Структурные изменения в плаценте, печени беременных мышей, их плодов при БЦЖ-гранулематозе и лечении изониазидом

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, при котором могут поражаться все органы человеческого организма. Это одна из наиболее актуальных социальных и медицинских проблем. В настоящее время отмечают равномерный рост показателей заболеваемости туберкулезом женщин репродуктивного возраста (в возрасте от 20 до 57 лет), в том числе беременных женщин, начавшийся после 1998 г. (Жученко О.Г., 2001; Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачев А.В. и др., 2003). Наиболее неблагоприятная ситуация по заболеваемости туберкулезом сложилась в Западно-Сибирском регионе - 15% от числа всех зарегистрированных случаев туберкулеза на территории Российской Федерации (Урсов И.Г., Краснов В.А., 2000), при этом, в возрасте 18-30 лет, заболеваемость туберкулезом была в 2 раза выше, чем в других возрастных группах за период времени с 1991 по 1995 гг. (Кононенко В.Г. и др., 1995; Мурашкина Г.С. и др., 1997; Кононенко В.Т., Шкурупий В.А., 2002).

Проблема сочетания туберкулеза и материнства чрезвычайно актуальна, поскольку страдает не только репродуктивное здоровье женщин, но и формируются условия для рождения ослабленных, больных детей, что является одним из факторов отрицательного влияния на генофонд нации.

Наиболее часто у беременных выявляют инфильтративную форму туберкулеза легких - 48 %, очаговый туберкулез - 24 % беременных и фиброзно-кавернозный туберкулез - у 27 % беременных женщин. Впервые во время беременности активный туберкулез выявляют у 6-и % беременных, обострение туберкулезного процесса наблюдают у 11-и % беременных и у 22-х % женщин беременность формируется на фоне активного туберкулезного воспаления (Омарова Х.М., 2000).

Существует прямая связь между тяжестью специфического туберкулезного процесса и тяжестью сформировавшихся осложнений развития беременности и родов, а также осложнений у плода (Омарова Х.М., 2000; Каюкова С. И. Стаханов В. А., Макаров О. В., 2003; Pranevieius A et al, 2003).

Внутриутробное развитие и состояние плода зависят от морфофункционального состояния органов в системе “мать - плацента - плод” (Милованов А. П., 1999; Cross J.C., 2006). При повреждении какого-либо из компонентов данной системы, при развитии беременности на фоне туберкулеза, существует риск формирования синдрома задержки развития плода, врожденных пороков развития, перинатальной смертности и мертворождения (Майоров К. Б., Бочарова И. В. 1996; Милованов А. П., 1999; Stray - Pedersen B., 1993). Однако, механизмы развития этих осложнений как факторов риска патологического развития беременности при туберкулезе у матери и плода, остаются недостаточно изученными (Майоров К.Б., Бочарова И В. 1996).

Учитывая рост заболеваемости и летальности при туберкулезе среди беременных женщин и необходимость сохранения плода и его здоровья, нужно иметь представление о механизмах развития процессов, происходящих в печени и плаценте беременных больных туберкулезом - органах, определяющих трофику плода и его развитие, а также о последствиях этих процессов, которые развиваются в печени плода и оказывают непосредственное влияние на его развитие.

Выбор плаценты, в качестве объекта для изучения, обусловлен тем, что данный провизорный орган жизненно значим для развивающегося плода, так как выполняет многообразные функции, обеспечивающие внутриутробную жизнедеятельность и нормальное развитие плода. Отклонения в любом из органов системы “мать - плацента - плод”, неизбежно приводят к развитию ответной реакции во всех взаимодействующих компонентах системы, как функционального, так и структурного характера (Цирельников Н.И., 2005).

Выбор печени, как объекта исследования, обусловлен тем, что при генерализованном туберкулезном процессе печень поражается в 60-93% случаев (Логинов А.С., Аруин Л. И., 1985). В ней сосредоточено до 70% резидентных макрофагов СМФ (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Козинец Г.И. и др., 2001). Печень определяет уровень энергетических процессов при формировании стресс-синдрома (Панин Л. Е., 1983), который является неспецифической адаптивной реакцией организма и проявляется при любом патологическом процессе. Помимо этого печень плода является первым органом на пути возбудителя при инфекционном поражении последа (Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф., 2002) и, вероятно, от ее морфофункционального состояния зависит выраженность и исход инфицирования плода (Надеев А.П. И др., 2006).

Цель исследования. Изучить влияние туберкулезного воспаления на структурные преобразования в печени, плаценте беременных мышей, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности и во время беременности, а также в печени их плодов и при лечении изониазидом.

Задачи исследования:

1. Изучить структурную организацию печени беременных мышей линии C57Bl/6 в норме в различные периоды гестации.

2. Изучить структурную организацию плаценты мышей линии C57Bl/6 в норме в различные периоды гестации.

3. Изучить структурную организацию печени плодов мышей линии C57Bl/6 в норме в различные периоды гестации.

4. Изучить патоморфологические изменения в печени мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при различных сроках гестации.

5. Изучить патоморфологические изменения в плаценте мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при различных сроках гестации.

6. Изучить патоморфологические изменения в печени плодов мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при различных сроках гестации.

7. Изучить патоморфологические преобразования в печени мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при лечении изониазидом.

8. Изучить патоморфологические преобразования в плаценте мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при лечении изониазидом.

9. Изучить патоморфологические изменения в печени плодов мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ до и во время беременности при лечении изониазидом.

10. Исследовать структурные особенности проявлений БЦЖ-гранулематоза различной продолжительности в печени и плаценте беременных мышей линии C57Bl/6, а также печени их плодов.

Научная новизна результатов исследования. При исследовании структурной организации печени в норме у мышей линии C57Bl/6 в различные периоды гестации выявлено, что состояние беременности сопряжено с повышенной активацией пластических процессов в печени мышей-самок при низком уровне деструктивных изменений.

При исследовании структурной организации плаценты в норме мышей линии C57Bl/6 в различные периоды гестации установлено увеличение количества материнских и плодовых сосудов, уменьшение размеров островков гликогенсодержащих клеток и концентрации гигантских трофобластических клеток лабиринтного отдела плацент при увеличении срока гестации, что отражает естественные инволютивные и компенсаторные изменения в плаценте.

При изучении структурной организации печени в норме у плодов мышей линии C57Bl/6 при различных сроках гестации выявлено уменьшение концентрации очагов внекостномозгового кроветворения обратно пропорциональное увеличению продолжительности периода гестации.

При исследовании структурной организации печени беременных мышей линии C57Bl/6 в различные сроки беременности и разной продолжительности БЦЖ-гранулематоза выявлено нарастание деструктивных процессов в печени и преобладание дистрофических изменений над некробиотическими, с усилением процессов репаративной регенерации при увеличении продолжительности периода инфицированности и срока гестации и, особенно, при лечении изониазидом инфицированных вакциной БЦЖ беременных мышей.

При изучении структурной организации плаценты беременных мышей линии C57Bl/6 в разные сроки гестации при разной продолжительности БЦЖ-индуцированного воспаления установлено преобладание дистрофических изменений над некробиотическими хориального эпителия лабиринтного отдела плацент, с незначительной степенью их нарастания, уменьшение концентрации сосудов в плаценте с формированием в них гемодинамических нарушений и стаза, что особенно выражено у мышей, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности и при терапии изониазидом и сочетается с большим уровнем репаративных процессов.

При изучении влияния патоморфологических изменений в печени и плаценте беременных мышей линии C57Bl/6 при различной продолжительности состояния инфицированности их вакциной БЦЖ на изменения массы тела плодов и развитие структурных изменений в их печени установлено, что увеличение продолжительности состояния инфицированности вакциной БЦЖ беременных мышей проявляется увеличением дефицита массы тела у плодов, нарастанием масштабов деструктивных изменений и формированием состояния персистенции внекостномозгового кроветворения в их печени, что в большей степени выражено у плодов мышей, инфицированных до беременности, не получавших терапии изониазидом.

При исследовании особенностей БЦЖ-гранулем (изменение количества и размеров гранулем) в печени беременных мышей при разной продолжительности состояния инфицированности вакциной БЦЖ, установлено их отсутствие в плаценте и печени плодов инфицированных мышей, независимо от продолжительности состояния инфицированности и проведения противотуберкулезной терапии изониазидом.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты исследования структурных изменений в печени и плаценте, развивающиеся при сочетании беременности с инфицированием M.tuberculosis до начала периода гестации во время беременности, позволяют прогнозировать формирование осложнений развития беременности и плода.

Полученные результаты исследования морфологических проявлений в печени, плаценте беременных мышей и их плодов при разной продолжительности состояния инфицированности вакциной БЦЖ и разной продолжительности лечения изониазидом могут служить обоснованием выбора сроков проведения патогенетической терапии туберкулеза и ее продолжительности.

Результаты исследования морфофункциональных изменений в печени беременных мышей и их плодов, при развитии БЦЖ-гранулематозного воспаления, в отношении процессов дистрофии и некробиоза, формирования гранулем и их инволютивных преобразований, компенсаторно-приспособительных реакций, а в плаценте в отношении процессов формирования деструктивных изменений, гемодинамических нарушений в сочетании с нарушением ангиогенеза и процессов репаративной регенерации тканей плаценты, могут быть использованы в курсе общей и частной патологической анатомии в разделах “Дистрофии”, “Некроз, апоптоз”, “Продуктивное воспаление”, “Компенсация. Адаптация”, “Воспаление”, “Перинатальные инфекции”, в курсе гистологии, цитологии в разделе “Печень”, “Плацента”.

Положения, выносимые на защиту:

1. Состояние беременности у мышей самок сопряжено с морфологическими проявлениями повышения уровня пластических процессов в печени, сопровождающимися процессами незначительной деструкции. При этом, по мере увеличения сроков гестации в плаценте постепенно нарастали морфологические проявления физиологических инволютивных процессов, тогда как в печени плодов доминировали пластические и процессы дифференцирования структуры органа, что указывает на становление печени плода, как его трофического центра.

2. Состояние беременности, генерализованного туберкулезного воспаления и лечения изониазидом сопровождалось развитием процесса деструкции (дистрофия и некроз гепатоцитов), масштабы которых были тем больше, чем продолжительнее был период гестации и период лечения. Интенсивность репаративных процессов была прямо пропорциональна масштабам повреждения. При этом в печени у беременных инфицированных мышей наблюдали структурные проявления элиминации микобактерий, масштабы которых были большими, у леченных инфицированных беременных мышей.

3. Состояние беременности не было сопряжено с наличием гранулем в плаценте и печени плодов. Состояние беременности, у не леченных беременных мышей по мере увеличения сроков гестации, было сопряжено с постепенным нарастанием структурных изменений, проявлявшихся редуцированием сосудов плаценты, выраженных, в несколько меньшей степени, в ее плодовой части, что детерминировано у леченных беременных мышей воздействием наряду с метаболитами микобактерий и метаболитов изониазида, что обусловило структурные проявления в печени плодов и их гипотрофию.

1. Материал и методы исследования

Работа выполнена на 120 беременных мышах линии C57Bl/6, от которых получали плоды на 10-е и 21-е сутки периода гестации. Животные получены из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск).

Исследование проводили в двух экспериментах. Первый эксперимент выполнен на 70 мышах-самках линии C57Bl/6, а второй - на 50 мышах-самках линии C57Bl/6 двухмесячного возраста массой тела 20-22 г.

Условия содержания животных в виварии, период и условия адаптации, часы изъятия образцов материала были идентичными при проведении первого и второго экспериментов.

Диссеминированное туберкулезное воспаление в первом и втором экспериментах моделировали однократным интраперитонеальным введением животным вакцины БЦЖ (ГП “Аллерген”, г. Ставрополь). Каждому животному вводили 0,5 мг вакцины на каждое животное на 13-е сутки периода гестации. Выбор данной экспериментальной модели обусловлен ее особенностью - крайне редкое развитие в гранулемах некротического процесса делает возможным исследование изменения клеточного состава гранулем в полном объеме, а также, будучи наиболее резистентным из штаммов, вызывающих развитие туберкулезного воспаления, предъявляет повышенные требования к предполагаемому в качестве противотуберкулезной терапии препарату (Шкурупий В.А., 1999).

В первом эксперименте животные были разделены на пять групп по 10 животных. Первая группа - контрольная - здоровые беременные мыши линии C57Bl/6. Вторая группа - здоровые беременные мыши линии C57Bl/6 при интраперитонеальном введении изониазида с 13-х суток периода гестации в дозе 1,6 мг/кг массы тела в 0,2 мл 0,9 % водного раствора NaCl 1 раз в день. Третья группа - небеременные мыши-самки линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ. Продолжительность БЦЖ-гранулематозного воспаления составила 8 суток. Четвертая группа - беременные мыши линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ на 13-е сутки периода гестации. Продолжительность БЦЖ-гранулематозного воспаления 8 суток. Пятая группа - беременные мыши линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ на 13-е сутки периода гестации при интраперитонеальном введении изониазида с 13-го дня периода гестации в дозе 1,6 мг/кг массы тела в 0,2 мл 0,9 % водного раствора NaCl 1 раз в день. Лечение продолжали до 21 дня периода гестации. Выбор данного периода инфицирования обусловлен тем, что это период становления функций клеток СМФ в печени плода.

Взятие материала проводили на 21-е сутки периода гестации. Под эфирным наркозом извлекали плоды беременных мышей-самок линии C57Bl/6 с последующим их взвешиванием. Для последующего морфологического исследования забирали печень плодов, плаценты и печень беременных мышей.

Во втором эксперименте животные были разделены на пять групп по 10 животных. Первая группа - контрольная - здоровые беременные мыши линии C57Bl/6. Вторая группа - здоровые беременные мыши линии C57Bl/6 при интраперитонеальном введении изониазида с 1-го дня периода гестации в дозе 1,6 мг/кг массы тела в 0,2 мл 0,9 % водного раствора NaCl 1 раз в день. Третья группа - небеременные мыши-самки линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ. Продолжительность БЦЖ-гранулематозного воспаления составила 40 суток и 51-и сутки. Четвертая группа - беременные мыши линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ за один месяц до наступления беременности. Пятая группа - беременные мыши линии C57Bl/6, инфицированные вакциной БЦЖ за один месяц до наступления беременности при интраперитонеальном введении изониазида с 1 дня периода гестации в дозе 1,6 мг/кг массы тела в 0,2 мл 0,9 % водного раствора 1 раз в день.

Через один месяц после заражения у мышей развивалось диссеминированное гранулематозное воспаление. Взятие материала проводили на 8 и 51 сутки периода инфицированности вакциной БЦЖ, что соответствовало 21 суткам гестации. Под эфирным наркозом извлекали плоды беременных мышей линии C57Bl/6, с последующим взвешиванием и взятием для последующего морфологического исследования печеней плодов, плаценты и печени беременных мышей. Взрослых мышей-самок в первом и втором экспериментах выводили из эксперимента путем дислокации позвонков шейного отдела позвоночника под эфирным наркозом.

Выбор изониазида, в качестве терапевтического средства, был обусловлен тем, что данный препарат является базовым при проведении противотуберкулезной терапии и входит в большинство современных схем лечения, обладает бактериостатическим и бактерицидным эффектом, оказывает влияние как на внеклеточные, так и на внутриклеточные формы микобактерий, проникает через тканевые барьеры во все физиологические жидкости, через плаценту, в грудное молоко, обладает умеренной гепатотоксичностью и характеризуется отсутствием тератогенного эффекта (Страчунский Л. С. Белоусов Ю. Б., Козлов С. Н., 2002; Mandell G.M., Sande M.A., 1985; Starke J.R., 1997).

Объектом исследования служила печень взрослых беременных мышей линии C57Bl/6, плацента, учитывая возможность прохождения плацентарного барьера M. tuberculosis при гематогенной диссеминации, а также печень их плодов, учитывая возможное, проникновение возбудителя в организм плода.

Для светооптического исследования образцы печени беременных мышей линии C57Bl/6 и их плодов, во всех случаях брали из левой доли, а образцы плаценты из центральной части плацентарного диска. Все образцы фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации с последующим заключением в парафин. На санном микротоме изготовляли срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по Ван-Гизону и заключали в канадский бальзам на предметных стеклах (Меркулов Г.А., 1969; Автандилов Г.Г, 1994). От каждого объекта изготавливали по 3-4 микроскопических среза.

Морфометрию структур печени беременных мышей линии C57Bl/6 осуществляли с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек (Автандилов Г.Г, 1990). Подсчитывали численную плотность (Nai) гранулем в печени на единицу тестовой площади 1,16х105мкм2 и диаметр гранулем, объемную плотность (Vv) зон некрозов и зон дистрофических изменений гепатоцитов, а также численную (Nai) и объемную (Vv) плотности двуядерных гепатоцитов; объемную плотность (Vv) фуксинофильных коллагеновых волокон, как в гранулемах, так и в окружающей ткани (Чернова Т.Г., 1993; Филимонов П.Н., 1996; Надеев А.П., 1998; Козяев М.А., 1999) с целью оценки фиброгенного эффекта используемого противотуберкулезного препарата. Исследовали клеточный состав гранулем в ткани печени беременных мышей линии C57Bl/6 и их плодов, принимая за 100% суммарное количество клеток в них. Учитывали абсолютное и относительное количество макрофагов, эпителиоидных клеток, лимфоцитов, нейтрофилов, фибробластов по критериям, изложенным в работе А.С. Логинова, Л.И. Аруина (1985).

Морфометрическое исследование печени плодов беременных мышей линии C57Bl/6 проводили с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек площадью 1,16х105мкм2 (Автандилов Г.Г, 1990). Подсчитывали объемную (Vv) плотность зон дистрофически и некротически измененных гепатоцитов, объемную (Vv) плотность очагов экстрамедуллярного кроветворения, численную (Nai) плотность мегакариоцитов. Степень выраженности репаративной регенерации в паренхиме печени плодов оценивали по численной плотности (Nai) двуядерных гепатоцитов.

Морфометрию структур плаценты беременных мышей линии C57Bl/6 осуществляли с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек площадью 1,16х105мкм2 (Автандилов Г.Г, 1990; Милованов А.П.,1999). В образцах плаценты подсчитывали численную (Nai) и объемную (Vv) плотности материнских и плодовых сосудов, объемную плотность (Vv) участков дистрофии и некроза хориального эпителия лабиринтного отдела плаценты, объемную плотность (Vv) гигантских трофобластических клеток, объемную плотность (Vv) островков гликогенсодержащих клеток и фуксинофильных коллагеновых волокон в плаценте беременных мышей линии C57Bl/6 (Милованов А.П., 1999). Кроме того, определяли массу плодов мышей сразу после их изъятия.

Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета прикладных программ “Statistica 5.0” на Pentium 4. Числовые данные выражали в виде средней арифметической величины и ошибки средней (М±m). Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании t- критерия Стьюдента для независимых выборок. Различия между средними величинами считали достоверными при p<0,05.

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Структурная организация печени здоровых беременных мышей линии C57Bl/6.

В печени беременных здоровых мышей линии C57Bl/6 выявили, при увеличении срока гестации, не сопровождавшихся образованием воспалительных инфильтратов, небольшие по масштабам дистрофические (объемная плотность очагов дистрофически измененных гепатоцитов) и некротические (объемная плотность зон микронекрозов гепатоцитов) изменения гепатоцитов, с доминированием первого процесса (табл. 2, 4), что является подтверждением возможного развития внутриклеточной репаративной регенерации дистрофически измененных гепатоцитов у этих животных. Однако, независимо от сроков гестации, в паренхиме печени беременных здоровых мышей выявили структурные признаки повышенной активности пластических процессов, что проявилось высоким уровнем содержания двуядерных гепатоцитов (количество двуядерных гепатоцитов и их объемная плотность) (см. табл. 2, 4).

2. Структурная организация плаценты здоровых беременных мышей линии C57Bl/6.

В плацентах беременных здоровых мышей линии C57Bl/6, независимо от сроков гестации, выявили незначительное преобладание концентрации материнских сосудов над плодовыми (количество материнских/плодовых сосудов и их объемная плотность) (табл. 6, 8). Помимо изменений сосудистого компонента плаценты у здоровых беременных мышей наблюдали незначительные по масштабам морфологические проявления физиологической клеточной гибели, увеличение концентрации гигантских трофобластических клеток в лабиринтном отделе плацент по мере увеличения сроков гестации (табл. 5, 7) . Это, очевидно, является структурным свидетельством развития физиологических инволютивных процессов и процессов клеточной репаративной регенерации в плаценте при нарастании сроков гестации.

3. Структурная организация печени плодов здоровых мышей-самок линии C57Bl/6.

При взвешивании плодов здоровых мышей-самок линии C57Bl/6, независимо от сроков гестации, гипотрофию не выявили (табл. 9, 11).

При исследовании структурной организации печени плодов здоровых мышей-самок линии C57Bl/6 выявили минимальные масштабы деструктивных изменений гепатоцитов в виде зон микронекрозов и, преобладающие на ними по масштабу очаги дистрофически измененных гепатоцитов (табл. 10, 12), что свидетельствуют о развитии внутриклеточной репаративной регенерации (Саркисов Д.С., 1967, 1971). Так же наблюдали увеличение содержания двуядерных гепатоцитов в паренхиме печени, что отражает активность процессов клеточной репаративной регенерации, которые могут быть детерминированы анаболическими эффектами гормонов плаценты (прогестерон, эстрадиол и др.) и, в значительной степени, фактора роста гепатоцитов (HGF) (Фишер Ю.Я., 1994; Милованов А.П., 1999, 2006), выделяемого трофобластическими клетками плаценты, клетками Купфера, гепатоцитами печени беременной (Конышев В.А., 1974). Помимо этого выявили уменьшение концентрации очагов внекостномозгового кроветворения и количества мегакариоцитов в них, по мере увеличения продолжительности беременности (см. табл. 10, 12), что может свидетельствовать о становлении печени, как, отчасти, независимого от материнского организма метаболического и трофического центра.

4. Патоморфологическая характеристика изменений в печени беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-гранулематозе, индуцированном во время беременности.

Морфологическими критериями активности воспаления и эффективности лечения служили показатели изменения количества гранулем в единице объема ткани и размеры (диаметр) гранулем (Кононенко В.Г., Шкурупий В.А., 2002).

В печени беременных мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ на 13 день периода гестации при сроке гестации 21 день и беременных мышей инфицированных вакциной БЦЖ на 13 день периода гестации при сроке гестации 21 день и леченных изониазидом через 8 суток после инфицирования, отмечали макрофагальные гранулемы, которые располагались диффузно и состояли, из макрофагов (Мф), незначительного количества моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. Некроза в БЦЖ-гранулемах во все периоды исследования выявлено не было, что, видимо, определяется низкой вирулентностью M.bovis в составе вакцины БЦЖ (Valone S.E. et al., 1988; Dahl K.E., et al., 1996). Аналогичные данные были получены в работах по изучению БЦЖ-гранулематоза Т.Г. Черновой (1993), П.Н. Филимоновым (1996), А.П. Надеевым (1998), М.А. Козяевым (1999), О.В. Потаповой (2003), Шкурупием В.А., (2002, 2003), а также Mendez-Samperio P. et al., (2000).

В печени беременных мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ на 13 день беременности, при сроке гестации 21 день на 8-е сутки БЦЖ-гранулематозного воспаления наблюдали меньшую численность БЦЖ-гранулем (в 2,2 раза), в сравнении с показателем у небеременных мышей-самок при аналогичной продолжительности периода инфицированности вакциной БЦЖ (табл. 1). При этом у леченных изониазидом, инфицированных беременных мышей, при сроке гестации 21 день и количество БЦЖ-гранулем на 8-е сутки развития БЦЖ-гранулематоза, было в 1,2 раза меньшим, в сравнении с величиной аналогичного показателя у нелеченных инфицированных беременных мышей при аналогичном сроке гестации.

Таблица 1. Результаты морфометрического исследования БЦЖ-гранулем в печени мышей-самок линии C57Bl/6, при развитии БЦЖ-гранулематозного воспаления и лечении изониазидом (M±m)

Примечание: “*” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра у беременных мышей при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и у небеременных мышей-самок, при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

“#” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и, лечении изониазидом, при p<0,05.

Данные изменения сопровождались уменьшением диаметра БЦЖ-гранулем в печени беременных, инфицированных, нелеченных мышей в 1,2 раза, в сравнении с величиной аналогичного показателя у небеременных мышей-самок при продолжительности БЦЖ-гранулематозного воспаления 8 суток (см. табл. 1). Возможно, спонтанное уменьшение количества гранулем сопряжено с большей микробицидной активностью макрофагов гранулем в печени у беременных мышей, в сравнении с инфицированными, небеременными мышами, вероятно, обусловленной влиянием “гормонов беременности” и плацентарных гормонов на макрофаги (Фишер Ю.Я.,1994) и усилением продукции ими активных метаболитов кислорода, обусловивших элиминацию части персистирующих M.tuberculosis. При этом, размеры БЦЖ-гранулем в печени леченных изониазидом, инфицированных беременных мышей были меньшими в 1,2 раза, в сравнении с величиной аналогичного показателя в группе нелеченных изониазидом, инфицированных беременных мышей на 8-е сутки БЦЖ-гранулематозного воспаления. Видимо, это обусловлено дополнительной элиминацией микобактерий из организма в целом и уменьшением количества возбудителя в печени при реализации бактерицидных свойств изониазида.

В паренхиме печени БЦЖ-инфицированных нелеченных и леченных изониазидом беременных мышей на 8-е сутки БЦЖ-гранулематозного воспаления выявляли альтеративные изменения в виде средневакуольной дистрофии гепатоцитов и, меньших по масштабу, зон микронекрозов. Степень выраженности деструктивных изменений в паренхиме печени, нелеченных, инфицированных беременных мышей была большей, чем таковая у здоровых беременных мышей и небеременных мышей-самок, инфицированных вакциной БЦЖ, но при этом была меньшей, чем у леченных изониазидом, инфицированных беременных мышей (табл. 2).

Повреждение паренхимы печени, очевидно, является результатом токсического воздействия метаболитов возбудителя (Зенков Н.И., 1993; Судаков К.В., 1997). При этом продукты деструкции ткани печени - “некрогормоны” - повышают чувствительность макрофагов к эндотоксинам (Shiratori Y., Tanaka M., Hai K. еt al., 1990). Это сопровождается их активацией и секрецией цитокинов TNF-б (McCuskey R.S., Urbasher R., McCuskey P. S. et al., 1989; Persoon J.N., Schornagel K., Brev J. et al., 1995), ИЛ-6 (Busam K., Bauer T. M., Bauer J. et al., 1990; Persoon J.N., Schornagel K., Brev J. et al., 1995), простагландинов (PGE2, PGJ2) (Rodriquez de Turko E., Spitzer J.,1990), окислов азота (Nathan C.C., 1991; Persoon J.N., Schornagel K., Brev J. et al., 1995), обладающих деструктивной способностью (Decker K., 1987, 1989; Shiratory Y., Tanaka M., Hai K., 1990). Меньшие масштабы некротических изменений по сравнению с дистрофическими изменениями гепатоцитов на 8-е сутки развития БЦЖ-гранулематозного воспаления как у нелеченных, так и у леченных беременных мышей свидетельствуют о развитии процессов внутриклеточной репаративной регенерации (Саркисов Д.С., 1967, 1971), которые могут быть детерминированы анаболическими эффектами гормонов плаценты (прогестерон, эстрадиол и др.) и, в значительной степени, фактора роста гепатоцитов (HGF) (Фишер Ю.Я., 1994; Милованов А.П., 1999, 2006), выделяемого трофобластическими клетками плаценты, клетками Купфера, гепатоцитами печени беременной (Конышев В.А., 1974).

При этом показатели численной и объемной плотностей двуядерных гепатоцитов преобладали в печени леченных изониазидом инфицированных беременных мышей над таковыми у нелеченных инфицированных животных, что можно расценивать как отсутствие подавления клеточных репаративных процессов в паренхиме печени при лечении изониазидом (см. табл. 2).

Таблица 2. Результаты исследования объемных плотностей (Vv) очагов дистрофии гепатоцитов, зон некрозов гепатоцитов и численной (Nai) и объемной (Vv) плотностей двуядерных гепатоцитов в паренхиме печени мышей-самок линии C57Bl/6, при развитии БЦЖ-гранулематозного воспаления и лечении изониазидом (M±m)

Примечание: “*” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и небеременными мышами-самками, при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

“#” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и, лечении изониазидом, при p<0,05.

“” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между здоровыми беременными мышами и беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

4.1. Патоморфологическая характеристика изменений в печени беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-гранулематозе, индуцированном до беременности.

В паренхиме печени беременных мышей линии C57Bl/6 4 группы, инфицированных вакциной БЦЖ за 30 суток до беременности, независимо от продолжительности периода инфицированности и срока гестации, были выявлены диффузно расположенные, БЦЖ-гранулемы, в которых эпителиоидные клетки (ЭК) располагались в центре гранулем, а по периферии гранулем Мф и моноциты, незначительное количество лимфоцитов и фибробластов. Некроз в гранулемах отсутствовал.

Состояние инфицированности вакциной БЦЖ, индуцированное до наступления беременности у мышей линии C57Bl/6, сопряжено со спонтанным уменьшением количества и размеров гранулем при увеличении продолжительности периода инфицированности и сроков гестации (табл. 3), что, очевидно, определяется “диссоциацией” клеток из гранулем, так как в последних не обнаруживали некрозы (Шкурупий В.А., и др., 1993; Шкурупий В.А., и др., 1998). Процесс “диссоциации” клеток из БЦЖ-гранулем может быть связан со снижением градиента хематтрактантов и факторов, детерминирующих удержание клеток в гранулеме (Чернова Т. Г., 1993; Филимонов П. Н., 1996; Шкурупий В. А., 1998). При этом, в условиях сочетания состояния инфицированности и беременности, возможно, что процесс “диссоциации” клеток из гранулем в печени обусловлен, так же, влиянием “гормонов беременности” на макрофаги гранулем и усилением продукции ими активных метаболитов кислорода, обусловивших элиминацию части персистирующих M.tuberculosis. Сочетание стояния инфицированности вакциной БЦЖ мышей-самок до наступления беременности и лечения изониазидом в течение всего периода гестации сопряжено с количественным и качественным изменениями БЦЖ-гранулем, что проявилось, в большей степени, чем у не леченных беременных мышей, уменьшением количества, размеров гранулем (cм. табл. 3). Данные изменения, очевидно, определяются реализацией эффектов изониазида и его метаболитов, в отношении микобактерий, что обеспечивает элиминацию части возбудителя из органа и организма в целом, а, следовательно, уменьшает активность резидентных макрофагов в печени к гранулемообразованию. Так же, по всей видимости, активируется механизм “диссоциации” гранулем, что может быть инициировано элиминацией части микобактерий, уменьшением продукции цитокинов активированными макрофагами, что обусловливает снижение градиента хематтрактантов в очаге воспаления (Кононенко В.Г., Шкурупий В.А., 2002) и является причиной нарушения межклеточных взаимодействий в гранулеме (Маянский Д.Н., 1991).

Таблица 3. Результаты морфометрического исследования БЦЖ-гранулем в печени мышей-самок линии C57Bl/6, при развитии БЦЖ-гранулематозного воспаления и лечении изониазидом (M±m)

Примечание: “*” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и небеременными мышами-самками, при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

“#” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и, лечении изониазидом, при p<0,05.

Помимо гранулем в паренхиме печени леченных изониазидом, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности мышей, во все периоды наблюдения определяли очаги средне- и крупновакуольной дистрофии, а у нелеченных инфицированных беременных мышей очаги крупновакуольной и баллонной дистрофии гепатоцитов, зоны микронекроза гепатоцитов, двуядерные гепатоциты (табл. 4). Выраженные деструктивные изменения в паренхиме печени, а также их прогрессирование, в связи с увеличением периодов инфицированности и лечения изониазидом, у нелеченных и леченных изониазидом беременных мышей, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности, вероятно, определяются, формированием БЦЖ-гранулематозного воспаления до наступления беременности, когда происходит реализация цитопатического влияния метаболитов M. tuberculosis, в сочетании с повреждающим действием цитокинов активированных макрофагов (McCuskey R.S., Urbasher R., McCuskey P. S. et al., 1989; Persoon J.N., Schornagel K., Brev J. et al., 1995). Формируется состояние “окислительного стресса” (Чернова Т.Г., 1993; Шкурупий В.А. и др. 1998; Козяев М.А., 1999; Потапова О.В., 2003; Надеев А.П. 2006; Beker J.E., 1988; Sies H., 1991) - возрастает активность свободно-радикального окисления, что сопровождается угнетением активности ферментов тканевого “дыхания” в клетках печени и деструкцией гепатоцитов (Леденев А.Н., Рууге Э.К., 1985; Биленко М.В., 1989). У леченных изониазидом, инфицированных до беременности мышей так же важным фактором деструкции гепатоцитов является реализация прямого токсического эффекта изониазида на гепатоциты (Буеверов А.О., 2001; Liu Z.X., Kaplowitz N., 2000), который увеличивается по мере прогрессирования срока гестации и периода инфицированности и обусловливает нарастание выраженности деструктивных изменений.

Не зависимо от продолжительности БЦЖ-гранулематозного воспаления, индуцированного до беременности соотношение дистрофически и некробиотически измененных гепатоцитов в паренхиме печени, леченных изониазидом, инфицированных беременных мышей было тем же, что и у инфицированных, но нелеченных беременных мышей (преобладание дистрофии над некрозом гепатоцитов) (см. табл. 4). Это указывает на сходный характер проявлений у них процессов внутриклеточной репаративной регенерации гепатоцитов.

Таблица 4. Результаты исследования объемных плотностей (Vv) очагов дистрофии гепатоцитов, зон некрозов гепатоцитов и численной (Nai) и объемной (Vv) плотностей двуядерных гепатоцитов в паренхиме печени мышей-самок линии C57Bl/6, при развитии БЦЖ-гранулематозного воспаления и лечении изониазидом (M±m)

Примечание: “*” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и небеременными мышами-самками, при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

“#” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и, лечении изониазидом, при p<0,05.

“” обозначены достоверные отличия величин рассматриваемого параметра между здоровыми беременными мышами и беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

Инфицирование мышей-самок вакциной БЦЖ до наступления беременности при отсутствии терапии изониазидом сопряжено с формированием в паренхиме печени деструктивных изменений больших масштабов, что, однако сопровождалось увеличением уровня клеточной репаративной регенерации (увеличение количества двуядерных гепатоцитов и их объема в паренхиме печени), что можно расценивать как реализацию стимулирующих влияний “гормонов беременности” и плацентарных факторов роста на синтез ДНК в гепатоцитах. При этом масштабы процессов клеточной репаративной регенерации в паренхиме печени у леченных изониазидом мышей, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности, возрастали по мере увеличения продолжительности периода инфицированности и лечения изониазидом и были, большими, в сравнении с проявлениями таковых процессов в печени, нелеченных беременных мышей в аналогичные периоды исследования БЦЖ-гранулематозного воспаления (см. табл. 4), что свидетельствует об отсутствии угнетения репаративных процессов в печени при реализации эффектов изониазида на ее клетки.

5. Характеристика патоморфологических изменений и регенераторных процессов в плаценте беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-гранулематозе, индуцированном во время беременности

Светооптическое исследование плацент беременных мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ на 13-е сутки беременности, нелеченных и леченных изониазидом, на 8-е сутки развития БЦЖ-индуцированного воспаления, признаков специфического гранулематозного процесса, в виде формирования БЦЖ-гранулем, выявлено не было. Это может свидетельствовать об эффективности клиринговой функции резидентных макрофагов и макрофагов гранулем печени в отношении микобактерий. Вместе с тем, нельзя исключить, что продукты метаболизма микобактерий и метаболиты изониазида проникали в плаценту, что проявилось формированием в плацентах деструктивных изменений в виде мелко- и средневакуольной дистрофии и очагов микронекрозов хориального эпителия лабиринтного отдела плацент (табл. 5). Этому, могла, способствовала активация плацентарных макрофагов метаболитами M.tuberculosis (Ietta F.,Yuanhong Wu., Romagnoli R. et al., 2007), циркулирующими в материнский кровотоке, что сопровождалось повышением уровня содержания провоспалительных цитокинов и развитием “окислительного стресса” (Minakami H. et al., 1993; Ghabour M.S., Eis A. L., Brockman D. E. et al., 1995; Kato H., Ohashi T., Matsushiro H. et al., 1997; Gubel C.A., 1998) с образованием большого количества активных форм кислорода (Wulf., 2002), которые, обладают повреждающим действием на клетки хориального эпителия лабиринтного отдела плаценты. У нелеченных и леченных изониазидом инфицированных беременных мышей на 8-е сутки БЦЖ-индуцированного воспаления отмечали преобладание масштабов дистрофических изменений хориального эпителия лабиринтного отдела плацент над масштабами некроза (см. табл. 5), что можно расценивать, как проявление процессов репаративной регенерации в дистрофически измененных клетках хориального эпителия. При этом, у леченных изониазидом инфицированных беременных мышей масштабы деструктивных изменений в плаценте, были меньшими в сравнении с таковыми у не леченных животных, что можно расценивать как структурные признаки сохранности клиринговой функции печени инфицированных животных в отношении проникновения в плаценту не только метаболитов M.tuberculosis, но и метаболитов изониазида и предотвращение реализации их повреждающего воздействия на плаценту.

Таблица 5. Результаты исследования структурной организации плаценты беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-индуцированном воспалении и лечении изониазидом (M ± m)

Примечание: “г” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза, леченных изониазидом и беременными здоровыми мышами при введении изониазида, при р <0,05. “#” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и лечении изониазидом, при p<0,05. “” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между здоровыми, беременными мышами и беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

Наряду с этими изменениями, выявили нарушение ангиогенеза, что проявлялось уменьшением концентрации плацентарных сосудов, развитием фибриноидных изменений, преимущественно, стенок сосудов материнской части плаценты и сопровождалось очаговым стазом в них с формированием ишемии. При этом уменьшение величин показателей численной и объемной плотностей материнских сосудов в плацентах леченных изониазидом, инфицированных беременных мышей на 8-е сутки БЦЖ-индуцированного воспаления, было выражено в большей степени, чем у нелеченных животных (табл. 6). Данные изменения, видимо, определяются непосредственным повреждением, в первую очередь, эндотелиальных клеток материнских сосудов плаценты метаболитами M. tuberculosis и, в меньшей степени, метаболитами изониазида. Это может инициировать активацию плацентарных макрофагов с образованием активных метаболитов кислорода (АМК). Кроме того, не исключено, в этой связи, выделение и поступление тромбогенных факторов активированных макрофагов (PAF), которые обусловливают стаз и тромбоз в материнских сосудах плаценты, что вызывает повреждение эндотелиальных клеток в связи с ишемией и гипоксией стенок самих сосудов.

Преобладание в плацентах как леченных изониазидом, так и нелеченных беременных мышей, инфицированных вакциной БЦЖ во время беременности, плодовых сосудов (см. табл. 6), видимо, связано с усилением секреции плацентарными макрофагами активных метаболитов кислорода (АМК), в частности, NO, который способствует реализации эффектов плацентарных ростовых факторов (Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Droge W., 2002; Nathan C., 2003) в отношении тканей плаценты. Так сосудистый эндотелиальный фактор роста (Reynolds L.P. , Redmer D.A., 2001) индуцирует усиление ангиогенеза плодовых сосудов.

Таблица 6. Результаты исследования материнских и плодовых сосудов в плаценте беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-индуцированном воспалении (M ± m)

Примечание: “г” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза, леченных изониазидом и беременными здоровыми мышами при введении изониазида, при р <0,05. “#” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и лечении изониазидом, при p<0,05. “” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между здоровыми, беременными мышами и беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.

Нарушение ангиогенеза, в плацентах инфицированных вакциной БЦЖ во время беременности мышей линии C57Bl/6 могло служить дополнительным фактором развития деструктивных изменений, что сопровождалось у нелеченных животных признаками нарушения процессов клеточной репаративной регенерации в виде уменьшения содержания гигантских трофобластических клеток в лабиринтном отделе плацент (см. табл. 5). У леченных изониазидом беременных мышей состояние инфицированности вакциной БЦЖ сопровождалось увеличением уровня содержания гигантских трофобластических клеток в лабиринтном отделе плацент, в сравнении с таковым у нелеченных, инфицированных беременных мышей (см. табл. 5). Это, видимо, сопряжено с формированием у леченных изониазидом животных, больших по масштабу, деструктивных изменений в плаценте, а преобладание процессов дистрофии хориального эпителия над его некрозом, свидетельствует о высокой активности процессов клеточной репаративной регенерации дистрофически измененного хориального эпителия плаценты.

5.1. Характеристика патоморфологических изменений и регенераторных процессов в плаценте беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-гранулематозе, индуцированном до беременности.

При гистологическом исследовании плацент леченных и нелеченных изониазидом, беременных мышей линии C57Bl/6, инфицированных вакциной БЦЖ за 30 суток до беременности, во все периоды исследования БЦЖ-индуцированного воспаления наблюдали очаги средне- и крупновакуольной дистрофии и зоны некроза хориального эпителия лабиринтного отдела плаценты, в сочетании с признаками нарушения репаративной регенерации в виде уменьшения показателей численной и объемной плотности гигантских трофобластических клеток. Гранулемообразования в плацентах нелеченных и леченных изониазидом мышей, инфицированных вакциной БЦЖ до беременности, выявлено не было.

Выявили, что лечение изониазидом беременных, инфицированных мышей сопряжено с большими масштабами деструктивных изменений (вакуольная дистрофия и некроз хориального эпителия лабиринтного отдела плацент), чем у нелеченных, инфицированных беременных мышей (табл. 7).

Таблица 7. Результаты исследования структурной организации плаценты беременных мышей линии C57Bl/6 при БЦЖ-индуцированном воспалении и лечении изониазидом (M ± m)

Примечание: “г” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза, леченных изониазидом и беременными здоровыми мышами при введении изониазида, при р <0,05. “#” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза и беременными мышами при развитии БЦЖ-гранулематоза и лечении изониазидом, при p<0,05. “” обозначены отличия величин рассматриваемого параметра между здоровыми, беременными мышами и беременными мышами при “естественном” развитии БЦЖ-гранулематоза, при p<0,05.