Значение определения в периферической крови циркулирующих раковых клеток в диагностике и лечении злокачественных новообразований

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.01.17 - хирургия

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ РАКОВЫХ КЛЕТОК В ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

ЧИМИТОВ АНАТОЛИЙ АГВАНОВИЧ

Барнаул - 2015



Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Алтайском филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Российской академии наук, Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер»

Научные консультанты:

Шойхет Яков Нахманович доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН

Дамбаев Георгий Цыренович доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН

Официальные оппоненты:

Штофин Сергей Григорьевич доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей хирургии, заведующий кафедрой (г. Новосибирск)

Дыхно Юрий Александрович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра онкологии, профессор (г. Красноярск)

Косенок Виктор Константинович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра онкологии, заведующий кафедрой, (г. Омск)

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» Сибирского отделения Российской академии наук.

Защита диссертации состоится « » апреля 2015 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.002.02 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте (www.agmu.ru) государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (656031, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126).

Автореферат разослан января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Цеймах Евгений Александрович

раковый гемофильтроцитологический адъювантный полихимиотерапия

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Проблема диагностики и лечения злокачественных новообразований остается актуальной, вследствие высокой заболеваемости, распространенности и смертности (Давыдов М.И., Аксель Е.М.,2014; Каприн А.Д. с соавт., 2013, 2014). Лишь немного более половины больных из состоящих на диспансерном учете с первично установленными злокачественными заболеваниями наблюдаются 5 лет и более (Каприн А.Д. с соавт., 2014). Почти четвертая-пятая часть больных злокачественными новообразованиями выявляются с запущенным опухолевым процессом (Каприн А.Д. с соавт., 2014). Несмотря на значительное переоснащение лечебно-профилактических учреждений, резкого сдвига в сторону раннего выявления злокачественных новообразований не произошло (Каприн А.Д. с соавт., 2014). Это обосновывает поиски новых подходов в диагностике злокачественных новообразований.

Не решенной проблемой остается ранняя диагностика злокачественных новообразований, особенно до визуализации, что обуславливает при выявлении высокий удельный вес опухолей III-IV стадий процесса.

Не менее трудной проблемой является профилактика и ранняя диагностика рецидивов у радикально оперированных больных, требующей новых подходов к решению. Все это побуждает возврат на новом уровне к проблеме иммунобиологии злокачественных новообразований, молекулярным основам опухолевого роста и трансформации клеточного клона.

Одним из направлений в последние годы были разработки получения и оценки опухолевых маркеров (М.И Давыдов, 2004). Новым аспектом в ранней диагностике возможного распространения опухолевого процесса является выявление в периферической крови циркулирующих раковых клеток (ЦРК), (Hanahan D., 2000; Dirix L., 2005; Cristofanilli M., Mendelsohn J.,2006; Meng, S.,2006; Dawood S., 2008; Чисов В.И., Дарьялова С.Л.,2009; Лядов В.К.,2014;), что имеет важное значение в принятии решения о применении химиотерапии и т.д. Проблема представляет интерес не только с позиций диагностически циркулирующих раковых клеток, но и определения по ним гистогенеза, возможности решения вопроса о назначении полихимиотерапии, критериев для динамического наблюдения, объективизации суждения об эффективности лечения, прогноза течения процесса. Осуществление вышеуказанных задач обеспечивается процессом технологии диагностики циркулирующих раковых клеток.

Цель исследования: улучшение диагностики и лечения злокачественных новообразований путем выявления циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови с помощью гемофильтроцитологического исследования для принятия решения о применении адъювантной полихимиотерапии, прогноза течения процесса у радикально оперированных больных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать и оценить методики диагностики циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови, интерпретацию результатов исследования.

2. Определить диагностическую значимость циркулирующих раковых клеток в периферической крови у больных злокачественными новообразованиями.

3. Оценить эффективность 3-летнего наблюдения за радикально оперированными больными раком легкого, желудка, толстой кишки в зависимости от применения адъювантной химиотерапии с учетом выявления ЦРК, рецидива опухоли и летальности.

4. Исследовать влияния годичных этапов диспансерного наблюдения за радикально оперированными больными на основе выявления у них ЦРК, рецидивов опухоли, летальности.

5. Определить взаимосвязь выявления ЦРК в периферической венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки с рецидивами злокачественных новообразований.

6. Исследовать влияние адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки на трехлетнюю общую и безрецидивную выживаемость.

7. Определить темпы убывания наблюдаемых в течение 3 лет радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки с наличием в периферической венозной крови ЦРК с учетом применения адъювантной химиотерапии.

Научная новизна

Разработан ряд новых идей, обогащающих концепцию диагностики и лечения злокачественных новообразований на основе гемофильтроцитологического метода исследования циркулирующих раковых клеток у онкологических больных, включая радикально оперированных.

Повышена точность исследований, благодаря усовершенствованию технологий их выделения, защищенной патентами.

Предложена оригинальная технология гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови.

Доказана возможность диагностики циркулирующих раковых клеток на основе гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у больных злокачественными новообразованиями с использованием оригинальных технологий.

Подтверждено, что по цитоморфологическим признакам выделенных атипичных клеток можно определить их опухолевую природу и, в ряде случаев, гистологическую форму. Показано, что применение гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у радикально оперированных больных злокачественными новообразованиями легких, желудка, толстой кишки позволяет определять показания к адъювантной полихимиотерапии, оценить ее эффективность, влияние на последующее выявление ЦРК, рецидивы опухоли, летальность, трехлетнюю общую и безрецидивную выживаемость.

Теоретическая и практическая значимость работы

Сформулированы новые положения и разработаны новые методики по совершенствования ранней диагностики злокачественных новообразований при подозрении на них, объективизации показаний к адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки, прогноза заболевания, коррекции лечебной тактики.

Определена взаимосвязь между выявлением в периферической венозной крови циркулирующих раковых клеток у радикально оперированных больных злокачественными новообразованиями и рецидивами процесса.

Установлена частота выявления циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови у больных злокачественными новообразованиями, включая радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки на 15 и 20 день после операции и в течение последующих 3-лет с учетом применения адъювантной полихимиотерапии. Выявлена взаимосвязь степени патоморфоза в циркулирующих раковых клетках с клиническим эффектом.

Выявление циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования способствует установлению диагноза, а при его подтверждении может рассматриваться в качестве показания к адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных, использоваться для контроля течения процесса при диспансерном наблюдении.

Применение разработанной технологии выявления циркулирующих раковых клеток у больных с подозрением на злокачественные новообразования позволило в условиях регионального онкологического диспансера на модели Бурятского республиканского клинического онкологического диспансера увеличить долю больных с впервые выявленными онкологическими заболеваниями с I-II стадиями в 2010 году до 30,1% (2009 г. - 27,5%), а в 2011 г. - до 33,8%. Внедрение в практику основных положений работы обеспечило более объективный подход к назначению адъювантной полихимиотерапии профилактике рецидивов.

Методология и методы исследования

Проведенное исследование было контролируемым, сравнительным, проспективным с элементами ретроспективного анализа на сопоставимых группах.

В работе использовались данные о 572 больных злокачественными новообразованиями и 173 донорах.

В программу исследования были включены проблема диагностической значимости гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови при злокачественных новообразованиях; оценка прогноза и эффективности комплексного лечения у радикально оперированных больных злокачественными новообразованиями легких, желудка и толстой кишки.

В работе использовался весь комплекс клинического, лабораторного и инструментального обследования для постановки диагноза и его верификации, применен оригинальный, разработанный нами, метод и технология гемофильтроцитологического исследования, обеспечивающие микропросеивание венозной крови (патент на изобретение № 24144710 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2011 г, изобретение относится к физиологии и медицине).

Методика проведения осуществлялась при помощи способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на ЗНО (патент на изобретение № 2425385 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений РФ 27.07.2011 года).

В работе применялись методы вариационной статистики. Использовались методики расчета медико-статистических показателей в онкологии, рекомендованные Г.В. Петровой с соавт. (2014). Проверка гипотезы о значимости на основе критерия х2 (хи-квадрат) использована в исследовании при статистических непараметрических данных, которые были обработаны критерием Пирсона х2 .

В работе также применялся стандартный ?-критерий (универсальный критерий Фишера), что обеспечивалось достаточным количеством наблюдений в каждой из групп и в каждой из таблиц. Для связанных выборок использовался критерий Манна-Уитни. Большие массивы данных обрабатывались на компьютере с помощью программы SPSS21.0.

Анализ общей трёхлетней и общей безрецидивной выживаемости в сравниваемых группах осуществлялся по методу Caplan and Meier.

Положения, выносимые на защиту

Целесообразность диагностики циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови при подозрении на злокачественные новообразования для раннего выявления опухоли, возможного установления гистологической формы, а также у радикально оперированных больных с раком легкого, желудка и толстой кишки на 15 и 20 день после операции для решения вопроса о применении адъювантной полихимиотерапии.

Возможность использования гемофильтрацитологического исследования периферической венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки в ближайшие 3 года для оценки эффективности адъювантной полихимиотерапии, прогноза клинического течения, диспансерного наблюдения.

Необходимость учета при решении вопроса об адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки разной чувствительности к ней видов опухолей: наибольшая - при раке толстой кишки, наименьшая - при раке желудка. Методом выбора для объективизации эффекта полихимиотерапии может быть лечебный патоморфоз III-IV степени в циркулирующих раковых клетках периферической венозной крови.

Целесообразность проведения гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки в течение 3 лет, что позволяет в ряде случаев выявить циркулирующие раковые клетки (при раке легкого - у 17,2% больных, при раке желудка - у 10,9% больных, при раке толстой кишки - у 3,7% больных) и внести коррекцию в лечебную тактику, учитывая возможность возникновения рецидивов через 5,5-6,5 месяцев с момента выявления циркулирующих раковых клеток.

Следует учитывать, что у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки с определяемыми в периферической крови циркулирующими раковыми клетками адъювантная полихимиотерапия уменьшает статистически значимо частоту последующего выявления циркулирующих раковых клеток, рецидивов только при раке легкого и толстой кишки. Уменьшение летальности отмечается при всех трех видах злокачественных новообразований.

Необходимо принимать во внимание, что применение адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого и толстой кишки с выявляемыми в периферической венозной крови циркулирующих раковых клеток позволяет в течение трех лет после операции увеличивать трехлетнюю общую выживаемость. При раке желудка общая трехлетняя выживаемость не зависит от проведения адъювантной полихимиотерапии.

Целесообразно учитывать, что адъювантная полихимиотерапия у радикально оперированных больных раком легкого с выявляемыми в периферической венозной крови циркулирующими раковыми клетками по сравнению с больными раком желудка и толстой кишки увеличивает трехлетнюю безрецидивную выживаемость.

Степень достоверности и апробация результатов

Исследования носили сравнительный, динамический характер. Результаты исследования получены при использовании современных методов диагностики на основе глубокого анализа циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови на протяжении трёхлетнего периода. Обработка полученных данных проводилась с применением известных, проверенных методов математического анализа; всесторонней оценки обширного клинического материала, с последовательным применением в процессе решения поставленных задач современных математических и статистических методов.

Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на VII съезде онкологов России (29-30 октября 2009 г., г. Москва), XIII Российском онкологическом конгрессе (17-19 ноября 2009 г., г. Москва), VI съезде онкологов и радиологов СНГ (1-4 октября 2010 г., г. Душанбе, Республика Таджикистан), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (24-26 июня 2009 г., г. Казань), на Российской научно-практической конференции с международным участием посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН (10-11 сентября 2009 г., г. Томск), на итоговом совещании хирургов Министерства здравоохранения Республики Бурятия (в 2010 г.), на заседании Медицинского совета Управления здравоохранения Администрации г. Улан-Удэ (23.03.2011 г.), Международном конгрессе по биомониторингу окружающей среды (24-26 октября 2013, г. Касабланка, Марокко).

Результаты исследования внедрены в практическую работу ГБУЗ «Бурятского республиканского клинического онкодиспансера». Метод морфологической диагностики внедрен и используется в работе централизованной цитологической лаборатории. Ряд положений диссертационной работы внедрены и используются в учебном процессе в курсе лекций и практических занятий у студентов на кафедре госпитальной хирургии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, (г. Томск), а также ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет».

Основное содержание работы

Общая характеристика больных, материалы и методы исследования

В основу работы положены данные о 745 лицах, у которых с целью определения циркулирующих раковых клеток применялось гемофильтроцитологическое исследование, находившихся на обследовании, лечении и диспансерном наблюдении с 2007 года в ГБУЗ «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер» (таблица 1). Из них 338 больных были радикально оперированы по поводу злокачественных новообразований, в том числе по поводу рака толстой кишки - 42,9% больных, рака легкого - 33,1%, рака желудка - 24,0%.

Таблица 1 - Характеристика статуса больных, у которых проведено гемофильтроцитологическое исследование.

Характеристика статуса	Абс. число	%
Больные с подозрением на злокачественные новообразования Больные с отдаленными метастазами с неустановленной локализацией первичной опухоли Больные, радикально оперированные по поводу злокачественных новообразований, в том числе рака легкого рака желудка рака толстой кишки	211 23 338 112 81 145	36,9 4,0 59,1 19,6 14,2 25,4
Всего	572	100,0

Диагностическая значимость гемофильтроцитологического исследования изучалась у 234 больных и 173 доноров (таблица 2). С целью оценки реальной диагностической ценности гемофильтроцитологического метода исследования были обследованы 407 человек.

В основную группу вошли 234 (57,5%) пациента с подозрением на наличие у них злокачественной опухоли и больных с отдаленными метастазами без первично выявленного очага. Контрольную группу составили 173 (42,5%) донора, также обследованных на предмет отсутствия или наличия у них ЦРК.

Таблица 2 - Обследованные контингенты больных и доноров.

Цель исследования	Группа обследованных
	всего	в том числе
		основная	контрольная
	абс. число	%	абс. число	%	абс. число	%
Диагностическая значимость гемофильтроцитологического исследования	407	100,0	234	57,5	173	42,5
Оценка прогноза и эффективности лечения в послеоперационном периоде	338	100,0	ЦРК+	ЦРК -
			259	76,6	79	23,4
Всего:	745	100,0

Оценка прогноза и эффективности лечения проводилась у 338 радикально оперированных больных по поводу злокачественных новообразований (ЗНО) легких, желудка и толстого кишечника. Из них 112 пациентов были с ЗНО легких, 81 -желудка и 145 - толстой кишки. У этих больных на 15 и 20 дни раннего послеоперационного периода был проведен забор периферической венозной крови для ее микрофильтрации. Последующее цитологическое исследование отпечатка фильтрата венозной крови выявило у 259 пациентов циркулирующие раковые клетки. Таким образом, количество радикально оперированных больных, у которых в послеоперационном периоде были обнаружены ЦРК, составило 76,6% от числа обследованных. Кроме этого, динамическое наблюдение за циркулирующими клетками в течение 3 лет проводилось у радикально оперированных больных со злокачественными новообразованиями легкого, желудка и толстой кишки, в том числе у пациентов, получавших адъювантную полихимиотерапию.

Всем онкологическим больным (n=259), учитывая обнаруженные у них ЦРК, было предложено проведение адъювантной полихимиотерапии (АХТ). Из них у 185 пациентов, согласных на нее, проведена адъювантная полихимиотерапия по общепринятой схеме.

С целью выяснения, есть ли различия в характеристиках больных с обнаруженными у них в периферической венозной крови ЦРК, рандомизированы 2 группы пациентов. В основную группу вошли 185 радикально оперированных больных. Критерием включения в данную группу пациентов с ЗНО являлось их письменное согласие и проведение АХТ. Критерием исключения из этой группы пациентов служил отказ от проведения полихимиотерапии.

Группу сравнения составили 74 радикально оперированных онкологических больных. Критерием включения в эту группу являлся отказ от проведения АХТ. Критерием исключения больных из данной группы служило их согласие в последующем на проведение АХТ.

В данное сравнительное проспективное клиническое исследование вошли 87 больных с раком лёгкого, 64 больных с раком желудка и 108 больных с раком толстой кишки. У этих больных после радикальной операции были обнаружены ЦРК.

Из радикально оперированных больных с раком легкого 62 пациента вошли в основную группу, а 25 больных, не получивших химиотерапию, - в группу сравнения. По половому, возрастному, патоморфологическому строению опухолей, локализации процесса, стадии, объему операции обе группы были сопоставимы.

В следующую серию исследований вошли 64 пациента, радикально оперированные по поводу рака желудка. Из них 43 пациента вошли в основную группу, а остальные 21 - в группу сравнения. По половому, возрастному составу, гистологической форме, степени зрелости опухоли, локализации, стадии процесса, объему операции анализируемые группы были сопоставимы.

Среди больных раком толстой кишки выделено 2 группы: основная - 80 больных; сравнения - 28 больных. По половому, возрастному составу, гистологической форме, степени зрелости опухоли, локализации, стадии процесса, объему операции анализируемые группы были сопоставимы.

По стандартным методикам изучены результаты клинико-лабораторных, биохимических исследований, включающих определение серологических опухолевых маркеров, лучевых и инструментальных методов диагностики.

Для выявления в периферической венозной крови циркулирующих раковых клеток у 572 онкологических больных осуществлена микрофильтрация периферической венозной крови с последующим цитологическим исследованием отпечатка фильтрата венозной крови с целью диагностики в нем циркулирующих раковых клеток. Для проведения гемофильтроцитологического исследования использовалось оригинальное устройство для микропросеивания венозной крови (рисунок 1).

Рисунок 1. Устройство для микропросеивания венозной крови

Устройство содержит стеклянный цилиндр (1), который заключен в пластиковый кожух (2). На дне стеклянного цилиндра установлена пластмассовая решетка (3) с закрепленным на ней с помощью металлического кольца (4) калиброванным фильтром (5). Диаметр пор у калиброванного фильтра равен 6000 нм (6 мкм). Внутри стеклянного цилиндра установлен поршень (6) со штоком (7), который ввинчен не до упора. В поршне выполнены два разных по диаметру канала (8), на стыке которых расположен металлический шарик (9), выполняющий назначение выпускного клапана для воздуха. Стеклянный цилиндр имеет верхнее входное отверстие (10) для подачи венозной крови и нижнее выходное отверстие (11) для оттока венозной крови, последнее снабжено приспособлением (12) для осуществления положений «открыто» и «закрыто» (рисунок 2).

Рисунок 2. Схема устройства для определения циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования.

Методика включала оригинальный способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на ЗНО (патент на изобретение № 2425385 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам).

Способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с помощью данного прибора проводился следующим образом. Накануне из локтевой вены обследуемого брали в две пробирки типа вакутайнер с антикоагулянтом ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) по 6 мл венозной крови, независимо от приема пищи. В день исследования осуществляли сборку устройства. На дно стеклянного цилиндра, заключенного в пластиковый кожух, помещали пластмассовую решетку с закрепленным на ней с помощью металлического кольца калиброванным фильтром.

Для проведения гемофильтроцитологического исследования при закрытом положении нижнего выходного отверстия, в стеклянный цилиндр через верхнее входное отверстие наливали из пробирки венозную кровь обследуемого больного в количестве 12 мл. В стеклянный цилиндр вводили поршень со штоком, ввинченным не до упора.

Поршень продвигался до уровня жидкости в стеклянном цилиндре, при этом воздух из цилиндра выпускали через каналы в поршне с помощью металлического шарика, выполняющего назначение выпускного клапана. Затем шток завинчивался до упора в поршне и тем самым зажимали металлический шарик (выпускной клапан закрыт). Далее приспособление нижнего выходного отверстия стеклянного цилиндра ставилось в положение «открыто» и пропускали всю исследуемую венозную кровь через калиброванный фильтр, при этом происходила задержка раковых клеток в осадке на калиброванном фильтре. Осадок наносили на предметные стекла, предварительно обезжиренные и охлажденные, для лучшего прилипания клеток и высыхания. Фиксировали мазки- отпечатки 3% спиртовым раствором Лейшмана 2-4 минуты. Затем смывали дистиллированной водой и красили азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 в течение 6-8 минут.

После покраски промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и приступали к просмотру под микроскопом. В настоящее время в специальной литературе изучены и описаны цитологические картины большинства опухолей, исходя из которых (размеры, форма, структура) были определены и описаны, выделенные из крови, циркулирующие раковые клетки. Уверенное цитологическое заключение о наличии злокачественного новообразования (рака, саркомы), совпадающее с клиническими симптомами и данными других диагностических исследований, следует расценивать как морфологическое подтверждение диагноза злокачественной опухоли (Трахтенберг А.Х., Чиссов В.И, 2001).

Таким образом, в основу работы положено достаточное количество для решения поставленных задач клинических наблюдений больных со злокачественными новообразованиями и в качестве контроля большая группа доноров. С целью определения циркулирующих раковых клеток у 745 человек проведено гемофильтроцитологическое исследование. Дизайн исследования обеспечил адекватный поставленным задачам набор материала с исключением заболеваний, изучение особенностей которых не входило в цель исследования. Контрольная группа, включавшая доноров, позволила избежать ошибок, связанных с злокачественными новообразованиями. Диагностика онкологических заболеваний с общепризнанными технологиями и современными методами исследования, включала изучение циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови.

Диагностическое значение гемофильтроцитологического исследования у больных с подозрением на злокачественные новообразования.

С целью оценки диагностической значимости гемофильтроцитологического метода определения ЦРК в венозной крови у больных проведено обследование 407 лиц. Из них 234 (основная группа) были пациентами с подозрением на ЗНО и больные с отдаленными метастазами при неустановленной локализации первичного очага. В основной группе выделены 2 подгруппы. В 1 подгруппу вошли 211 пациентов с подозрением на ЗНО. Вторую подгруппу составили 23 больных с отдаленными метастазами. Контрольную группу составили 173 донора без признаков каких-либо заболеваний (таблица 3).

Установлено, что у 198 больных (93,8%) с подозрением на ЗНО при проведении гемофильтроцитологического исследования в периферической крови были обнаружены циркулирующие раковые клетки.

Проведенное в дальнейшем у этих больных целенаправленное инструментальное обследование с патогистологическим исследованием биопсийного или операционного материала, подтвердило у них наличие злокачественной опухоли.

Таблица 3 - Распределение по группам лиц, прошедших гемофильтроцитологическое исследование крови

n	Основная группа (1)	В том числе подгруппы	Контрольная
		первая (2)	вторая (3)	группа (4)
	абс. число	%	абс. число	%	абс. число	%	абс. число	%
407	234	57,5	211	90,2	23	9,8	173	42,5

Среди 198 больных, у которых при гемофильтроцитологическом исследовании были установлены ЦРК (рисунок 3-5), у 41(20,7%) пациента имелась I-II стадии злокачественного процесса. У 13 (6,2%) больных с гистологически верифицированными ЗНО I-II стадии ЦРК в периферической крови выявлены не были вследствие их низкой концентрации. Чувствительность гемофильтроцитологического исследования составила 93,8%.



Ув. Ч 3000

Рисунок 3. Больная 57 лет. Окраска азур-эозином. Диагноз: «Рак левого легкого III В». Опухолевая клетка с крупным инвагинированным ядром. Хроматин крупнозернистый, неравномерно распределенный.

Ув. х 3000

Рисунок 4. Больная 63 лет. Окраска азур-эозином. Диагноз: «Рак желудка IIА». Двухядерная опухолевая клетка с эксцентрически расположенным ядром. Хроматин нежной структуры.

Ув. Ч 3000

Рисунок 5. Больной 71 год. Окраска азур-эозином. Диагноз: «Рак толстой кишки IIIB». Опухолевая клетка с крупным, уродливым ядром. Контуры ядра неровные. Хроматин нежной структуры.

По результатам гемофильтроцитологического метода установлена гистологическая форма ЗНО у 121 (61,1%) больного. Цитоморфологическая оценка ЦРК обнаружила в них признаки характерные для аденокарциномы (у 85 больных), плоскоклеточного рака (у 26 больных), протокового рака (у 8 больных), долькового рака молочных желез (у 2 больных). В виду недостаточной выраженности специфических признаков клеточной атипии у 77 больных установить гистологискую форму опухоли не представилось возможным.

Доказано, что частота выявления циркулирующих раковых клеток в крови при различных нозологических формах ЗНО колебалась от 75,0% до 97,6% (таблица 4).

Таблица 4 - Впервые установленные злокачественные новообразования

Локализация злокачественного новообразования	Выявление ЗНО по результатам
	патогистологии	гемофильтроцито-диагностики
	абс. число	%	абс. число	%
Легкие	47	100,0	45	95,8
Желудок	50	100,0	48	96,0
Поджелудочная железа	12	100,0	9	75,0
Толстая кишка	41	100,0	40	97,6
Молочные железы	24	100,0	21	87,5
Яичники	37	100,0	35	94,6
Всего:	211	100,0	198	93,8

Установлено, что при пяти степенях свободы и уровне достоверности p=0,005 табличное значение критических точек распределения хи-квадрата 16,750 к расчетным значениям=29,10, установленных на основании результатов гистологических исследований, и =34,6, установленных дополнительно к гистологическому исследованию, на основании результатов гемофильтродиагностики. Полученные показатели больше критического и оба расчетных значения статистически значимы с вероятностью более 99,0%. Различия статистически значимы при распределении выборки на 4,26% при n=211 и уровне достоверности p=0,005.

Таким образом, применение гемофильтроцитологического исследования у больных с подозрением на наличие злокачественной опухоли, способствует диагностике злокачественного новообразования. Проведение гемофильтроцитологического исследования позволило обнаружить ЦРК в крови у 93,8% пациентов, что дало основание для целенаправленного инструментального обследования и установления диагноза ЗНО. Гемофильтроцитологическое исследование обнаруженных ЦРК позволило определить гистологическую форму ЗНО у 61,1% больного. В тоже время у доноров циркулирующие раковые клетки не обнаруживались, что свидетельствует о 100% специфичности методики.

Роль гемофильтроцитологического исследования венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки в назначении и оценке эффективности адъювантной полихимиотерапии.

Установлено, что методика гемофильтцитологического исследования позволяет установить наличие ЦРК в периферической венозной крови радикально оперированных больных со злокачественными нообразованиями на 15 и 20 сутки после операции в 76,6% случаев.

Таким образом, одним из показаний к назначению адъювантной полихимиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки может являться двухкратное обнаружение в периферической венозной крови (на 15 и 20 сутки) после операции ЦРК с помощью гемофильтроцитологического исследования.

При немелкоклеточном раке легкого применялись двухкомпонентные платиносодержащие режимы адъювантной химиотерапии (АХТ): ЕР; GP

При мелкоклеточном раке легкого использовались схемы АХТ: EC и PC

При раке желудка применялась стандартная схема АХТ: 5-ФУ/ЛВ (режим Мейо).

При раке толстой кишки использовались следующие схемы АХТ: FOLFOX-4; 5-ФУ/ЛВ (режим Мейо)

Установлено, что наиболее чувствительными к адъювантной полихимиотерапии являются злокачественные новообразования толстой кишки, а резистентными - опухоль желудка.

Доказано, что статистически значимое преобладание наиболее выраженных (III и IV) степеней патоморфоза над наименее выраженными его степенями (I и II) отмечены при злокачественных новообразованиях толстой кишки - в среднем на 30,0% (р<0,001). При раке желудка наименее выраженные степени патоморфоза (I и II) превалировали над наиболее выраженными (III и IV) на 58,2% (р<0,001). При раке легкого и в целом в основной группе не отмечено статистически значимой разницы между наиболее и наименее значимой степенями патоморфоза (р>0,05).

Установлено, что I степень патоморфоза раковых клеток после полихимиотерапии наблюдалась при раке желудка у 41,9% больных, что было больше, чем при раке легкого на 24,1% (р<0,02). При раке толстой кишки больные с этой степенью патоморфоза не наблюдались. II и III степени патоморфоза раковых клеток после химиотерапии одинаково часто наблюдались при всех трех видах злокачественных новообразований. IV степень патоморфоза раковых клеток после адъювантной полихимиотерапии наблюдалась только при раке легкого и толстой кишки, соответственно, в 12,9% и 20,0% случаев. При раке желудка эта степень патоморфоза не отмечена.

Полный клинический эффект отмечен у 81 больного после адъювантной полихимиотерапии на фоне III и IV степени патоморфоза (100,0%), при этом у 54,3 % пациентов наблюдалась IV степень патоморфоза. Частичный клинический эффект наблюдался у 63 больных, при этом у 57,3% пациентов после АХТ отмечены III и IV степени патоморфоза раковых клеток, а у 42,7% - I и II степени (р>0,05). Стабилизация процесса отмечена на фоне I и II степени патоморфоза раковых клеток после АХТ у 91,5% пациентов и лишь у 8,5% больных с III степенью патоморфоза раковых клеток (р<0,001). При прогрессировании процесса после полихимиотерапии ни у одного больного не наблюдалась III и IV степень патоморфоза раковых клеток.

При анализе аналогичных данных у больных раком легкого установлено, что у 22 пациентов, получивших комбинированное лечение с лекарственным патоморфозом III и IV степени, развился полный клинический эффект. Частичный клинический эффект отмечен у 28 больных, при чем в равные доли как с I-II степенью, так и с III-IV степенью лекарственного патоморфоза. Стабилизация наблюдалась у 10 больных с I-II степенью лекарственного патоморфоза в 90% случаев. Прогрессирование процесса было у двух больных с I-II степенью лекарственного патоморфоза. В целом у больных перенесших радикальное оперативное вмешательство и адъювантную полихимиотерапию по поводу рака легкого отмечено совпадение клинического эффекта с достаточно выраженным лекарственным патоморфозом в 58% наблюдений.

Установлено, что среди больных раком желудка полный клинический эффект отмечен только у 5 пациентов после адъювантной полихимиотерапии на фоне III степени лекарственного патоморфоза (11,6%). Частичный клинический эффект наблюдался у 16 больных (37,2%), причем в 13 случаях отмечен лекарственный патоморфоз I-II степени и лишь у 3 пациентов - III степени. Стабилизация процесса отмечена у 18 больных (41,9%), в том числе на фоне I-II степени патоморфоза раковых клеток - у 16 пациентов, а на фоне III степени лекарственного патоморфоза- у 2. Прогрессирование протекало у 4 больных с I степенью лекарственного патоморфоза.

У больных раком толстой кишки полный клинический эффект был отмечен у 54 больных с лекарственным патоморфозом III-IV степени (в 100% случаев). Частичный клинический эффект отмечен у 19 пациентов с III-IV степенью лекарственного патоморфоза также в 100% случаев. Стабилизацию процесса наблюдали у 7 больных со II степенью лекарственного патоморфоза. У больных получивших комбинированное лечение по поводу рака толстой кишки отмечен полный и частичный клинический эффект с лекарственным патоморфозом III-IV степени в 91,2% случаев.

Анализ полученных результатов свидетельствует о возможности при ряде злокачественных новообразований с помощью химиотерапевтического лечения достигнуть полный клинический эффект, который совпадает с наибольшей степенью лекарственного патоморфоза.

Гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови позволяет оценивать лечебный патоморфоз и степень клинического эффекта при проведении специального лечения у больных со злокачественными новообразованиями легкого, желудка и толстой кишки. Кроме этого, оно позволяет провести морфологическую оценку выделенных из периферической крови ЦРК с определением степени лекарственного патоморфоза у онкологического больного после проведенного химиотерапевтического лечения (рисунок 6-8).

Таким образом, проведение гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки на 15 и 20 день после операции позволяет выявить циркулирующие клетки у 76,6% больных. По данным гемофильтроцитологического исследования патоморфоза циркулирующих раковых клеток у больных раком легкого, желудка и толстой кишки наиболее чувствительны к химиотерапии были злокачественные новообразования толстой кишки, наименее - желудка. Преобладание III и IV степеней патоморфоза над I и II степенью при раке толстой кишки составило 30,0% (р<0,001), при раке легкого разница была не значимой, а при раке желудка она была меньше на 58,2% (р<0,001).

Ув. х 3000

Рисунок 6. Больной, 67 лет. Диагноз: «Рак правого легкого IIIА». Окраска азур-эозином. Лекарственный патоморфоз 1-ой степени. Опухолевая клетка с очаговыми дистрофическими и некробиотическими изменениями.

Ув. х 3000

Рисунок 7. Больная, 50 лет. Диагноз: «Рак желудка IIА». Окраска азур-эозином. Лекарственный патоморфоз 2-ой степени. Выражен клеточный и ядерный полиморфизм. Ядра разных размеров и форм. Структура хроматина грубая.



Ув. х 3000

Рисунок 8. Больная, 53 лет. Диагноз: «Рак левого легкого IIВ». Окраска азур-эозином. Лекарственный патоморфоз 3-ей степени. Опухолевая клетка с резким полиморфизмом и признаками дистрофии в виде вакуолизации ядра в клетке.

После химиотерапии у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки полный клинический эффект наблюдался при патоморфозе III и IV ЦРК, причем у 53,4% пациентов патоморфоз был IV степени.Частичный клинический эффект был отмечен при одинаковой частоте I-II и III-IV степенями патоморфоза ЦРК. При прогрессировании процесса ни у одного больного не наблюдалось патоморфоза ЦРК III-IV степени. У больных раком легкого с полным клиническим эффектом (35,0% от пролеченных АХТ) был патоморфоз ЦРК III-IV степени. При раке желудка только у 11,6% больных отмечен полный клинический эффект, при этом патоморфоз ЦРК у них был III степени. При раке толстой кишки полный клинический эффект был у 67,5% больных, при этом у всех этих больных был патоморфоз III-IV степени.

Результаты комплексного лечения злокачественных новообразований легкого, желудка и толстой кишки с использованием данных гемофильтроцитологического исследования

Динамическое наблюдение за радикально оперированными больными злокачественными новообразованиями позволило выявить следующую закономерность во взаимосвязи определения у больных ЦРК и появление рецидива опухолевого роста. Период времени между этими проявлениями составил 5,5- 6,5 месяцев. Случаев рецидива злокачественной опухоли у данной группы диспансерных больных при отсутствии в предшествующий период ЦРК на протяжении указанных сроков наблюдения не отмечено.

Установлено, что у больных раком легкого после радикальной операции ЦРК были обнаружены у 15 (17,2%) больных из 87. В основной группе после радикальной операции ЦРК в периферической крови были выделены у 5 (8,1%) больных из 62, а в группе сравнения у 10 (40,0%) больных из 25 (р<0,01). Анализ данных показал, что темпы убывания наблюдаемых больных в анализируемых группах статистически не значимы (р=0,18). Доказано, что различия распределения показателей в группах в предположениях, что наблюдения связаны по полным данным, статистически значимы: по ЦРК - р=0,046, по рецидивам - р=0,041, по летальным исходам - р=0,041. Различия распределения показателей в группах в предположениях, что все наблюдения связаны по годам, незначимы (по всем показателям р=0,109), без учета их связи по полным данным незначимы по частоте выявления ЦРК, рецидивов - р=0,297, по летальности - р=0,161. Без учета связи по годам различия всех показателей также статистически незначимы. Сравнительный анализ трехлетней безрецидивной выживаемости и общей трехлетней выживаемости у радикально оперированных больных раком легкого выявил значимые различия между основной группой и группой сравнения. В основной группе разница по трехлетней общей безрецидивной выживаемости превышала данные группы сравнения со статистической значимостью 0,007 и 0,001 соответственно (таблица 5; рисунок 9,10).

Установлено, что у больных раком желудка после операции ЦРК были обнаружены у 7 (10,9%) больных из 64, что по частоте не отличалось от данных после операции на легких. В основной группе из 43 больных ЦРК в периферической крови после радикальной операции были выявлены у 3 (7,0%) больных из 43, а в группе сравнения - у 4 (14,3%) из 21 (р>0,05). Анализ данных показал, что темпы убывания наблюдаемых больных в анализируемых группах статистически различимы не значимо (р=0,157). Различия распределения показателей в группах в предположениях, что наблюдения связаны по полным данным, статистически значимы только по летальности (р=0,041). По ЦРК, появлению рецидивов они близки к значимым (соответственно, р=0,063 и р=0,068). Различия распределения показателей в группах в предположениях, что наблюдения связаны по годам (без учета квартальных данных) статистически не значимы (по ЦРК - р=0,18; по рецидивам - р=0,18; по летальности - р=0,109). Различия в распределениях показателей без учета их связи по полным данным статистически не значимы (по ЦРК - р=0,113; по рецидивам - р=0,258; по летальности - р=0,077). Различия распределения показателей без учета их связи по годам статистически не значимы (по ЦРК и рецидивам - р=0,2; по летальности - р=0,1). Трехлетняя безрецидивная и общая выживаемость у радикально оперированных больных в сравниваемых группах больных была одинаковой (таблица 6; рисунок 11,12).

Таблица 5 - Сравнительный анализ трехлетней общей и безрецидивной выживаемости у больных раком легкого

Показатель	n	Группы больных
		основная	сравнения	р<
		абс. число	%	показатель выживаемости	± ?	абс. число	%	показатель выживаемости	± ?
Трехлетняя безрецидивная выживаемость	87	62	71,3	0,92	0,06	25	28,7	0,60	0,19	0,001
Общая трехлетняя выживаемость	87	62	71,3	0,97	0,04	25	28,7	0,76	0,16	0,007

Рисунок 9. Сравнительный анализ трехлетней общей выживаемости у больных с раком легкого по методу Caplan and Meier

Рисунок 10. Сравнительный анализ трехлетней безрецидивной выживаемости у больных с раком легкого по методу Caplan and Meier

Таблица 6 - Сравнительный анализ трехлетней общей и безрецидивной выживаемости у больных раком желудка

Показатель	n	Группы больных
		основная	сравнения	р<
		абс. число	%	показатель выживаемости	± ?	абс. число	%	показатель выживаемости	± ?
Трехлетняя безрецидивная выживаемость	64	43	67,2	0,93	0,07	21	32,8	0,81	0,16	0,309
Общая трехлетняя выживаемость	64	43	67,2	0,98	0,04	21	32,8	0,86	0,14	0,179

Рисунок 11. Сравнительный анализ трехлетней общей выживаемости у больных с раком желудка по методу Caplan and Meier



Рисунок 12. Сравнительный анализ безрецидивнойобщей выживаемости у больных с раком желудка по методу Caplan and Meier

Установлено, что у больных раком толстой кишки после операции ЦРК были выявлены у 4 (3,7%) из 108 радикально больных, что было меньше чем после операции на легких на 13,5% (р<0,01) и не отличалось от данных после операций на желудке. В основной группе ЦРК в периферической крови после операции были выявлены у 2 (2,5%) больных из 80, а в группе сравнения - у 2 (7,2%) больных из 28 (р>0,25). Доказано, что общая трехлетняя выживаемость у больных основной группы, страдающих раком толстой кишки превышала данные группы сравнения со статистической значимостью (р=0,0048). Различия по трехлетней безрецидивной выживаемости были статистически не значимыми (таблица 7; рисунок 13,14).

Установлено, что в целом в основной группе ЦРК после радикальной операции были выявлены у 10 (5,4%) из 185 пациентов, а в группе сравнения у 16 (21,6%) из 74 больных. Различия в 16,2% случаев статистически значимы (р<0,01). Темпы убывания наблюдаемых больных были одинаковыми и составили 0,18. Доказано, что различия в распределении показателей по полным данным были статистически значимыми (по ЦРК - р=0,035; по рецидивам - р=0,027; по летальности - р=0,041). Различия в распределении всех показателей в группах в предположениях, что наблюдения связаны по годам (без учета квартальных данных) статистически не значимы (р=0,109). Различия в распределении всех показателей в группах без учета их связи по полным данным статистически не значимы (р=0,161). Различия в распределении всех показателей в группах без учета их связи по годам статистически не значимы (р=0,1). Трехлетняя безрецидивная и трехлетняя общая выживаемость в основной группе радикально оперированных больных превышала данные группы сравнения при р, соответственно, 0,0016 и 0,00046 (таблица 8; рисунок 15,16).

Таким образом, у радикально оперированных больных злокачественными новообразованиями легких, желудка и толстой кишки с помощью гемофильтроцитологического исследования после операции в 10% случаев выявляются циркулирующие раковые клетки, что может служить основанием для адъювантной химиотерапии.

Таблица 7 - Сравнительный анализ трехлетней общей и безрецидивной выживаемости у больных раком толстой кишки

Показатель	n	Группы больных
		основная	сравнения	р<
		абс. число	%	показатель выживаемости	± ?	абс. число	%	показатель выживаемости	± ?
Трехлетняя безрецидивная выживаемость	108	80	74,0	0,96	0,04	28	26,0	0,93	0,08	0,9
Общая трехлетняя выживаемость	108	80	74,0	1,00	-	28	26,0	0,86	0,12	0,005



Рисунок 13. Сравнительный анализ трехлетней общей выживаемости у больных с раком толстой кишки по методу Caplan and Meier

Рисунок 14. Сравнительный анализ трехлетней безрецидивной выживаемости у больных с раком толстой кишки по методу Caplan and Meier

Таблица 8 - Сравнительный анализ трехлетней общей и безрецидивной выживаемости у онкологических больных

Показатель	n	Группы больных
		основная	сравнения	р<
		абс. число	%	показатель выживаемости	± ?	абс. число	%	показатель выживаемости	± ?
Трехлетняя безрецидивная выживаемость	259	185	71,4	0,94	0,03	74	28,6	0,80	0,09	0,0016
Общая трехлетняя выживаемость	259	185	71,4	0,98	0,02	74	28,6	0,86	0,07	0,0004



Рисунок 15. Сравнительный анализ трехлетней общей выживаемости у онкологических больных по методу Caplan and Meier

Рисунок 16. Сравнительный анализ трехлетней безрецидивной выживаемости у онкологических больных по методу Caplan and Meier

Частота выявления циркулирующих раковых клеток после операции у больных, оперированных по поводу рака легких, больше, чем у больных, оперированных по поводу рака толстой кишки на 13,5% (р<0,01). Период времени между выявлением после операции ЦРК и рецидивом опухоли составлял 5,5-6,5 месяцев.

У радикально оперированных больных раком легкого, толстой кишки проведение адъювантной химиотерапии статистически значимо снижало на протяжении трехлетнего наблюдения частоту выявления циркулирующих раковых клеток в периферической крови (р=0,035) в послеоперационном периоде, рецидивов злокачественных новообразований (р=0,027) и летальных исходов (р=0,041). Особенно данная тенденция была выражена у больных раком легкого (снижение частоты ЦРК после операции со статистической значимостью -р=0,046; рецидивов - р=0,041; летальности - р=0,041). При раке желудка отмечено статистически значимое снижение летальности (р=0,041).

Различия распределения показателей частоты выявления ЦРК, рецидивов, летальных исходов в зависимости от года определения ЦРК после операции в течение 3-летнего периода наблюдения не были статистически значимыми (р>0,109).

Общая и безрецидивная трехлетняя выживаемость у радикально оперированных больных раком легкого, желудка, толстой кишки при выявлении в периферической крови ЦРК при проведении в послеоперационном периоде адъювантной химиотерапии превосходит данные после изолированного хирургического лечения со статистической значимостью, соответственно, р=0,0004 и р=0,0016.

Общая трехлетняя выживаемость у радикально оперированных больных раком легкого и толстой кишки с выявляемыми циркулирующими раковыми клетками выше у больных, получавших адъювантную химиотерапии со статистической значимостью различий, соответственно, р=0,007 и р=0,005

У больных раком легкого после адъювантной химиотерапии также выше различия по безрецидивной выживаемости со статистической значимостью р=0,001. При раке желудка различия общей и безрецидивной выживаемости не зависели от проведения адъювантной химиотерапии (р=0,179 и р=0,308).

Темпы убывания наблюдаемых больных на протяжении 3-лет наблюдения были статистически незначимыми (р=0,157-0,18).



Выводы

1. Диагностика циркулирующих раковых клеток с использованием гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у больных злокачественными новообразованиями обоснована возможностью их выявления у 93,8% пациентов, определения гистологической формы - в 61,1% случаев, отсутствием их у здоровых доноров.

2. Исследование циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови у радикально оперированных больных раком легкого, желудка и толстой кишки на 15 и 20 день после операции позволяет выявить их в 76,6% случаев, что является основанием для назначения адъювантной химиотерапии.