С возрастом в костном мозге, тимусе и селезенке происходит достоверное снижение численности КОК-ф, изменение морфологии образуемых ими колоний и эффективности клонирования клеток-предшественников у всех изученных экспериментальных животных, особенно значительно и резко в тимусе морских свинок и мышей - в 75 и 12 раз соответственно (рис. 4). Отмечается высокая степень (более 0,5) отрицательной корреляции между возрастом животных, численностью КОК-ф и эффективностью их клонирования в костном мозге крыс, особенно при выявлении в адгезивных культурах.

Возрастные изменения числа КОК-ф в органах и их ЭКО-ф варьируются по степени выраженности, срокам у разных видов экспериментальных животных и у животных одного вида в различных органах, что, вероятно, зависит от физиологических характеристик, особенностей старения организма, продолжительности жизни животных и функционального назначения органов. Поскольку известно, что в состав популяции КОК-ф селезёнки и тимуса входят индуцибельные остеогенные клетки, то полученные данные указывают на возможность возрастного снижения численности этой категории стромальных предшественников, что можно считать одной из причин возрастного остеопороза.

Изучение влияния ч-АФП, содержащегося в препарате профеталь, на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки мышей показало, что при введении препарата in vivo в 2-3 раза повышается эффективность их клонирования, что может быть обусловлено иммуностимулирующим действием этого белка на лимфоидную ткань (табл. 1). О такой возможности свидетельствует ряд данных [Dudich E., Semenkova L., Dudich I. et al., 1999; Hooper D.C., Cohen B.H., Ducas D. et al., 1999].

Рис. 4. Количество стромальных клеток-предшественииков в костном мозге (а, б), в тимусе (в, г) и в селезёнке (д, е): а, в, д - у мышей; б, г, е - у морских свинок По оси абсцисс - возраст животных; по левой оси ординат - ЭКО-ф, по правой оси - кол-во КОК-ф на исследуемый орган. На диаграмме - число ядросодержащих клеток на исследуемый орган.

Таблица 1. Изменение эффективности клонирования и численность стромальных клеток-предшественников в культурах селезёнки и костного мозга мышей под действием препарата профеталь*

В крови морских свинок, перитонеальном, плевральном и перикардиальном транссудатах кроликов, морских свинок и крыс, а также в перитонеальном экссудате крыс выявлены клоногенные клетки, образующие в монослойных культурах колонии фибробластоподобных клеток (рис. 6). Количество их варьируется от 10⁵ среди циркулирующих лейкоцитов крови до 10х10⁵ от числа клеток перитонеального транссудата.

Обнаруженные в биологических жидкостях клоногенные клетки по своим характеристикам: степени зависимости от возраста и линии животных, от условий культивирования - плотности эксплантированных клеток, наличия фидера (облучённых клеток аллогенного или сингенного костного мозга), состава газовой среды, по морфологии и диаметру образованных ими колоний, гистологическим и гистохимическим особенностям составляющих их элементов идентичны стромальным клеткам-предшественникам костного мозга.

Рис. 6. Монослойные культуры индуцибельных стромальных клеток-предшественников, циркулирующих:

а, б - в крови морской свинки; в, г - в плевральном транссудате крысы; д, е - в перитонеальном транссудате крысы (12 суток инкубации) Микрофотографии колоний (а, в, д), сформированных индуцибельными остеогенными клетками-предшественниками (б, г, е). Окр. азуром II-эозином (а, в, д - ок. 10, об. 2,5; б, г, е - ок. 10, об. 40)

Особенно высока степень корреляции (более 0,8) между клоногенными клетками костного мозга и перитонеального транссудата, перитонеального транссудата и экссудата крыс в отношении зависимости численности КОК-ф и значений ЭКО-ф в культурах от возраста животных и плотности эксплантированных клеток.

Анализ иммунофенотипа клеток, формирующих колонии в монослойных культурах клеточных элементов перитонеального транссудата мышей, демонстрирует преобладание CD80+ клеток (63,4%) и высокий уровень экспрессии на поверхности клеток главного комплекса гистосовместимости I типа (83,3%), а также наличие некоторого количества CD34+ клеток и клеточных форм, имеющих маркёры моноцитов-макрофагов (20,0 и 21,8% соответственно).

Полученные данные свидетельствует о том, что выявленные в монослойных культурах клеток крови, перитонеального, плеврального и перикардиального транссудатов клоногенные клетки по многим характеристикам в большинстве своём могут быть отнесены к популяции индуцибельных остеогенных стромальных клеток-предшественников.

В крови морских свинок, взятой из различных отделов сердечно-сосудистой системы, выявляется различное количество стромальных клеток-предшественников. Самый высокий уровень числа КОК-ф обнаруживается в крови, оттекающей от кроветворных органов. Наибольшей пролиферативной активностью обладают клоногенные предшественники фибробластов, циркулирующие в венозных отделах кровеносной системы.

Сравнительная характеристика детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных остеогенных клеток, циркулирующих в перитонеальном транссудате и экссудате крыс.

Численность клеток-предшественников стромы костного мозга на орган (бедро крысы), выявленных во всех видах культур, значительно превышает количество КОК-ф, обнаруженных в перитонеальном транссудате крыс. При этом значения эффективности клонирования индуцибельных КОК-ф транссудата крыс вполне сопоставимы с ЭКО-ф детерминированных остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга и даже значительно превышают их уровень в некоторых возрастных группах экспериментальных животных, а также при определённой плотности эксплантированных клеток, преимущественно, в адгезивных типах культур без фидера и с добавлением фидера (рис. 7, 8).

Рис. 7. Сравнительная характеристика количества стромальных клеток-предшественников и эффективности их клонирования во всех видах монослойных культур клеток костного мозга, перитониального транссудата и экссудата крыс различного возраста (по весу)

По оси абсцисс - вес животных (в г); по оси ординат - число КОК-ф и значения ЭКО-ф (10-6)

При сравнении возрастных (по весу животных) изменений количества КОК-ф и значений ЭКО-ф во всех видах культур в целом выявлено, что если в костном мозге с возрастом количество КОК-ф и эффективность их клонирования значительно снижается, то в перитонеальном транссудате, напротив, показатели числа КОК-ф и ЭКО-ф повышаются, хотя и не достигают максимальных величин, характеризующих клетки-предшественники костного мозга (рис. 7).

Плотность эксплантируемых клеток во всех видах культур в целом оказывает одинаковое влияние на численность выявляемых КОК-ф и эффективность клонирования как клеток стромы костного мозга, так и находящихся в перитонеальном транссудате клеток-предшественников - при превышении оптимальной плотности эксплантации снижаются оба показателя (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительная характеристика эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников в монослойных культурах клеток костного мозга, перитониального транссудата и экссудата крыс при различной плотности эксплантации

По оси абсцисс - плотность эксплантированных клеток (1х106 на см2); по оси ординат - значения ЭКО-ф (10-6).

В перитонеальном экссудате крыс отмечаются довольно высокие и сравнимые с костным мозгом показатели численности КОК-ф и эффективности их клонирования во всех видах культур (особенно у животных старшего возраста), которые в значительной степени коррелируют с возрастом животных, плотностью эксплантированных клеток, наличием и концентрацией фидера, временем адгезии и временем забора жидкости с момента начала воспалительного процесса.

Лимфокин-активированные киллеры: морфология, иммунофенотип, функциональные свойства, источники генерации

В работе исследованы морфологические, электронно-микроскопические, иммунофенотипические и функциональные особенности лимфокин-активированных киллеров, генерированных под действием ИЛ-2 как из общепринятого источника - мононуклеарных клеток периферической крови человека, так и из спленоцитов больных раком желудка, МЛ плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных с метастатическим поражением серозных оболочек, клеток лейкоцитарных инфильтратов паратуморальных областей поражённой метастазами печени онкобольных, и проведена их сравнительная характеристика.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что инкубация МЛ периферической крови здоровых доноров с ИЛ-2 в оптимальной концентрации (1000-2000 МЕ/мл) приводит к генерации активированных лимфоцитов, которые по морфологическим и функциональным характеристикам могут быть отнесены к ЛАК-клеткам. Цитологическое изучение мононуклеарных клеток при инкубации с ИЛ-2 выявило, что через 3 суток после активации в культуральной взвеси на фоне резкого уменьшения числа гранулярных лейкоцитов существенно возрастает количество лимфоцитов, которое продолжает прогрессивно увеличиваться до 10 суток (рис. 9).

Рис. 9. Динамика клеточного состава культуральной взвеси мононуклеарных лейкоцитов крови человека, активированных интерлейкином-2 (%)

По оси абсцисс - сроки культивирования; по оси ординат - количество клеточных форм (%). Данные обработаны путём компьютерного моделирования с применением метода градиентного спуска

В культуральной взвеси при фазовоконтрастной микроскопии выявляются колонии крупных клеток лимфоцитарного ряда (рис. 10 а). На 5-е сутки среди мононуклеаров преобладают бласты, пролимфоциты и пиронинофильные лимфоциты (рис. 10 б, в), причём большое количество бластных форм и активированных лимфоцитов сохраняется в течение всего срока исследования. Зрелые лимфоциты подвергаются бласттрансформации и в процессе дифференцировки активируются, о чём свидетельствует накопление РНК в цитоплазме, проявляющееся в её яркой пиронинофилии, исчезающей после обработки РНК-зой, и в появлении многочисленных ШИК-позитивных гранул (рис. 10 в, г).

Рис. 10. Лимфокин-активированные киллеры в культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, инкубированных с ИЛ-2 (5-е сутки культивирования)

а - микрофотография культуральной взвеси при фазово-контрастной микроскопии (ок. 10, об. 20). б, в, г - микрофотографии клеток в мазках культуральной взвеси: б - окр. азуром II-эозином (ок. 10; об. 100); в - окр. метиловым зелёным-пиронином по Браше (ок. 10; об. 40); г - окр. Шифф-йодной кислотой по Шабадашу (ок. 10; об. 40).

На электронных микрофотографиях большинство клеток культуральной взвеси характеризуются как большие гранулярные лимфоциты с хорошо развитыми синтетическими органоидами: митохондриями, гранулярной ЭПС, полисомами и пластинчатым комплексом Гольджи (рис. 11 а).

Рис. 11. Электронные микрофотографии мононуклеарных лейкоцитов в культуральной взвеси клеток периферической крови человека на 5-е сутки инкубирования с ИЛ-2

а - ультраструктура ЛАК, увел.3000; б - ультраструктура ЛАК и ДК,увел.1000.

Наряду с ЛАК при активации мононуклеаров периферической крови IL-2 на 3-и сутки в культурах появляются в достаточном кoличестве (24,82+0,06%) и сохраняются в течение всего исследования СD83+-клетки. Они имеют морфогистохимические (крупные размеры, эксцентрично расположенное ядро и вакуолизированную цитоплазму, содержащую пиронинофильный и ШИК-положительный компоненты) и электронно-микроскопические (ветвящиеся отростки, многочисленные вакуоли и активированный секреторный аппарат) признаки зрелых ДК (рис. 11 б).

Особенности иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных молекул СD38, СD25, молекул НLА-DR и молекул адгезии СD58 также отражают процесс активации лимфоцитов (см. табл. 4). Он продолжается в течение 6-9 суток, после чего, согласно данным исследования иммунофенотипа (преобладание в популяции ЛАК СD3+-клеток, снижение уровня экспрессии активационных антигенов и молекул адгезии к 10-м суткам), происходит дифференцировка ЛАК в зрелые Т-лимфоциты.

Результаты исследований показывают, что генерированные клетки обладают значительно более высокой (в 1,5-2,5 раза) киллерной активностью, чем интактные МНК, по отношению к линии опухолевых клеток К-562. Это подтверждает принадлежность полученных клеток к ЛАК, способным активно лизировать клетки-мишени. Таким образом, исследования подтверждают целесообразность использования ЛАК на 3-5-е сутки инкубации применения в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку в данные сроки выявлено максимальное количество типичных ЛАК с высокой цитотоксической активностью, которые сохраняют пролиферативные способности в течение 10 суток.

Таблица 4. Влияние интерлейкина-2 на иммунофенотип мононуклеарныхлейкоцитов периферической крови человека (Уровень экспрессии поверхностных кластеров детерминации, p±sp,%)

Таблица 6. Цитотоксическая и НК-активность мононуклеарных лейкоцитов печени и периферической крови онкологических больных с метастазами в печень (p±s_p,%)

Данные клетки представлены молодыми и активированными (пиронинофильными) формами лимфоидного ряда (рис. 17).

Рис. 17. Мононуклеарные лейкоциты, взятые из параметастатического участка печени онкологических больных

Микрофотографии МЛ, инфильтририрующих параметастатические участки печени онкологических больных, в мазках взвеси: а - окр. азуром II-эозином по Романовскому-Гимза (ок. 10, об. 90); б - окр. метиловым зеленым-пиронином по Браше (ок. 10, об. 40)

Под действием IL-2 данные клетки могут дифференцироваться в ЛАК-клетки. Генерированные из этого источника ЛАК-клетки обладают более высоким уровнем НК-активности, чем ЛАК, полученные из МЛ интактных участков печени и МНПК онкологических больных и здоровых доноров (см. табл. 7). В популяции ЛАК, генерированных из НКТ печени, преобладают клетки, экспрессирующие маркёры НК-клеток, молекулы адгезии и антигены активации.

Цитоиммунохимические исследования лейкоцитарных инфильтратов на гистологических срезах поражённой метастазами печени онкологических больных с помощью моноклональных антител (МкАТ) показали наличие большого количества клеток, экспрессирующих на своей поверхности маркёры гранулоцитов (CD15), клеток мезенхимного происхождения (WIM), Т-лимфоцитов (CD3), макрофагов (CD68), предшественников Т и В-лимфоцитов (TdT), лимфоцитов и макрофагов (OLA), маркёра пролиферации - Ki67.

Таблица 7. Иммунофенотип активированных ИЛ-2 мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени и крови онкологических больных (Уровень экспрессии антигенов, %)

При цитоиммунохимическом исследовании печени мышей, заражённых опухолью CAO-1, в лейкоцитарных инфильтратах параметастатических областей выявляется значительно большее количество CD15+, WIM+, CD3+, CD68+, TdT+, OLA+, Ki67+ клеток, чем в печени онкологических больных, а также выявляются клетки, экспрессирующие стволовоклеточные антигены (CD10 - CALLA common), pan-B-маркёры - CD20.

Рис. 18. Цитофлюорограммы, характеризующие экспрессию поверхностных молекул CD3(FITC), NK (РЕ) МK, выделенных из печени (а-в) и селезёнки (г-д) мышей с опухолевым поражением печени

Обозначения: а - распределение МЛ печени; б - распределение МЛ печени при двойном прижизненном окрашивании (CD3/NK) в регионе R2; в - распределение МЛ печени (CD3/NK) при двойном прижизненном окрашивании в регионе R1; г - распределение МЛ селезёнки

МЛ, выделенные из печени мышей после имплантации опухолевых клеток рака яичников СаО-1 в паренхиму органа, проявляют в более высокую степень НК-активности (в 2-2,5 раза) и цитотоксического потенциала по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, чем лимфоциты селезёнки. В большинстве своём они экспрессируют CD3 и НК-маркёры (см. рис 18).

Следовательно, мононуклеарные лейкоциты, инфильтрирующие пораженную опухолевым процессом печень и циркулирующие в экссудатах онкологических больных могут дифференцироваться в НКТ, а при стимуляции ИЛ-2 - в активные ЛАК-клетки, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунитете. Этот может быть использовано для разработки методов локорегионарной адъювантной иммунотерапии метастазов в печень и серозные оболочки.

Источники генерации, индукторы созревания, морфологические, иммунофенотипические и функциональные особенности антигенпрезентирующих дендритных клеток.

При стандартных условиях культивирования с добавлением коктейля цитокинов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-4 и фактора некроза опухолей в течение 7 суток из моноцитов/макрофагов крови или стволовых клеток костного мозга генерируются антигенпрезентирующие ДК с эксцентрично расположенным ядром, характерными ветвящимися отростками, выраженной вакуолизацией цитоплазмы, развитым комплексом Гольджи и рибосомальным аппаратом (рис. 19).

Рис. 19. Зрелые дендритные клетки, генерированных из моноцитов периферической крови здоровых доноров

а - микрофотография дендритной клетки, прилипшей к дну культурального сосуда. Окр. фуксином Циля (ок. 10, об. 90); б, в, г - электронная микрофотография дендритных клеток в культуральной взвеси

Морфологические и фенотипические признаки свидетельствуют об активности белоксинезирующего и лизомального аппаратов, высокой вероятности межклеточных контактов за счет развитой системы цитоплазматических отростков и выраженной экспрессии активационных антигенов, что позволяет отнести рассматриваемые клетки к субпопуляции зрелых ДК. Генерированные из данных источников ДК демонстрируют также высокий уровень экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и маркеры костимулирующих антигенов.

Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК также из стволовых клеток эмбриональной печени мышей при использовании в качестве индукторов созревания ДК фактора некроза опухолей и поливалентной вакцины Иммуновак ВП-4, которые почти в одинаковой степени оказывают влияние на процесс созревания дендритных клеток.

Рис. 20. Зрелые дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников эмбриональной печени мышей, в культуре (9-е сутки инкубации)

а, б - микрофотографии зрелых ДК в мазке культуральной взвеси, окр. метиловым зелёным-пиронином по Браше (ок. 10, об. 100): а - на 3-и сутки после пульсации TNF-?; б - на 3-и сутки после пульсации вакциной «Иммуновак» ВП-4.; в, г - электронные микрофотографии зрелых ДК в культуральной взвеси: в - контакты ДК с клетками лимфоидного ряда на 3-и сутки после пульсации TNF-?, увел. 1000; г - зрелая ДК на 3-и сутки после пульсации вакциной «Иммуновак» ВП-4, увел.3000.

Генерированные дендритные клетки имеют типичные морфологические и электронно-микроскопические характеристики, отражающие повышенные синтетические функции, и иммунофенотип (CD34-, CD38+, CD40+, CD80+, CD86+, МНСI+, МНСII+, F4/80-+). В мазках культуральной взвеси они выявляются в виде крупных клеток овальной формы с эксцентрично расположенным ядром и пиронинофильными ядрышками, вакуолизированной цитоплазмой, имеющей ШИК-позитивный компонент и ярко пиронинофильную окраску за счёт повышенного содержания в ней РНК (см. рис. 20).

Обнаружена способность таких ДК стимулировать пролиферацию сингенных мононуклеарных лейкоцитов. Антигенная стимуляция ДК, полученных из клеток-предшественников эмбриональной печени мышей, лизатом опухолевых клеток линии YAC-1 приводит к дифференцировке in vitro иммунных лимфоцитов, обладающих высокой цитотоксической активностью по отношению к клеткам данной опухолевой линии. Эти факты свидетельствует о возможности использования генерированных из стволовых клеток эмбриональной печени дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических заболеваний.

Сравнительное изучение использования в качестве индукторов созревания дендритных клеток, полученных из клеток-предшественников костного мозга мышей, иммуномодуляторов микробного происхождения (ЛПС Klepsiella pneumoniae)и в качестве контроля - TNF-б показывает, что эти факторы в равной степени приводят к созреванию ДК, в процессе которого изменяется их иммунофенотип. В культурах увеличивается количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности активационные, костимулирующие молекулы и маркёры гистосовместимости I и II типов.

Рис. 21. Дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников костного мозга мышей (9-е сутки инкубации)

а, б - микрофотографии ДК в мазке культуральной взвеси на 9-е сутки инкубации с ГМ-КСФ, ИЛ-4 и ФНО-а (3-и сутки после пульсации ФНО-а): а - окр. Шифф-йодной кислотой по Шабадашу (ок. 10, об. 100); б - окр. Шифф-йодной кислотой по Шабадашу после контрольной обработки амилазой (ок. 10, об. 90); в, г - электронные микрофотографии зрелых ДК в культуральной взвеси: в - ультраструктура дендритной клетки; г - полисомы и гранулярная эндоплазматическая сеть в цитоплазме зрелой дендритной клетки

Генерированные данным образом клетки обладают всеми морфологическими, иммунофенотипическими и функциональными признаками зрелых ДК, лишь незначительными нюансами отличаясь от ДК, полученных из моноцитов/макрофагов периферической крови человека и клеток-предшественников эмбриональной печени мышей. Зрелые дендритные клетки имеют более высокую концентрацию ШИК-положительного компонента в цитоплазме, уровень которой снижается и почти выравнивается в клетках разной степени зрелости после обработки амилазой, что свидетельствует о повышенном содержании гликогена в зрелых ДК по сравнению с незрелыми формами (рис. 21 а, б). Электронные микрофотографии демонстрируют высокий уровень синтетических процессов в зрелых ДК, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей (рис. 21 в, г).

При созревании ДК уменьшается их фагоцитарная активность, а в культуральной среде достоверно повышается уровень содержания цитокинов, регулирующих дифференцировку лимфоцитов (IL-1в, IL-6, IL-12, INF-г, TNF-б), и снижается количество цитокинов, действующих на дифференцировку самих ДК (IL-4), уровень IL-2, IL-10 остаётся без изменений (табл. 8).

Таблица 8. Индукция цитокинов дендритными клетками, генерированными из клеток-предшественников костного мозга мышей (пкг/мл)

Примечание: Достоверность различий между группами: * - p<0,05; ** - p<0,001.

Зрелые дендритные клетки, стимулированные исследуемыми препаратами, способны повышать цитотоксическую активность лимфоцитов после обработки лизатом клеток опухоли Эрлиха и мышиной лимфомы YAC-1 и усиливать пролиферативные способности сингенных мононуклеарных лейкоцитов.

Дендритные клетки, полученные в опытах из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров, при активации их препаратом профеталь, имели иммунофенотипические признаки зрелых ДК: высокий уровень маркёров антигенного представления (CDla), костимулирующих молекул (CD80), адгезивных молекул (CD11с) и, наконец, основной показатель зрелости ДК - высокий уровень экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83. При этом показатели экспрессии данных кластеров детерминации были не ниже, чем у клеток, генерированных при использовании общепринятого индуктора созревания ДК -TNF-б.

Данные морфологических исследований соответствовали функциональным и иммунофенотипическим критериям, характеризующим клетки, полученные в культурах при действиипрофеталя, как зрелые ДК (рис. 22). Электронномикроскопические исследования полученных дендритных клеток выявляли типичные ДК с многочисленными отростками, теснейшим образом контактирующими с клетками лимфоидного ряда (рис. 22 в). Эксцентрично расположенные ядра содержали хроматин, конденсирующийся вблизи ядерной мембраны. В цитоплазме и крупных ядрышках при обработке по Бернару определялось большое количество РНК (рис. 22 г).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК из различных источников (моноциты периферической крови, бластные формы больных острым миелоидным лейкозом, клетки-предшественники эмбриональной печени и костного мозга взрослых животных) при использовании в качестве индуктора созревания как общепринятых цитокинов (фактора некроза опухолей), так и иммуномодуляторов бактериального происхождения (поливалентной вакцины Иммуновак ВП-4, бактериальных липополисахаридных комплексов) иммуномодуляторов, содержащих человеческий б-фетопротеин (препарат профеталь).

Рис. 22. Мононуклеарные лейкоциты периферической крови доноров, активированные гранулатоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором, ИЛ-4 и препаратом профеталь, в культуральной взвеси на 9-е сутки инкубации (3-е сутки после пульсации профеталем) а, б - микрофотографии лимфоцитов и зрелых дендритных клеток, генерированных из МЛ периферической крови, в мазках культуральной взвеси: а - окр. метиловым зелёным-пиронином по Браше (ок. 10, об. 100); б - окр. азуром II-эозином (ок. 10, об. 90); в, г - электронные микрофотографии лимфоцитов и зрелых дендритных клеток, генерированных из МЛ периферической крови, в клеточной взвеси: в - контакт дендритной клетки и лимфоцита; г - дендритная клетка при обработке препарата по Бернару для выявления РНК

Все виды ДК, генерированные из разных источников и с применением в качестве индукторов созревания различных цитокинов и иммуномодуляторов, имеют морфологические и иммунофенотипические признаки зрелых ДК, обладают способностью усиливать пролиферативную и цитотоксическую способность сингенных мононуклеарных лейкоцитов в культурах. Данные факты свидетельствует о возможности использования генерируемых изученными способами дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что под влиянием различных регуляторных факторов: ростовых колониестимулирующих факторов, бактериальных антигенов, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения, цитокинов, человеческого б-фетопротеин в составе препарата профеталь, - стромальные клетки-предшественники и связанные с ними иммунокомпетентные клетки способны изменять свои морфологические, иммунофенотипические и функциональные свойства. Таким образом, путём подбора оптимальных доз эффективно действующих иммуномодулирующих препаратов ex vivo можно вызывать направленную дифференцировку клеток с формированием клеточных форм, обладающих различно выраженной биологической активностью. Изученные способы генерации клеток с заданными свойствами могут быть использованы для разработки методов, применяемых в адоптивной иммуноклеточной терапии патологических состояний разнообразного генеза.

Выводы

1. Стромальные клетки-предшественники костного мозга и клоногенные клетки, обнаруженные в биологических жидкостях, в равной степени зависимы от условий культивирования: плотности эксплантируемых клеток, времени адгезии, состава газовой среды, наличия или отсутствия фидера (облучённых гемопоэтических клеток), его происхождения. Эффективность клонирования КОК-ф зависит от стимулирующего или индуцирующего воздействия присутствующих в культурах кроветворных клеток.

2. В онтогенезе по мере старения организма происходит снижение численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников в кроветворных и лимфоидных органах у мышей, морских свинок и крыс, при этом у крыс повышается их уровень в перитонеальном транссудате и экссудате.

3. На иммунофенотип, клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф костного мозга и селезёнки существенное влияние оказывают введение препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента человеческий б-фетопротеин, а также вакцинация антигенами стрептококка.

4. Индуцибельные клоногенные клетки, обнаруженные в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном и перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате), по многим характеристикам: уровню эффективности клонирования, зависимости её от возраста и вида лабораторных животных, плотности эксплантируемых клеток, по морфологии формируемых ими колоний, - коррелируют и сопоставимы с детерминированными стромальными клетками костного мозга.

5. Киллерная активность и пролиферативный потенциал мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека повышаются под действием содержащего человеческий б-фетопротеин препарата профеталь, более значительно, чем под влиянием классических митогенов - фитогемагглютинина и интерлейкина-2. При этом реакция бласттрансформации сопровождается образованием CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников. Максимальное количество активированных лимфоцитов с высокой цитотоксической активностью достигается на 3-5-е сутки коинкубации с иммуномодуляторами.

6. Мононуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные из параметастатических участков, обладая более высокой НК-активностью, по своему иммунологическому фенотипу и морфологии существенно отличаются от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови этих же больных и могут быть отнесены к популяции НКТ-клеток. Под действием интерлейкина-2 мононуклеарные лейкоциты печени, плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных дифференцируются в лимфокин-активированные киллеры.

7. Дендритные клетки, генерированные из различных источников: моноцитов крови человека, клеток-предшественников печени эмбрионов и костного мозга мышей СВА, - обладают сходными морфологическими, иммунофенотипическими и функциональными характеристиками. Их созревание может индуцироваться как общепринятым набором цитокинов, так и бактериальными липополисахаридными комплексами и человеческим б-фетопротеином в составе препарата профеталь. Полученные дендритные клетки имеют иммунофенотипические признаки зрелых ДК: CDla+, CD80+, CD11с+ и высокий уровень экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83.