Размещено на http://www.allbest.ru/

22

На правах рукописи

Автореферат диссертации

на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток

Лебединская Ольга Витальевна

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени ак. Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (Пермь), в лаборатории регуляции иммунитета ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН» (Москва) и в лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН» (Москва)

Научные консультанты:

академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор Черешнев Валерий Александрович;

доктор медицинских наук, профессор Киселевский Михаил Валентинович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Быков Владимир Лазаревич;

доктор медицинских наук, профессор Верин Владимир Константинович;

доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Московская государственная медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Защита состоится: 2007 г. на заседании диссертационного совета Д 208.087.01 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (194100 Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2, тел.: 542-95-92)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ».

Автореферат разослан: 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Н.Р. Карелина.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Исследование и использование в клинике стволовых клеток (СК) являются одними из самых актуальных вопросов современной биологии. Интерес к СК обусловлен, с одной стороны, возможностями изучения на этой модели механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток, и участия в этих процессах специфических факторов, определяющих тип дифференцировки in vivo и in vitro. С другой стороны, актуальность данной проблемы связана с возможностью применения СК для генной и клеточной терапии [Dinsmore J., Ratliff J., Jacoby D. et al., 1998; Schuldiner V., Yanuka O., Iscovitz-Eldor J. et al., 2000]. Наиболее перспективной областью применения СК следует считать, по-видимому, заместительную биотерапию [Uzan G., 2004]. Причем успехи клинического применения СК, а также возможности появления новых направлений в этой области напрямую зависят от результатов фундаментальных исследований, направленных на изучение стволовых клеток.

Существенный интерес для клинического применения представляют мезенхимальные стволовые клетки (МСК), входящие в состав популяции стромальных клеток-предшественников костного мозга [Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al., 2001; Ballas C.B., Zielske S.P., Gerson S.L., 2002]. Стромальные клетки-предшественники костного мозга были открыты А.Я. Фриденштейном [Friedenstein A., Chailakhjan R., Lalykina K., 1970] около 30 лет назад. Оказалось, что при эксплантации диссоциированных костномозговых клеток в ограниченном количестве in vitro в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки, в культурах развиваются колонии адгезивных фибробластоподобных клеток. Каждая колония является клоном, то есть образуется путем пролиферации одной клетки. Эти клетки были названы колониеобразующими клетками фибробластов - КОК-ф, или стромальными клетками-предшественниками [Friedenstein A., Chailakhjan R., Lalykina K., 1970; Friedenstein A., 1976].

КОК-ф могут быть широко использованы в репаративной биотерапии в силу своего значительного пролиферативного и дифференцировочного потенциала. Численность мезенхимных стволовых клеток может увеличиваться in vitro в 100000 раз в течение 6-8 недель, при этом они остаются в недифференцированном состоянии [Pituch-Noworolska A., Majka M., Janowska-Wieczorek A. et al., 2003]. Таким образом, мезенхимальные стволовые клетки, часть популяции стромальных клеток-предшественников, обладают всеми признаками СК: они способны к интенсивной пролиферации, могут дифференцироваться во многие клеточные типы, трансплантабельны in vivo [Vassilopoulos G., Wang P., Russel D., 2003]. КОК-ф содержатся не только в костном мозге, но и в других кроветворных и лимфоидных органах - селезёнке, тимусе, лимфатических узлах.

Несмотря на значительный интерес, который проявляют исследователи в последние годы к стромальнымстволовым клеткам, многие сведения, касающиеся КОК-ф противоречивы, а часть вопросов остаются не изученными. Например, не исследованы возрастные изменения количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников и их потомков. Недостаточно изучены иммунофенотип, морфологические и гистохимические особенности КОК-ф, характеристика формируемых ими колоний, влияние условий культивирования и ряда ростовых факторов на дифференцировку и клоногенность стромальных стволовых клеток. Ограничены знания о действии введённых in vivo и in vitro бактериальных антигенов и некоторых иммуномодулирующих препаратов на клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф. Практически не исследованы индуцибельные остеогенные клетки-предшественники, выявляющиеся в кровеносном русле и серозных полостях, дискутируются вопросы о возможности циркуляции стромальных клеток предшественников и т.д.

Стромальные стволовые клетки составляют кроветворное микроокружение лимфоидной и миелоидной ткани. Они продуцируют целый ряд необходимых для функционирования гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток ростовых факторов и цитокинов: интерлейкины - 6, 7, 8, 11, 12, 14, колониестимулирующие факторы, LIF и ряд других [Haynesworth S., Baber M., Caplan A., 1996; Ballas C., Zeilske S., Gerson S., 2002]. В свою очередь иммунокомпетентные клетки также вырабатывают ряд стимулирующих и ингибирующих факторов, которые оказывают воздействие на стромальные клетки-предшественники. Таким образом, возможна обоюдная «корректировка» нарушений как микроокружения, так и гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток.

В связи с этим другой важнейшей проблемой является исследование возможностей дифференцировки ex vivo иммунокомпетентных клеток (активированных мононуклеарных лейкоцитов, антигенпрезентирующих дендритных клеток, натуральных киллеров и натуральных киллеров-Т-клеток) под влиянием регуляторных факторов, вырабатываемых стромальными клетками микроокружения. Именно данные группы генерированных экстракорпорально клеток находят всё большее применение в биотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний, некоторые из них используются для создания противоопухолевых и противоинфекционных вакцин.

Митогенные факторы (лектины) и цитокины (интерлейкины) при инкубации со зрелыми лимфоцитами крови вызывают реакцию бласттрансформации (РБТЛ). В процессе реакции РБТЛ в популяции зрелых лимфоцитов появляются незрелые лимфоидные элементы типа иммунобластов и пролимфоцитов, которые относят к категории активированных лимфоцитов. Иммунофенотип этих клеток также свидетельствует об уменьшении количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры зрелых лимфоцитов (CD3, CD4, CD8). Подобное явление можно рассматривать как этап дифференцировки зрелых лимфоцитов. Интересен поиск иммуномодулирующих агентов, способных вызвать подобный митогенный эффект. Примером трансдифференцировки гемопоэтических клеток может служить генерация дендритных клеток (ДК). При воздействии ростовых факторов ДК могут быть получены из клеток как миелоидного, так и лимфоидного ряда. Однако группа изученных источников генерации и индукторов созревания ДК весьма ограниченна.

Вышеизложенное свидетельствует о наличии множества нерешённых вопросов, касающихся стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток. Часть из них может быть решена в комплексном исследовании данных клеток в процессе их культурального роста под воздействием разнообразных регуляторных факторов.

Цель исследования - изучение морфологических, иммунофенотипических и функциональных свойств стромальных и иммунокомпетентных клеток, а также видовых, возрастных и культуральных особенностей их дифференцировки ex vivo и возможностей её регуляции.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать клоногенные свойства, морфогистохимические и иммунофенотипические особенности стромальных клеток-предшественников костного мозга и выделенных из биологических жидкостей (крови, плеврального, перикардиального и перитонеального транссудатов) КОК-ф лабораторных животных при различных условиях культивирования in vitro.

2. Определить возрастные изменения количества и клоногенных возможностей детерминированных и индуцибельных остеогенных клеток-предшественников и морфологии формируемых ими колоний у различных лабораторных животных.

3. Изучить возможности модуляции дифференцировки, клоногенных и остеогенных свойств стромальных клеток-предшественников с использованием бактериальных антигенов и человеческого б-фетопротеина, входящего в качестве основного компонента в препарат профеталь.

4. Провести сравнительный анализ морфологических и функциональных свойств детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных клоногенных клеток, находящихся в перитонеальном транссудате и экссудате крыс.

5. Исследовать морфогистохимические, электронно-микроскопические и биологические характеристики мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, активированных интерлейкином-2, фитогемагглютинином и человеческим б-фетопротеином в составе препарата профеталь

6. Охарактеризовать иммунофенотип, функциональную активность, морфологические и иммуноцитохимические особенности натуральных киллеров, выделенных из поражённой опухолевым процессом печени лабораторных животных, печени и плеврального экссудата онкологических больных, и дифференцированных из них натуральных киллеров Т-клеток и лимфокин-активированных киллеров.

7. Выявить возможности экстракорпоральной генерации антигенпрезентирующих дендритных клеток из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, прогениторных клеток печени эмбрионов и костного мозга взрослых мышей и индукции созревания их с применением различных иммуномодуляторов. Изучить в сравнительном аспекте иммунофенотипические и морфо-функциональные особенности полученных клеток.

8. Изучить возможности получения опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов при инкубации со зрелыми дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами.

Научная новизна. На значительном экспериментальном материале впервые подробно изучены индуцибельные стромальные остеогенные клетки-предшественники, выявленные в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном, перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате) лабораторных животных.

Дана сравнительная характеристика изменений морфогистохимических, иммунофенотипических и функциональных показателей КОК-ф костного мозга и клоногенных клеток, обнаруженных в перитонеальном транссудате и экссудате крыс, под влиянием биологических особенностей экспериментальных животных (возраст, вид) и условий культивирования.

Показаны не изученные ранее возрастные изменения численности и эффективности клонирования детерминированных остеогенных клеток-предшественников (ДОКП) костного мозга и индуцибельных остеогенных клеток-предшественников (ИОКП) тимуса, селезёнки, перитонеального транссудата и экссудата различных лабораторных животных.

Впервые исследованы изменения иммунофенотипа, численности и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников костного мозга и селезёнки мышей СВА под действием введённого in vivo и in vitro препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента человеческий б-фетопротеин (ч-АФП). На модели гетеротропных трансплантатов впервые продемонстрированы изменения эффективности клонирования и способности к остеогенезу КОК-ф костного мозга мышей при вакцинации их антигенами стрептококка группы А.

Получены новые данные, характеризующие динамику дифференцировки лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) из мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) периферической крови человека, и на основе морфологических, функциональных и иммунофенотипических характеристик определены оптимальные сроки их культивирования.

Впервые проведена сравнительная оценка активации мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека под влиянием интерлейкина-2 (IL-2), фитогемагглютинином (ФГА) и препарата профеталь (ПФТ). Выявленавысокая степень бласттрансформации под действием последнего с формированием CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.

Исследованы мононуклеарные лейкоциты крови, МЛ, циркулирующие в плевральном и перитонеальном экссудате и инфильтрирующие различные участки печени онкологических больных и экспериментальных животных с метастатическим процессом, их морфологические, цитоиммунохимические и фенотипические особенности, продемонстрированы возможности их дифференцировки в ЛАК и НКТ-клетки, показаны их сравнительные характеристики.

Впервые дана сравнительная оценка морфогистохимических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных особенностей незрелых и зрелых дендритных клеток, генерированных из различных источников под действием ряда иммуномодуляторов.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты подробного изучения индуцибельных стромальных остеогенных клеток-предшественников, обнаруженных в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном транссудатах, перитонеальном транссудате и экссудате), расширяют представления о стволовых мезенхимных клетках, в том числе как источника применения в практической медицине.

Сравнительная характеристика детерминированных остеогенных клеток-предшественников костного мозга и выявленных в биологических жидкостях индуцибельных остеогенных клеток предшественников имеет научно-теоретическое значение и вносит вклад в дискуссию о возможностях циркуляции стволовых стромальных клеток.

При изучении влияния условий культивирования КОК-ф на их клоногенные свойства продемонстрирована необходимость соблюдения оптимальных параметров - определённой плотности эксплантируемых клеток, присутствия фидера определённого происхождения в культурах, времени адгезии клеток и т.д. при разработке методов подготовки стволовых стромальных клеток ex vivo с целью использования в биотерапии или экспериментальных исследованиях.

Полученные данные о возрастных изменениях количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга, тимуса, селезёнки и биологических жидкостей имеют значение для понимания процессов, происходящих при возрастном остеопорозе, и трактуют необходимость учёта возраста донора и реципиента, источника получения мезенхимных стволовых клеток на определённом возрастном этапе в случае применения КОК-ф в заместительной терапии.

Выявленное влияние антигенов стрептококка группы А на клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф на модели гетеротопных трансплантатов акцентирует внимание на том, какое значительное воздействие могут оказывать процессы, происходящие в организме реципиента, на функциональные способности трансплантированных стромальных клеток предшественников и морфологистохимические особенности формирующейся костной ткани. И это, несомненно, необходимо учитывать при разработке методов по использованию мезенхимных стволовых клеток для трансплантации.

На основании выявленной динамики дифференцировки лимфокин-активированных киллеров из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, их морфологических, функциональных, иммунофенотипических характеристик определены оптимальные сроки экстракорпорального культивирования ЛАК, применяемых в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний.

Исследование иммуномодулирующих способностей препарата профеталь демонстрирует его более широкие по сравнению с классическими митогенами возможности для экстракорпорального получения активированных мононуклеарных лейкоцитов, обладающих высокими пролиферативными и цитотоксическими способностями, для индукции созревания дендритных клеток и опосредованного влияния через данные популяции на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки. Данные эффекты и выявленный в исследованиях высокий уровень бласттрансформации мононуклеарных лейкоцитов под действием профеталя, приводящей к формированию CD34/45-положительных гемопоэтических клеток-предшественников предполагает возможность использования изученных свойств этого препарата в практической медицине.

Выявленная возможность генерации ЛАК-клеток из мононуклеарных лейкоцитов плеврального и перитонеального экссудатов, ЛАК и НКТ-клеток из паратуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных с метастатическим процессом и поражённых опухолью мышей, изучение морфологических, иммунофенотипических и функциональных характеристик полученных ЛАК и НКТ-клеток имеет значение для теоретической и клинической онкологии.

Сравнительный анализ морфологических, гистохимических, электронно-микроскопических, функциональных и иммунофенотипических особенностей дендритных клеток различного происхождения и находящихся на разных этапах созревания вносит вклад в теоретические аспекты клеточной дифференцировки и предоставляет возможность выбора источников и индукторов созревания при разработке методов создания ДК-вакцин для использования в биотерапии опухолей и тяжёлых инфекций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективность клонирования и морфология формируемых колоний в равной степени как детерминированных стромальных остеогенных клеток-предшественников костного мозга, так и выявленных в биологических жидкостях индуцибельных остеогенных клеток-предшественников зависит от биологических особенностей экспериментальных животных и условий культивирования, связанных с влиянием гемопоэтических клеток, претерпевают значительные изменения в процессе онтогенеза.

2. Под влиянием антигенов стрептококка группы А происходят измененияне только численности и клоногенных свойств детерминированных клеток-предшественников костного мозга мышей, но и процессов остеогенеза, осуществляемых КОК-ф в гетеротопных трансплантатах. Причём степень этих изменений зависит от длительности воздействия бактериальных антигенов на остеогенные клетки.

3. Стимулирующее влияние препарата профеталь, введённого in vivo, на КОК-ф костного мозга и селезёнки мышей выражается непосредственно в усилении пролиферативных и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников. Ингибиция колониеобразующих способностей КОК-ф при введении профеталя in vitro осуществляется опосредованно через активированные препаратом мононуклеарные лейкоциты.

4. Сравнительная характеристика морфогистохимических, электронно-микроскопических, фенотипических и функциональных свойств мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, инкубированных с IL-2, ФГА и профеталем демонстрирует наиболее выраженную стимуляцию цитотоксической и пролиферативной активности МНПК под влиянием последнего. Бласттрансформация мононуклеарных лейкоцитов, вызванная действием человеческого б-фетопротеина в составе препарата профеталь, приводит к появлению CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников в культурах.

5. Генерация ЛАК-клеток возможна из МЛ плеврального, перитонеального экссудатов, ЛАК и НКТ-клеток - из перитуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных и печени экспериментальных животных с метастатическим процессом.

6. Клетки, генерированные из моноцитов периферической крови человека, прогениторных клеток эмбриональной печени мышей, клеток-предшественников костного мозга взрослых животных, бластов больных острым миелоидным лейкозом имеют комплекс морфологических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных признаков ДК. Созревание их может происходить как под действием общепринятого индуктора - фактора некроза опухолей (TNF-б), так и под влиянием ряда иммуномодулирующих агентов (препарата профеталь, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения, поликомпонентной вакцины ВП-4).

Апробация работы.

Материалы диссертационного исследования представлены в виде публикаций на 66 конференциях, съездах, форумах и конгрессах, из них: 3 - на международных конгрессах, 5 - на международных форумах и съездах, 21 - на международных и общероссийских конференциях с международным участием, 25 - на всероссийских конференциях, симпозиумах и съездах, 12 - на межрегионарных, региональных и заочных электронных конференциях РАЕ.

В виде устных и постерных докладов основные положения исследований доложены на: VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), Х Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005» (Санкт-Петербург, 2005), Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006), Международной научной конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитации (Москва, 2005), Всероссийской научной конференции, посвящённой памяти академика Н.В. Васильева (Томск, 2005), V Всероссийской научной конференции с международным участием (Уфа, 2005), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Пермь, 2005), II Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальная и клиническая лимфология - практическому здравоохранению» (Пермь, 2003), Межрегионарной научной сессии ПГМА и ИГМА (Пермь, 2005), Научной конференции «Иммунология вчера, сегодня и завтра», (Пермь, 2005), Научных сессиях ПГМА (Пермь 1996, 1997, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004, 2006).

Апробация диссертации состоялась 02.06.2006 г. на объединённом межкафедральном научном заседании морфологических кафедр и кафедры микробилогии и иммунологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ, иммунологов Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь) и кафедры микробилогии и иммунологии Пермского государственного университета.

Внедрение в практику. Основные результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедр онкологии, инфекционных болезней, кафедры профессиональных болезней, промышленной экологии и терапии медико-профилактического факультета с курсом профпатологии ФПК и ППС, гистологии, эмбриологии и цитологии, микробиологии и иммунологии, патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера Росздрава», кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, в лечебный процесс отделения биотерапии ГУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН» (Москва), в научно-исследовательскую работу лабораторий Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь), Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), Института стволовой клетки и клеточных технологий РАМН (Москва).

Экономическая значимость работы обусловлена разработкой малозатратных и недорогостоящих методов экстракорпоральной генерации активированных мононуклеарных лейкоцитов, CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников и антигенпрезентирующих дендритных клеток, которые могут быть использованы при создании препаратов, применяемых в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 98 печатных работах. В рекомендуемых ВАК изданиях: 31 статья опубликована в рецензируемых журналах, 2 работы депонированы в ВИНИТИ, 56 статей и тезисов представлены в материалах международных конгрессов, форумов, всесоюзных и всероссийских съездов, международных и общероссийских конференций, В прочих изданиях (межрегиональных и региональных) напечатано 9 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, посвящённых собственным исследованиям, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 53 графиками, 27 гистограммами, 270 фотографиями, содержит 31 таблицу. Библиографический список включает 352 источника (70 - отечественных и 283 - зарубежных авторов).

Место проведения работы. Диссертационная работа обобщает исследования стромальных клеток-предшественников, выполненные автором на базе лаборатории иммуноморфологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, проф. А.Я. Фриденштейна; вопросы влияния культуры стрептококка группы А и препарата профеталь на КОК-ф - в отделе регуляции иммунитета ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН» (зав. лаб. - д-р мед. наук, проф. В.Г. Нестеренко). Исследование иммунофенотипа и функциональных свойств иммунокомпетентных клеток (мононуклеарных лейкоцитов, дендритных клеток, натуральных киллеров, натуральных киллеров Т-клеток) - на базе лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН» (зав. лаб. - д-р мед. наук, проф. М.В. Киселевский). Морфологическая часть работы выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава» (зав. каф. - д-р мед. наук, проф. В.А. Четвертных); электронно-микроскопические исследования - в группе электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (зав. гр. - д-р биол. наук, В.И. Попенко).

Автор выражает благодарность коллективам и руководителям названных научных учреждений и лично ведущему научному сотруднику НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи - д-ру мед. наук Ю.Ф. Горской и старшему научному сотруднику РОНЦ им. Н.Н. Блохина - канд. мед. наук Н.К. Ахматовой, совместно с которыми проведено ряд исследований. Автор искренне благодарен всем участникам работы, чей вклад адекватно отражён в совместных публикациях.

Автор также благодарит своих научных консультантов: ак. РАН и РАМН, д-ра мед. наук, проф. В.А. Черешнева и д-ра мед. наук, проф. М.В. Киселевского за постоянную помощь, внимание и доброжелательное участие на всех этапах работы.

Особая глубокая благодарность и память - своему Учителю, увлёкшему изучением стволовых стромальных клеток, давшему направление исследованиям, - чл.-корр. РАМН, д-ру мед. наук, проф. А.Я. Фриденштейну.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в рамках программы «Влияние инфекционного процесса на стромальные остеогенные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и программы «Разработка методов адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований. Исследование механизмов противоопухолевого иммунитета» ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

дендритный иммуномодулирующий иммунофенотип

Содержание работы

Объекты исследования. Исследования проведены на самцах лабораторных животных: 700 мышах линии СВА и гибридов F4 массой 18-20 г, 30 эмбрионах мышей СВА, 615 крысах линии Wistar и Augusta массой 45-350 г, 175 морских свинках линии Хьюстон массой 180-250 г, 20 кроликах Новозеландской, Калифорнийской пород и породы «Шиншилла» массой 1,5-2 кг.

Материалы исследования. В исследовании использованы также 20 культур штаммов стромальных фибробластов костного мозга здоровых добровольцев, 210 проб периферической крови здоровых добровольцев, 30 проб периферической крови онкологических больных, 20 проб плеврального, 30 проб перитонеального экссудатов онкологических больных с метастатическим процессом, 65 биоптатов селезёнки онкологических больных, 20 проб костного мозга больных острым миелоидным лейкозом, 20 проб биопсийного материала поражённой метастазами печени онкобольных и 10 проб биопсийного материала печени, поражённой опухолевым процессом и гепатитом В.

Методы исследования.

Культуральные

Культивирование стромальных клеток-предшественников костного мозга, тимуса, селезёнки, клеток гетеротопных трансплантатов костного мозга и селезёнки, клоногенных клеток, находящихся в биологических жидкостях организма лабораторных животных (крови, плевральном, перикардиальном, перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате). В исследованиях использовали 4 вида культур: AMCC (Adhesive myeloid culture cells) - культуры адгезивных костномозговых клеток, оставшихся после удаления неприкрепившихся к поверхности культурального сосуда гемопоэтических элементов (А-культуры); AMCC+F (Adhesive myeloid culture cells + feeder) - культуры адгезивных костномозговых клеток с последующим добавлением облученных клеток красного костного мозга -фидера (А+ф-культуры); FMCC (Full myeloid culture cells) - культуры полной популяции костномозговых клеток (П-культуры); FMCC+F (Full myeloid culture cells + feeder) - культуры полной популяции костномозговых клеток с последующим добавлением фидера (П+ф-культуры), при различных условиях культивирования [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980]. Определяли количество, морфологию сформированных колоний состоящих не менее чем из 50 клеток, морфологию, гистохимию и иммунофенотип образующих их клеток. Определяли численность КОК-ф и эффективность их клонирования (ЭКО-ф - 10^-5 или 10^-6) по формуле

или 10⁶.

Клонирование КОК-ф и получение перевиваемых штаммов стромальных фибробластов лабораторных животных и человека [Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я., 1978].

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов [Boyum A., 1968] периферической крови здоровых доноров, онкологических больных, крови и селезёнки мышей СВА, активированных ИЛ-2, ФГА и препаратом профеталь, основным действующим компонентом которого является человеческий б-фетопротеин, лиофилизированный и стабилизированный декстраном. Интерлейкин-2 (Proleukine, Chiron, Голландия) использовался в дозах 1000-2000 МЕ/мл, фитогемагглютинин (ПанЭко, Москва) - в дозах 5,0-10,0-15,0 мкг/мл, профеталь (ЗАО «Институт новых медицинских технологий», Пермь) - в дозах 0,001-0,01-0,1-1,0-10,0 мкг/мл.

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов селезёнки, печени, плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных, коинкубированных с ИЛ-2 («Ронколейкин», Биотех, Россия) в дозе 2000 МЕ/мл.

Генерация и культивирование дендритных клеток. ДК получали из различных источников: моноцитов периферической крови здоровых доноров, бластных форм больных острым миелоидным лейкозом, прогениторных клеток-предшественников печени эмбрионов и костного мозга взрослых мышей СВА, с применением стандартного набора цитокинов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) [Чкадуа Г.З. и др., 2002] и индуцировали созревание ДК с помощью фактора некроза опухолей (ФНО-б), ВП-вакцины, бактериальных липополисахаридов (ЛПС), препарата профеталь.

Культивирование опухолевых клеток NK-чувствительных линий: эритробластного лейкоза человека - К-562, колоректального рака человека - Colo, мышиной лимфомы - YАС-1, рака яичников мышей - СаО-1 и опухоли Эрлиха. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянными пассажами культуры через каждые 2-3 суток.

Методы аллогенной гетеротопной трансплантации

Пересадка клеток костного мозга и селезёнки мышей СВА под капсулу почки мышам той же линии [Чайлахян Р.К. и др., 2001] при сочетаниях донора и реципиента: «молодой - молодой», «старый - молодой», «молодой - старый» [Горская Ю.Ф. и др., 2001].

Пересадка клеток костного мозга мышей СВА под капсулу почки мышам той же линии [Чайлахян Р.К. и др., 2001] при сочетаниях донора и реципиента: «нормальный - нормальный», «иммунизированный культурой стрептококка группы А - нормальный», «нормальный - иммунизированный культурой стрептококка группы А» [Горская Ю.Ф. и др., 2005]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно убитой вакциной стрептококка группы А 5-го типа (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) в течение 3 недель нарастающими дозами вакцины (на 1-й неделе - 1 млрд. микробных клеток на инъекцию, на 2-й - 2 млрд. и на 3-й - 3 млрд.). Показано, что при такой схеме иммунизации животных (кроликов, мышей) кроме образования антител к антигенам стрептококка, наблюдается появление аутоантител к антигенам различных тканей организма [Базанова Е.А. и др., 1991; Данилова Т.А. и др., 1994]. Определение аутоантител к антигенам ткани сердца в сыворотках иммунных мышей проводили с помощью непрямого метода иммунофлюоресценции (НИФ) на срезах сердца быка [Danilova T.A., 1994]. Использована сыворотка против иммуноглобулинов мыши, меченная ФИТЦ, производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Анализ иммунофенотипа методом проточной цитофлюорометрии.

Исследование экспрессии поверхностных кластеров детерминации клеток (FACS-анализ) при помощи соответствующих моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Определяли уровень экспрессии дифференцировочных антигенов - CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, NK 1.1; активационных антигенов - CD25, CD38; молекул адгезии - CD57, CD58; маркёров гемопоэтических клеток-предшественников - CD34, CD45; костимулирующих молекул - CD40, CD80/B7-1, CD86/B7-2; молекул антигенного представления CD1а, MHC I и II классов (HLA-DR и др.), маркёров моноцитов/макрофагов - CD11c, CD14, CDF4/80; семейства молекул CD11с, CD29 и маркёра терминальной дифференцировки ДК - CD83.

Метод иммуномагнитной сепарации.

Выделение CD34+ клеток из активированных мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров посредством положительной селекции клеток с использованием набора для магнитной сепарации опухолевых клеток (MACS Cytokeratin Microbeads Carcinoma Cell Enrichment Kit, Miltenvi Biotec, Германия). МЛ инкубировали с магнитными шариками, покрытыми моноклональными антителами к CD34. Процедуру иммуномагнитного разделения проводили в соответствии с протоколом, предусмотренным производителем. Обогащённую взвесь CD34+ клеток помещали на покрытые полилизином стёкла и окрашивали FITC-меченными моноклональными антителами CD34, а также для морфологической идентификации - гематоксилином-эозином. Образцы, включавшие две и более клеток с шариками, прикрепленными в форме розетки, считались положительными.

Методы цитологического исследования.

Фазовоконтрастная микроскопия культуральной взвеси в светлом и тёмном поле и при окраске моноклональными антителами, меченными FITC (флюоресцинизотиоционатом) и R-PE (фикоэритрином) с соответствующими изотипическими контролями IgG1 (Caltag Laboratories, США) с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Zeiss, Германия).

Гистологические и гистохимические методы - окраска парафиновых срезов органов, мазков культуральной взвеси, колоний и клеток, прилипших к дну культурального сосуда, гематоксилином-эозином, азуром II-эозином по Романовскому-Гимзе, метиленовым синим, фуксином Циля, метиловым зелёным-пиронином по Браше с контрольной обработкой РНК-зой для выявления РНК, кармином Беста, Шифф-йодной кислотой по Шабадашу на гликоген, Шифф-йодной кислотой по Шабадашу с контрольной обработкой амилазой и альциановым синим для определения содержания гликозаминогликанов, суданом I на липиды, выявление активности щелочной фосфатазы по Гомори [Лилли Р., 1969].

Иммуноцитохимические методы - определение экспрессии антигенов клеток при помощи моноклональных антител (Novocastra, Швейцария) на парафиновых срезах печени онкологических больных, поражённых метастатическим процессом, и мышей, заражённых опухолью. Исследованы маркёры: б-фетопротеина, CD3, OLA-LCA-DACO (клоны 2В11 и PD7126) - общего лейкоцитарного антигена, CD10 - стволово-клеточного антигена, TdT - антигена предшественников Т и В лимфоцитов, WIM (виментин) - клеток мезенхимального происхождения, CD15 - нормальных гранулоцитов, CD20 -общего В-клеточного антигена, CD68 - антигена макрофагов, гистиоцитов, Ki-67 - пролиферации, BCL-2 - белка-негативного регулятора апоптоза.

Электронно-микроскопические методы - исследование и фотографирование обработанных традиционным способом и окрашенных по Бернару для выявления РНК клеток культуральной взвеси и прилипших к дну культурального сосуда на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX (LEOL, Япония).

Анализ и фотографирование меченых клеток в культуральной взвеси, парафиновых срезов органов, окрашенных колоний и клеток на дне культурального сосуда и в мазках с использованием системы Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Jenna, Германия), «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Морфометрические методы.

Измерение толщины костных капсул (в мкм) во вновь образованном костно-мозговом органе при пересадке костномозгового гетеротопного трансплантата с помощью аппаратно-программного морфоденситометрического комплекса для клеток и тканей организма «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Определение средней оптической плотности (в усл. ед.) костной ткани костномозгового трансплантата на препаратах, окрашенных гистохимическими методами, с помощью «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Методы определения функциональной активности стимулированных различными факторами мононуклеарных лейкоцитов

Цитотоксический тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест) - «Fluka» (Zund G. et al., 1999) по отношению к клеткам опухолевых линий К-562, Colo, YАС-1.

Тест пролиферативной активности МЛ в колориметрическом тесте с использованием витального красителя AlamarBlue (Fluca, CША) (Page D. et al., 1993), оценкой результатов на флюориметре Versa Fluor V13 (Vtocal) при длине волны возбуждения 540 и 620 нм. Процент пролиферирующих клеток или значения пролиферации определяли в единицах ОП флюоресценции по разнице длин между указанными оптическими сигналами (ОП₅₄₀-ОП₆₂₀), подсчитывали индекс стимуляции (ИС).

Оценка жизнеспособности и митотической активности МЛ с использованием морфологического теста РБТЛ традиционным способом [Самойлина Н.Л., 1970] и подсчёт ИС, представляющего отношение процента бластных клеток в стимулированной культуре мононуклеаров к проценту спонтанных бластных форм в контроле.

Оценка цитокинового профиля.

Определение концентрации IL-1в, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-б, INF-г в супернатантах культур спленоцитов мышей, культур незрелых и зрелых ДК методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем (Biosource, Бельгия).

Метод определения фагоцитарной способности дендритных клеток.

Оценка фагоцитарной активности ДК по поглотительной способности в отношении латексных частиц диаметром 2,7 мкм (ДИАэМ, Москва).

Оценка фагоцитарной активности ДК по поглотительной способности в отношении штаммов St. Aureus 1991 и S. Typhimurium 415 (0,4 мл взвеси культуры ДК - 10х10⁶ кл/мл).

Определение фагоцитарного индекса (ФИ), фагоцитарного числа (ФЧ), коэффициента фагоцитарного числа [Меньшиков В.В., 1987].

Методы статистической обработки результатов.

Обработка результатов в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием регрессивного и многомерного факторного анализа, критерия Стьюдента, метода Хи-квадрат (ч²) при помощи стандартных пакетов статистических программ StatSoft 6.0, SPSS 13.0 MS Excel, WinMDI 2.8, ИПСО. Данные представлены как M±m. Различия рассматривались как значимые при p<0,05.

Использование статистических методов, входящих в пакет программ аппаратно-программного морфоденситометрического комплекса для клеток и тканей организма «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Применение метода математического моделирования по специальной программе, реализующей метод градиентного спуска, который представляет собой разновидность направленного поиска в сторону уменьшения ошибки, при этом искомая функциональная зависимость определяется уравнением экспоненциальной регрессии с линейным членом [Носач В.В., 1994].

Определение переменных с интервальной и номинальной шкалой - коэффициент корреляции Пирсона (корреляция моментов произведений). Значимыми считались корреляции при p<0,01.

Результаты исследования.

Влияние условий культивирования и регуляторных факторов на морфо-функциональные свойства стромальных клеток-предшественников.

Стромальные клетки-предшественники костного мозга, селезёнки и тимуса мышей, морских свинок, кроликов и крыс во всех видах монослойных культур (AMCC; AMCC+F; FMCC; и FMCC+F) образуют на поверхности дна культуральных сосудов колонии-клоны остеогенных фибробластов, каждая из которых является потомком одной КОК-ф.

Несмотря на то, что основную массу колоний составляют фибробласты, они отличаются по плотности расположения клеток, их количеству и форме (рис. 1). На примере колоний, сформированных клоногенными клетками стромы костного мозга крыс, выделено три основных типа колоний: компактные, диффузные и состоящие из, так называемых, сквамозных фибробластов.

Компактные колонии состоят из различных по величине типичных фибробластов, расположение которых характеризуется строгой упорядоченностью: более плотно в одном или нескольких центрах и диффузно - на периферии (рис. 1 а-б). Данные колонии могут содержать от нескольких сотен до нескольких тысяч клеток и обладают наибольшим пролиферативным потенциалом. Диффузный тип колоний характеризуется наличием в его составе от нескольких десятков до нескольких сотен фибробластов, разобщённых между собой и свободно располагающихся в её пределах (рис. 1 в-г). Клетки имеют выраженные и хорошо различимые отростки. В данном виде колоний наблюдается снижение их пролиферативной активности. Колонии, содержащие сквамозные фибробласты, состоят из клеток, которые имеют распластанный вид, плотное пикнотичное ядро, вакуолизированную цитоплазму и представляют собой дистрофически изменённую форму клеточных элементов (рис. 1 д-е).

Анализ иммунофенотипа клоногенных клеток в культурах костного мозга мышей СВА показал, что среди них имеется большое количество клеток, экспрессирующих на поверхности маркёры NK (NK-1 - 90,9%), моноцитов/макрофагов (F4/80 - 77,39%), активационных молекул (CD 25 - 80,68%), костимулирующих молекул (CD80/В7-1 - 80,63% и CD86/В7-2 - 33,9%). Введение животным убитой вакцины Salmonella typhi murium не сказывалось на исследованном иммунофенотипе детерминированных клоногенных клеток костного мозга мышей.



Рис. 1. Монослойные культуры клеток костного мозга крыс (12-й день культивирования)

Микрофотографии колоний, сформированных стромальными клетками-предшественниками: а - компактный тип (ок. 10, об. 2,5); в - диффузный тип (ок. 10, об. 10); д - колония, содержащая сквамозные (дегенерирующие) клетки (ок. 10, об. 10); б, г, е - фибробласты, формирующие соответствующие типы колоний; б (ок. 10, об. 20); г, е (ок. 10, об. 40); а, б, в, г - окр. метиленовым синим; д, е - окр. азуром II-эозином.

Среди клеток первичных культур селезёнки мышей наблюдалось большое количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности NK-антигены (57,07%), костимулирующие молекулы CD80/В7-1 и CD86/В7-2 (80,63 и 78,50% соответственно), активационные антигены (CD25 - 88,35%) и макрофагальные маркёры (F4/80 - 66,61%). Между тем уровень экспрессии поверхностных молекул был сравнительно ниже, чем у клоногенных клеток костного мозга. Иммунизация животных убитой вакциной Salmonella typhi murium практически не оказывала влияния на экспрессию исследованных антигенов на поверхности индуцибельных клоногенных клеток селезёнки мышей.

ЭКО-ф стромальных клеток-предшественников в культурах клеток костного мозга крыс, костного мозга, тимуса и селезёнки мышей, морских свинок и кроликов [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980; Горская Ю.Ф., Лациник Н.В., Шуклина Е.Ю., Нестеренко В.Г., 2000] зависит от наличия костномозгового фидера (облученных аутологичных гемопоэтических клеток или клеток костного мозга морских свинок). В тимусе, например, в отсутствие фидера даже при высокой плотности эксплантированных клеток (20-30х10⁴ на 1 см²) ЭКО-ф и в адгезивных, и в полных культурах практически равняется нулю, но значительно увеличивается при добавлении облученных гемопоэтических клеток.

Рис. 2. Эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников в монослойных культурах клеток костного мозга крыс

По оси абсцисс - концентрация эксплантируемых клеток на 1 мм² дна культурального сосуда; по оси ординат - эффективность клонирования (х10^-5). Данные обработаны путём компьютерного моделирования с применением метода градиентного спуска

Введение фидepa в культуры КОК-ф костного мозга крыс более чем в 6 раз повышает эффективность их клонирования, однако ЭКО-ф не достигает значений, полученных при культивировании с собственными клетками костного мозга крыс (рис. 2). Выявлено, что присутствие в среде культуры собственных гемопоэтических клеток приводит к повышению эффективности клонирования стромальных фибробластов костного мозга крыс в 10-20 раз.

При этом прослеживается корреляция между уровнем ЭКО-ф и временем адгезии до введения фидера, концентрацией и аллогенным или сингенным источником его (рис. 3).

Полученные результаты соответствует данным о том, что колониестимулирующей активностью в отношении КОК-ф обладают клетки костного мозга и селезенки благодаря содержанию в них тромбоцитов и мегакариоцитов [Горская Ю.Ф., Куралесова А.И., Шуклина Е.Ю. и др., 2002]. Напротив, клетки тимуса, лимфатических узлов и лейкоциты крови не обладают подобной активностью.

Рис. 3. Уровень зависимости эфективности клонирования стромальных клеток-предшественииков костного мозга крыс от биологии животных и условий культивирования во всех видах монослойных культур (А-, А+ф, П-, П+ф)

По оси абсцисс - биология животных и условия культивирования; по оси ординат - степень корреляции. Данные обработаны с применением метода корреляции по Пирсону. Значимая степень корреляции - 0,2 и более

Добавление фидера выравнивает эффективность колониеобразования в адгезивных и полных культурах клеток всех кроветворных и лимфоидных органов у крыс, мышей и морских свинок, но ингибирует колониеобразование как в исходных культурах клеток костного мозга кроликов, так и в культурах перевиваемых штаммов фибробластов. Однако культуральные потомки КОК-ф костного мозга кроликов сохраняют высокую чувствительность к ростстимулирующим факторам тромбоцитов, присущую другим видам животных.

При математическом анализе полученных данных отмечается высокая степень коррелятивной зависимости (более 0,5) ЭКО-ф от количества эксплантируемых клеток и плотности их эксплантации в монослойных культурах клеток костного мозга крыс (см. рис. 3).

Увеличение количества эксплантированных клеток в культурах усиливает эффективность клонирования КОК-ф по экспоненциальной кривой, но лишь до определённого уровня плотности эксплантата. Повышение плотности эксплантируемых клеток более чем 1,5х10⁶/1 см² дна культурального сосуда, сопровождается падением ЭКО-ф: резким - в полных костномозговых культурах и более плавным - в адгезивных культурах, почти до нулевых значений, независимо от того, достигается ли эта плотность за счёт интактных или облучённых клеток (см. рис. 2). Это свидетельствует не только о ростостимулирующем, но и об ингибирующем воздействием на КОК-ф стромы регуляторных факторов, вырабатываемых гемопоэтическими клетками.

Таким образом, присутствие определённого количества и вида гемопоэтических клеток и вырабатываемых ими факторов обязательно для нормального функционирования стромы. Причём данные факторы оказывают как стимулирующее (прежде всего ростстимулирующий фактор тромбоцитов) [Фриденштейн А.Я. и др., 1999; Friedenstein A.J. et al., 1992], так и ингибирующее действие и имеют видовые отличия.