Теоретические и экспериментальные аспекты создания лекарственных средств на основе сырья природного происхождения

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Теоретические и экспериментальные аспекты создания лекарственных средств на основе сырья природного происхождения

15.00.01 - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Блинова Ольга Алексеевна

Пермь - 2009

Диссертационная работа выполнена на базе ГОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научные консультанты:

доктор фармацевтических наук Назаренко Павел Владимирович,

доктор медицинских наук Коростелев Сергей Анатольевич.

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, зам. директора по НИР ЗАО "Медисорб" Вдовина Галина Петровна,

доктор фармацевтических наук, профессор ГУ "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" РАСХН Давыдова Валентина Николаевна,

доктор фармацевтических наук, профессор ФГУН Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства Лесиовская Елена Евгеньевна.

Ведущая организация: ГОУ ВПО "Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Защита состоится _________________ 200__ г в ___ час на заседании Диссертационного совета Д.208.068.01 Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан _______________ 200__ года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на значительные достижения в области создания синтетических лекарственных препаратов нового поколения в последнее десятилетие отмечается все более возрастающий интерес к средствам растительного происхождения. Актуальны вопросы создания лекарственных средств на основе, как индивидуального лекарственного растительного сырья (ЛРС), так и его сборов. Многокомпонентные сборы достаточно широко используются в традиционной медицине, что объясняется наличием широкого спектра фармакологического действия, мягко и гармонично воздействующего на все системы организма при минимальном количестве побочных эффектов в условиях длительного применения. Однако ассортимент сборов, официально утвержденных к медицинскому применению на территории Российской Федерации, достаточно ограничен [Саканян, 1996, Маркарян А.А., 2003; Пупыкина К.А., 2008].

Представляется важным изучение возможных путей создания современных фитопрепаратов с использованием методологических подходов, базирующихся на изучении технологии их разработки и обеспечении качества лекарственных средств по комплексу характеристик.

При промышленном производстве суммарных фитопрепаратов эффективность извлечения комплекса действующих веществ в ряде случаев достигает лишь 40-50 % из-за недостаточности истощения сырья по всем группам действующих веществ [Давыдова, 2002; Каухова И.Е., 2006]. Данный факт свидетельствует о необходимости использования технологических приемов, повышающих выход БАВ в экстракты, как из индивидуального растительного сырья, так и из сборов.

Использование экстрактов в качестве субстанций для изготовления лекарственных форм (ЛФ) позволит расширить ассортимент комплексных фитопрепаратов для перорального (гранулы) и трансдермального (трансмукоидного) применения (пленки лекарственные). Лекарственные формы пролонгированного и контролируемого действия, обеспечивающие высокую степень биологической доступности лекарственных средств и направленный транспорт БАВ, приходят на смену традиционным лекарственным формам первого поколения Пленки лекарственные (ПЛ) относятся к аппликационным ЛФ с пролонгированным эффектом, которые можно использовать не только для лечения, но и профилактики многих заболеваний. Создание и изучение таких лекарственных форм в настоящее время сложилось в самостоятельное научное направление [Бертулис, 1990; Николов И.С., 1990; Мизина П.Г., 2004].

Вместе с тем наблюдается отсутствие единого методического подхода к созданию ПЛ с субстанциями растительного и животного происхождения, который требует проведения технологических, физико-химических, биофармацевтических и фармакологических исследований.

Актуальным является совершенствование методов стандартизации и контроля качества как исходного ЛРС, так и его лекарственных форм по основным группам биологически активных веществ (флавоноиды, полисахариды, антоцианы и др.) [Самылина, 1998; Сорокина А.А., 2002]. Интерес к природным флаванам вызван их выраженными антиоксидантными (антигипоксическими) свойствами [Самылина, 2004; Назаренко П.В., 2005]. Кроме этого они обладают противовоспалительным, антимикробным, ранозаживляющим, иммуномодулирующим действием. Ценными источниками флаванов являются такие растения, как трава фиалки - Herba Violae, листья земляники - Folia Fragariae vescae, цветки ноготков - Flores Calendulae, цветки ромашки - Flores Сhamomillаe, трава манжетки - Herba Alchemillae и трава очанки - Herba Euphrasiae). Известно также, что в процессе воспаления участвует система свертывания крови, вызывая тромбообразование и локальное нарушение кровообращения. Одним из перспективных средств природного происхождения тромболитического действия является препарат медицинской пиявки - пиявит [Никонов, 1998].

Цель и задачи исследования. Целью диссертационного исследования является теоретическое и экспериментальное обоснование использования природного сырья для получения субстанций и создания лекарственных форм на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- разработать методологические подходы к созданию лекарственных средств на основе сырья природного происхождения на основе комплекса технологических, биофармацевтических, физико-химических, химических, микробиологических и фармакологических исследований, использовать их при разработке лекарственных средств выбранных объектов для лечения воспалительных заболеваний пародонта;

- теоретически обосновать и экспериментально подтвердить выбор лекарственного растительного сырья с целью получения сбора заданного фармакологического действия, определить критерии его подлинности, разработать методики количественного определения основных групп БАВ и нормы их содержания, составить проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП);

- изучить влияние основных факторов, влияющих на выход БАВ из ЛРС и сборов, оптимизировать технологические приемы получения сухих экстрактов на их основе, провести стандартизацию полученных субстанций;

- сформулировать общие закономерности выбора оптимальной матрицы-носителя, технологических приемов изготовления и показатели качества пленок лекарственных;

- полученные закономерности использовать для разработки составов и технологии ПЛ с ФЭС, НЭС и препаратом медицинской пиявки, провести их стандартизацию и составить методические указания (МУ) по изготовлению в аптеке, с целью обеспечения противовоспалительного, антимикробного, ранозаживляющего и тромболитического действия;

- провести исследования по разработке состава, технологии и стандартизации гранул ФЭС и составить проект ФСП;

- провести фармакологические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств.

- разработать необходимую нормативную документацию на ЛРС, сбор и лекарственные формы, рекомендуемые к внедрению в медицинскую практику в виде проектов ФСП, лабораторных и опытно-промышленных регламентов на производство;

- подготовка разработанных нормативных документов к представлению в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора.

Научная новизна. На основании комплекса теоретических и экспериментальных исследований сформулированы методологические подходы к созданию лекарственных средств на основе сырья природного происхождения, включающие два основных направления. Первое - определение рациональной схемы получения оригинальных субстанций (ФЭС и НЭС). Второе - создание современных, качественных, эффективных и безопасных лекарственных форм на основе сухих экстрактов.

Теоретически и экспериментально, с помощью фармакологического скрининга обоснован состав сбора противовоспалительного, антимикробного, регенерирующего, иммуномодулирующего и капилляроукрепляющего действия. В ходе проведения фармакогностического исследования сбора выявлены диагностически значимые признаки для установления подлинности и стандартности, установлено содержание основных групп БАВ, органических кислот, витаминов, аминокислот, макро- и микроэлементов. Проведено определение уровня микробиологической чистоты ЛРС, сбора, субстанций на их основе, обеспечивающего максимальную чистоту сырья и фитопрепаратов.

Для оценки качества сырья, субстанций и лекарственных форм на их основе разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов.

В результате технологических исследований определены оптимальные параметры производства ФЭС и "Нормофит" экстракта сухого (НЭС), проведена их стандартизация, определен оптимальный срок хранения. Полученные данные использованы для составления НД.

Научно обоснован состав пленочной матрицы - носителя, обеспечивающей функциональную пригодность ПЛ на основе сухих экстрактов ("Фиадент", "Нормофит") и ПЛ с пиявитом, установлены показатели качества, проведена стандартизация и установлен срок годности.

По результатам проведенных исследований разработан состав и технология получения гранул ФЭС.

Фармакологическими исследованиями противовоспалительной, регенерирующей, антимикробной, иммуномодулирующей и других видов активности, доказана безопасность и эффективность разработанных субстанций и их лекарственных форм.

Приоритет, разработанных субстанций и лекарственных форм, защищен:

Патентами РФ на изобретение:

- № 2259835 (приоритет от 10.09.2005);

- № 2201194 (приоритет от 27.03.2003);

- № 2342945 (приоритет от 02.08.07).

Практическая значимость.

На основании проведенных исследований разработаны:

• технология и показатели качества фиалки экстракта сухого (полученные данные включены в ФСП 42-9430-08, опытно-промышленный регламент на производство).

• состав, технология и показатели качества "Нормофит" экстракта сухого (проект ФСП, проект инструкции по применению);

• состав, технология и показатели качества пленок лекарственных "Фиадент" (проект ФСП, результаты исследования включены в "Методические указания по изготовлению и контролю качества пленок лекарственных "Фиадент" в условиях аптечных учреждений различных форм собственности", утверждены Региональным испытательным центром "Фарматест", г. Пермь);

• состав, технология и показатели качества пленок лекарственных "Нормофит" (проект ФСП, результаты исследования включены в "Методические указания по изготовлению и контролю качества пленок лекарственных "Фиадент" в условиях аптечных учреждений различных форм собственности", утверждены Региональным испытательным центром "Фарматест", г. Пермь);

• состав, технология и показатели качества гранул фиалки экстракта сухого (проект ФСП, проект инструкции по применению);

• получено удостоверение на рационализаторское предложение "Способ лечения гингивита с использованием биопленок на основе Пиявита" (удостоверение № 2169 от 15.02.2001);

• материалы исследований включены в проект ОФС "Пленки лекарственные";

• материалы исследований использованы при составлении проекта ОФС "Экстракты сухие".

Проведена апробация технологии экстрактов сухих (Акты от 17.01.06, 07.02.06.), пленок лекарственных (Акты от 11.04.06, 10.05.06, 12.09.06.) и гранул (Акт от 14.11.06.) на базе ФГУП "Межбольничная аптека" УД Президента РФ.

Результаты исследований используются в учебном процессе:

- на кафедре фармацевтической технологии ГОУ ВПО "ПГФА Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" при изучении теоретического и практического материала на 3 курсе очного факультета, на занятиях интернов, слушателей факультета дополнительного профессионального образования (Акт от 06.10.08).

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на: Межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001); Третьей международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2002); IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002); VI Международном съезде "Актуальные проблемы создания препаратов природного происхождения" (С. - Петербург, 2002); Областной научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов "Молодежная наука Прикамья - 2002" (Пермь, 2002); IV Международном конгрессе молодых ученых "Науки о человеке" (Томск, 2003); Межвузовской научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава "Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы" (Пермь, 2003); Российской научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (Пермь, 2004); XI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004); XII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2005); XIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2006); Научно-практической конференции "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2007); на ежегодных конференциях профессорско-преподавательского состава ПГФА (Пермь, 2001-2007 гг.), на научно-практической конференции "Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации" (Ташкент, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 53 печатных работы, из них 3 патента РФ на изобретение, 1 рационализаторское предложение, 1 ФСП, 8 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 6 статей в материалах съездов и конференций, 34 тезисов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" в соответствии с планом научно-исследовательских работ (№ государственной регистрации 01.9.50 007426).

На защиту выносятся:

- методологические подходы и основные принципы создания научно-обоснованных составов, технологии и анализа лекарственных форм на основе сырья природного происхождения;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и изучению сбора "Нормофит", по разработке технологии и показателей качества ФЭС, НЭС, научно-обоснованных составов, технологии и показателей качества ПЛ на основе ФЭС, НЭС, препарата медицинской пиявки и гранул ФЭС;

- результаты фармакологического изучения разработанных субстанций и лекарственных форм.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована ___ рисунками, ___ таблицами и состоит из введения, обзора литературы, шести глав, посвященных экспериментальным исследованиям, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает ___ источников, в том числе ___ на иностранных языках.

В Приложение включена нормативная документация - ФСП, проекты ФСП, лабораторные и опытно-промышленный регламенты, проекты ОФС, Методические указания, акты внедрения и апробации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы (глава I) содержит теоретическое обоснование технологии получения и разработки показателей качества экстракционных препаратов. Показана целесообразность использования изучаемых видов сырья для создания лекарственных препаратов. Особое внимание уделено перспективности лекарственной формы - пленки лекарственные.

Во второй главе охарактеризованы объекты исследования и приведены методики, использованные при выполнении работы. При постановке и проведении экспериментов применяли методы математического планирования эксперимента. Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам ГФ ХI изд. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали t-критерий Стьюдента.

Методологические подходы к разработке лекарственных средств на основе сырья природного происхождения. Предлагаемая методология базируется на проведении комплекса теоретических, технологических, физико-химических, биофармацевтических и фармакологических исследований, обеспечивающих получение современных, качественных, эффективных и безопасных лекарственных средств (рис. 1). Она включает три этапа, каждый из которых завершается получением промежуточного продукта, обеспечивающего постановку задач для каждого последующего этапа.

Первый этап включает проведение поиска литературных данных с целью выявление сырья растительного и животного происхождения, воздействующего на основные симптомы воспалительных заболеваний пародонта. Известно, что при возникновении воспаления расширяются сосуды, вследствие чего увеличивается кровоснабжение, происходит замедление кровотока и как следствие, покраснение, местное повышение температуры, затем увеличение проницаемости стенки капилляров ведёт к выходу лейкоцитов, макрофагов из жидкой части крови (плазмы) в место повреждения - отёк, который, в свою очередь, сдавливая нервные окончания, вызывает боль. В повреждённой ткани усиливаются процессы образования свободных радикалов.



Рисунок 1. Методологические подходы к разработке лекарственных средств на основе сырья природного происхождения

Обычно для устранения воспаления требуется применение нескольких препаратов, воздействующих на различные звенья патологического процесса. Использование растительного сырья обеспечивает широкий спектр фармакологического действия. Следующим слагаемым первого этапа исследования является поиск рациональных приемов экстрагирования ЛРС, позволяющих извлечь необходимое количество и спектр БАВ, изучение показателей стандартизации экстрактов.

Заключительной стадией первого этапа является выбор перспективных лекарственных форм. Применение в терапевтической практике лекарственных средств для профилактики и местного лечения инфекционно-воспалительных поражений слизистых оболочек в виде растворов, мазевых аппликаций характеризуются неточностью дозирования, слабыми адгезивными свойствами, незначительной глубиной проникновения лекарственного вещества в ткани, кратковременной терапевтической эффективностью, быстрым снижением концентрации препарата из-за разбавления слюной, необходимостью многократного введения вещества, большими затратами времени врача и пациента для лечения, а также необходимостью использования дополнительных средств для удержания тампонов. Создание ПЛ на основе субстанций природного происхождения обеспечивает максимальную биологическую доступность БАВ, точное и непрерывное дозирование в течение длительного промежутка времени, устранение биодеструкции ферментами ЖКТ. Гранулирование сухих экстрактов позволяет улучшить их технологические свойства и расширить область практического применения.

Разработка состава сбора и технологии получения сухих экстрактов.

Главными составляющими при подборе лекарственного растительного сырья для формирования сбора, являлись следующие: данные о составе биологически активных веществ растений, опыте их использования в традиционной и официальной медицине для лечения воспалительных заболеваний.

В состав разрабатываемых композиций вводили и дублирующие по действию растительные компоненты, исходя из того, что усложнение комплекса биологически активных веществ, приводит к потенцированию фармакологических эффектов за счет того, что компоненты одноименного действия имеют различные точки воздействия и повышают надежность ожидаемого лечебного эффекта. При этом обеспечивается поливалентность действия и снижается возможность побочных эффектов.

При составлении сборов для лечения воспалительных заболеваний учитывали необходимость введения растений, обладающих противовоспалительным, антимикробным, регенеративным, кровоостанавливающим, обезболивающим, иммуномодулирующим и противоотечным действием, что позволило отобрать 13 видов лекарственного растительного сырья. Немаловажным при проведении поиска являлось изучение противопоказаний и предостережений при применении лекарственных растений, что позволило сократить количество лекарственных растений до 6 наименований.

Наличие растительных компонентов, содержащих различные группы БАВ, позволяет достичь потенцирования эффектов и поливалентного фармакологического действия. Все выбранные растения обладают противовоспалительной, антимикробной и регенеративной активностью. Поскольку в патогенезе воспалительных заболеваний наблюдается расширение капилляров и кровоточивость, в сбор введена трава очанки, обладающая также кровоостанавливающим и антиоксидантным действием, присутствие травы манжетки предполагает усиление обезболивающего действия сбора.

Процентное соотношение компонентов в сборе обосновывали теоретически с учетом вклада каждого компонента в оказание конечного лечебного эффекта и экспериментально (табл. 1).

Таблица 1. Составы сборов полифункционального действия

Наименование сырья	Состав, %
	№1	№2	№3	№4
Трава фиалки	20	25	25	25
Листья земляники	20	25	20	20
Цветки ромашки	20	20	20	15
Цветки ноготков	20	20	20	20
Трава манжетки	10	5	10	10
Трава очанки	10	5	5	10

Таким образом, по результатам исследований нами разработана оптимальная пропись сбора (№1), названного "Нормофит".

Разработанный сбор включает несколько растительных компонентов, что делает целесообразным постановку вопроса его стандартизации по комплексу доминирующих биологически активных соединений. С поликомпонентностью состава связаны трудности выбора группы БАВ, позволяющей репрезентативно стандартизировать сбор. Решение этой проблемы невозможно без детального изучения химического состава сбора и выбора приоритетных и специфических маркеров, по которым бы планировалось в дальнейшем проведение стандартизации.

Качественными реакциями и методами хроматографического анализа на бумаге и в тонком слое сорбента выделены и идентифицированы в сборе "Нормофит" индивидуальные фенольные соединения, такие как флавоноиды (рутин и кверцетин).

Рисунок 2. Схема тонкослойной хроматографии извлечения из сбора в системе БУВ (4:1:5)

При проведении одномерной бумажной хроматографии и ТСХ лучшее разделение флавоноидных соединений происходит в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), а при использовании двумерной бумажной хроматографии - в системе БУВ и 15 %-ной уксусной кислоты. На рисунке 2 показано наличие не менее 18 веществ фенольной природы. По расположению пятен и их окраске до и после проявления парами аммиака можно сделать вывод, что в сборе присутствуют, как агликоны, так и гликозиды флавоноидов.

В результате определения спектральной характеристики извлечения из сбора установлено, что максимум находится в области от 405 до 415 нм (рис. 3).

Рисунок 3. Спектральная характеристика ГСО рутина и извлечения из сбора

Спектр поглощения сбора имеет максимум близкий к спектру рутина, поэтому он выбран в качестве доминирующего в сумме, на который в дальнейшем вели пересчет. В основу разрабатываемой методики количественного определения легла спектрофотометрия с комплексообразующей добавкой, аналитические параметры которой позволяют использовать ее для определения содержания флавоноидов в растительных объектах, содержащих неидентичный набор флавоноидов, а, следовательно, приемлемый и для сбора. В качестве аналитической принята длина волна 410 нм, а экстрагента - 70 % спирт этиловый.

Далее подобраны оптимальные условия проведения количественного определения флавоноидов в сборе (табл. 2).

Таблица 2. Оптимальные условия количественного определения флавоноидов в сборе

Экстрагент (спирт этиловый)	70 %
Измельченность сырья	2-3 мм
Соотношение сырье - экстрагент	1:100
Время и кратность экстракции	Трехкратная экстракция по 30 мин
Длина волны	410 нм
Концентрация комплексообразователя	2 % спиртовый раствор AlCl3
Количество добавляемого комплексообразователя	2 мл
Время комплексообразования	40 мин и комплекс стабилен в течение 1 часа

Метрологическая характеристика содержания суммы флавоноидов в сборе, в пересчете на рутин, представлена в таблице 3.

Таблица 3. Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе "Нормофит"

Хср	S2	Sx	E?	E
2,44	0,005	0,03	0,09	3,69 %

Относительная ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 0,95 составляет 5,23 %. Опыты с добавками ГСО рутина показали отсутствие систематической ошибки предлагаемой методики. Результаты проведенных исследований подтверждают ее воспроизводимость.

С помощью этой методики проанализировано пять серий сбора. Исходя из полученных данных, для включения в проект ФСП рекомендуется содержание суммы флавоноидов в сборе в пересчете на рутин не менее 2 %.

В процессе фитохимических исследований сбора с использованием качественных реакций обнаружены другие группы БАВ: фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, свободные органические кислоты, полисахариды и определено их количественное содержание с помощью методов гравиметрии, титриметрии и спектрофотометрии. Содержание полисахаридов находится в пределах от 7,10 до 7,92 %, дубильных веществ - 11,40-11,86 %, аскорбиновой кислоты - 0,21-0,43, свободных органических кислот - 2,3-2,8, фенолкарбоновых кислот - 0,24-0,29.

Установлен качественный и количественный аминокислотный состав сбора "Нормофит" на аминокислотном анализаторе ААА-339 (ЧССР) (табл. 4). Полученные данные позволили установить присутствие 14 аминокислот, из которых восемь незаменимых, среди которых преобладают аминокислоты - пролин, глицин, валин, цистеин и аргинин.

Таблица 4. Содержание свободных аминокислот в сборе "Нормофит"

Наименование аминокислот	Содержание аминокислот, %
Лизин*	0,111±0,004
Метионин*	0,154±0,006
Цистеин	0,58±0,01
Гистидин*	0,071±0,001
Аргинин	0,70±0,02
Треонин*	0,34±0,01
Серин	0,54±0,01
Пролин	1,52±0,08
Глицин	0,91±0,05
Валин*	0,72±0,03
Изолейцин*	0,26±0,01
Лейцин*	0,021±0,001
Тирозин	0,20±0,01
Фенилаланин*	0,42±0,02

Примечание: * - незаменимые аминокислоты.

Методом атомно-абсорбционной спектрометрии с помощью дифракционного спектрографа ДФС-13-1 проведено определение макро- и микроэлементов в сборе "Нормофит", поскольку они играют важную роль в формировании систем организма, пластических процессах, проявляют фармакологическую активность, влияют на обмен веществ, активизируют ферментные системы, потенцируют действие витаминов С, Р, В ₂, В ₁₂ и др. (табл.5).

Таблица 5. Результаты изучения микроэлементного состава сбора "Нормофит"

№ п/п	Элемент	мг/кг сырья
1	Ni	Никель	7,51
2	Co	Кобальт	0,64
3	Cr	Хром	5,78
4	Mn	Марганец	352
5	V	Ванадий	1,20
6	Ti	Титан	110
7	Sc	Скандий	0,52
8	Ge	Германий	0
9	Cu	Медь	10,15
10	Zn	Цинк	11,2
11	Pb	Свинец	0
12	Ag	Серебро	0,055
13	As	Мышьяк	0
14	Sb	Сурьма	0
15	Cd	Кадмий	0
16	Bi	Висмут	0
17	Mo	Молибден	0,224
18	Ba	Барий	112
19	Sr	Стронций	46,5
20	W	Вольфрам	0
21	Sn	Олово	0
22	Be	Бериллий	0,14
23	Zr	Цирконий	11,5
24	Ga	Галлий	0,74
25	Y	Иттрий	1,10
26	Yb	Иттербий	0,17
27	Li	Литий	0
28	Nb	Ниобий	1,00

В тоже время, наличие и относительно высокое содержание некоторых микроэлементов (Zn, Mn, Cu), расширяет диапазон применения сбора для профилактики и лечения воспалительных заболеваний пародонта.

Таким образом, проведено подробное изучение химического состава сбора "Нормофит" и определено количественное содержание различных групп биологически активных веществ.

Результаты проведенных товароведческих, морфолого-анатомических и фитохимических исследований включены в проект ФСП "Сбор "Нормофит" (таблица 6).

Таблица 6. Результаты стандартизации сбора "Нормофит"

Наименование показателей	Требования проекта ФСП	Фактические данные
Внешние признаки	Смесь неоднородных частиц листьев, стеблей, цельных или частично осыпавшихся корзинок со слабым, ароматным запахом. Вкус горьковатый. Цвет желто - зеленый с фиолетовыми и оранжево - коричневыми включениями.	Соответствует
Подлинность	1. УФ-спектр имеет максимум при длине волны 410 ± 5 нм. 2. Качественная реакция с 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида (III) (зеленовато-желтое окрашивание); 3. ТСХ	Соответствует Соответствует Соответствует
Содержание суммы флавоноидов (в пересчете на рутин), %, не менее	2	2,44+0,08
Экстрактивных веществ, %, не менее	25	35,86+1,53
Золы общей, %, не более	12	9,76+0,55
Золы нерастворимой в 10 % растворе HCl, %, не более	5	4,6+0,30
Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями 3мм, %, не более	10	1,9+0,08
Потеря в массе при высушивании, %, не более	10	4,37+0,14
Органическая примесь, не более, %	0,5	0,10+0,03
Минеральная примесь, не более, %	0,5	0,05+0,01
Микробиологическая чистота	Категория 4а	Соответствует

Срок годности сбора составил 2 года при хранении в бумажных пакетах, уложенных в пачки из бумаги или картона, в помещении с относительной влажностью воздуха 60+5⁰С. При этом содержание действующих веществ оставалось на уровне, удовлетворяющем требованиям проекта ФСП.

Разработка технологии получения Фиалки экстракта сухого и "Нормофит" экстракта сухого.

Основными факторами, влияющими на скорость и полноту высвобождения действующих веществ, являются: тип экстрагента, температура, степень измельченности сырья, продолжительность экстрагирования и гидродинамические условия.

Установлено, что оптимальным экстрагентом является вода очищенная, в связи с этим предложено проводить экстракцию горячей водой. Далее нами изучена зависимость выхода БАВ (флавоноидов) при экстракции горячей водой в различных соотношениях к количеству сырья.

Анализ экспериментальных данных свидетельствует о том, что оптимальным является соотношение сырья и экстрагента от 1:10 до 1:15. Дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, т.к. выход извлекаемых веществ не повышается.

Следующим важным фактором, влияющим на процесс экстрагирования флавоноидов, является степень измельчения сырья. Вместо разнотипного по величине частиц и механическим свойствам использовали вальцованное растительное сырье, измельченное до частиц менее 1 мм.

Для интенсификации процесса изучены условия перемешивания и рекомендовано проводить экстракцию при 70-80⁰С и периодическом перемешивании в течение не менее 10 минут. При этом возрастала скорость экстракции, что позволило сократить время настаивания на каждой ступени на 30 минут.

С целью определения продолжительности и кратности экстракции изучено время наступления равновесной концентрации в системе "сырье - экстрагент" при 1, 2 и 3 контактах фаз. Установлено, что равновесное состояние в системе достигается через 1 час при первом контакте и через 30 минут при втором и третьем. Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает полное истощение сырья.

Все установленные факторы экстракции заложены в режим экстрагирования травы фиалки и сбора "Нормофит": экстрагент ? вода очищенная, соотношение сырья и экстрагента ? 1:10-1:15, температурный режим ? 75?±5?, размер частиц - 1-2 мм, трехкратная экстракция (первая - 30 мин, вторая и третья - 15 мин).

При изучении влияния способа сушки на содержание биологически активных веществ, физико-химические и технологические свойства экстрактов, исследованы процессы сушки в вакуум-сушильном шкафу (ВСШ), распылительным (РС) и сублимационным (СС) способами. В результате исследования усыновлено (табл. 7), что оптимальными показателями обладают экстракты, полученные распылительной сушкой. Установлено также, что экстракты, высушенные в вакуум-сушильном шкафу, требуют дополнительного измельчения, а сублимационной сушкой - более гигроскопичны (4,57 %).

На базе ФГУП "Межбольничная аптека" УД Президента РФ отработаны опытно-промышленные регламенты и составлены технологические схемы получения Фиалки экстракта сухого и "Нормофит" экстракта сухого.

Для экстракции использована комплектная опытно-промышленная установка, включающая дозатор сырья, экстрактор, фильтрационную установку, вакуум-выпарной аппарат, сепаратор и сушилку.

Таблица 7. Результаты изучения влияния способа сушки на показатели качества ФЭС (1) и "Нормофит" экстракта сухого (2)

№ п/п	Показатели качества	Способ сушки
1.		ВСШ	РС	СС
1.		1	2	1	2	1	2
1.	Сыпучесть, г/сек	1,42	2,40	1,46	1,80	1,84	2,73
2.	Насыпная плотность, кг/мі	0,60	0,62	0,64	0,68	0,73	0,74
3.	Угол естественного откоса, град	37,0	35,0	45,0	42,0	40,0	36,0
4.	Потеря в массе при высушивании, %	4,13	3,22	4,22	3,16	4,56	4,55
5.	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %	4,02	4,75	4,12	4,98	3,98	4,52

Экстрагирование сырья проводили водой очищенной в экстракторе из нержавеющей стали с ложным дном вместимостью 200 л, снабженном якорной мешалкой, паровой рубашкой и гильзой для термометра. На дно экстрактора помещали серошинельное сукно и два слоя бязи, при сливе извлечение одновременно фильтровалось. Очистку объединенных водных извлечений осуществляли фильтрацией и сепарированием. Для упаривания извлечений применяли вакуум-выпарной аппарат Simax (ЧССР), который обладает высокой производительностью и мягкими условиями упарки. Сушку экстракта проводили на распылительной сушилке Niro Atomazer (Дания). Экспериментально при загрузках установлена оптимальная температура воздуха на входе 150-180⁰С, на выходе 70-80⁰С, производительность сушилки составила 2,0-2,5 л/ч по испаренной влаге. Концентрация исходного извлечения для сушки должна быть не ниже 15 %.

На всех стадиях технологического производства проводили контроль технологический (Кт), химический (Кх) и микробиологический (Км) сырья, концентрированного экстракта, осадка после сепарирования, шрота и конечного продукта производства - субстанции (рис. 4).

Стандартизация Фиалки экстракта сухого.

Регламентируемые действующей ГФ показатели качества, указывают на необходимость разработки современных, точных, избирательных и воспроизводимых методик анализа. Изучение литературных данных, отечественных и ведущих зарубежных фармакопей позволило сформулировать общие требования, предъявляемые к указанной лекарственной форме, использованные при разработке проекта ОФС "Экстракты сухие": внешний вид (описание), подлинность, содержание действующих веществ (количественное определение), потеря в массе при высушивании, содержание тяжелых металлов, микробиологическая чистота.

Стандартизацию ФЭС проводили на 5 сериях, полученных в опытно - промышленных условиях (табл. 9). Внешний вид, цвет и запах ФЭС определяли на основании визуальных наблюдений.

Для подтверждения подлинности использовали спектральную характеристику, проведение качественных реакций и хроматографию в тонком слое сорбента.

лекарственный растительное сырье фармакологическое

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 4. Технологическая схема получения ФЭС

УФ-спектр. Ультрафиолетовый спектр поглощения раствора Б, приготовленного для количественного определения, в области от 380 до 470 нм имеет максимум при длине волны (405 ± 5) нм (рис. 5).

Рисунок 5. Спектр поглощения комплекса флавоноидов ФЭС с алюминия хлоридом и ГСО рутина

Качественные реакции. К 1 мл раствора, приготовленного для количественного определения, прибавляют 2 мл 2 % раствора алюминия хлорида в спирте этиловом 95 %, раствор окрашивается в зеленовато-желтый цвет (флавоноиды).

Хроматография. На стартовую линию пластинки "Sorbfil" (ПТСХ-АФ-А-УФ) наносят 0,04 мл 10 % раствора фиалки экстракта сухого, рядом наносят по 0,005 мл 0,05 % растворов ГСО рутина и ГСО кверцетина (раздел "Количественное определение"). Пластинку помещают в камеру с системой растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) и хроматографируют восходящим способом (смесь растворителей готовят и заливают в камеру непосредственно перед хроматографированием). Когда фронт растворителя пройдет 13 см, пластинку вынимают из камеры, высушивают в вытяжном шкафу в течение нескольких минут и просматривают в УФ свете при длине волны 254 нм. После обработки 1 % раствором алюминия хлорида на хроматограмме должны быть видны 4 основные зоны: две ярко-желтого цвета (одна на уровне ГСО рутина, другая на уровне ГСО кверцетина), имеющие в УФ - свете зеленую флюоресценцию, остальные - с Rs около 0,57, Rs около 0,88, имеющие темную флуоресценцию (рис. 6). Допускается наличие 2-5 дополнительных зон.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 6. Схема хроматограммы ФЭС в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) методом ТСХ

Количественное определение суммы флавоноидов проводили спектрофотометрическим методом после реакции с 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 410 нм в кювете с толщиной 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность стандартного образца рутина (ГСО).

Для количественного определения антоцианов разработана унифицированная методика спектрофотометрического определения в пересчете на цианидин-3,5-диглюкозид, которая апробирована на трех образцах сырья и ФЭС (табл. 8).

Таблица 8. Результаты количественного определения антоцианов в траве фиалки и ФЭС

№ п/п	Образец сырья	Содержание антоцианов, %	Еб	Е, %
1.	Трава фиалки	0,115	0,005	4,26
2.	Трава фиалки	0,135	0,004	2,67
3.	Трава фиалки	0,127	0,005	4,02
4.	Фиалки экстракт сухой	0,122	0,004	2,38
5.	Фиалки экстракт сухой	0,115	0,003	2,02
6.	Фиалки экстракт сухой	0,158	0,006	4,51

Из таблицы следует, что относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает +4,51 %.

Таблица 9. Результаты определения качества ФЭС

Номер серии	Дата	НД	Описание	Подлинность	Тяжелые металлы, %	Содержание флавоноидов, %	Потеря в массе при высушивании, %	Микробиологическая чистота	Отклонение от НД	Заключение
Требования ФСП
		ФСП	Аморфный, гигроскопичный порошок от светло - коричневого до темно - коричневого цвета со специфическим запахом, горьковатого вкуса.	Положительна	Не более 0,01	не менее 2,0	Не более 5,0	Общее число бактерий - не более 104. Общее число грибов - 102.	Нет	Удовлетворяет
Фактические данные
10/01-06	10.01.06		Аморфный, гигроскопичный порошок от светло - коричневого до темно - коричневого цвета со специфическим запахом, горьковатого вкуса.	Положительна	Не более 0,01	4,11	4,01	1500	Нет	Удовлетворяет
11/01-06	11.01.06	- " -	- " -	- " -	- " -	4,05	3,99	2010	- " -	- " -
12/01-06	12.01.06	- " -	- " -	- " -	- " -	4,08	4,36	2000	- " -	- " -
13/01-06	13.01.06	- " -	- " -	- " -	- " -	4,21	4,71	2530	- " -	- " -
16/01-06	16.01.06	- " -	- " -	- " -	- " -	4,00	4,10	1015	- " -	- " -

Таблица 10. Результаты определения качества образцов ФЭС при естественном хранении

Номер серии	Срок хранения	Описание	Подлинность	Содержание суммы флавоноидов (%)	Потеря в массе при высушивании, (%)	Микробиол. чистота
1	2	3	4	5	6	7
01	0	Аморфный порошок коричневого цвета, с ароматным приятным запахом	положительна	4,29+0,07	4,11	соответствует
	0,5	-"-	-"-	4,22 ± 0,01	4,24	-"-
	1	-"-	-"-	4,17 ± 0,05	4,51	-"-
	1,5	-"-	-"-	4,09 ± 0,02	4,66	-"-
	2	-"-	-"-	3,92 ± 0,01	4,62	-"-
02	0	Аморфный порошок коричневого цвета, с ароматным приятным запахом	положительна	4,05 ± 0,09	3,99	соответствует
	0,5	-"-	-"-	4,05 ± 0,04	4,11	-"-
	1	-"-	-"-	3,89 ± 0,07	4,44	-"-
	1,5	-"-	-"-	3,80 ± 0,01	4,50	-"-
	2	-"-	-"-	3,58 ± 0,02	4,78	-"-
03	0	Аморфный порошок коричневого цвета, с ароматным приятным запахом	положительна	4,55 ± 0,05	4,22	соответствует
	0,5	-"-	-"-	4,55 ± 0,05	4,31	-"-
	1	-"-	-"-	4,39 ± 0,05	4,67	-"-
	1,5	-"-	-"-	4,35 ± 0,02	4,85	-"-
	2	-"-	-"-	4,18± 0,01	4,90	-"-
04	0	Аморфный порошок коричневого цвета, с ароматным приятным запахом	положительна	3,94 ± 0,04	4,51	соответствует
	0,5	-"-	-"-	3,94 ± 0,07	4,68	-"-
	1	-"-	-"-	3,71 ± 0,08	4,74	-"-
	1,5	-"-	-"-	3,39 ± 0,03	4,79	-"-
	2	-"-	-"-	3,21± 0,03	4,84	-"-
05	0	Аморфный порошок коричневого цвета, с ароматным приятным запахом	положительна	4,19 ± 0,02	4,02	соответствует
	0,5	-"-	-"-	4,19 ± 0,02	4,15	-"-
	1	-"-	-"-	4,11 ± 0,09	4,30	-"-
	1,5	-"-	-"-	4,02 ± 0,01	4,36	-"-
	2	-"-	-"-	3,87 ± 0,02	4,68	-"-

Изучение стабильности ФЭС в естественных условиях при температуре 15-25⁰С расфасованного по 50,0 г в банки из стекломассы типа БВ 100-40-ОС-1 (ОСТ 64-2-71-80) показало постоянство показателей качества в течение периода времени не менее 2 лет, что позволяет рекомендовать его как срок хранения ФЭС (таблица 10).

Определение показателей качества "Нормофит" экстракта сухого.

Описание. "Нормофит" экстракт сухой представляет собой гигроскопичный аморфный порошок от темно-желтого до желто-коричневого цвета со специфическим запахом, гигроскопичен, комкуется.

Подлинность. Фитохимическими исследованиями в НЭС установлено наличие рутина. Для проведения качественной реакции с 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида предложено использовать спиртовое извлечение, приготовленное для количественного определения.

Для подтверждения подлинности экстракта используется также определение спектра поглощения в УФ - области спектра (максимум при 410 нм) и проведение ТСХ со свидетелем ГСО рутина.

После обработки 1 % раствором алюминия хлорида на хроматограмме видны 3 основные зоны: одна ярко-желтого цвета на уровне ГСО рутина, имеющая в УФ - свете зеленую флюоресценцию, остальные - с Rf около 0,7, Rf около 0,8, имеющие темную флуоресценцию. Допускается наличие 2-5 дополнительных зон.

Потеря в массе при высушивании. НЭС обладает гигроскопичностью. Данный показатель характеризует стабильность субстанции при хранении. Определение проводили в соответствие с ГФ XI, вып. 2, стр.176. Потеря в массе не должна превышать 5 % (таблица 11).

Таблица 11. Результаты определения потери в массе при высушивании "Нормофит" экстракта сухого

№ серии	Хср	Е	Е, %
01	3,16	0,13	4,11
02	3,66	0,07	1,91
03	3,44	0,16	4,65
04	3,21	0,14	4,36
05	3,60	0,06	1,67

Тяжелые металлы. В соответствии с ГФ XI (вып. 2, С. 172) на НЭС установлено требование содержания тяжелых металлов не более 0,01 %.

Количественное определение. Количественная оценка содержания суммы флавоноидов является одним из важнейших показателей экстракта. Определение осуществляли спектрофотометрическим методом при длине волны 410 нм в кювете 10 мм.

Таблица 12. Результаты определения содержания суммы флавоноидов в "Нормофит" экстракте сухом

№ серии	Хср, %	Е	Е, %
01	4,98	0,03	0,60
02	5,05	0,01	0,20
03	4,93	0,02	0,41
04	4,98	0,01	0,20
05	5,18	0,04	0,77

Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в НЭС должно быть не менее 3 % (таблица 12).

Микробиологическая чистота. Определение микробиологической чистоты проводили в соответствии с требованиями ГФ XI и изм. №3 от 2003 г. (категория 3Б) (таблица 13).

Таблица 13. Результаты определения микробиологической чистоты "Нормофит" экстракта сухого

Номер серии	Общее число бактерий	Общее число грибов	Наличие патогенных микроорганизмов
			Escherichia coli	Staphylococcus aureus	Pseudomonas aeruginosa
01	5000	80	?	?	?
02	5000	80	?	?	?
03	4500	80	?	?	?
04	5000	80	?	?	?
05	5000	80	?	?	?

Примечание: "?" - отсутствие роста бактериальной культуры

Изучение антимикробной активности показало, что НЭС обладает активностью в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli в разведении от 1:10 до 1:40.

Срок годности. Изучение стабильности НЭС проводили на трех образцах в естественных условиях при температуре 15-25⁰С и влажности воздуха 60+5 %. Проверку показателей качества осуществляли каждые 6 месяцев хранения. В результате сделаны выводы о стабильности субстанции в течение не менее 2 лет.

Разработка лекарственных форм на основе субстанций природного происхождения.

Несмотря на значительный уровень исследований в области создания ТС различного типа, их ассортимент ограничен конструктивно различными формами на основе синтетических полимеров, что аргументирует актуальность проводимого нами исследования по разработке методологии создания пленок на основе полимеров природного происхождения и БАВ растений.

На основании литературных данных и экспериментальных исследований установлены медико-фармацевтических требования к пленкам трансмукоидного назначения:

- высокая адгезионная способность к влажным покровам слизистой оболочки полости рта (СОПР);

- достаточная газопроницаемость, обеспечивающая нормальное протекание репаративных аэробных процессов;

- сохранение анатомо-физиологических свойств СОПР;

- соблюдение гигиенической нормы разницы рН слюнной жидкости (в пределах 1);

- стабильность или минимальная вариабельность терапевтического эффекта;

- устранение болевого синдрома и ускорение эпителизации зон поражения;

- пролонгирование действия БАВ;

- точность дозирования и постоянство концентрации БАВ в течение продолжительного времени;

- обеспечение комплексности терапии в результате всасывания БАВ как местного, так и резорбтивного действия;

- биосовместимость, отсутствие аллергизирующего, местнораздражающего действия;

- комфортность в применении и возможность применения в экстремальных полевых условиях при проведении массовых профилактических мероприятий;

- индивидуализация терапии с учетом наличия сопутствующих заболеваний пациентов, адаптированность к детской стоматологии и гериатрии;

- конструктивная простота и технологические возможности выпуска;

- удобство транспортирования и хранения;

- сохранение физико-химических параметров и концентрации лекарственных веществ в течение не менее двух лет.

Разработанные с учетом указанных требований, основные принципы создания пленок, предполагают соблюдение необходимой этапности и носят причинно-следственный характер, определяемый ключевыми факторами.

методические Принципы создания Пл
Этапы	Ключевые факторы
Обоснование вида БАВ пленок	БАВ полифункционального характера местного и резорбтивного действия
Обоснование выбора оптимального состава пленочной матрицы	Функциональная пригодность пленок
Научно-обоснованный выбор рациональной технологии ПЛ	Специфичность компонентного состава, метод изготовления
Разработка оптимальных стандартов качества и методов их контроля при производстве и хранении	Необходимость реализации медико-фармацевтических требований к аппликационным лекарственным формам
Установление стабильности ПЛ	Обеспечение доброкачественности в заданных условиях хранения и транспортирования
Клинико-экспериментальное обоснование фармакологической активности и биологической безвредности ПЛ	Обеспечение терапевтической эффективности при отсутствии токсичности

Состав матрицы установлен в результате поэтапного исследования 94 композиций, представляющих собой различные сочетания полимеров: натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na КМЦ), метилцеллюлоза - 16; 35 и 100, метилоксипропилцеллюлоза, натрия альгинат медицинский, поливиниловый спирт, биополимер растворимый, поливинилпирролидон, зарубежные пленкообразователи голландской фирмы Hercules, широко применяемые в пищевой, фармацевтической промышленности в качестве связующих веществ, диспергаторов, загустителей, пленкообразователей: Бланозе Целлюлозе Гам (Blanose Gum) типов 7МF и 7М 8SF, Натросол 250 Фарм (Natrosol 250 Farm) типов 250 НХ, 250 М, 250G, которые в соответствии с законодательством ЕЭС по опасным веществам и технологиям их производства, относятся к разряду безопасных, соответствуют по чистоте требованиям Европейской фармакопеи, Фармакопеи США и Международной Фармакопеи Ш издания. С целью придания пленкам необходимой пластичности использовался пластификатор - глицерин.

Критериями оценки пленочных композиций на первом этапе являлись результаты оценки их органолептических свойств (однородность, отсутствие микротрещин, разрывов, хорошее отставание от подложки).

Для статистической обработки полученных результатов использован метод обобщенной функции желательности Харрингтона, включающий расчеты значений частных наиболее значимых показателей желательности отдельных свойств (d) этих показателей в единый количественный признак, позволяющий сделать окончательный вывод. В результате, из 94 изученных композиций выбраны 4 состава на основе Бланозе 7МF и 7М 8SF, Na КМЦ и альгината натрия.