Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов

длина

ширина

до 6 см

до 4 см

4

наличие черешка

стеблевые

у розеточных

сидячие

- длиной до 5 см

5

строение листа

простые, лопастные

6

Жилкование

пальчатонервное

7

Край

зубчатый

8

Опушение

верхней стороны листа

с нижней стороны

малоопушенная

более опушенная

9

Цвет

верхней стороны

нижней стороны

зеленый

светлозеленый

Ц В Е Т К И

1

тип соцветия

дихазиальное, клубочковидное

2

строение цветка

строение околоцветника

актиноморфный

простой 4х - мерный, чашечковидный с подчашием

3

Цвет

желтозеленые

Запах сырья

Слабый

Вкус сырья

Горьковатый

Таблица 5 Сравнительная характеристика микроскопических диагностических признаков травы манжетки отдельных видов

Диагностический признак	A.gracilis A.baltica	A.semilunaris A.hisuticaulis
1. кольцевое расположение тканей стебля 2. аномоцитный устьичный комплекс 3. волоски простые 4. друзы 5. три концентрических сосудистоволокнистых пучка в черешках	+ + + + + + + + + +	+ + + + + + + + + +

На бумажной хроматограмме ацетонового извлечения, в системах 1БУВ 4:2:1 и П15% уксусная кислота, детергент желтая кровяная соль проявляет большинство соединений полифенольного комплекса - самое яркое -агримониин.

На ВЭЖХроматограмме идентифицированы пики фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, в частности рутина (рис. 9); олиготанина-агримониина (рис.12).

Экспериментально подобранные нами требования к пробоподготовке для RAPDанализа позволяют проводить идентификацию цельного и высокой степени измельчения, как свежего, так и высушенного сырья, соответственно характеризующегося набором из шестивосьми фрагментов амплифицированной ДНК, причем, нижние две полосы, имеют длину менее 500 пар нуклеотидов, (определённую относительно маркёра _Hindlll).

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья, а также для порошка из него: сумма флавоноидов в пересчёте на рутин, влажность, зола общая, зола, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, пожелтевшие и блёклые листья; черешки листьев и цветоносы длиннее 10 см, органическая примесь, минеральная примесь, характеризующие качество сырья, определены нами экспериментально и установлены их нормы.

Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин проведено по подобранным нами и адаптированным фармакопейным спектрофотометрическим методикам. Ошибка метода составила 5, 16%.” При изучении вопросов стандартизации нами установлены нормы содержания основной группы БАВ.

Результаты валидации методик качественного и количественного анализа БАВ и суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Валидационной проверке подвергались методики качественного и количественного определения биологически активных веществ: полифенолов, флавоноидов и агримониина квалификационные исследования заключались в оценке их воспроизводимости и устойчивости стандартных растворов, подверженных линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества, достигаемой чувствительности определения, расчете метрологических характеристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Результаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0, 005 %) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания флавоноидов (коэффициенты корреляции составили 0, 998), что определяет высокую точность анализа. Это выражается в хорошей воспроизводимости результатов, а также в статистически доказанной правильности определения.

Сделанные выводы дают возможность считать разработанную методику пригодной для достоверного количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы манжетки.

При разработке системы мероприятий, способствующих сохранению качества сырья до его применения, необходимо учитывать динамику содержания и фи зикохимические свойства БАВ, содержащиеся в нём.

Содержание суммы флавоноидов в траве

Год проведения сбора Содержание суммы флавоноидов, %

1996 2, 85±0, 15

1995 2, 78±0, 25

1994 2, 07±0, 18

1993 1, 78±0, 28

1992 1, 75±0, 33

До 1997 года собирали всю надземную часть манжетки, не отделяя черешки и жёсткую часть цветоносов.

Так как в траве манжетки флавоноиды относятся к одной из главных групп действующих веществ, обуславливающих основные фармакологические эффекты, проводили изучение стабильности содержания суммы флавоноидов в траве манжетки, заложенной на хранение в 1992 году в сухом, защищенном от света месте. Проведенное исследование показало, что со временем (по истечении двух лет хранения) этот показатель значительно уменьшается, сырье выгорает. Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин представлены в таблице 7, где видно, что хранить траву манжетки дольше двух лет нерационально.Таким образом, трава манжетки должна храниться по общему списку в защищенном от света, хорошо проветриваемом помещении не более двух лет.

Срок годности экспериментально установлен - 2 года.

Ресурсоведческое исследование

На основании проведенного ресурсоведческого исследования природных популяций манжетки установлено, что для изученных популяции характерно доминирование A.gracilis (до70%), A.baltica(15%), A.subcrenata (10%) и все остальные виды составляют менее 5% * (рис.13); определено, что проективное покрытие в среднем охватывает 70±15% учетной площадки; сбор свежего сырья должен составлять около 50% от всей биомассы, одна особь при этом дает 2035 грамм свежего сырья, занимая площадь от 0, 25 до 0, 50 мІ; коэффициент усушки - составил 4. В результате расчетов определено, что 1% проективного покрытия даёт 0, 9±0, 1 грамм сухого сырья при ежегодной заготовке сырья с соблюдением ресурсосберегающих требований.

Рис.13. Диаграмма соотношения видов Alchemila в популяции

Манжетка входит в ценокомплекс в составе злаково-манжетково- разнотравной ассоциации; разнотравье представлено следующими видами: купырь лесной - Anthriscus silvestris (L) Hoffm, дудник лесной-Angelica sylvestris L., хвощ лесной - Equisetum sylvaticum L., вербейник монетчатый - Lysimachia nummularia L., герань лесная - Geranium sylvaticum L., лапчатка прямостоячая - Potentilla erecta (L.) Raeusch., вероника дубравная-Veronica chamaedrys L., горошек заборный Vicia sepium L., зверобой пятнистый - Hypericum quadrangulum L., и др.Эти виды могут попадать в сырье, как органическая примесь (не более 10%).

Расчеты среднего выхода сырья с одного квадратного метра проводили за пять лет. Они составили:

56, 325, 87г(2001г), 45, 463, 45г(2002г),

65, 678, 35г(2003г), 35, 524, 57г(2004г); 72, 269, 06 г(2005г).

Проанализировав полученные данные, установили, что урожайность травы манжетки находится в зависимости от погодных факторов вегетационного периода, при этом выход сухого сырья травы манжетки может составлять в среднем до 5, 5 ц/га.

Таким образом, нами установлено, что манжетка образует сплошные невысокие заросли - «куртины», поэтому определение урожайности можно проводить по проективному покрытию, «цена» 1% будет равна около 0, 9 г, а урожайность травы манжетки в среднем составляет 5, 5 ц/га. Т.о. установлен объем ежегодных заготовок.

Определение острой токсичности и специфической активности травы манжетки показало, что настой из нее относится к классу нетоксичных, максимально переносимая доза настоя МПДLD₁₀. Установлено, что настой травы манжетки обладает антиметастатическим действием (ТРМ более 25%) при раннем начале лечения (на модели опухоли карциномы Льюис), при этом настой обладает способностью ингибировать процесс рецидивирования опухоли у животных. При пероральном введении настоя травы манжетки мышам в дозе 7, 0 мг/кг способствует снижению метастазирования саркомы 37 на 29%. По предварительным данным настой травы манжетки в дозе 13, 7 мг/кг per os значительно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой37 в сравнении с контролем. Также определена перспективность его применения при комбинированной терапии.

Обсуждение результатов Лекарственные растения, применяемые отечественной народной медициной составляют более 600 видов, а разрешенных к медицинскому применению, включенных в Государственный Реестр - 260 видов, причем многие из них не образуют промышленно значимых зарослей или включены в Красную Книгу. Кроме того, ухудшение экологической обстановки, антропогенное воздействие на места обитания многих ценных лекарственных видов сокращают их природные запасы. Все это вызывает необходимость активнее изучать и внедрять лекарственные растения народной медицины для расширения сырьевой базы получения отечественных лекарственных средств.

Для этого необходимо разработать научно обоснованные методические подходы к изучению лекарственных растений Флоры России, создать алгоритм, позволяющий наиболее полно изучать и эффективно внедрять их в научную медицину.

Схема 1. Алгоритм изучения лекарственных растений

Научно обоснованная схема изучения лекарственных растений народной медицины должна содержать следующие этапы:

Выявление лекарственного растения наиболее часто применяемого для лечения определенного вида патологий;

Изучение жизненного цикла растения и возможности введения его в культуру;

Изучение природной сырьевой базы;

Выявление биологически активных веществ, определяющих фармакологическую активность лекарственного сырья;

Определение показателей подлинности и качества сырья;

Разработка нормативных документов на сырье

Изучение биологической активности

Клинические испытания

и представлена на схеме 1.

На основании этого алгоритма были проведены исследования для разработки нормативных документов. Результаты исследования перспективных лекарственных растений были положены в основу методических указаний по изучению растений Флоры России.

В результате изучения особенностей биологии лекарственных растений было установлено, что для идентификации видов, обладающих аберратными формами размножения необходимо использовать молекулярно-биологические методы анализа. Они позволяют четко очертить круг видов, относящихся к растениям, производящим сырье, а также определить его подлинность в препаратах из него высокой степени измельчения.

Поскольку эти методы достаточно точны, доступны, воспроизводимы и расширяют возможности фармакогностического анализа, считаем необходимым включить нормативные документы на них в последующее издание Государственной Фармакопеи.

Проведенные исследования позволили разработать методические подходы (алгоритм) для изучения лекарственных растений народной медицины, обладающих сложной таксономией и аберратными формами размножения, образующих агамные комплексы и др. Схема 1., а также разработать нормативные документы на перспективное лекарственное растительное сырье трава манжетки (проект Фармакопейной статьи и Инструкции по сбору и сушке), кроме того, проект общей Фармакопейной статьи «RAPDанализ лекарственного растительного сырья».

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью RAPDанализа на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

2. Изучена взаимосвязь между строением геномов видов рода манжетка и стабильностью химического состава БАВ. В качестве химических маркеров определены рутин, гиперозид, галловая и кофейная кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.

3. Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава манжетки, как перспективного лекарственного сырья для отчественной медицины, эти данные вошли в проекты Фармакопейной статьи и Инструкцию по сбору и сушке.

4. Изучение полифенольного состава травы манжетки от разных производящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

5. Показана возможность применения RAPD для видоидентификации лекарственного растительного сырья и молекулярно-биологических методов для дальнейшего изучения лекарственных растений на примере 17 видов сырья растений, относящихся к 11ти родам и к 7ми семействам. Разработан проект Общей Фармакопейной статьи «RAPDанализ лекарственного растительного сырья».

6. Установлена возможность использования применения секвенирования ДНК перспективных и лекарственных растений с использованием последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 12), хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petBpetD) и на примере рода Аnthylis L., и проведен филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

7. Выявлено отсутствие токсичности и определена специфическая активность настоя травы манжетки.

8. Определена урожайность перспективного сырья - трава манжетки: при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий, она составляет до 5, 5 ц/га.

9. В результате проведенного фармакогностического изучения перспективных лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов обобщенны экспериментальные данные и дано теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения при комплексном изучении перспективных лекарственных растений, применяемых в народной медицине.

10. Разработан алгоритм изучения сложных в таксономическом отношении видов и родов этих растений в том числе и обладающих аберратными формами размножения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

1. Баева В.М. Динамика накопления дубильных веществ цветков иванчая узколистного по фазам онтогенеза. Деп.во ВНИИМИ, МРЖ, № 6, 1986, раздел ХХП, публ.1051.

2. Баева В.М., Барабанов Е.И. «Микроэлементный состав иванчая узколистного и препарата “Ханерол” // Фармация, 1994, № 6.С.46.

3. Баева В.М., Павкин А.В. ”Морфолого-анатомические особенности строения представителей рода манжетка”.Сб.”Актуальные вопросы медицины” Материалы Всероссийской студенческой конференции, посвященной 50летию АМН России, 46 октября 1994.М., 1994. - С.60.

4. Баева В.М., Сасов С.А. ”Сравнительное изучение химического состава представителей рода манжетка”. “Современные аспекты изучения лекарственных растений”. Научные труды, т. ХХХ1У, М. 1995. С.242244.

5. Баева В.М., Боброва В.К. ”Сравнительное изучение геномов представителей рода манжетка”. Материалы докладов Российской национальной конференции “Формирование приоритетов лекарственной политики”. М., 1995 2829 июня. - С.165166.

6. Баева В.М., Боброва В.К. ”Геномный анализ рода манжетка”. Тезисы докладов Первого международного симпозиума “Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования” (15 августа 1995 г) Пущино - 1995. С.2425.

7. Баева В.М. “Изучение манжеток ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова” “Лекарственные растения ботанического сада” - Материалы тезисов научной конференции, посвященной 50летию ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова. М., 1996. - С.40.

8. Баева В.М., Боброва В.К. «RAPD - перспективный анализ для изучения лекарственных растений». - Научные труды: «Фармацевтическая наука и практика в новых социальноэкономических условиях», т. ХХХ1У, часть П. М., 1997.С.174177.

9. Баева В.М., Володин Ю.Ю., Толкачёв В.Н. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов манжетки // Международный конгресс по аналитической химии 1521 июня 1997 г. Тесизы докладов, М., 1997. - Россия. Абстракт, № 2. - С.46.

10. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий А.В., Антонов А.С. RAPDанализ ДНК рода манжетка // Фармация, 1998 № 2. С.3841.

11. Баева В.М. Перпективы применения геномного анализа для изучения лекарственных растений // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2125 апреля 1998 г. - С. 345.

12. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для определения качества лекарственного растительного сырья». У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2125 апреля 1998 г. С.346.

13. Баева В.М., Глазунова К.П. Манжетка обыкновенная -перспективное лекарственное растение // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2125 апреля 1998. - С.358.

14. Баева В.М., Сасов С.А. Флавоноидный состав цветков иванчая узколистного // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Тезисы докладов, М., 2125 апреля 1998. С. 358359.

15. Баева В.М. Микроэлементный состав травы манжетки // Материалы научно-практической конференции «Традиционные методы лечения - основные направления и перспективы развития». МЗ РФ. М., 1416 мая 1998. - С.109.

16. Баева В.М., Глазунова К.П. «Применение пыльцевого анализа для определения загрязнённости лекарственного растительного сырья». Сб. «Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения». Научные труды, том ХХХУП, ч. П, М., 1998. С.145149.

17. Baeva V.M., Sepp S., Antonov A.S. et and. Genetic and morfological variabiliti in same microspecies of agamous Alchemilla L. Ineternacional Symposium “Plant Evolution in Manmade Habitats. - August 1015.1998. - S. 93.

18. Баева В.М., Глазунова К.П. Изучение морфогенетической изменчивости у видов рода манжетка // Сб. «Современные проблемы фармацевтической науки и практики». Научные труды, том ХХХУШ, ч. П. М., 1999. С.155158.

19. Баева В.М., Коваленко Т.Ф. RAPDанализ листьев дуба // Сб. «Фармация на современном этапе - проблемы и достижения». Научные труды, том ХХХ1Х, часть П, М., 1999. - С.196198.

20. Баева В.М., Можайский А.М. Изучение полифенольного состава водных извлечений травы некоторых видов манжетки // Фармация, 2001, № 5.- С. 2526.

21. Баева В.М., Козин С.В. Изучение токсичности настоя травы манжетки // УШ Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов М., апрель 2001. - С.442.

22. Баева В.М., Сасов С.А., Ярцева И.В. Изучение полифенольного состава травы манжетки // У1 Симпозиум по фенольным соединениям 2830 апреля 2004 Москва. Тезисы докладов М., 2004. С.96.

23. Баева В.М. «Лечение растениями. Основы фитотерапии». М., 2004. С.202.

24. Баева В.М., Потанина О.Г., Самылина И.А., и др. Пыльца, как анатомо-диагностический признак при определении подлинности лекарственного растительного сырья // Материалы съезда и конференции. 9й международный съезд «Фитофарм 2005». Конференция молодых учёных Европейского фитохимического общества (Растения и здоровье).С. Петербург 2225 июня 2005 г. С.283289.

25. Баева В.М.Полиморфизм лекарственных растений // Фармация, 2005, № 6. С. 4042.

26. Баева В.М. Изучение запасов перспективного лекарственного сырья трава манжетки //«Традиционная медицина 2007». Сб.научн.трудов конгресса, посвященного 30летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии. Москва, 13 марта 2007.С.3032.

27. Баева В.М., Сасов С.А. Полифенолы травы манжетки // Фармация, 2007, № 8. С. 910. .

28. Баева В.М., Мурин И.И. Изучение аминокислотного состава настоя и порошка травы манжетки //«Традиционная медицина» № 1 [8] 2007. С.5356.

29. Баева В.М. Использование методов молекулярной биологии для идентификации лекарственного растительного сырья // «Традиционная медицина 2007». Сб. научн. трудов конгресса, посвященного 30летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии. Москва, 13 марта 2007.С.3233.

30. Баева В.М., Ермакова В.А, Сорокина А.А., Самылина И.А.и др. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М., 2007. С.672.

31. Баева В.М. Современный подход к изучению лекарственных растений // Сб. научных трудов. Г.Москва 1416 марта 2008 года. М .2008. С. 268271

32. Баева В.М. Фармакогностическое изучение и стандартизация сырья трава манжетки.//Сб. научных трудов. Г. Москва 1416 марта 2008 года. М .2008. С.231232.

33. Баева В.М., Сасов С.А. Полифенолы травы манжетки // Фармация. - 2007. № 8. С.910.

34. Монастырева Н.А., Баева В.М. Изучение состава полифенольного комплекса травы монарды методом ВЭЖХ. Тезисы итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова. Москва.2007.С.22.

35. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата - циклофосфаминда // Тезисы У Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Российская Федерация, г. Москва. 2008.с.307, 545 С.

36. Баева В.М., Вальехо Роман К.М., Смигуллин Т.Х. Перспективы изучения лекарственных растений с использованием секвенирования ДНК на примере рода Anthyllis L.// Фармация.2009, № 3. С.2326.

37. Баева В.М., Монастырева Н.А. Применение RAPDанализа для изучения лекарственного растительного сырья // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009, №2. - С. 2931.

38. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки, на общую токсичность противоопухолевого препарата циклофосфамид // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. № 2 // Материалы УШ Всероссийской научнопрактической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 2122 апреля 2009 г. С.55.

Размещено на Allbest.ru