 220±10 г, по 6 в каждой группе (4-я группа). Животных опытных групп сенсибилизировали однократно введение в подушечки 4-х лапок препарата в смеси с полным адъювантом Фрейда (ПФА) в объеме 0,5 мл в соотношении 1:1. Препарат вводили в дозах 1 и 10 мкг/кг (1 и 2группа). Контрольным животным аналогичным способом вводили ПФА (3 и 4 группы). На 21-й день опыта животным на выстриженной участок кожи спины внутрикожно вводили разрешающую дозу препарата (2 и 20 мкг/кг) в объеме0,05мл. Через 1, 6, 24 и 48 часов определяли реакции кожи. Реакцию кожи визуально оценивали в баллах по следующей схеме:

0 - видимой реакции нет

1 - бледно-розовая эритема по всему участку или его периферии

2 - ярко - розовая эритема по всему участку или его периферии

3 - красная эритема по всему участку

4 - инфильтрация и отек кожи

5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления.

Сульфопарин в дозах 1 и 10 мг/кг не вызывал каких-либо реакции на выстриженном участке поверхности кожи морских свинок, что позволит сделать вывод о том, что Сульфопарин не вызывает гиперчувствительности замедленного типа.

Метод накожных аппликаций. Опыт был проведен на 10 морских свинках массой 220±10 г, по 5 в каждой группе. На выстриженный участок кожи боковой поверхности ближе к середине туловища, наносили по 3 капли 0,1% (1 группа) и 1% (2 группа) раствор препарата, приготовленного на физиологическом растворе. Препарат наносили на протяжении 4-х недель по 5 раз в неделю.

Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале кожных проб, приведенных выше. Этот эксперимент позволяет выявить опасность развития не аллергического контактного дерматита в зависимости от дозы препарата. Исследование сенсибилизирующего действия Сульфопарина проводили путем 20 повторных аппликаций. Первое тестирование проводили через 10 аппликаций и при отрицательном результате число аппликаций доводили до 20.