Изучение воздействия препарата Селекартен на сетчатку (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

изучение воздействия препарата селекартен на сетчатку (экспериментальное исследование)

14.00.08 - глазные болезни

03.00.13 - физиология

Швецова Надежда Евгеньевна

Москва 2008

Работа выполнена в ФГУ «Московском научно-исследовательском институте глазных болезней имени Гельмгольца Росмедтехнологий» (директор - доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Нероев В.В.).

Научные руководители:

доктор медицинских наук ИВАНОВ Андрей Николаевич

кандидат биологических наук ЦАПЕНКО Ирина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор КОРНИЛОВСКИЙ Игорь Михайлович

доктор медицинских наук, профессор СЕВЕРИН Александр Евгеньевич

Ведущая организация: ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С. Н. Федорова Росмедтехнологий»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук ФИЛАТОВА И.А.

Общая характеристика диссертации

Актуальность темы

Исследования последних десятилетий показали, что процесс свободнорадикального окисления липидов клеточных мембран структур глаза играет существенную роль в патогенезе многих глазных заболеваний. Практически нет такой офтальмологической патологии, при которой не было бы установлено усиления свободнорадикальных процессов (Л.Ф. Лазаренко, 1982). Интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) доказана при глаукоме, катаракте, аутоиммунных увеитах, кератитах различного генеза, кератоконусе, прогрессирующей близорукости, ретинопатии разнообразной этиологии, внутриглазных кровоизлияниях (Р.А. Гундорова, Л.Д. Далгат, А.Д. Ромащенко с соавт., 1981; М.А. Бабижаев, А.А. Шведова, Ю.В Архипенко с соавт., 1985; В.С. Рыкун, Ю.Ф. Майчук, 1988; А.Я. Бунин, А.А.Филина, В.П. Еричев, 1992; Н.И. Курышева, М.И. Винецкая, В.П. Еричев с соавт., 1996; Е.Н. Иомдина, З.К. Болтаева, М.И. Винецкая с соавт., 2001; Л.А. Голуб, 2004; и др.; J.V. Fecondo, R.C. Augusten, 1983; K.C. Bhuyan, D.K. Bhuyan, S.M. Podos, 1986; M. Babizhayev, 1989; F. Simonelli, A. Nesti, M. Pensa at. al., 1989; W.G. Christen, 1994; S. Ishimoto, G.S. Wu, S. Hayashi at. al., 1996).

Известно, что любая травма органа зрения сопровождается нарушением нормального кровообращения и вследствие этого недостаточным питанием внутриглазных структур с развитием воспалительных и дегенеративных изменений тканей внутренних оболочек глаза. Это является причиной низких функциональных результатов даже при сохранном переднем отделе глазного яблока (В.В. Кашников, 2000; Р.А. Гундорова, В.В. Кашников, В.В. Нероев, 2005; В.В. Кашников, 2007). Повреждение органа зрения приводит к сдвигам в иммунном статусе и метаболическим нарушениям в тканях глаза (активацией процессов ПОЛ клеточных мембран, увеличением активности протеолитических ферментов и т.д.) (А.В. Степанов, И.Б. Федорович, 1993). Детальные исследования процессов ПОЛ выявили их усиление после получения энергетической (лазерной) травмы глаза (А.В. Степанов, 1991).

Поскольку через хрусталик на сетчатку концентрируется интенсивный световой поток, и наружная сетчатка экспонируется к среде с высоким содержанием кислорода, в тканях глаза вероятность свободнорадикального повреждения наиболее велика для структур заднего отдела глазного яблока. В мембранных структурах сетчатки более половины фосфолипидов содержат полиеновые жирнокислотные остатки, восприимчивые к атаке липидными радикалами и активными формами кислорода (А.А. Шведова, 1986). Такая комбинация внешних и внутренних факторов среды идеальна для развития фотоокислительного стресса и последующего оксидативного повреждения ретинальных нейронов (В. Е. Каган, В. З. Ланкин, А. А. Шведова с соавт., 1979). Учитывая высокую потенциальную чувствительность клеток сетчатки и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) к действию прооксидантных факторов, исключительно важным является поддержание нормального состояния антиокислительной системы тканей глаза (M. Castillo, J. Bellot, et al., 2002). Поэтому одним из перспективных направлений в лечении многих глазных заболеваний, а также посттравматической ретинальной патологии является применение антиоксидантной терапии для нормализации обменных процессов в сетчатке и повышения ее репаративной способности.

Несмотря на большой спектр используемых в офтальмологической практике препаратов антиоксидантного действия (эмоксипин, аскорбиновая кислота, рибофлавин, альфа-токоферола ацетат, аскорутин, метилметионин, липоевая кислота, глутаминовая кислота, бета-каротин, Гинкго билоба, Диквертин, парааминобензойная кислота - ПАБК, гистохром и т.д.), поиск лекарственных форм не только с антиоксидантными, но и ретинопротекторными свойствами, пригодных для местного применения, остается актуальной проблемой. При травмах глаза данный вопрос наименее изучен.

В настоящее время активно разрабатываются препараты, биологически-активные добавки, содержащие селен (Se) - незаменимый микроэлемент, обладающий целым рядом свойств и известный своей высокой антиоксидантной активностью (A. Tappel, K. Caldwell, 1966; V. N. Gladyshev, 2001; L. Dolph Hatfield, Marla J. Berry et al., 2006). Важным является создание новых комплексных глазных форм, усиливающих положительное действие селена на ткани глаза, и в то же время исключающих возможные отрицательные эффекты микроэлемента, поскольку установлено, что селен в больших дозах токсичен для организма (А.М. Манаков, 1968). селекартен сетчатка лазерный сосуд

В 60-х годах прошлого века было обнаружено, что в сетчатке глаза имеется значительное количество селена (H.Taussky, 1961; H. Taussky, 1964; M.J. Siren, 1964). Причем у наиболее остро видящих животных содержание селена в сетчатке максимально (Ю.А. Золотов, 2003). Также установлено, что селен является необходимым звеном в цепи фотохимических превращений, составляющих основу первичного механизма зрительного акта (А. И. Джафаров и др., 1974). В ранних единичных работах по изучению влияния селена на сетчатку, выявлено длительное и эффективное повышение световой чувствительности глаза экспериментальных животных по данным электроретинографии при однократном подкожном и ретробульбарном введении селенита натрия в нетоксичной дозе (Г.Б. Абдуллаев и др., 1972). Авторы предположили, что основное воздействие этот микроэлемент оказывает на процессы, связанные с фотохимическими превращениями родопсина.

Учитывая выше сказанное, важным является изучение полезных для тканей глаза свойств новой формы препарата, содержащего селен, - Селекартен (СК). В эксперименте на кроликах и крысах с подострым токсическим поражением печени А.К. Холовым (2005) было показано, что СК обладает выраженным гепатопротекторным действием, проявляет антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства, увеличивает скорость ферментативной утилизации липоперекисей, стабилизируя активность малонового диальдегида и гидроперекисей липидов как в сыворотке крови, так и в ткани печени животных. В работе автор отмечает, что Селекартен нетоксичен для организма животных при используемых им концентрациях и формах его введения. Тем не менее, воздействие Селекартена на ткани глаза не изучалось, а многообразие функций препарата делает актуальным исследование эффективности его применения в офтальмологии, в том числе в комплексном лечении посттравматических изменений сетчатки.

Известно, что основой правильного лечения заболеваний сетчатки служит своевременная диагностика патологических изменений на глазном дне. Учитывая тот факт, что данные электрофизиологических исследований часто имеют определяющее значение в ранней и дифференциальной диагностике ретинальных нарушений (М.В. Зуева, И. В. Цапенко, 1993), для изучения влияния Селекартена на морфофункциональное состояние сетчатки необходимо проведение комплексных клинико-функциональных и морфологических исследований, с широким спектром электроретинографических исследований. Анализ динамики ретинального электрогенеза позволит оценить характер и топографию ретинальных нарушений, а также выявить наиболее лабильные к гипоксии структуры сетчатки, их реакцию на введение селеносодержащего препарата.

Целью работы явилось изучение воздействия препарата Селекартен на структуру и функцию сетчатки при различном характере лазерного повреждения в эксперименте.

Для достижения цели поставлены и решены следующие задачи исследования:

1. Изучить действие препарата Селекартен на функциональную активность и анатомическую структуру здоровой сетчатки кролика, а также зависимость эффекта от формы введения препарата.

2. Определить возможность накопления селена в тканях глаза кроликов на фоне инстилляций препарата Селекартен.

3. Оценить характер развивающихся изменений в сетчатке и динамику ретинального электрогенеза при экспериментальном моделировании ретинальной ишемии.

4. Изучить антиокислительный и антипротеолитический статус слезной жидкости при создании ишемии сетчатки и на фоне лечения препаратом Селекартен.

5. С помощью клинико-функциональных и морфологических исследований оценить эффективность терапевтического действия препарата Селекартен на течение восстановительного периода после лазеркоагуляции ретинальных сосудов в эксперименте.

6. Изучить эффективность применения Селекартена при очаговом повреждении сетчатки лазерным излучением в зависимости от формы его введения на основании результатов клинико-функциональных и морфологических исследований.

Научная новизна исследования

1. Впервые изучено действие Селекартена на интактную сетчатку кролика при различных формах его введения с помощью электроретинографических исследований. Установлено, что СК вызывает повышение функциональной активности сетчатки; инстилляции препарата в разведении 1:15 сбалансированным физиологическим раствором (СФР) не оказывают токсического действия на ткани глаза экспериментальных животных и являются оптимальной формой его введения.

2. Выявлено накопление селена во влаге передней камеры и ретино-хориоидальном комплексе кроликов при инстилляциях Селекартена методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП), что свидетельствует о его проникновении через гематоофтальмический барьер и возможности использования инстилляционной формы СК для повышения местной антиоксидантной защиты сред и тканей глаза.

3. Для исследования механизмов терапевтических эффектов Селекартена при развитии патологических состояний, сопровождающихся сосудистыми нарушениями в сетчатке, впервые разработан способ моделирования ишемии сетчатки, основанный на дозированной лазерной коагуляции ретинальных сосудов и обеспечивающий получение хорошо воспроизводимой транзиторной ретинальной ишемии. Получена клиническая, электроретинографическая и морфологическая характеристика экспериментальной модели на сроках наблюдения до 30-ти дней. Доказано, что характер альтераций a-, b-волн ЭРГ и ритмической ЭРГ, а также индекса b/a зависит от объема и глубины развивающейся гипоксии сетчатки. Получен Патент РФ на изобретение № 2313312 на «Способ моделирования ишемии сетчатки глаза» от 27.12.2007.

4. В слезной жидкости выявлено увеличение антипротеолитической и антиокислительной активности на фоне инстилляций препарата Селекартен при экспериментальной ишемии сетчатки, свидетельствующее об усилении под влиянием препарата компенсаторных механизмов, направленных на восстановление кровообращения и сохранение ретинальных функций.

5. На основании клинико-функциональных исследований доказано, что инстилляции Селекартена повышают компенсаторные возможности ретинальной ткани в условиях гипоксии. После лазеркоагуляции ретинальных сосудов на фоне лечения происходит более быстрое восстановление кровотока в поврежденных сосудах. Динамика электрогенеза сетчатки на фоне лечения указывает на нейропротекторные эффекты СК: отмечается умеренное изменение функциональной активности внутренних слоев сетчатки и фоторецепторов в ранние сроки после создания ишемии по сравнению с контрольной группой, и сокращение сроков восстановления ретинальной функции.

6. Показано, что терапевтическое воздействие Селекартена на сетчатку при ее очаговом повреждении лазерным излучением согласно электроретинографическим и морфологическим исследованиям зависит от дозы введения и проявляется в динамике развития дистрофических изменений в зоне лазерного воздействия и характере изменения биопотенциалов сетчатки на первых двух неделях эксперимента. Наибольший положительный эффект препарата проявился в динамике амплитуды a-волны ЭРГ, которая в данной модели повреждения сетчатки без лечения значительно снижалась.

Практическая значимость работы

Разработан новый способ экспериментального моделирования ишемии сетчатки в результате дозированной лазеркоагуляции ретинальных сосудов (Патент РФ на изобретение № 2313312 от 27.12.2007), позволяющий изучать механизмы действия новых терапевтических агентов и оценивать их эффективность в лечении патологических состояний, сопровождающихся сосудистыми нарушениями в сетчатке и развитием ишемии. Изменения в сетчатке, развивающиеся при создании предложенной модели, а также оценка лечебных эффектов новых лекарственных препаратов могут объективно контролироваться при проведении электрофизиологических исследований.

Обоснована перспективность клинических исследований Селекартена в офтальмологии, как препарата местного действия, обладающего антиоксидантными, ангио- и ретинопротекторными свойствами. Определены оптимальные формы введения Селекартена и доказана возможность его длительного использования в виде инстилляций в разведении 1:15 сбалансированным физиологическим раствором.

Получена клинико-функциональная и морфологическая характеристика двух моделей лазерного повреждения сетчатки: ретинальной ишемии и очаговых дистрофических изменений, представлена технология их воспроизведения, а также качественные и количественные критерии объективной оценки морфофункциональных изменений сетчатки, облегчающие широкое практическое использование данных моделей в офтальмологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании клинико-функциональных и морфологических исследований доказано, что в интактной сетчатке кролика Селекартен вызывает повышение функциональной активности фоторецепторов и нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки, инстилляции препарата в разведении 1:15 СФР не оказывают токсического действия на ткани глаза и являются оптимальной формой его введения.

2. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой доказано, что инстилляции препарата Селекартен в разведении 1:15 СФР дважды в день приводят к накоплению селена во влаге передней камеры и ретино-хориоидальном комплексе кролика, что свидетельствует о его проникновении через гематоофтальмический барьер и целесообразности применения СК для повышения местной антиоксидантной защиты тканей глаза.

3. Для изучения механизмов развития ретинальной ишемии и терапевтического действия СК на сетчатку при сосудистых нарушениях, разработан новый способ моделирования ишемии сетчатки в эксперименте, который позволяет создавать транзиторную ретинальную ишемию смешанного артерио-венозного характера заданной площади и глубины, что подтверждается результатами клинико-функциональных и морфологических исследований. Экспериментальная ишемия приводит к характерной динамике электрогенеза сетчатки: изменения b-волны ЭРГ и снижение индекса b/a развиваются раньше угнетения a-волны и более выражены из-за ухудшения трофики нейронов внутреннего ядерного слоя при нарушении кровообращения в сетчатке, характер альтераций ЭРГ и РЭРГ позволяет судить о глубине повреждения. В поздние сроки (2-3 недели) нарастающее угнетение a-волны ЭРГ свидетельствует о вовлечении в патологический процесс фоторецепторов. Изменения протеиназно-ингибиторного баланса слезы указывают на активацию компонентов системы ее гомеостаза при развитии ишемии сетчатки.

4. Доказано, что Селекартен благоприятно влияет на течение восстановительного периода после лазеркоагуляции ретинальных сосудов, повышает компенсаторные возможности ретинальной ткани в условиях гипоксии. Препарат способствует рециркуляции крови в участках ишемии сетчатки с большей плотностью сосудистого русла, приводит к увеличению антипротеолитической и антиокислительной активности слезной жидкости, положительно влияет на ретинальную функцию в ранний период после моделирования ишемии, ускоряет период восстановления электрогенеза сетчатки в отдаленные сроки.

5. Установлено, что Селекартен оказывает умеренное нейропротекторное действие, положительно влияет на структуру и функцию сетчатки после ее очагового повреждения в эксперименте. На фоне инстилляций СК происходит менее выраженное по сравнению с контрольной группой повреждение ретинальной ткани и угнетение электрогенеза сетчатки в ранний период после лазерного ожога. По результатам электрофизиологических и гистологических исследований, эффективность терапевтического действия Селекартена на сетчатку зависит от дозы введения: максимальный положительный эффект препарата выявлен при разведении Селекартена 1:15 сбалансированным физиологическим раствором.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: Всероссийской научной конференции с международным участием «Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике» (Санкт-Петербург, 2006); на 29-ой Европейской конференции по зрительному восприятию (29 European Conference on Visual Perception: EVCP-2006, Санкт-Петербург); на IV международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2006); на ХХ Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); на симпозиуме международного общества клинических электрофизиологов зрения (XLV ISCEV Symposium, Хайдарабад, Индия, 2007). Диссертационная работа апробирована на межотделенческой конференции в МНИИ ГБ им. Гельмгольца (19.03.2008).

Публикации

Всего по теме диссертации опубликовано 22 работы (4 на английском языке), в том числе 2 - в центральной печати. Получен патент на изобретение № 2313312 от 27.12.2007 г.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 204 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», главы «Морфо-функциональные и клинические исследования воздействия Селекартена на сетчатку (собственные исследования)», заключения, выводов и практических рекомендаций. Содержит 21 таблицу, 67 рисунков. Библиография включает 341 работу: 194 источника отечественной и 147 иностранной литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе проводилось изучение и оценка свойств препарата Селекартен, предоставленного ООО «БАЙОЮНИКТЕХ» - комплекса селена, фосфолипидов, бета-каротина, жидкого экстракта Лектадена. Препарат изготовлен ООО «БАЙОЮНИКТЕХ» (Россия, Москва) при использовании наномолекулярных и биоселеновых технологий. В настоящее время разработана фармакопейная статья на препарат. Все документы находятся на втором этапе изучения в Фармакологическом комитете РФ. Препарат зарегистрирован в Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

Селекартен содержит 8-12 мкг/мл 4-х валентного селена, находящегося на месте дисульфидных связей, т.е. внутри молекулы. Нами определено, что в Селекартене в разведении 1:15 сбалансированным физиологическим раствором содержание селена 1,172 мкг / мл.

Экспериментальные исследования проведены на 139 кроликах (277 глаз) породы шиншилла (половозрелые животные, масса тела 2,5-3,5 кг, возраст животных 7-8 месяцев), (табл. 1А-В).

Клинические (офтальмоскопия и фоторегистрация глазного дна) исследования проводили на 1-е, 3-и, 7-е, 21-е и 28-е сутки эксперимента. Динамика ретинального электрогенеза при интравитреальном (и/в) и субконъюнктивальном (с/к) введении СК, а также его инстилляциях в концентрациях 1:15 и 1:30 изучалась через 5-10 минут, 2 часа, а также на 1-е, 4-е, 7-8-е, 14-16-е, 28-30-е сутки эксперимента. Предварительно регистрировалась ЭРГ до введения препарата. Сроки наблюдения во всех группах составили 28-30 дней, на некоторых глазах при с/к и и/в введениях биоэлектрическая активность сетчатки оценивалась также на 50-е сутки эксперимента. Регистрация ЭРГ и РЭРГ проведена на 95 кроликах (189 глаз), у которых с учетом динамических наблюдений выполнено 11576 исследований.

Таблица 1А

Изучение влияния препарата Селекартен на здоровую сетчатку

С целью изучения эффектов препарата Селекартен в эксперименте воспроизводились две модели ретинального повреждения - модель острой ишемии сетчатки и модель очаговых дистрофических изменений (лазерное повреждение) сетчатки.

Модель острой ишемии сетчатки создавалась на кроликах с помощью лазеркоагуляции ретинальных сосудов I-III порядка в наружном квадранте глазного дна. В зависимости от диаметра коагулируемого сосуда мощность импульса варьировала от 500 до 1000 мВт, диаметр пятна от 200 до 500 мкм, время экспозиции в пределах 0,1-0,5 сек. Длина волны лазерного излучения составляла 530 нм. Для полной окклюзии сосуда на протяжении около 1 диаметра ДЗН обычно требовалось от 15 до 65 коагулятов. При описании модели ишемии сетчатки дана ее клинико-функциональная и морфологическая характеристика (Патент РФ на изобретение № 2313312).

Таблица 1Б

Моделирование ишемии сетчатки: эффекты препарата Селекартен

Таблица 1В

Очаговое повреждение сетчатки: эффекты препарата Селекартен

Лазерное повреждение сетчатки кролика использовалось как модель очаговой патологии сетчатки. В нижнем квадранте глазного дна на расстоянии одного диаметра ДЗН от зрительного нерва наносились 20 сливных коагулятов, энергия излучения 400 мВт, длительность экспозиции 0,1 сек, диаметр пятна 100 мкм, длина волны 530 нм (ожог III степени по L'Esperance, 1983).

Были проведены следующие исследования в динамике: клинические ? биомикроскопия, офтальмоскопия (осмотр глазного дна с трехзеркальной линзой), фоторегистрация глазного дна экспериментальных животных ? в отделе травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования (рук. проф. Гундорова Р.А.); оптическая когерентная томография (ОКТ), флюоресцеиновая ангиография сосудов глазного дна (ФАГ) ? в отделе патологии сетчатки и зрительного нерва (рук. проф. Нероев В.В.); электрофизиологические исследования ? в лаборатории клинической физиологии зрения им. С.В. Кравкова (рук. проф. Зуева М.В.). Электроретинограмму регистрировали на одиночную (ЭРГ 1 Гц) и ритмическую (РЭРГ 30 Гц) стимуляцию с помощью электрофизиологической мини-системы для животных «Mjolner» (фирмы Global EYE Program AB, Швеция) на 5 градаций интенсивности стимулов от 0 log (1,7 кд·сек/м²) до 1,2 log. При разработке модели ишемии сетчатки (V серия), а также в II, IV, VI сериях экспериментов для оценки глио-нейрональных взаимоотношений в сетчатке регистрация ЭРГ проводилась по методу М.В. Зуевой и И.В. Цапенко (1992, 1993, 1996) на «Нейропта» фирмы «Меделек» (Англия) / Roland (Германия): энергия вспышек света на уровне роговицы - 1 мкДж/см² (50кд/м²) при записи ганц-фельд ЭРГ на одиночную (0,25 Гц) и 0,36 мкДж/см² (16 кд/м²) при ритмической (12 и 32 Гц) стимуляции сетчатки. Биохимические исследования (отд. патофизиологии и биохимии МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца - рук. проф. Чеснокова Н.Б.): в слезе определяли антиокислительную активность (АОА), антитриптическую активность (АТА) и активность ₂-макроглобулина (₂-МГ).

Изучалось накопление селена в тканях глаза экспериментальных животных на фоне инстилляций препарата Селекартен. Селен во влаге передней камеры и ретино-хориоидальном комплексе определяли с помощью метода атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (испытательная лаб. Минеральных Вод ГЦ ВНИИ ПБ и ВП - рук. Буткова О.Л.). Гистологические исследования: оценка острой и хронической токсичности препарата Селекартен (лаб. патологической анатомии и гистологии глаза МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца - рук. проф. Хорошилова-Маслова И.П); динамика морфологических изменений в сетчатке на двух моделях ретинального повреждения исследована в.н.с., к.м.н. Федоровым А.А. (лаб. патологической анатомии и гистологии глаза ГУ НИИ глазных болезней РАМН - рук. к.м.н. Г.Г. Зиангирова). Статистическая обработка данных проводилась средствами программ Statsoft Statistica 6.0 и AnalystSoft Biostat 2006. При этом использовали параметрические и непараметрические методы (при сравнении групп использовали тест Манна - Уитни).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью определения токсичности Селекартена для тканей глаза, при всех формах введения препарата проводились гистологические и электроретинографические исследования на интактной сетчатке кроликов. На фоне и/в инъекции 0,1 мл препарата в разведении 1:15 СФР, на 7-е сутки после инъекции обнаружена слабая воспалительная инфильтрация стекловидного тела, а также дистрофические изменения ретинального пигментного эпителия, что, может свидетельствовать о токсическом действии СК на внутренние оболочки глаза экспериментальных животных при данной форме введения.

На фоне с/к введения 0,2 мл СК в разведении 1:15 СФР на 3-и сутки после инъекции морфологические изменения отмечались только в зоне введения препарата, в виде отека ткани и небольшой деструкции коллагенового каркаса в lamina propria конъюнктивы. При этом отек конъюнктивы глазного яблока распространялся на эписклеру, пронизанную нейтрофильными лейкоцитами без токсических изменений других структур глаза. Так как изменение тканей конъюнктивы выявлено только в зоне инъекции СК, данный факт может быть связан самой манипуляцией независимо от введенного вещества.

Инстилляции препарата Селекартен в разведении 1:15 СФР дважды в день в течение 1 месяца (тест на хроническую токсичность) на 30-е сутки вызывали незначительные изменения со стороны эпителия роговицы в виде уменьшения его толщины, малой склонности к десквамации. Наблюдаемый отек конъюнктивы глазного яблока, разрыхленность ее ткани, указывали на некоторое раздражающее действие инстилляций. В сроки до 3-х суток (тест на острую токсичность) отмечалось ограниченное повреждение эпителия, которое сопровождалось десквамацией поверхностных слоев с сохранением базального слоя, плотно скрепленного с базальной мембраной. Изменения локализовались в периферической зоне роговицы и соответствовали примыкающей к ней конъюнктиве. Вероятнее всего, это было связано с зоной прямого воздействия капель. Со стороны других внутриглазных структур на фоне инстилляций СК изменения не выявлены как в острых, так и в хронических опытах.

Для того чтобы выяснить, в какие структуры глаза проникает селен, его содержание в тканях глаза кролика определяли на фоне двукратных инстилляций Селекартена в разведении 1:15 СФР. Во влаге передней камеры в опытной группе кроликов после 3-4-х недельных инстилляций его содержание составляло в среднем 0,316 ± 0,026 мкг/мл, тогда как в контрольной - 0,196 ± 0,058 мкг/мл. При этом разница между содержанием селена во влаге передней камеры на 3-ей и 4-ой неделе в опыте была статистически достоверна: 0,261 ± 0,02 мкг/мл и 0,379 ± 0,038 мкг/мл, соответственно (р0,05). Содержание селена в ретино-хориоидальном комплексе в эти же сроки наблюдения на фоне инстилляций СК было выше, чем в группе контроля: 1,005 ± 0,082 мкг/мл и 0,537 ± 0,160 мкг/мл (p0,05) соответственно. Результаты исследований свидетельствуют о проникновении селена через гематоофтальмический барьер и его накоплении во влаге передней камеры и ретино-хориоидальном комплексе. Накопление Se быстрее происходило во влаге передней камеры и медленнее - в ретино-хориоидальном комплексе.

При изучении действия Селекартена на функциональное состояние здоровой сетчатки в эксперименте установлено усиление ее биоэлектрической активности при всех формах введения препарата. Динамика ретинального электрогенеза после и/в и с/к инъекций препарата указывает на его стимулирующий эффект. Это, прежде всего, проявилось в гиперреакции наружных слоев сетчатки в 1-4-е сутки эксперимента. Супернормальная ЭРГ оставалась повышенной до конца наблюдения, отражая высокую чувствительность к СК фоторецепторов. Повышение функциональной активности сетчатки, возможно, обусловлено непосредственным действием селена на самые первичные процессы фоторецепторного акта, связанные с фотохимическими превращениями родопсина, т.е. на начальные стадии фоторецепции, а также на метаболические процессы в сетчатке. В то же время, биопотенциалы, отражающие функциональное состояние пост-фоторецепторной сетчатки после введения СК сначала возрастали, затем, через 16 суток эксперимента следовало стабильное угнетение амплитуды b-волны и ритмической ЭРГ. Мы предположили, что это может указывать на необходимость поиска более мягких форм доставки препарата к тканям глаза для исключения любого возможного токсического эффекта селена на ретинальные клеточные элементы, в то же время, сохраняя его положительные свойства. Поэтому в следующей серии исследований изучались эффекты Селекартена при инстилляционной форме введения препарата.

Обнаружено, что ежедневные инстилляции СК в разведении 1:15 и 1:30 приводят к повышению функционального состояния наружных и внутренних слоев сетчатки на всех сроках наблюдения без угнетения ретинального электрогенеза в конце эксперимента, как это отмечалось при с/к и и/в введении препарата. Если на фоне инъекций наибольшая чувствительность к СК в ранние сроки эксперимента выявлена для фоторецепторов; при инстилляциях отмечалось повышение функциональной активности и фоторецепторов, и клеток внутреннего ядерного слоя сетчатки. Использование капель различной концентрации СК (в разведении 1:15 и 1:30) не выявило значимых отличий на глазах, поэтому можно полагать, что инстилляции СК в указанных концентрациях обладают практически одинаковым воздействием на функцию интактной сетчатки. Отрицательных эффектов препарата свидетельствующих о возможном токсическом воздействии на ретинальную функцию не обнаружено.

Изучение ангиопротекторных, антиоксидантных и нейропротекторных эффектов препарата Селекартен проводилось на моделях патологии сетчатки, наиболее часто развивающихся при глазной травме. В эксперименте создавались две модели ретинального повреждения - модель острой ишемии и модель очаговых дистрофических изменений (лазерное повреждение) сетчатки. Если очаговое повреждение сетчатки воспроизводилось по известной ранее схеме (ожог III степени по L'Esperance, 1983), то для изучения полезных свойств СК при ретинальных сосудистых нарушениях разработан новый способ экспериментального моделирования ишемии сетчатки у кроликов (Патент РФ на изобретение № 2313312 на «Способ моделирования ишемии сетчатки глаза» от 27.12.2007). С помощью лазерной коагуляции ретинальных сосудов I - III порядка обеспечивается получение полноценной дозированной транзиторной ретинальной ишемии, которая сопровождается значительным снижением уровня венозного оттока и потому носит смешанный (артерио-венозный) характер. Модель хорошо воспроизводится в эксперименте. Возникающие нарушения в сетчатке можно объективно контролировать в клинических, функциональных и морфологических исследованиях.

Согласно клиническим данным в результате узконаправленного транспупиллярного фотокоагуляционного воздействия на стенку ретинальных сосудов и окружающую сетчатку возникала послеожоговая воспалительная реакция с последующей окклюзией сосуда и развитием ишемии в кровоснабжаемых им слоях сетчатой оболочки. Данные изменения сохранялись до 2-х недель с постепенным, но неполным восстановлением кровотока в сосудах, подвергшихся лазеркоагуляции. При воспроизведении острой ишемии сетчатки происходило значительное повреждение внутреннего гематоретинального барьера.

Электрофизиологические исследования убедительно доказали, что изменения в сетчатке, вызванные лазерной коагуляцией ретинальных сосудов, приводят к патологическим изменениям во внутренних слоях периферических отделов сетчатки из-за нарушения их кровоснабжения. Прежде всего, это проявилось в снижении функции биполярных, ганглиозных и глиальных клеток Мюллера. При нарушении ретинальной циркуляции изменения b-волны ЭРГ развиваются раньше угнетения a-волны и более выражены из-за ухудшения трофики нейронов внутренней сетчатки. Функциональная активность фоторецепторов, как наиболее чувствительных к гипоксии клеток, также нарушалась, несмотря на сохранность хориокапиллярного кровообращения в представленной модели. По нашим данным, окклюзия сосудов и последующее развитие ретинальной ишемии уже в первые сутки приводили к угнетению a-волны на 20-40% и высокочастотной ритмической ЭРГ (30 Гц) на 10-20% от исходных значений. Динамика изменений b-волны, зависела от характера ретинальной ишемии. При острой обширной ишемии сетчатки b-волна ЭРГ угнеталась на 20-40%, а при меньшей зоне поражения, ее амплитуда возрастала, достигая 115-130% от исходных показателей.

Известно, что при нарушении микроциркуляции сетчатки происходит компенсаторная активизация метаболизма клеток Мюллера, что связано с процессами защиты нейронов от их возможного повреждения и восстановления функционирования ретинальной ткани. В случае возникновения обширной ретинальной ишемии клетки Мюллера стимулируют неоваскуляризацию в том случае, когда требования глио-нейронального взаимодействия превышают их метаболические способности (В.В. Нероев, М.В. Зуева, И.В. Цапенко с соавт., 2004, 2005). Активизация клеток Мюллера проявляется в ЭРГ повышением амплитуды b-волны и возрастанием глиального индекса. Перед появлением неоваскуляризации сетчатки функциональная активность Мюллеровских клеток угнетается, что отражается в снижении b-волны и повышенного ранее глиального индекса.

Характер альтераций ЭРГ позволяет судить о глубине развивающейся ишемии. В слоях сетчатки, зависящих от ретинального кровотока, ишемические изменения развиваются постепенно, носят локальный характер, что коррелирует с данными гистологических наблюдений. Выявлена двухфазная динамика амплитуды a- и b-волн ЭРГ и индекса гипоксии b/a. Коэффициент b/a, вычисляемый по отношению амплитуды b-волны к амплитуде a-волны ЭРГ, часто используется в клинической практике как критерий ишемии у больных с острым нарушением кровообращения в сетчатке (В.В. Нероев, М.В. Зуева, И.В. Цапенко и др., 2004). Существенное угнетение амплитуды b-волны ЭРГ сразу после лазерной коагуляции ретинальных сосудов приводило к снижению отношения b/a, отражая изменения функционального состояния внутренней сетчатки, обусловленные острым нарушением ретинального кровообращения. В поздние сроки (2 - 3 недели) после создания ишемии значения b/a возрастают до супернормальных. Это связанно со значительным угнетением a-волны и может свидетельствовать о вовлечении в патологический процесс фоторецепторов.

При проведении гистологических исследований показано, что лазерная коагуляция магистральных ретинальных сосудов кролика вызывала ишемию внутренних слоев сетчатки, кровоснабжаемых ветвями этих сосудов с преимущественным вовлечением слоя ганглиозных клеток и нервных волокон. Признаки нарушения кровообращения сохранялись до 3-х недель после лазерного воздействия в основном на периферии сетчатки и ограничивались слоями, получающими питание из ретинального сосудистого русла с развитием ретинального неоангиогенеза, что является подтверждением состоятельности выбранной модели ишемии сетчатки.

Процессы, происходившие в сетчатке при экспериментальной ишемии, нашли отражение в увеличении антипротеолитической активности слезной жидкости. На 3-и сутки после создания ишемии наблюдалось увеличение суммарной АТА слезы в 2 раза по сравнению с группой контроля с дальнейшим возвратом к норме на 7-е сутки без статистически достоверных различий между группами животных. Активность ₂-макроглобулина в слезе также значительно возрастала на 3-и сутки эксперимента и оставалась повышенной до 10-х суток включительно. При моделировании ишемии сетчатки значимого изменения уровня общей антиокислительной активности слезы не наблюдалось.

Таким образом, полученные результаты комплексных клинико-функциональных и гистологических исследований убедительно доказали, что разработанная модель ишемии является удобным инструментом для последующего изучения механизмов действия и эффективности новых терапевтических стратегий в лечении патологических состояний, сопровождающихся сосудистыми нарушениями в сетчатке и развитием ишемии.

На фоне инстилляций СК по данным офтальмоскопии происходило более быстрое (начиная с 3-х суток) восстановление кровообращения в ретинальных сосудах, подвергшихся лазеркоагуляции. При этом на 22-е сутки эксперимента обращало на себя внимание хорошее кровенаполнение сосудов в зоне лазерного воздействия с умеренными изменениями паравазальной сетчатки по сравнению с группой нелеченных животных.

Электрофизиологические исследования свидетельствуют о том, что инстилляции Селекартена оказывают умеренное нейропротекторное воздействие, положительно влияя на ретинальную функцию в ранний период и сокращая период восстановления электрогенеза сетчатки в отдаленные сроки после моделирования ишемии. Показано, что в течение первых двух недель после лазерной коагуляции ретинальных сосудов на фоне инстилляций СК характер динамики функциональной активности сетчатки практически повторял закономерности изменения ЭРГ и РЭРГ, отмеченные в контрольной группе, однако степень угнетения ретинальной функции была менее выраженной у кроликов, получающих лечение СК.

В поздние сроки наблюдения (3 недели) амплитуда a-волны ЭРГ в опытной группе была существенно выше, чем в группе без лечения (в среднем составляла 85% и 52% нормы соответственно). Кроме того, на фоне лечения выявлена лучшая динамика восстановления b-волны ЭРГ, что может свидетельствовать о развитии меньшей «степени ишемизации» сетчатки по сравнению с группой контроля. На глазном дне это проявилось в более быстром восстановлении кровообращения в ретинальных сосудах, подвергшихся лазеркоагуляции и менее выраженных изменениях паравазальной сетчатки в зоне лазерного воздействия у леченых СК животных на сроках наблюдения 1-3 недели. В то же время, ритмические ответы сетчатки на частоту стимуляции 30 Гц угнетались сразу после создания ишемии и у большинства животных оставались сниженными до конца эксперимента, хотя степень их снижения от нормы составляла всего лишь 5-15%. В 37,5% случаев показатели РЭРГ восстанавливались до исходных значений. Из-за разброса индивидуальных амплитудных показателей волн ЭРГ средние результаты по группе были статистически достоверны не на всех сроках наблюдения.

На основании полученных данных, можно предположить, что у животных, получавших лечение, относительно лучшая сохранность электрогенеза сетчатки и более быстрое его восстановление после лазерной коагуляции сосудов может быть связано с ретинопротекторным и, прежде всего, антиоксидантным действием СК при развитии острой гипоксии сетчатки. Результаты электроретинографии нашли свое подтверждение в биохимических и морфологических исследованиях.

При определении биохимических показателей слезы в восстановительном периоде после лазеркоагуляции ретинальных сосудов установлено статистически достоверное повышение в слезной жидкости антиокислительной активности (p < 0,05). Антитриптическая активность на фоне лечения СК повышалась недостоверно из-за разброса индивидуальных данных. Так в слезе происходило увеличение активности ингибитора протеолиза ₂-МГ по сравнению с группой животных, не получавшей лечения, что связано, по-видимому, с иммунотропным действием препарата. Увеличение антипротеолитической и антиокислительной активности слезной жидкости на фоне инстилляций СК свидетельствует об усилении под его влиянием компенсаторных механизмов, направленных на восстановление кровообращения и повреждений ретинальной ткани при ишемии сетчатки.

Морфологические исследования показали, что восстановление кровообращения на 30-е сутки на фоне инстилляций СК происходит в участках сетчатки с большей плотностью сосудистого русла и, следовательно, менее восприимчивых к гемодинамическим нарушениям. В экваториальной зоне сетчатки с меньшей плотностью ретинального русла применение СК не приводило к купированию ишемических процессов в слое нервных волокон. На периферии сетчатки на фоне лечения в зависимости от числа неперфузируемых ретинальных капилляров встречались участки демиелинизированных нервных волокон с признаками их постепенного глиального замещения.

Изучение воздействия СК при очаговом повреждении сетчатки лазерным излучением выявило более быстрое восстановление клинически видимых изменений на глазном дне по сравнению с контрольной группой экспериментальных животных. Однако, при проведении офтальмоскопии существенных отличий на глазном дне у кроликов на фоне однократного и/в и еженедельного с/к введения СК в разведении 1:15 СФР в течение 1 месяца отмечено не было, что, возможно, объясняется выраженным повреждением сетчатки при очаговой лазеркоагуляции. Динамическая оценка состояния зоны лазеркоагуляции сетчатки между животными, получавшими инстилляции СК в разведении 1:15 и 1:30 СФР также не выявила принципиальной разницы. В то же время, на глазном дне отмечалась большая сохранность сосудистого рисунка сетчатки в непосредственной близости от зоны коагуляции, снижение экссудативной реакции ретинальной ткани на лазерное воздействие на фоне лечения. Обращало на себя внимание менее грубое формирование хориоретинального рубца, при этом сохранялась его умеренная пигментация.

Морфометрические исследования сетчатки (ОКТ) показали, что при инстилляциях СК выявлялось менее выраженное истончение сетчатки в зоне лазерного воздействия с нарушением дифференцировки остаточных ее слоев, по сравнению с контрольной группой животных. На глазах без лечения очаговая коагуляция сетчатки приводила к более грубому ее повреждению с потерей основных клеточных элементов, дезорганизацией наружных сегментов фоторецепторов и хориокапилляров. Достоверной разницы в динамике состояния зоны лазеркоагуляции сетчатки между животными, получавшими инстилляции СК в различных концентрациях (в разведении 1:15 и 1:30 СФР) на всех сроках эксперимента не установлено.

Модель очаговой патологии сетчатки характеризовалась значительным угнетением ретинального электрогенеза, указывающего на развитие дистрофических изменений в наружных и внутренних слоях сетчатки. При этом больше всего угнетается a-волна ЭРГ, в генерации которой принимают участие фоторецепторы, что свидетельствует о грубых деструктивных изменениях в наружных слоях сетчатки, характерных данному виду ретинального повреждения. Учитывая тот факт, что в основе развития фотодегенерации зрительных клеток сетчатки лежат процессы свободно-радикального окисления, использование ингибиторов свободно-радикальных процессов - антиоксидантов, может оказаться перспективным для фотопротекции сетчатки. Действительно, электроретинографические исследования показали, что при использовании различных форм введения СК на модели очаговой патологии снижается повреждающее действие лазерной коагуляции сетчатки. Это проявилось в динамике восстановления электрогенеза сетчатки, особенно на 1-2 неделях эксперимента, что коррелирует с данными офтальмоскопических, морфометрических и гистологических исследований.

Угнетение функциональной активности сетчатки после ее очагового повреждения на фоне лечения СК было менее выраженным, чем в контрольной группе. Положительный эффект препарата отразился, прежде всего, на динамике восстановления амплитуды a-волны ЭРГ, которая, как отмечалось выше в данной модели ретинального повреждения без лечения значительно снижалась. На фоне инстилляций СК в 50% случаев на 7 - 16 сутки выявлено возрастание волн ЭРГ на одиночные вспышки света. В этот период наблюдения амплитуда b-волны ЭРГ иногда достигала 110-120%, амплитуда a-волны - 140-150% нормы. Такое повышение функциональной активности фоторецепторов и нейронов внутреннего ядерного слоя, вероятно, может быть обусловлено воздействием СК на клетки сетчатки и/или их взаимодействием (возможно, опосредованно через глиальные клетки Мюллера) и свидетельствует о протекторных и репаративных свойствах препарата при ретинальном повреждении. Через 21-28 дней как на фоне инстилляций, так и при с/к и и/в введениях СК величина a-волны ЭРГ и ритмической ЭРГ не превышали 60-80% нормы, что, однако выше значений в группе контроля. Полного восстановления ретинального электрогенеза к окончанию эксперимента не отмечалось из-за развития грубых дистрофических изменений в области заднего полюса глаза.

При анализе изменения электрогенеза сетчатки на фоне ежедневных инстилляций СК в разных концентрациях, установлен больший положительный эффект СК 1:15, чем СК 1:30. Эффективность лечения инстилляциями была ниже, чем при с/к введении препарата. Однако, по нашему мнению, именно инстилляционную форму СК целесообразно использовать как атравматичный и нетоксичный для тканей глаза способ введения, позволяющий длительное использование СК в качестве препарата, восстанавливающего функциональное состояние сетчатки при различных видах ретинальной патологии.

Таким образом, по данным ЭФИ в контрольной группе животных без лечения лазерная коагуляция сетчатки приводила к более грубому повреждению ретинальных клеточных элементов в зоне воздействия, выраженному угнетению функции фоторецепторов и нейронов внутреннего ядерного слоя. Применение СК оказывало положительный эффект на ретинальную функцию и течение восстановительного периода после лазерного ожога сетчатки. Гистологическое исследование хориоретинального рубца после лазеркоагуляции на фоне лечения СК выявило большую его пигментацию по сравнению с группой нелеченных животных, что свидетельствует о повышенной макрофагальной активности производных клеток РПЭ. Известно, что гиперплазия РПЭ ингибирует ангиогенез и препятствует появлению ятрогенной хориоидальной неоваскуляризации, которая может быть индуцирована лазерным воздействием (B.M. Glaser, P.A. Campochiaro, J.L. Davis at al., 1985; B.M. Glaser, 1988). На фоне инстилляций СК в разведении 1:15 СФР площадь и толщина очага, а также глубина супрахориоидального пространства имели меньшее значение без уменьшения адгезивных свойств глиального рубца.

Морфологически уменьшение концентрации СК до 1:30 приводило к значительному увеличению площади очага с одновременным утолщением спайки, в основном за счет отека и микрокровоизлияний в подлежащей сосудистой оболочке. Вероятно, СК обладает индуцирующим действием на макрофагальную активность РПЭ в зоне патологического очага, влияя также на реологические свойства крови. В разведении СК 1:15 СФР это приводит к уменьшению размеров хориоретинального рубца и одновременному увеличению его плотности. Разведение СК 1:30 СФР переориентирует его влияние на пролиферативную активность глиальных клеток, что приводит к увеличению размеров рубца и усиливает проницаемость сосудистой стенки.