Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

На правах рукописи

Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов

15.00.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Баева Вера Михайловна

Москва 2009

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные консультанты:

Член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук профессор Ирина Александровна Самылина

академик РАЕН, доктор биологических наук профессор Андрей Сергеевич Антонов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна

доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна

доктор фармацевтических наук, профессор Патудин Александр Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская Государственная медицинская академия

Защита состоится « «___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (г. Москва, Никитский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).

Автореферат разослан « » 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.040.09. доктор фармацевтических наук, Наталья Петровна Садчикова

лекарственный аберратный фармакогностический манжетка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фармации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую очередь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.

Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом, отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении заготовки лекарственного растительного сырья и создает необходимость определения глубины этой изменчивости на уровне генома растения.

Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размножения (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибридов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие другие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет способствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В. Алёхин, 1938).

В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности видов при изучении лекарственных растений с использованием новейших достижений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику отечественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сырья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалительным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.

Также актуальным является расширение арсенала методов определения подлинности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлечением наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических методов.

Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981), который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная суперструктура достигает полного развития. Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.

В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых - Vulgares не является монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Frцhner, 1986), так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических агамных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный комплекс (V. Grant, 1981). Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П. Глазунова, 1977, 1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии многочисленных форм, групп особей или отдельных экземпляров, среди которых многие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, размеры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значительные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Европейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые исследователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, таких как м. балтийская, м. изящная, м. остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции манжетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов, 1981), также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у разных авторов.

Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарственных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.

Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заставило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярнобиологических методов, в частности, для характеристики геномов.

Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методических подходов к изучению лекарственных растений с использованием молекулярнобиологических методов актуальна.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.

Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная филогенетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927

Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработать методические подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогностические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка - Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай мерами (RAPDметод)

2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.

3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогностическом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPDанализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфологических групп.

4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекарственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 12), хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petBpetD) и на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот манжетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных растений.

6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать критерии идентификации (внешние и анатомические признаки, качественные характеристики), числовые показатели и установить их нормы.

7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.

8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.

Научная новизна результатов исследования. Показана возможность применения молекулярно-биологических методов для фармакогностического анализа. С использованием RAPDанализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изучение полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPDанализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья растений семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кипрейные, астровые.

Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.

Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава манжетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.

Исследование безопасности настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая активность.

Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для обладающих аберратными формами размножения).

Практическая значимость полученных результатов. Нами показана возможность применения молекулярно-биологических методов для идентификации лекарственного растительного сырья.

Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высушенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPDанализа. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармакопейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и разработаны проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопейной статьи «RAPDанализ лекарственного растительного сырья».

Изучены сырьевая база и вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоноидов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухолевой активностью - агримониин.

На основании изучения геномов и полифенольного комплекса для медицинского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филогенетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в основу проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.

С помощью RAPDанализа даны геномные характеристики 17ти видам растительного сырья.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов различных видов рода манжетка - Alchemilla L., с использованием RAPDанализа и определение характера изменчивости.

2. Данные применения RAPDанализа для идентификации лекарственного растительного сырья.

3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.

4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифенолов и аминокислот для изучаемых видов рода манжетка.

5. Результаты изучения запасов травы манжетки.

6. Данные по стандартизации травы манжетки.

7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических и фармакогностических методов.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарственной политики (Москва, 2829 июля 1995), на Первом международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 15 августа 1995), на научной конференции, посвященной 50летию ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 2125 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения - основные направления и перспективы развития» (Москва, 1416 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Manmade Habitats” (Vena, August 1015, 1998), на заседании Московского общества фитотерапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2830 апреля 2004г), на научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (13марта 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах 9.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 рисунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).

В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологических методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамнополовой комплекс Alchemilla vulgаris L. как источник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы применения.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и методов анализа, использованных в работе.

В третьей главе приведены результаты применения RAPDанализа при изучении самых распространённых видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья - трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов позволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и использовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биологических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPDанализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla и фракционное изучение полифенолов травы манжетки, а также изучения её аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.

В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической активности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы манжетки.

В приложении представлены проекты нормативных документов по применению RAPDанализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжеткиherba Alchemillaе, Фармакопейной статьи трава манжетки herba Alchemillaе.



СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования.

В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка остролопастная Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская Alchemilla baltica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая Аlchemilla propinqua Lindb.fil., манжетка горная Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская Alchemilla sarmatica Juz., манжетка полулуннаяAlchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная - Alchemilla cymatophylla Juz., манжетка шаровидноскрученная -Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).

Определение дикорастущих видов проводили по ключамопределителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н. Тихомировым (1966 г.).

Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методики Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определяемых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po tentilla erecta Hampe.), а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Filipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Asteraceae).

Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L., сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им. М.В. Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др.

Цветки иванчая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.

Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda didyma L.), траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. Цветки боярышника собирали там же с боярышника кровавокрасного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus caucasica C. Koch., Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагринском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечисленных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.

Для построения филогении язвенника использовали молекулярные маркеры применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый спейсерinternal transcribed spacer(ITS1 и ITS2)участок 18S5.8S26S ядерного рибосомального цистронаучасток ДНК, отвечающий за единичную функцию (I.Alwres, 2003); хлоропластный участок petBpetD относящийся к интронам II группы и состоящий из куска экзона petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона petD(C.Lohne, 2005);а также хлоропластный маркер экзон rps16 из группы II интронов (M.Clegg, 1993; B.Oxelman, 1997).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника проводили методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).

Для изображения филогенетических деревьев использовали методы максимальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.

Для исследований ценопопуляций манжетки была использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А. Урановым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозрастные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта использовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.

При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 мІ (10х10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б .Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой работе использовали методики разработанные А.И. Шретером (1966), и В.Б. Куваевым (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на единицу площади (ц/га).

Фармакогностическое изучение сырья трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (влажность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ ХI, т.1 (1987) и т.2 (1990).

Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ ХI, т.2(1990) в соотношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10.

Изучение полифенольного состава проводили с помощью хроматографических методов. В работе была использована бумажная, тонкослойная, колоночная хроматография и ВЭЖХ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с требованиями ГФ Х1 (1987г) и с использованием пакета статистических программ “Statistica for“.Для сравнительного изучения полифенольного, в частности флавоноидного состава настоев травы некоторых видов манжетки, наиболее часто встречающихся в естественных фитоценозах Подмосковья, был применён метод анализа - ВЭЖХ. Исследования проводили на хроматографе Perkin Elmer, Diode Array, Detektor 235 C при длине волны 255 нм для флавоноидов, и 280 нм для фенолкарбоновых кислот. Колонка 150 х4, 6 мм с размером частиц 3 мкм, сорбент гиперсил С 18; элюент ацетонитрил (АСN): вода (рН 3, 2).

Компьютерную обработку полученных данных проводили по стандартной программе “Turbochrom “.

Определение содержания суммы флавоноидов проводили с помощью спектрофотометра Beckman DU65. Количественное определение суммы флавоноидов проводили после модификации соответствующих фармакопейных методик спектрофотометрически.

Доклинические исследования настоя манжетки проводили на лабораторных животных: DВА₂; C57BI₆ ; гибриды BDF₁ и F₁; беспородные мыши SHK. В исследовании использованы перевиваемые опухоли: лимфолейкоз L1210, эпидермоидная карцинома легкого Льюис(LLC) и саркома37 асцитная и солидная.

Методы оценки острой токсичности и антиметастатической активности.

Изучение токсического действия настоя травы манжетки 1:10 и определение диапазона терапевтических доз на интактных животных проводили при оптимальном пути введения вещества в организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой (МПД). Использовали диапазон однократных или курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы определялся максимальный эффект по одному из возможных критериев.

С помощью построения графика ?дозаэффект? определяли ЕД20, ЕД50 и ЕД90 - расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли (ТРО) на 20%, 50% и 90%, соответственно. Затем рассчитывали терапевтические индексы (ТИ20, ТИ50 или ТИ90) как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз. ТИ является единственным показателем избирательности противоопухолевого действия, рекомендуемое значение ТИ50?2. ТИ50 определяли по формуле:

ТИ=ЛД50/ЕД50,

где ЛД50 - доза, вызывающая гибель 50% здоровых животных.

Определяли оптимальные схемы терапии. Оценка эффективности терапии устанавливали по увеличению продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению.

Оценку эффективности лечения, противоопухолевого и антиметастатического эффекта определяли по торможению роста опухоли:

определяли 23 размера опухоли у каждого животного в группе, после чего вычисляли объем (V, мм3) опухоли по формуле:

V=a*b*c или V=(a*b2)/2,

где a, b и с - длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем вычисляли средний объем опухоли в группе Vср.

Степень торможения роста опухоли определяли по показателям ТРО и Т/С, вычисляемым по формулам:

ТРО%=(VконтроляVопыта)x100/Vконтроля,

Т/С%=Vопытаx100/Vконтроля,

где V средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок; Т - леченая группа; С - контрольная группа; Т/С - величина, обратная ТРО. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток после окончания лечения.

Оценку антиметастатической активности проводили на карциноме легких Льюис, меланоме В6 и Клаудмана, а также саркоме37 характеризующихся высокой интенсивностью ме-тастазирования и дающих макроскопические метастазы, доступные для каче-ственной и количественной оценки простыми способами. При оценке эффективности лечебных воздействий учитывали массу первичного опухолевого узла, частоту метастазирования опухоли (ЧМ), среднюю массу метастазов в пересчете на 1 мышь, рассчитывали индексы ингибирования метастазирования (ИИМ) и торможения роста опухоли в процентах (ТРО).

Частота метастазирования опухоли - процент животных с метастазами по отношению к общему количеству животных в группе. В случае лимфогенного метастазирования подсчитывали массу метастазов и среднее значение этого показателя в группе. В зависимости от количества и размера метастатических узлов в легочной ткани определяли степень поражения легких.

Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле:

ИИМ = [(А х Вк) - (А х В)] х 100%/ Ак х Вк,

где Ак и А - частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп; Вк и В - среднее число метастазов в легких в контрольной и опытной группах.

Торможение метастазирования по средней массе легких (ТРМ%):

ТРО%=(сред. m легких контролясред.m легких опыта) х100/Vконтроля

Изучение геномов видов рода манжетка (как модельного) RAPD-методом

Для установления молекулярно-генетического родства между апогамными видами и популяциями манжетки обыкновенной был применён получивший широкое распространение в последнее десятилетие прошлого века метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами со случайной произвольной последовательностью - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - или AP (Arbitrary Primed) - анализ (Welsh J., 1990; Williams J.G.K, 1990), который успешно используется для оценки степени cходства геномов близкородственных организмов, относящихся к самым разным таксономическим группам.

На первом этапе нами была предпринята попытка сравнительного изучения геномов нескольких хорошо определяемых в природе видов: м. балтийской, м. изящной и м. городчатой. Первые две отнесены одними авторами, а последние две - другими авторами к манжетке обыкновенной; для сравнения, в качестве устойчивого вида, не образующего агамный комплекс, использовали лапчатку прямостоячую. Для выделения сумарной ДНК использовали методику, предложенную Дж. Дрейпером (1989) и случайные праймеры П₁₇ и П₂₀. Перед этим нами экспериментально были подобраны: реакционная смесь (объем полимеразы, количество магния хлорида, число, количество и состав праймеров: режим ПЦР и количество циклов. Для“DNA Thermal Cycler”“Perkin Elmer Cetus” (USA) был подобран следующий режим:

денатурация 94є C - 2 мин } 94єC - 1 мин }

отжиг 25єC 2 мин } 2 цикла и 55єC 1 мин } 40 циклов

элонгация 70є C 2 мин } 72єC - 1 мин }

В качестве контроля ставили пробу без ДНК и пробу без праймера. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в трисборатном буфере и фотографировали на пленку “Микрат” в проходящем УФсвете после окрашивания бромистым этидием.

В результате нами было установлено, что ДНК лапчатки прямостоячей отличается от ДНК манжеток по следующим молекулярным признакам: при одинаковых условиях амплификации у манжетки стабильно амплифицируется набор фрагментов, отличающихся молекулярной массой. Реакция хорошо воспроизводится в стандартных условия в диапазоне концентраций ДНК от 10 до 20 нг. Введение в реакционную смесь второго праймера увеличивает число амплифицированных фрагментов ДНК для манжетки и изменяет их подвижность для фрагментов ДНК лапчатки.

Сравнение продуктов амплификации ДНК репешка европейского, азиатского, лапчаток гусиной, ползучей и манжеток показало наличие отличающихся наборов полос с различной подвижностью, что позволило предположить возможность дальнейшего использования этого метода для идентификации видов рода манжетка.

Далее брали небольшое количество хорошо определяемых видов из определённых мест обитаний: манжетка балтийская, собранная в Истринском районе и манжетка балтийская, собранная в парке ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова. Для них выявлены значительные отличия, а именно, наличие у первой набора из восьми фрагментов амплифицированной ДНК, а у второй - только из пяти, причем, нижние две полосы, имеющие длину около 500 нуклеотидов, (определённую относительно маркёра _Hindlll) менее четкие. При этом манжетки, собранные в одном фитоценозе (Истринский район), изящная и городчатая, хорошо различающиеся по внешним признакам, проявляли явное сходство наборов RAPD-фрагментов по шесть одинаковых полос. Эти виды объединены С.К. Черепановым (1981) в одну группу манжетка обыкновенная.

Набор фрагментов, амплифицированных для манжетки полулунной, из этого же фитоценоза и не относящейся вообще к манжетке обыкновенной, также как для манжетки балтийской представлен пятью полосами, но они отличаются по длине. Манжетка Линдберга, также как и полулунная, не относящаяся к группе манжетка обыкновенная и собранная в Щёлковском районе, давала на электрофореграмме четыре фрагмента, из них последний - четвёртый более короткий, соответствующий фрагменту маркёра _Hindlll длиной менее 500 пн, характерен только для этого вида.

Таким образом, проведённый RAPDанализ ДНК манжеток дал обнадёживающие результаты, показавшие возможность его использования для идентификации представителей сложных агамных комплексов.

На следующем этапе для исследования объектами служили апогамные виды Alchemilla vulgaris L.s.ampliss, собранные в период цветения в Московской области - A.baltica (1 - Бот.сад ММА им И.М. Сеченова, II - Истринский район), A.gracilis, A.subcrenata, A.hirsuticaulis ( I - Щёлковский район, II - Истринский район, К- Казахстан, предгорья Алатау, интродуцированая в Бот. саду ММА), А. propinqua, A.lindbtrgiana и A.semilunaris. Собранные листья замораживали и хранили при 20єС до выделения ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

Для амплификации использовали 10ти членные олигонуклеотидные праймеры П₁П₄ с произвольной последовательностью:

П₁ - 5ґ СТСАССGTCC3ґ, П₂- 5ґ ACGGTACCAG3ґ,

П₃ - 5ґ GATGACCGCC3ґ, П₄ - 5ґ AGGCGGGAAC3ґ.



М 1 2 3 4 5

Рис. 1. Электрофореграмма в 2% агарозном геле RAPD фрагментов ДНК A.hisuticaulis с разными праймерами (П) М - маркёр длины - перевар ДНК фага л рестриктазой PstI. 1 - П₁ ; 2 П ₂; 3 П₃ ; 4 П ₄; 5 П₄

Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала 1 ед. Taq полимеразы “Promega”, в буферном растворе, предлагаемом фирмой, по 100 мкМ dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1мкМ праймера, 4 mM MgCl₂ и 1020 нг ДНК. ДНК амплифицировали в течение 36 циклов в програмируемом термостате “Циклотемп” (СТМ, Москва) в режиме: денатурация - 1 мин 94єС, отжиг - 1 мин 37єС, элонгация - 2 мин 72єС. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%ном агарозном геле в трисборатном буфере и фотографировали на плёнку “Микрат” в проходящем УФсвете (305 нм) после окрашивания бромистым этидием.

Компьютерный ввод изображений и их обработка проведены с использованием видеоденситометра и програмных продуктов фирмы “itti” (USA). Построение фенограммы осуществлено невзвешенным парногрупповым методом с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием пакета программ “Восторг” (ИЦИГ РАН, Новосибирск).

Результаты и обсуждение. Количество продуктов амплификации, выявляемых как отдельные полосы после электрофореза, в реакции при использовании конкретного праймера с определённой последовательностью нуклеотидов зависит от количества сайтов связывания праймера, т.е. участков последовательности ДНК, комплементарных данному праймеру в обеих цепях ДНК исследуемого генома и/или от их относительного сродства. Поэтому RAPD паттерны для каждого конкретного праймера будут состоять из различного количества полос.

Кроме того, на количество и интенсивность полос оказывают влияние условия проведения реакции амплификацииконцентрация и степень очистки ДНК, температура отжига праймера, концентрация MgCl₂, число циклов амплификации. Для каждого праймера необходимо было подобрать оптимальные условия, при которых амплификация происходит эффективно и даёт воспроизводимые результаты. Последующее строгое соблюдение этих условий проведения реакции гарантировало надежность полученных результатов.

Четыре имевшиеся в нашем распоряжении праймера П₁ - П₄ были предварительно проверены в реакции амплификации с A.hirsuticaulis (рис. 1). Установлено, что все праймеры активны в реакции амплификации и служат затравкой для синтеза наборов специфических фрагментов ДНК. Количество и длина амплифицированных с каждого праймера фрагментов, как и следовало ожидать, неодинаковы. В последующих опытах был использован праймер П₂, приводящий к RAPDспектру с наибольшим количеством полос (рис. 1).

Для оптимизации условий реакции было исследовано влияние изменения температуры отжига праймера, концентрации MgCl₂ и концентрации ДНК на набор продуктов реакции. Установлено, что результаты хорошо воспроизводятся в диапазоне температуры отжига от 30 до 37єС и концентрации MgCl₂ 2, 5 - 4, 0 мМ, а также при разведении исходных растворов ДНК в отношениях от 1:10 до 1:100. Для последующих опытов были использованы разведения 1:50, что соответствует содержанию 1020 нг ДНК в реакционной смеси.



М 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 10 М

Рис. 2. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma) RAPDфрагментов ДНК 1. A.semilunaris, 2. A.gracilis, 3. A.baltica (1), 4. A.baltica (П), 5. A.subcrenata, 6. A.propinqua, 7. A.lindbergiana, 8. A.hisuticaulis (1), 9. A.hisuticaulis (K), 10. A.hirsuticaulis (П) c праймером П₂ М - маркёр длины - перевар ДНК фага л рестриктазой PstI.

Разделение амплифицированных фрагментов ДНК апогамных видов популяций Alchеmilla при электрофорезе в агарозном геле (рис.2), с последующим сканированием и математической обработкой полученных результатов с помощью компьютерных программ позволило установить, что исследуемые апогамные виды и популяции характеризуются специфическими RAPD-спектрами. Различия касаются как наличия/отсутствия полос одинакового размера у разных видов, так и изменения относительной интенсивности некоторых полос.



Рис.3. Распределение амплифицированных фрагментов ДНК разной молекулярной массы у исследованных видов манжетки (обозначения см. рис.2)

На рисунке 3 показано присутствие амплифицированных фрагментов ДНК с указанием их размеров, а в таблице 1 - матрица состояний бинарного признака наличия/отсутствия (1/0) полос с одинаковой электрофоретической подвижностью в RAPD - спектрах изученных растений. Минорные полосы слабо выявляющиеся на электрофореграммах рассматривались как отсутствующие, и им приписывалось значение 0.

По этим данным рассчитана матрица различий между видами и популяциями манжетки, по которой построена фенограмма (рис.4).Полученные данные свидетельствуют, что как апогамные A.vulgaris L.Ampliss., так и популяции одного вида различаются по RAPD-спектрам, при этом диапазоны уровней сходства между популяциями и видами могут перекрываться.

Обращает внимание, что две популяции A. hirsuticaulis из Московской области гораздо более сходны между собой, чем с популяцией того же вида из Казахстана. Какоголибо соответствия характера кластеризации на фенограмме со схемами таксономии Alchemilla В. Ротмалера (1936) и С.В. Юзепчука (1941) не прослеживается.



Таким образом, полученные данные результов RAPD - анализа свидетельствуют об отсутствии различий уровней внутри и межвидовой генотипической изменчивости в группе A.vulgaris. Определение степени изменчивости подмосковных видов рода манжетка показало, что из всех видов только A.gracilis и A.baltica ведут себя как монофилетические групппы, A.glaucescens и A.hirsuti caulis вместе также образуют монофилетическую группу. Все остальные виды не проявляют себя как монофилетические.

A.glaucescens, A.hirsuticaulis, A.monticola и A.sarmatica вместе образуют монофилетическую группу. Все четыре вида относятся к секции Plicatae, согласно S. Frцhner (1990), но поV. Rothmaler (1936) они принадлежат, соответственно, к двум подсекциям. Образцы A.semilinaris образуют монофилетическую линию, а все образцы A.subcrenata объединяются вместе и близки к образцам секции Plicatae. A.acutiloba и A.gracilis перемешаны друг с другом, но повидимому, вместе образуют монофилетическую группу. Положение A.glabricaulis и A.baltica неопределённо. A.gracilis, повидимому, образует отдельную ветвь. Все остальные виды расположены вперемешку друг с другом и не могут считаться монофилетическими.



Рис. 4. Фенограмма сходства RAPDспектров ДНК видов Рода Alchemilla, построенная методом UPGMA по данным матрицы в таблице 1; d -процент различий

Расшифровка радиограмм и электрофореграмм, компьтерная математическая обработка полученных результатов анализа показала отсутствие в изучаемых популяциях манжетки предковых видов и невозможность построения из этих видов филогенетического дерева, хотя некоторые наборы RAPDфрагментов были сходны для нескольких видов, особенно взятых из одного фитоценоза, что может говорить о их гибридогенном происхождении. Величина внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости оказалась очень высокой.

Таким образом, применение геномного анализа позволило характеризовать геномы видов манжеток, преимущественно как гибридные, что дает возможность рекомендовать для сбора траву всех видов манжеток, как близкородственных и обладающих сходным биосинтезом БАВ, что дает возможность прогнозировать близкий состав биологически активных веществ.

Применение RAPD - анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.

В отечественной и мировой литературе отсутствуют данные о применении молекулярно-биологических методов для изучения лекарственного растительную для его идентификации. Прежде всего необходимо было адаптировать методику выделения ДНК из сухого сырья и подобрать условия амплификации.

Наилучшими оказались следующие условия проведения реакции амплификации для термоциклера фирмы Perkin ElmerCetus Instruments: денатурация - 94?С - 1 мин; отжиг - 36?С - 1мин; синтез - 72?С 1 мин.

При сравнении результатов амплификации установлено, что RAPDнабор ДНК свежего и высушенного сырья отличается по количеству и расположению фрагментов, вследствие деградации ДНК при сушке (рис. 5). Разделение и обнаружение фрагментов ДНК, полученных в результате реакции амплификации, проводили методом электрофореза в 2 % геле агарозы.

Рис. 5. Электрофореграмма амплификатов ДНК свежих и высушенных листьев двух видов дубаQuercus с праймером 3`CGGCCCCTGT5`

1молекулярный маркер; 2контрольный опыт;

3фрагменты ДНК свежих листьев дуба черешчатого;

4фрагменты ДНК высушенных листьев дуба черешчатого;

5фрагменты ДНК высушенных листьев дуба красного

Выделение и амплификацию ДНК из сухого сырья: цветков с листьями боярышника кровавокрасного и боярышника кавказского, травы череды трёхраздельной и череды поникшей, а также цветков иванчая узколистного (розовой формы и белой), травы горца почечуйного (растущих рядом зелёной и красной) проводили по модифицированной нами методике. Результат разделения представлен на рисунке 6. На полученных электрофореграммах, (рис. 6) четко видны различия наборов RAPDфрагментов боярышников и обоих видов череды, а RAPDспектры для ДНК иванчая розового и белого - а также для двух рас горца почечуйного были идентичными, что говорит о их генетической равноценности.

Рис. 6. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma) продуктов RAPD ДНК растительного сырья:

1 боярышника крововокрасного Crataegus sanquinea Pall.),

2 боярышника кавказского Crataegus caucasica C.Koch. Cratz.et Mesp.

3 череды трёхраздельной Bidens tripartitus L.

4 череды поникшей Bidens cernuus L.

5 иванчая узколистного Chamaenerium angustifolium (L.) Scop.

6 иванчая узколистного Ch. angustifolium var. albiflorum Hausskn.

7 горца почечуйного (красного) Polygonum persicaria L.

8 горца почечуйного (зеленого) Polygonum persicaria L.

М - маркер длины (перевар ДНК фага л рестриктазой Psd)

Таблица 2 Стадии методики выделения и амплификации ДНК лекарственного растительного сырья

Стадия	Сущность методики	Теоретическое обоснование
1. Пробоподготовка	измельчение до порошка (менее 0, 5мм)
2.Экстракция	СТАБ буфером (70С) + меркаптоэтанол пробирку встряхивают, инкубируют при Т= 70С и центрифугируют отбирают жидкую фазу	Меркаптоэтанол добавляют для инактивации ферментов.
3.Очистка	Жидкая фаза смесь хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) встряхивают центрифугируют осадок денатурированных белков	Осаждение белка
4.Выделение ДНК	жидкость над осадком изопропанол перемешивают стекл.капил ляром аморфный студнеобразный осадок ДНК и полисахаридов. Далее ДНК «наматывают» на капилляр погружают в пробирку с 96% этанолом погружают в пробирку с водой до растворения ДНК.	изопропанол добавляют для осаждения ДНК 96% этанол необходим для удаления полисахаридов, т.к. полисахариды осаждаюся в спирте, а ДНК растворяется в воде.
5. Реакция амплификации	ДНК праймеры буферный раствор TrisHCl+ дезоксинуклеозидтрифосфаты MgCl2 Taqполимераза термоциклерразделение электрофорезом окрашенные фрагменты ДНК.

Рис. 7. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов RAPD ДНК листьев:1 монарды двойчатой Monarda didyma L, 2 мяты перечной Мentha piperita L; травы: 3 чабреца Thymus serpillum L.), 4 мелиссы Melissa officinalis L.; цветков 5манжетки обыкновенной - Alchemilla vulgaris L., 6таволги вязолистной Filipendula ulmaria Max.), 7розы морщинистой Rosa rugosa Thunb., mМ маркер длины

При изучении RAPDспектров ДНК, выделенной из разных видов сухого сырья: цветков, листьев и травы растений, относящихся к разным семействам: Lamiaceae и Rosaceae: листья монарды, листья мяты перечной, трава чабреца, трава мелиссы; цветки манжетки, цветки таволги, лепестки шиповника на электрофореграмме наблюдались дискретные полосы, выявляющие межвидовые различия фрагменты ДНК отличающиеся подвижностью (размерами) и их ко личеством (рис. 7).

Проведённые нами исследования показали возможность применения данного метода для идентификации сырья лекарственных растений.

Нами разработаны оптимальные методики для RAPDанализа 13 родов, относящихся к 5 семействам.

Применение секвенирования для изучения лекарственных растений и лекарственного растительного сырья

Применение секвенирования для филогенетического анализа рода Anthylis L., также показало перспективность его использования для изучения лекарственных растений народной медицины. Установлено, что род Anthylis L., проявляет себя как монофилетическая группа с высокими уровнями поддержки при анализе как ядерных, так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthylis vulneraria L., (рис. 8) характеризуется рядом уникальных морфологических особенностей, как отдельный подрод, что подтверждается данными об инделях: вставках из 6 п.н (АТААСА) на участке petBpetD. Эти молекулярные маркеры (индели) также могут быть рекомендованы для идентификации лекарственного растительного сырья молекулярно-филогенетическими методами.

Изучение состава БАВ травы манжетки.

Нами было проведено изучение полифенольного комплекса: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танинов и аминокислотный состав видов рода Alchemilla L.Предварительное сравнительное изучение химического состава манжеток: остролопастной, балтийской, изящной, собранных в июне 1990 года и в сентябре 1991 года в Истринском и Одинцовском районах Московской области показало сходство спектров поглощения спиртовых извлечений и сходство хроматографического разделения: одинаковое количество зон адсорбции с Одинаковыми R_f в различных системах растворителей. Далее исследование водных извлечений проводили с помощью метода ВЭЖХ. Идентификацию проводили по сопоставлению времен удерживания пиков соединений на хроматограмме с пиками стандартных образцов и совпадению УФ-спектров соединений с УФ-спектрами стандартных образцов. В водном извлечении были идентифицированы фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, коричная; флавоноиды - рутин, кверцетин, кемпферол (рис. 9). Определено, что в водном извлечении рутин составляет 50% и более суммы всех флавоноидов (табл.3).

Рис. 8. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ по участку ITS 12

Таким образом, в результате сравнительного химического изучения разных видов манжетки, собранных в нескольких районах Московской и на севере Тульской области, нами была установлена сходность химического состава полифенольных соединений этих видов это послужило основанием для дальнейших исследований. Для более полного изучения полифенольного комплекса проводили фракционное изучение ацетонового извлечения травы манжетки, в котором одна из фракций нами была идентифицирована как танин - агримониин.

Рис. 9. Хроматограмма водного извлечения травы манжетки: 1 галловая кислота; 2 хлорогеновая кислота; 3 кофейная кислота; 4 рутин; 5 коричная кислота; 6 кемпферол; 7 кверцетин

Выделение агримониина. Нам удалось выделить из травы манжетки димерный эллаготанин - агримониин, который был идентифицирован прямым сравнением спектра со спектрами известных образцов как агримониин, с помощью №Н ЯМР, №іC ЯМР и ПМР анализа. Полученные данные подтверждили правомерность химической структуры агримониина - как одного из первых димерных эллаготанинов, имеющих природное происхождение. Ранее японскими исследователями похожие соединения были выделены из некоторых растений также семейства розоцветные двух видов гравилата, репешка волосистого и эндемичной лапчатки [Okuda T., 1995].



Рис. 10. Хроматограмма агримониина

Рис.11. Спектры основных пиков

Хроматограмма свидетеля представлена на рисунке 10. Здесь агримониин виден, как главный пик с несколькими минорными компонентами. Время удерживания агримониина 27 минут, а его УФ-спектр (рис.11) поглощения имеет максимумы при 220 и 280 нм.

Определили фракции, содержащие очищенный танин (рис. 10) их упарили и высушили. Получили белое с желтоватым оттенком вещество - агримониин, идентификация которого была проведена ранее. Водный раствор агримониина, полученного путем препаративной колоночной хроматографии был использован в качестве свидетеля и для выявления расположения пика агримониина на хроматограмме водного извлечения. Сначала провели хроматографирование водного раствора свидетеля. Затем хроматографировали водное извлечение.



Рис.12. Хроматограмма водного извлечения (1) и агримониина (2)

По времени удерживания и УФспектру поглощения в сравнении с раствором свидетеля на хроматограмме был идентифицирован агримониин (рис. 12). При изучении отдельных фракций танинов нами установлено, что олигомерные танины манжетки представляют собой соединения, близкие по строению с агримониином. Они имеют разное время удерживания на хроматограмме, но у них одина ковый УФ-спектр с максимами поглощения при 220 и 280 нм, как у агримониина.

Таблица 3 Содержание свободных аминокислот в траве некоторых видов Alchemilla vulgaris L.

Аспаргиновая кислота+ аспаргин	0 .04	0.04	0.04
треонин	0.06	0.06	0.06
Серин	0.07	0.07	0.07
Глутаминовая кислота+ глутамин	0.09	0.09	0.09
пролин	0.45	0.45	0.45
Глицин	0.01	0.01	0.01
Аланин	0.05	0.05	0.05
Цистин	0.02	0.02	0.02
Валин	0.06	0.06	0.06
метионин	0.00	0.00	0.00
изолейцин	0.04	0.04	0.04
Лейцин	0.03	0.03	0.03
тирозин	0.01	0.01	0.01
фенилаланин	0.03	0.03	0.03
оксилизин	0.13	0.13	0.13
Лизин	0.01	0.01	0.01
гистидин	0.01	0.01	0.01
аргинин	0.01	0.01	0.01
Сумма	1.14	1.14	1.14

В результате этого исследования определено, что в водное извлечение из сырья переходит весь комплекс полифенолов: фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и олигомерные танины.

Изучение аминокислотного состава.

Изучение аминокислотного состава трёх видов рода манжетка: показало его идентичность (табл. 4). Из 20ти обнаруженых аминокислот в водном извлечении преобладают пролин и оксилизин (0, 45 мг/мл и 0, 13 мг/мл соответственно). Обладая высокой биодоступностью, они обуславливают, наряду с другими БАВ (полифенолы, макро и микроэлементы) травы манжетки широту спектра фармакологической активности её препаратов и могут служить маркерами, наряду с другими, подлинности сырья и качества настоя. Эти данные полученные с помощью RAPDанализа позволилu нам рекомендовать к медицинскому применению, для сбора траву всех изученных видов рода Alchemilla L., и рассматривать эти виды как производящие сырье - трава манжетки.

Фармакогностическое изучение травы манжетки.

Фармакогностическое изучение травы манжет позволило разработать критерии оценки подлинности и качества этого ценного сырья, а также разработать систему мероприятий по рациональному использованию природных ресурсов Alchemilla L.sp.Последняя включает описание производящих растений, позволяющее определять их в природе; и проводить выявление зарослей, пригодных для сбора сырья; даны рекомендации по условиям сбора, сушки и хранения сырья, а также режим эксплуатации зарослей.

Внешние признаки сырья приведены в таблице № 5: трава манжетки представляет собой смесь листьев и цветоносов с цветками и бутонами. Микроскопия травы манжетки позволила выявить особенности анатомического строения стебля, листа, черешка и чашелистиков (табл.5), опушение, строение клетокидиобластов с друзами, одинаковые для всех изученных видов, которые могут служить диагностическими признаками подлинности сырья.

Качественный анализ сырья. На основании качественных фармакопейных реакций установлено, что водное извлечение травы манжетки (1:10) даёт положительную цианидиновую пробу на флавоноиды с металлическим магнием или

Таблица 4 Внешние признаки сырья манжетки обыкновенной

№ п/п	Диагностический признак	Характеристика признака
С Т Е Б Е Л Ь
1	Форма	Округлый
2	характер поверхности	Опушенный
3	характер ветвления	Разветвленный
4	Размеры длина диаметр	до 10 см до 4 мм
5	Цвет	светлозеленый
Л И С Т Ь Я
1	Листорасположение	очередное
2	форма листовой пластинки	округлопочковидная и веерообразная
3	Размеры

Подобные документы

• Биологические характеристики некоторых лекарственный растений семейства Губоцветные

  История использования лекарственных растений в медицине. Потребность человека в витаминах. Химический состав, фармакологические свойства, лекарственные формы и применение в медицине видов лекарственных растений семейства Губоцветные Пензенской области.
  
  курсовая работа [1,2 M], добавлен 29.06.2013
  

• Использование лекарственных растений в медицине

  История изучения лекарственных растений, содержание биологически активных веществ в них. Этапы внедрения их в медицину. Фармакогнозия как наука о лекарственных растениях. Особенности и ботаническое описание лекарственных растений Московской области.
  
  курсовая работа [1,1 M], добавлен 20.12.2013
  

• Общие сведения о лекарственных растениях

  Биологически активные вещества лекарственных растений. Правила сбора, сушки и хранения. Применение лекарственных растений в виде различных лекарственных форм и препаратов. Лекарственные растения семейства губоцветные, их практическое применение.
  
  курсовая работа [42,7 K], добавлен 22.09.2009
  

• Видовое разнообразие лекарственных растений Природного парка "Река Чусовая"

  Общая характеристика лекарственных растений, история их открытия и основные свойства. Сведения об использовании целебных свойств растений в древности. Методика сбора лекарственных растений. Перечень лекарственных растений Природного парка "Река Чусовая".
  
  реферат [56,1 K], добавлен 08.12.2013
  

• Лекарственные растения, нормализующие деятельность нервной системы, произрастающие в Приднестровском регионе

  Морфолого-анатомическая характеристика лекарственных растений, произрастающих в Приднестровском регионе, которые успокаивают и стимулируют центральную нервную систему. Химический состав и применение лекарственных растений. Заготовка и хранение сырья.
  
  курсовая работа [34,4 K], добавлен 29.07.2010
  

• Возделывание (культивирование) лекарственных растений в ООО "Соцветие"

  Приемы возделывания различных лекарственных растений. Определение ресурсов дикорастущих лекарственных растений на примере травянистых, древесных и кустарниковых. Приемы сбора лекарственных средств, сушка и хранение. Растения, снижающие секрецию желез.
  
  отчет по практике [107,3 K], добавлен 14.06.2012
  

• Сапонины: физико-химические и биологические свойства, методы определения сапонинов в ЛРС и применение в медицине

  Общая характеристика лекарственных растений, содержащих сапонины и определение их вида, строения и свойств содержащихся в них. Правила заготовки лекарственных растений, содержащих сапонины, характеристика лекарственного сырья и область его применения.
  
  курсовая работа [2,3 M], добавлен 08.12.2012
  

• Лекарственные растения, применяемые для коррекции климактерических расстройств

  Ботаническая характеристика, ареал распространения, химический состав, особенности сушки и заготовки лекарственных растений, применяемых для коррекции климактерических расстройств. Фармакологические эффекты лекарственных растений и механизм их действия.
  
  курсовая работа [1,5 M], добавлен 02.11.2015
  

• История применения лекарственных растений с начала веков до XX века

  Применение лекарственных растений в Древнем мире. Источники сведений о фитотерапии в Египте. Лечение растениями в странах Восточной Азии. Абу Али Ибн Син как выдающийся представитель арабской медицины. "Ягодная повинность" на Руси в царский период.
  
  курсовая работа [34,9 K], добавлен 17.12.2011
  

• Лекарственные растения

  Сравнение между синтетическими и растительными препаратами, их недостатки и преимущества. История изучения и применения лекарственных растений, многовековой опыт медицины. Сбор, приготовление, хранение и применение растительных лекарственных препаратров.
  
  статья [22,3 K], добавлен 09.10.2009
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам